Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Genetică bacteriană
Genetică bacteriană
• Genetica – studiul caracterelor ereditare și al
variației acestora
• Genă – segment ADN care codifică prin secvența
nucleotidelor un produs specific (ARN, proteină)
• Genom – totalitatea genelor unui organism
• Genotip – ansamblul genelor care codifică
anumite caractere ale unui organism
• Fenotip – ansamblul caracterelor structurale sau
funcționale ale unui organism, rezultate din
expresia unor gene
1
10/27/2018
Structura ADN
• Gena - secvența ADN care codifică un caracter, precum și regiunile
reglatorii care controlează expresia genei
– la procariote – doar regiuni codante (exoni)
– la eucariote - și regiuni necodante (introni)
• Numărul de copii ale fiecărui locus genetic dintr-o celulă variază:
– celulele somatice ale organismelor cu reproducere sexuală –
diploide (două seturi de cromozomi omologi)
– celulele germinative (reproductive) - haploide
– celulele procariote - haploide
Structura ADN
• moleculă mare, compusă din unităti repetitive similare:
deoxiribonucleotide
deoxiribonucleotid = 2’ deoxiriboză + fosfat + baza azotată
• purinică (Adenina, Guanina)
• pirimidinică (Citozina, Timina)
2
10/27/2018
Structura ADN
• ADN – obișnuit dublu catenar
• Cele două lanțuri ADN - menținute prin
legăturile de H dintre o anumită bază
purinică și baza pirimidinică
complementară (A = T, G C)
• lungimea unei molecule ADN se
măsoară în perechi de baze (pb)
• 1 kpb = 1000 pb
Structura ADN
Cele două lanțuri ADN sunt:
• răsucite: formează o structură de tip dublu helix
• antiparalele – un lanț este în direcția 5’ -3’, celălalt în direcția
3’-5’
• complementare – succesiunea bazelor azotate din compoziția
unui lanț este complementară secvenței de pe celălalt lanț
Structura ADN – stabilă și adaptată funcției acestuia: stocarea
informației genetice – codificată în secvența (succesiunea)
bazelor azotate
3
10/27/2018
Localizarea ADN
• eucariote – ADN d.c.
– nuclear - cromozomi liniari multipli de diferite mărimi
– mitocondrial – cromozom circular
• procariote – ADN d.c.
– cromozomal (bacteriile au un singur cromozom circular)
– plasmidic
• virusuri
– moleculele de ADN relativ mici, m.c.sau d.c, lineare sau
circulare
– există și virusuri ARN (lipsite de ADN)
4
10/27/2018
Structura ARN
• moleculă mare, compusă din unități repetitive similare:
ribonucleotide
ribonucleotid = riboză + fosfat + baza azotată
• purinică (Adenina, Guanina)
• pirimidinică (Citozina, Uracil)
Structura ARN
• ARN - în general monocatenar, de aceea este capabil de pliere,
cu formarea unor structuri secundare și terțiare complexe
• numeroase funcții:
o transfer al informației genetice de la ADN la ribozomi
(ARNm)
o transfer al unor aminoacizi (ARNt)
o enzimatică (ribozime, ex. peptidil transferaza din ribozomi)
o reglatoare – interacționează prin complementaritate și
interferă cu translația unor ARNm
5
10/27/2018
Tipuri de ARN
• ARN ribozomal
– intră în compoziția celor 2 subunități ribosomale, impreună
cu proteine
– codificat de gene cromozomale (impropriu numite ADNr)
– ARN 16S are și activitate catalitică
Tipuri de ARN
• ARN mesager
• transmite ribozomilor informația stocată în secvența ADN
• ARN m.c. cu lungime de aproximativ 2 kb
• Fiecare secventa ARNm exista in celula in mai multe copii
• Marimea si diversitatea populatiei ARNm (formata din
totalitatea secventelor de ARNm din celula) depind de
tipul celulei și de starea sa fiziologică, deoarece reflectă
genele exprimate la un anumit moment
• La procariote ARNm este policistronic (codifică mai multe
polipeptide)
6
10/27/2018
Tipuri de ARN
• ARN transfer
– interacționează specific cu un anumit aminoacid
– complexul aminoacil – ARNt este recunoscut de ribozomi
– ARNt interacționează prin anticodon cu codonul
complementar al ARNm
Genomul bacterian
Componente:
A. Cromozom
B. Plasmide
C. Elemente genetice mobile
7
10/27/2018
A. Cromozomul bacterian
• moleculă unică de ADN d.c. circular
• conține genele care codifică toate caracterele esențiale
menținerii viabilității
• haploid
• 2000 – 4000 gene, 500 – 5000 kb
• atașat unui situs membranar de replicare
• intens plicaturat
• 1-2 mm lungime (ex. cromozomul E coli - 1300 µm
lungime, dimensiunile bacteriei 1µm x 3µm);
• ocupă 10% din volumul celulei
B. Plasmide
• elemente genetice extracromosomale
• atașate unui situs membranar de replicare
• au autonomie replicativă (replicon)
• mult mai mici decât cromozomul (< 5%)
• prezente doar la unele bacterii (caracter de tulpină)
• intr-o celulă bacteriană pot exista unul sau mai multe
plasmide (identice sau distincte)
• într-o populație bacteriană plasmidele pot realiza
transferul unor gene care codifică variate caractere (ex.
rezistența la antibiotice)
8
10/27/2018
B. Plasmide
Conțin
• Gene necesare pentru autonomia replicativă
• Gene care codifică structuri exprimate in fenotipul gazdei
(necesare bacteriilor pentru supraviețuire in conditii modificate
de mediu, dar expresia acestor caractere crește timpul de
generație)
– Factori de virulență (toxine, adezine etc)
– Enzime ale unor căi metabolice particulare
– Sinteza unor agenți antimicrobieni (bacteriocine)
– Factori de rezistență la agenti antimicrobieni (ex. beta-lactamaze)
– Criptice
• (doar în cazulplasmidelor conjugative) - gene care codifică
structurile implicate in conjugarea bacteriană (pili sexuali)
C. Elemente transpozabile
• elemente genetice mobile (“jumping genes”)
• fragmente de ADN capabile sa se insere și sa treacă de
la cromozom la plasmide și invers
• nu există independent in celulă (nu au autonomie
replicativă, deci trebuie să se integreze intr-un replicon)
• 2 tipuri: secvențe de inserție (SI) și transpozomi
• structură
– secvențe scurte (20-40 pb), inversate, dispuse la capetele
elementului; recunoscute de transpozaze
– gene care codifică transpozaze
– gene care codifică factori specifici (patogenitate, rezistență la
antibiotice) și se exprimă in fenotipul gazdei; prezente doar la
transpozomi, nu și la SI
9
10/27/2018
Elemente transpozabile
Consecințe ale integrării aleatorii a transpozomilor
• pierderea/ modificarea unui caracter, consecutiv
alterării secvenței genei cromozomale/plasmidice in care
se integrează
• dobândirea unor caractere noi (ex. – rezistența la
anumite antibiotice), consecutiv transferului intercelular
de gene; reprezintă o cauză majoră a variabilității
genetice în cadrul unei populații bacteriene
Bacteriofagi (fagi)
• virusuri care se replică in celule bacteriene
• specifice unei specii bacteriene
• Structură
ex fagul T4 al Escherichia coli
– Cap - capsida (ADN sau ARN, 3-200 gene)
– Coada
• Teaca contractilă
• Fibrele cozii
10
10/27/2018
Lizotipare
• lizotip (fagotip) - grup restrâns de bacterii, caracterizate
prin sensibilitatea la un anumit bacteriofag; fagul respectiv
produce liza bacteriilor din fagotipul respectiv
• metodă de identificare a unui lizotip (fagotip), prin
utilizarea unor suspensii fagice bine definite
• permite obținerea unor informații utile epidemiologic
(stabilirea relației dintre tulpini izolate de la cazuri diferite)
• procedura: peste cultură pură a tulpinii de identificat se
plasează cate o picatură din fiecare suspensie fagică; după
incubare in cultură se observă plaje de liză acolo unde a
fost inoculat fagul corespunzator tulpinii studiate
11
10/27/2018
Fag temperat
• prezintă trei stadii:
• fag infecțios (extracelular)
• profag (genom viral integrat in cromozomul bacterian) – faza
lizogenă
• fag vegetativ (capabil sa inițieze ciclul litic)
• Etapele fazei lizogene:
- genomul viral pătrunde in citoplasmă
- ADN-ul bacterian nu este fragmentat
- genomul viral sau ADN-ul complementar se integrează in
cromozomul bacterian (stadiu de profag)
- sintezele celulare sunt doar putin influentate
- genomul profagic se replică simultan cu cromozomul bacterian si se
transmite celor două celule bacteriene rezultate prin diviziune
Fag temperat
• In stadiul de profag genele vegetative sunt represate, fiind
exprimate doar genele responsabile de replicarea
genomului; uneori și gene exprimate in fenotipul bacterian
(caractere noi)
• Conversie lizogenică – apariția unui caracter nou (ex.
producerea unei toxine) la bacterii care găzduiesc un
profag
• Bacterie lizogenă – bacterie care găzduiește un profag
(după un număr de diviziuni ale celulei bacteriene profagul
va activa genele vegetative, va intra in ciclul litic și va
induce liza bacteriei si eliberarea de fagi infectiosi)
12
10/27/2018
Fag temperat
• Integrarea profagului in cromosom poate fi aleatorie
sau situs-specifică
• Derepresia genelor vegetative (trecerea din profag in
stadiul de fag vegetativ, cu inițierea ciclului litic) – are
loc in anumite condiții, de ex. la anumiți stimuli
externi (UV etc.)
13
10/27/2018
14
10/27/2018
15
10/27/2018
16
10/27/2018
17
10/27/2018
18
10/27/2018
19
10/27/2018
20
10/27/2018
21
10/27/2018
22
10/27/2018
Variația bacteriană
Fenotipică Genotipică
• Indusă de interactiunea • Modificare bruscă,
genomului cu factori de (spontană sau indusă)
mediu • Ireversibilă
• Reversibilă • transmisibilă ereditar
• Nu se transmite ereditar • prin
• Prin controlul la nivel a. Mutații
transcripțional, b. Transfer de ADN
translațional sau
posttranslațional c. Recombinare
genetică
23
10/27/2018
A. Mutații
• Modificare permanentă in secvența nucleotidică a unei
gene
• rata mutațiilor = probabilitatea apariției unei mutații in
cursul diviziunii celulare
• Spontane - erori in cursul replicării ADN
– ADN polimeraza realizează 1 eroare la 109 baze/celulă/ciclu
de replicare;
• Induse de agenți mutageni
– fizici (radiații ionizante, UV)
– chimici (acid nitros, analogi nucleozidici, benzopiren etc);
cresc rata mutațiilor de 10 – 1000 ori
A. Mutații
• Prezența și manifestarea mutațiilor într-o populație
bacteriană – favorizate de
– mărimea populatiilor bacteriene
– caracterul haploid al genomului bacterian
• Există mecanisme de reparare a mutațiilor apărute
– activitatea exonucleazică a enzimelor implicate în replicarea
ADN permite excizia nucleotidelor incorporate greșit și
incorporarea nucleotidelor complementare matriței; catena
utilizată ca matriță este recunoscută datorită metilării
adeninei din anumite poziții
– recombinarea ADN etc.
24
10/27/2018
A. Mutații
Tipuri
• Substituții – modifică un singur nucleotid dintr-un
codon, care astfel poate deveni codon
– sinonim – nu se modifică aminoacidul codificat
– nou – modificarea secvenței de aminoacizi (mutație cu
sens greșit)
– non-sens - sinteza unui peptid incomplet (mutație non-
sens); dacă mutația non-sens este in prima genă
structurală a unui operon – mutatie polară
A. Mutații
• Microinserții, microdeletii – inserția sau deleția a
unul sau mai multe nucleotide (mutații cu schimbare
de proiect)
25
10/27/2018
A. Mutații
• Consecința mutațiilor nonsinonime - modificarea
fenotipică (a unui caracter/ funcții)
• Reversia fenotipică (recâștigarea caracterului
fenotipic pierdut ca urmare a mutației primare) – se
poate realiza prin
– supresie - realizarea de mutații compensatorii
(mutații secundare, apărute în alte poziții decât
mutația primară) - frecvent
– reversie genotipică (refacerea secvenței inițiale) –
foarte rar
B. Transfer genetic
• la eucariote se realizează doar prin transfer la
următoarea generație - transfer vertical
• la procariote se poate realiza și între indivizi din
aceeași generație (din aceeași specie sau din specii
diferite) – transfer orizontal
• Bacteriile utilizează endonucleaze de restricție
pentru a se apăra de ADN-ul străin
• Transferul orizontal - limitat la fragmente mici de
ADN provenit de la o bacterie donor
26
10/27/2018
Endonucleaze de restricție
• recunosc secvențe specifice de 4-10 pb care constituie un
palindrom (se citesc identic in ambele sensuri)
• desfac legăturile fosfodiesterice ale ambelor catene ADN
• Fiecare specie are propriile enzime de restricție (au fost
identificate peste 3000 de enzime de restricție)
• Pentru a-și proteja ADN-ul propriu situsurile recunoscute
de enzimele de restricție proprii bacteriei sunt mascate
prin metilarea nucleotidelor (A sau C) din poziții specifice
• Metilarea – realizată imediat după sinteza catenei ADN
3`--GAATTC- -5` 3`--GA*ATTC- -5`
5`--CTTAAG- - 3` 5`--CTTAA*G- - 3`
Transfer genetic
• Gene ale bacteriei donor pot persista în bacteria
receptor fie
– integrate in cromosomul bacteriei receptor –
consecutiv recombinării genetice
– extracromosomal – dacă ADN-ul este circular și
are informațiile necesare pentru propria replicare
27
10/27/2018
Transferul genetic
Mecanisme
1. Transformarea
2. Conjugarea
3. Transducția (transferul mediat de bacteriofagi)
1. Transformarea
• Transfer de gene realizat prin intermediul ADN-ului liber
provenit de la o bacterie donor și acceptat de bacteria
receptor; este urmat de recombinare omologă (legitimă)
• depinde de mărimea ADN-ului și de starea de
competență a bacteriei (expresia unor proteine specifice
care captează ADN)
• fenomen descris la pneumococi, Bacillus, Haemophilus,
Neisseria
• fenomen evidențiat de Griffith, 1928
• experiment repetat de Avery, MacLeod, McCarty, 1944
28
10/27/2018
2. Conjugarea
• Transfer genetic realizat prin contact fizic intre două
bacterii, prin intermediul unor
– pili sexuali (bact Gram neg)
– molecule de adeziune (bact Gram poz)
• are loc intraspecific și interspecific
• Bacterie donor – doar bacteria care conține plasmide
conjugative (conjugoni) = plasmide care codifică structuri și
enzime necesare conjugării și transferului ADN (genele tra)
• factorul F – primul plasmid conjugativ descris
• Fiziologia si efectele conjugării diferă in funcție de
localizarea plasmidului (independent in citoplasmă,
respectiv integrat in cromosom, ca epizom)
29
10/27/2018
30
10/27/2018
Recombinarea genetică
= schimb de gene/fragmente intre două molecule ADN (ex. de la
o bacterie donor și de la bacteria receptor)
• contribuie la creșterea diversității fenotipice a populației
– La eucariote – in cursul meiozei (reproducere sexuată) –
transfer genetic vertical (transfer genetic de la părinți la
descendenți)
– La procariote – transfer genetic orizontal (de la bacterii din
aceeași generație)
• in functie de gradul de omologie dintre cele două secvențe
recombinarea poate fi
– omologă
– neomologă
31
10/27/2018
Recombinarea genetică
• Omologă (legitimă, generalizată)
– se realizează între secvențe cu un grad mare de omologie;
– constă în desfacerea lanțurilor ADN donor și receptor, schimbul
a 1-n alele intre ADN-ul donor și cel receptor și reunirea
moleculelor de ADN
– controlată de genele rec (gene cromosomale)
– reprezintă un mecanism de reparare a ADN d.c.
• Neomologă (ilegitimă)
– recombinare între secvențe de ADN care nu prezintă omologie
– sub acțiunea unor enzime codificate de gene din molecula ADN
donor; ex.
• transpozaze – permit integrarea aleatorie a transpozomului
în cromosomul bacterian
• integraze - realizează integrarea fagului în anumite situsuri
(recombinare situs-specifică)
32