FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES

LABORATORIO BIOQUÍMICA

Alumno: _______________________________________ Código: _________________

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PRACTICA 1: EXTRACCION DE ADN Y VISUALIZACIÓN DEL ADN

OBJETIVOS:

1. Realizar la extracción de ADN a partir de células humanas de la mucosa bucal

2. Discutir la importancia de la extracción de ADN en la investigación.

3. Analizar el efecto de los diferentes reactivos empleados en la técnica de extracción de ADN.

4. Comprender la utilidad de la técnica de electroforesis en el estudio del ADN.

5. Ganar experiencia en el manejo y principio fundamental de una maquina moderna para la

cuantificación del ADN.

1. FUNDAMENTO TEORICO

Los ácidos nucleicos tienen como principales funciones la transmisión y expresión de la

información genética. A través de estas funciones determinan no solo la estructura sino que
también regulan todos los procesos fisiológicos y metabólicos de los seres vivos. Existen dos
tipos de ácidos nucleicos, denominados ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico
(ARN), estos compuestos son polímeros de nucleótidos, los cuales a su vez se conforman de
tres moléculas diferentes (azúcar pentosa, base nitrogenada y fosfato).

En las células eucarióticas el ADN se encuentra en el núcleo asociado a proteínas

denominadas histonas formando la cromatina. También aparece en organelas como
mitocondrias y cloroplastos. (figura 1). En procariotes (Ej: bacterias) el ADN se localiza en el
citoplasma y no presenta una membrana de protección.

Figura No 1. Niveles de organización del ADN en células eucariotas. Tomado de La química del
genoma en Locos por la biología. Julio 20, 2011. Disponible en la web:
http://locosporlabiologia.wordpress.com/2011/07/20/la-quimica-del-genoma/
El ARN es un tipo de ácido nucleíco de menor tamaño que el ADN. Existen varios tipos de ARN:
mensajero (ARNm), ribosomal (ARNr) y de transferencia (ARNt) con diferentes funciones, todas
asociadas con la expresión de la información contenida en el ADN. El ARN es sintetizado en el
núcleo en el proceso de transcripción y ejerce sus funciones en el citoplasma.

El estudio de la estructura y propiedades de los ácidos nucleicos ha permitido la comprensión

de procesos asociados a mecanismos de enfermedades genéticas e infecciosas, respuesta
inmune, desarrollo de células cancerosas y resistencia a antibióticos, los cuales han sido
empleados en una serie de campos de la salud. El análisis de la secuencia de los ácidos
nucleicos así como el desarrollo tecnológico de sus procesos, han sido la base para el diseño
de vacunas, producción de fármacos, mejoramiento de la calidad nutricional de especies
vegetales y animales, resistencia vegetal a plagas, control de enfermedades parasitarias,
terapia y regulación génica.

Los ácidos nucleicos pueden ser aislados mediante la ruptura de la membrana celular y la
nuclear, dejándolos libres en el lisado celular, para su posterior limpieza y precipitación. Esto se
consigue mediante choque osmótico (ej; NaCl 3M), homogenización mecánica, digestión
enzimática (ej; proteinasa K) o tratamiento con detergentes (ej; SDS) o ácidos (ej; HCl).
Después de centrifugar para descartar las células intactas, organelas y restos de membranas, el
sobrenadante que contiene los ácidos nucleicos solubles, es tratado con agentes como fenol,
mezclas de cloroformo-alcohol isoamílico o una solución concentrada de sales (ej: cloruro de
sodio 5M) que permiten separar las proteínas al desnaturalizarlas. El ADN que era soluble en la
fase acuosa se precipita después de la centrifugación. La preparación de ADN puede ser de
mayor concentración y pureza al adicionar etanol frío. Después de ser secado y disuelto en un
buffer apropiado, el ADN puede ser visualizado mediante su separación en un gel de agarosa y
tinción con un colorante como el Bromuro de etídio o el SYBR green. Bajo luz ultravioleta estas
moléculas son fluorescentes y por estar unidas al ADN se pueden observar indirectamente las
moléculas de ADN con un color producto de la capacidad de fluorescencia del colorante.

Estos métodos de visualización son importantes ya que combinan la capacidad de los geles de
agarosa de separar las moléculas de ADN por tamaños con la capacidad de observar cada una
de estas moléculas debida al efecto del colorante.

Otra forma importante de analizar los ácidos nucleicos es mediante su capacidad de absorber
luz ultravioleta. Esta característica se usa principalmente para la cuantificación de la
concentración de ácidos nucleicos en una solución. En esta práctica tendrá la oportunidad de
interactuar con uno de los equipos más sofisticados y modernos para dicho fin, el NanoDrop.

Disfrute la práctica.
 2. SEGURIDAD DURANTE LA PRÁCTICA

2.1 Normas de seguridad

El estudiante debe referirse al manual de normas de seguridad.

2.2 Equipos de protección personal

Usar durante todo el desarrollo de la práctica los siguientes elementos de seguridad:

• Bata de laboratorio
• Guantes de nitrilo
• Gafas de seguridad
Mantener los elementos personales de seguridad identificados y en buen estado. Está prohibido su intercambio con
los demás compañeros de laboratorio.

2.3 Manejo de Residuos químicos

Tanto por razones de seguridad como por respeto al medio ambiente, es importante disponer los residuos
generados en las prácticas del laboratorio de química en forma adecuada. Por ello el estudiante debe:

1. Emplear los recipientes destinados para eliminar los residuos o desechos de laboratorio, los cuales están
debidamente identificados según el tipo de sustancia a desechar.

2. Verter únicamente los residuos en el recipiente correspondiente para evitar reacciones no controladas y
potencialmente peligrosas. No arrojar por el desagüe los desechos o residuos químicos obtenidos durante el
desarrollo de la práctica. Si tiene alguna inquietud al respecto comuníquela al responsable del laboratorio,
quien le indicará la forma correcta de hacerlo.

3. METODOS

3.1 REACTIVOS:

Tabla 1. Listado de reactivos necesarios para el desarrollo de la práctica por pareja.

ITEM CANTIDAD
Solución de SDS al 10% 5mL
Etanol al 96%, frío a -20ºC 20mL
Solución de NaCl 5M 60µL
Solución de SYBR Green 50 µL para todo el curso
Buffer TE (Tris-HCl10 mM /EDTA 1mM) 500 mL para todo el
curso
Agarosa 1g para todo el curso
Agua destilada -
3.2. MATERIALES

Tabla 2. Listado de materiales necesarios para el desarrollo de la práctica por pareja.

ITEM CANTIDAD x equipo

Probeta de 10mL 1
Pipeta graduada de 5mL 1
Pipeta graduada de 10mL 1
Propipeta 1
Micropipeta de 20µL 1
Micropipeta de 100µL 1
Pipeta Pasteur 2
Vaso de precipitados de 50mL 2
Vaso de precipitados de 100mL 1
Tubo Falcon de 50mL 1
Tubo eppendorf de 1,5mL 4
Caja de Petri 1 para todo el curso
Plancha de calentamiento con agitador 1 para todo el curso
Magneto 1 para todo el curso

3.3. EQUIPOS

ITEM CANTIDAD PARA EL CURSO

Camara de electroforesis pequeña 1
Transiluminador Ultravioleta 1
Equipo NanoDrop 1

3.4. PROCEDIMIENTO

I. EXTRACCIÓN DE ADN DE CÉLULAS DE MUCOSA ORAL

1. Deposite en una probeta una muestra de saliva (aproximadamente 5mL).

2. Tome 2,5 mL de la muestra y deposítela en un tubo Falcon. Adicione 2,5mL de solución SDS
al 10% y agite por inversión.

3. Adicione 50µL de solución de NaCl 5M y nuevamente agite.

3. Añada 10mL de etanol al 96% (debe estar a una temperatura de -20ºC). Agite por inversión
(muy suavemente).

4. Anotar observaciones.

5. Remover el ADN con una punta de micropipeta, y transferirla a un tubo eppendorf.

6. Secar el botón de ADN a 55ºC por 10 minutos.

7. Adicionar 1mL de Buffer TE. Agite por inversión.

VISUALIZACIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS:

1. Se extrae 5µL de la solución de ADN y se pasan a un pozo en la caja de Petri que contiene
agarosa al 1% (preguntar al instructor).

2. Adicionar 1µL de solución SYBR Green en el pozo. Deje difundir durante 4 minutos y observe
bajo luz ultravioleta (transiluminador)*

*NOTA: La exposición al Ultravioleta puede quemar su retina irreversiblemente, y lastimar su

piel. Por ello, es imprescindible que use el equipo de protección adecuado.
El bromuro de etidio es un intercalador de DNA por ende mutagenico. Maneje con sumo
cuidado.

3. Usando una micropipeta de volumen apropiado mezcle 5 uL de la solución de DNA con 10 uL

de SYBR Green (pregunte al instructor antes de proceder). Asegúrese que las dos soluciones
estén bien mezcladas.

4. Con la ayuda de su instructor “siembre” la muestra en el pozo designado para ello en el gel
de agarosa al 1% proveído por el instructor.

5. Una vez los demás grupos hayan realizado la siembra proceda a conectar la cámara de
electroforesis a la fuente de poder y usar los valores recomendados por el instructor. No olvide
ver el gel al final de la práctica en el transiluminador.

6. Coordine con el instructor para llevar la muestra de ADN al nanodrop para medición de la
absorción de luz por la muestra. Tome nota de la absorbancia y de la longitud de onda utilizada
ya que este valor será importante para medir la concentración de AND presente en la muestra.

4. RESULTADOS

Anote los resultados obtenidos con cada una de las técnicas de visualización de ácidos
nucleicos.
Haga dibujos donde esquematice lo observado en cada caso. Organice los resultados para
presentar en el informe de laboratorio.

5. PREGUNTAS

1. Elabore un esquema del procedimiento realizado en la práctica.

2. Explique la función o fundamento de los siguientes reactivos en la extracción de ADN:

a) El SDS
b) El cloruro de sodio
c) El etanol al 96%

3. Explique porque es posible observar el ADN con Luz UV cuando se tiñe con SYBR
Green o con Bromuro de etídio. ¿Cuál es el mecanismo de tinción de estos reactivos?
4. ¿A qué parte de la estructura de la molécula del ADN se debe la absorción de luz
ultravioleta observada en el nanodrop?

5. Usando los valores reportados en la literatura (investigue) y el valor de absorbancia

arrojado por el nanodrop calcule la concentración de ADN presente en su muestra.

6. Explique en que se basa la separación de moléculas de ADN en geles de agarosa

usando como ejemplo lo que observó en el gel que se realizó en la práctica de
laboratorio.

6. Bibliografía.

1. Bioquímica de Stryer
2. Bioquímica de Lehninger
3. SAMBROOK J, FRITSCH E, MANIATIS T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd
edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold S, Spring Harbor Laboratory.1989.
4. Sitios de internet:

− platea.pntic.mec.es/~cmarti3/bio/ADN/adn3/ppal.htm
− www.hospitalameijeiras.sld.cu/.../...
− http://www.hospitalameijeiras.sld.cu/hha/mpm/documentos/BIOLOGIA%20MOLE
CULAR%20Y%20GENETICA/GP/EXTRACCION%20DE%20DNA%20A%20PAR
TIR%20DE%20MUCOSA%20BUCAL.pdf