FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y BIOLÓGICAS

REPRODUCCIÓN ANIMAL

TRABAJO DE INVESTIGACIÓN FORMATIVA

ICSI y clonación en yeguas

Integrantes:

Sebastián Carreño

Paloma Ortigosa

Camila Ramos

2018-II
INTRODUCCIÓN:

El campo de la reproducción siempre ha sido uno muy importante dentro del manejo
animal, sobretodo para algunas especies como los equinos por sus usos en
diferentes áreas siendo la principal, el deporte. Por ello, se han creado técnicas de
reproducción asistida (TRA) o biotecnologías de reproducción que se van a centrar
en la colección de folículos y fertilización utilizando diferentes maneras para ampliar
el uso de estos. Las técnicas de reproducción asistida son métodos no
convencionales por los cuales se obtienen potros de yeguas con problemas
uterinos, geriátricas o incluso post-mortem mediante la obtención de ovocitos
viables. De esta manera, los problemas del útero o del oviducto que impiden un
buen transporte y sobrevivencia de los espermatozoides, adecuada fertilización y
consecuentemente transporte del embrión, son sobrepasados. (Velez, 2011)

Las biotecnologías utilizadas en equinos son muy similares a las utilizadas en

humanos. A pesar de que la fertilización in vitro en equinos no haya dado resultado,
existen otras que han tenido mucho éxito como la transferencia de embriones (TE),
la transferencia de ovocitos (TO), la superovulación (SOV), transferencia intra
oviductal de gametos (TIG), inyección intracitoplasmática de espermatozoides
(ICSI), y clonación mediante transferencia nuclear. En este trabajo nos enfocaremos
en ICSI y clonación. (Spermova, 2015)

́ ico de ICSI en equinos está ganando impulso por diversas razones, que
El uso clin
incluyen la posibilidad de tratar muchos casos de infertilidad de hembras y machos,
la obtención de cria
́ s de yeguas jóvenes y en actividad deportiva y la producción de
embriones fuera de la temporada reproductiva fisiológica, es decir, en invierno.
(Spermova, 2015)

La clonación en yeguas se dio a partir del año 2003, luego de la clonación de varias
especies domésticas. Esto fue debido a que esta especie hay un limitado desarrollo
de las técnicas de reproducción asistida clásicas como la maduración de ovocitos y
producción de embriones. Cuando se desarrollaron estas tecnologías, se pudo
obtener crías equinas clonadas exitosamente. (Spermova, 2015)
MARCO TEÓRICO

● ICSI
La inyección intracitoplasmática de espermatozoides o ICSI es, como su
nombre indica, la inyección de un espermatozoide que se obtiene con una
micropipeta en un microscopio con un micromanipulador en el citoplasma de
un oocito maduro (metafase II), que puede obtenerse mediante punción
folicular (in vivo) o post mortem (ex vivo).

Fue desarrollada para casos específicos de infertilidad masculina. El embrión

obtenido puede ser transferido al oviducto de una receptora mediante
laparotomiá o laparoscopia, o cultivado in vitro por siete u ocho dia ́ s hasta
́ cervical, al útero. (Angel D, 2010).
blastocisto para transferirlo, via

Una ventaja importante de ICSI sobre las diferentes técnicas de reproducción

asistida es el uso de semen, que puede ser fresco, refrigerado, congelado, e
incluso liofilizado (desecado).

Es posible descongelar una sola pajilla de semen, diluirla a menor

concentración y re-congelar numerosas pajillas que puedan ser usadas
posteriormente para realizar ICSI. Esto incrementa el número de intentos que
pueden ser realizados con una sola pajilla de semen del reproductor
deseado. (Velez I, 2011).

Ventajas de la ICSI sobre las diferentes TRA

La muestra de semen utilizada para ICSI puede provenir de individuos seniles

o con deficiencias reproductivas ya que la motilidad del espermatozoide no va
a interferir ni disminuir la probabilidad de preñez.

Ya que la fertilización in vitro estándar (combinar los oocitos y los

espermatozoides en una placa de Petri) todavía es inefectiva en el caballo,
ICSI es la única técnica de fertilización in vitro que es exitosa en esta especie
en este momento. Aunque requiere equipos de alto costo como un micro-
manipulador, incubadoras de CO2 y gas mixto y personal experimentado.
(Velez I, 2011)

Al realizar la fertilización en una placa petri, y no ser necesaria la

inseminación ni una aspiración folicular, se reduce el riesgo de endometritis.

Mediante ICSI es posible tratar cada oocito individualmente, hasta que

alcance estado de blastocisto y pueda ser transferido a una receptora, con la
posibilidad que cada uno de ellos genere un potro, mientras que con la TO
son transferidos a receptoras muchos oocitos posiblemente inviables, que no
formarán blastocistos.(Angel D, 2010).
 Proceso

La colección del oocito puede ser de dos maneras, punción folicular (in vivo)
o post mortem (ex vivo).

● Punción folicular: También llamado OPU (Ovum Pick-up), se

utiliza para recolectar ovocitos inmaduros de los folículos
normalmente guiada mediante ultrasonografía a través de la
pared vaginal. Este método no interfiere con la rutina de la
yegua y se puede realizar en cualquier ciclo estral. “Está dirigido
a yeguas con problemas reproductivos (enfermedades de los
ovarios, trompas y útero) también vinculadas a la vejez o con
antecedentes de abortos involuntarios recurrentes”. (Navarro, I)
● Post mortem: Método en el que se recolectan oocitos de
hembras que tuvieron una muerte repentina o serán
eutanaciadas ( para lo cual se realiza la recolección antes de
administrar el agente eutanásico). “Los oocitos deben ser
movidos a una placa de Petri de colección con medio limpio
mientras todos los folículos son cureteados. Al finalizar con la
colección de oocitos estos son puestos en medio de transporte
(EH) y son enviados al laboratorio para maduración y
fertilización”. (Velez I, 2011).
El procesamiento del semen consiste en colocar los espermatozoides en un
gradiente de percoll para disminuir el número de espermatozoides muertos,
luego es centrifugado y colocado en un medio de alta densidad (PVP). Este
medio permite disminuir la velocidad del movimiento de los espermatozoides,
seleccionar uno, fijarlo mediante la aguja del micromanipulador y aspirarlo
desde la cola. El siguiente paso consiste en inyectar el ovocito con el
espermatozoide seleccionado. Luego el ovocito inyectado puede ser cultivado
in vitro o transferido directamente al oviducto de una receptora previamente
acondicionada. (Lossino, L. 2007)

● CLONACIÓN
La clonación es el proceso biotecnológico que permite generar un organismo
genéticamente idéntico a otro. En la actualidad se pueden producir clones de
manera artificial mediante una técnica de micromanipulación llamada Transferencia
Nuclear. Esta técnica consiste en fusionar, mediante un pulso eléctrico, una célula
somática que contiene todos los cromosomas del individuo que se desea clonar con
un óvulo al que previamente se le extrajo el núcleo y que carece de información
genética nuclear. Es decir, mediante la fusión eléctrica, el óvulo sin núcleo (célula
receptora) incorpora el núcleo de la célula del individuo a reproducir (célula
donante). A partir de aqui,́ el núcleo de la célula donante, en su nuevo ambiente
citoplasmático, adquiere la capacidad de reprogramarse y comenzar a dividirse
generando un embrión que es transferido a una hembra receptora en donde
comienza la gestación y dará origen a un individuo nacido o "clon" genéticamente
idéntico al original. (Lossino, 2010)

Se utiliza en caballos que tienen un alto valor económico y prestigio social

como los dedicados al Polo o de competencia ecuestre. Debido a que es una
práctica muy costosa y riesgosa, ya que existen grandes diferencias entre caballos
respecto a la calidad de sus espermatozoides. Además, cuando se utiliza como
fuente de embriones la fecundación in vitro es muy difícil que los espermatozoides
sufren la capacitación espermática con reacción acrosómica sin perder su motilidad,
la disponibilidad de ovocitos de la madre para poder obtener embriones es muy
escasa. Tenemos que señalar que si en ganado vacuno de un ovario podemos
obtener unos 10 ovocitos de clase A, los perfectos para FIV, en yeguas esa cantidad
queda reducida a 2-3 máximo además de la dificultad de detectar los folículos.
(Spermova, 2014)

Inicialmente la clonación fue propuesta como un método para salvar genética

valiosa, sin embargo, hoy en dia ́ , debido a sus fallas y bajo porcentaje de eficiencia,
la técnica puede ofrecer principalmente un modelo biológico para investigación
básica biomédica. Actualmente la tasa de desarrollo de blastocisto in vitro es baja
(entre 1% y 10%), aunque la tasa de preñez después de transferir es un poco mas
alta, se reportan entre 9% hasta 60% de gestaciones exitosas, sin embargo, con los
datos actuales no es posible decir exactamente la proporción de gestaciones de
clones que lleguen a término y produzcan un potro viable. (Angel, 2010)

Ventajas

Las yeguas son una de las pocas hembras de mamíferos que

presentan una senescencia reproductiva a edad muy temprana (14 años).
Esto quiere decir que su vida reproductiva, sobre todo en animales deportivos
de alta performance, que deben competir algunos años sin preñar, es 30%
menor comparada con individuos en condiciones naturales no seleccionados
por lo que su productividad de crías nacidas es mucho menor. Aunque
tengan un perfecto estado de salud, su edad dificulta la reproducción
mediante técnicas convencionales de reproducción asistida como
inseminación artificial y transferencia embrionaria, porque uno de los
problemas con mayor frecuencia que afecta la eficiencia reproductiva son las
alteraciones gaméticas. Si se obtiene una cría por clonación, podría ser
utilizada como reproductora “nuevamente”, se conoce como clonación
reproductiva. (Lossino, 2010)

Otra ventaja es en el caso de los machos, muchos de estos de alta

performance deportiva son castrados. Si estos machos son clonados, los
nuevos potrillos pueden ser mantenidos como machos enteros para utilizarlos
netamente como reproductores y continuar la línea genética. El macho
castrado puede seguir compitiendo mientras su clon es utilizado como
reproductor. (Lossino, 2010)

Proceso

Se toma una muestra de tejido, generalmente fibroblastos y es llevada

al laboratorio refrigerada para cultivar in vitro. Una vez alcanzado el número
de fibroblastos, son removidos y suspendidos en un medio de cultivo y
dividido en varios platos de cultivo, este proceso es llamado pasaje. Luego,
se toma un ovocito maduro (Metafase II) de una yegua con un folículo pre
ovulatorio, otra opción es tomar ovocitos de folículos emergentes de ovarios
de mataderos o yeguas ciclando para ser madurados in vitro. El material
nuclear y el cuerpo polar del ovocito son removidos por micromanipulación,
esta nueva célula sin material genético es llamada ooplasma. A continuación
se toma una célula somática de los cultivos previamente realizados y se
combina con el ooplasma fusionados por pulso eléctrico. Después de la
fusión, el ovocito debe de ser activado aumentando el calcio e inhibiendo a
las proteínas que mantienen al ovocito en metafase. Una vez activado, el
ovocito puede ser transferido al oviducto de una receptora, o cultivado in vitro
hasta blastocisto para ser transferido convencionalmente. Este ovocito debe
reprogramar las funciones celulares (antes de la transferencia de la célula
somática al ovocito, dicha célula está transcribiendo para funciones de piel, si
es un fibroblasto, la reprogramación tiene que ver con cambiar estas
funciones por otras relacionadas al desarrollo embrionario). Si la
reprogramación es defectuosa, puede que no se desarrolle la gestación o que
el potro muera prematuramente. (Angel, 2010)

Factores que afectan la transferencia nuclear

Un individuo que es clonado, no es una copia exacta del individuo del

cual se originó. Existen diferencias en la expresión génica y en el ambiente
que generan diferencias fenotípicas entre ellos. Existen 3 mecanismos que
explican estas diferencias:

● ADN mitocondrial: El embrión logrado por clonación tendrá ADN

nuclear del donador pero también ADN mitocondrial del ovocito
receptor. La mitocondria posee su propio pequeño genoma que
codifica en 13 de las 3.000 protein ́ as estimadas que codifican en su
función, el impacto de esto es aún desconocido.
● Ambiente: El fenotipo del feto será afectado por el ambiente uterino y
la salud de la receptora durante la gestación, también será afectado
luego del nacimiento (producción de leche materna, contacto con
personas, entrenamiento, alimentación, etc). El ADN es heredado,
 pero el fenotipo es la consecuencia de la interacción de genes y
ambiente.
● Factores epigénicos: Son los que regulan el funcionamiento de los
genes, por ejemplo, algunos genes pueden apagarse y no expresarse
y al contrario, otros pueden expresarse.
CONCLUSIONES

● El método ICSI se creó para desarrollarlo en animales con problemas

fisiológicos o patológicos reproductivos.
● La ICSI es un método de alto costo, por lo que está dirigido a animales de
alto valor genético y económico.
● Se necesita un solo espermatozoide para el cultivo en esta técnica, lo que
permite diluir el contenido de una pajilla de semen, guardarlo en varios
depósitos y re-congelarlo para un futuro uso.
● El uso de ICSI reduce el riesgo de endometritis pues la fertilización se realiza
en una placa petri hasta que alcance estado de blastocisto.
● La clonación inicialmente fue un proceso para salvar genética valiosa, sin
embargo debido a sus fallas y bajo porcentaje de eficiencia, se utiliza hoy en
dia para investigación biomédica.

● TN tiene alto riesgo de que los espermatozoides pierdan la motilidad por los
procesos in vitro.

● En clonación la tasa de desarrollo de blastocisto in vitro es entre 1% y 10% y

la tasa de preñez después de transferir es entre 9% hasta 60% de
gestaciones exitosas.

BIBLIOGRAFÍA

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● Velez K. Técnicas de reproducción asistida en caballos. [Internet].

Redalyc.org. 2018 [cited 21 October 2018]. Available from:
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● Angel D, Bran J. Reproducción asistida en equinos: aportes desde la teoría

[Internet]. Revistas.ces.edu.co. 2018 [cited 21 October 2018]. Available from:
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● [Internet]. Navarro A, Garcia M. Punción folicular guiada por medio de

ultrasonografia. Disponible en: http://www.equisan.com/images/pdf/opu.pdf