INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS

BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE
METODOS DE ANALISIS

ESTUDIO DE ALGUNOS FACTORES

QUE AFECTAN EL
ESTABLECIMIENTO DE UN
MÉTODO ESPECTROFOMÉTRICO

GRUPO: 5QV2
INTEGRANTES:
CHAVEZ RICO PABLO
 “Estudio de algunos factores que afectan el establecimiento de un método
espectrofotométrico”
OBJETIVOS.
 Identificar puntos críticos de un método espectrofotométrico.
 Reconocer parámetros que afectan el análisis espectrofotométrico.
 Identificar condiciones óptimas para un análisis espectrofotométrico, para la
cuantificación de un mensurando, el ion férrico (3+), utilizando como
cromógeno iones tiocianato.
1
RESULTADOS.
CURVA TIPO
Se realizo una curva tipo para determinación de iones férricos, utilizando iones
tiocianato como cromógeno, los resultados se exponen en la tabla 1 y figura 1.
Tabla 1. Resultados de absorbancia para los tubos preparados, con
el fin de obtener la curva tipo de Fe3+. Tambien se observa el límite
de detección. Que fue obtenido a partir de estos datos
Tubo Fe3+ A ajustada por (y-yi)2 **
A 480 nm
No. (µM) regresión lineal
1 2.08 0.016 0.0368500 0.0004347
2 6.25 0.055 0.0743500 0.0003744
3 12.50 0.118 0.1306000 0.0001588
4 20.83 0.193 0.2056000 0.0001588
5 31.25 0.305 0.2993500 0.0000319
6 41.67 0.401 0.3931000 0.0000624
7 52.08 0.512 0.4868500 0.0006325
8 62.50 0.616 0.5806000 0.0012532
9 72.92 0.700 0.6743500 0.0006579
10 83.33 0.765 0.7681000 0.0000096
11 104.17 0.966 0.9556000 0.0001082
12 145.83 1.288 1.3306000 0.0018148
13 229.17 1.706 2.0806000 0.1403252
SUMA 0.1460223
Sb=S y/x 0.1208396
LDD 0.3806188
**Columna extra obtenida para determinar el LDD
Cálculos de concentración de iones férricos y LDD
 2 .0

1 .5
A 480 nm

1 .0

0 .5

0 .0
0 50 100 150 200 250
Fe3+ µM

Figura 1. Curva tipo de la concentración µM de iones férricos, considerando todos los puntos
obtenidos durante el análisis. Se puede observar que se tiene un buen coeficiente de correlación
sin embargo el último punto causa que el error aumente.

1 .5

1 .0
A 480 nm

0 .5

0 .0
0 50 100 150
Fe3+ µM
Figura 1.1 Curva tipo de la concentración µM de iones férricos, sin considerar el último punto. Se
puede observar que se tiene un mejor coeficiente de correlación, aumentando la sensibilidad del
método, esto es definido por la pendiente
DETERMINACIÓN DEL ERROR FOTOMÉTRICO POR EL MÉTODO DE
RINGBOM
Después de obtener la curva tipo, junto con las concentraciones micromolar del ion férrico
se realizaron otra serie de cálculos para obtener el porcentaje de error fotométrico por el
método de Ringbom, los resultados se citan enseguida.
Tabla 2. Resultados del método de Ringbom para la
determinación del error fotométrico
Tubo Fe3+ Log
A 480 nm %T absortancia
no. µM [Fe3+]
1 2.08 0.318 0.016 96.38 3.617
3
2 6.25 0.796 0.055 88.10 11.895
3 12.5 1.097 0.118 76.21 23.792
4 20.83 1.319 0.193 64.12 35.879
5 31.25 1.495 0.305 49.55 50.455
6 41.67 1.620 0.401 39.72 60.281
7 52.08 1.717 0.512 30.76 69.239
8 62.5 1.796 0.616 24.21 75.790
9 72.92 1.863 0.700 19.95 80.047
10 83.33 1.921 0.765 17.18 82.821
11 104.17 2.018 0.966 10.81 89.186
12 145.83 2.164 1.288 5.15 94.848

% Ep= 2.79%
Cálculos del método de Ringbom
 100

A B S O R T A N C IA 80

60

40
4

20

0
0 .0 0 .5 1 .0 1 .5 2 .0 2 .5

L o g [F e 3 + ]

Figura 2. Grafica de Ringbom, en donde se puede observar una linealidad a partir del punto
4, hasta el tubo 10

100

80
A B S O R T A N C IA

60

40

20

0
0 .0 0 .5 1 .0 1 .5 2 .0 2 .5
L o g [F e 3 + ]

Figura 2.1. Porción de la gráfica de Ringbom donde el análisis espectrofotométrico

mantiene una linealidad ideal, es decir es altamente sensible, con un coeficiente de
correlación con un valor de 0.9995.
 EFECTO DEL TIEMPO SOBRE LA ESTABILIDAD DEL COLOR.
Tambien se evaluó el tiempo de estabilidad del color, por lo cual se realizó un ensayo en
donde se leyó la absorbancia del tubo problema cada 30 minutos obteniendo lo siguiente.

Tabla 3. Resultados del ensayo del 0 .5 5

estudio de la estabilidad del color
en función del tiempo.
Tiempo
A 480 nm 0 .5 0
(min) 5

A 480 nm
0 0.544
30 0.505
0 .4 5
60 0.468
90 0.444
120 0.420
0 50 100
T ie m p o (m in )

Figura 3. Efecto del tiempo sobre la estabilidad de color,

se observa que a partir del tiempo 0, no hay estabilidad

EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL CROMOGENO SOBRE LA DETERMINACION

DE IONES FERRICOS (Fe3+)
Tambien se evaluó el efecto de la concentración del cromógeno, en donde en cada tubo
preparado se fueron cambian las concentraciones del ion tiocianato SCN-, estos fueron los
resultados.

Tabla 4. Resultados del efecto de la concentración

de cromógeno sobre la determinación de iones
férricos
𝐒𝐂𝐍−
Fe 3+
TUBO SCN- µM 𝐅𝐞𝟑+ A 480 nm
µM
1 5000 62.5 80 0.258
2 15000 62.5 240 0.399
3 50000 62.5 800 0.525
4 100000 62.5 1600 0.646
5 150000 62.5 2400 0.684
6 200000 62.5 3200 0.735
7 250000 62.5 4000 0.739
Cálculos realizados
 0 .8

0 .6
A 480 nm

0 .4
6

0 .2
0 1000 2000 3000 4000
S C N - /F e 3 +

Figura 4. Efecto de la concentración de tiocianato (SCN-), utilizado como cromógeno en la

determinación de iones férricos Fe3+.
EFECTO DE pH SOBRE LA REACCIÓN ENTRE EL ION FERRICO Y EL ION
TIOCINATO.
Otro parámetro evaluado durante esta práctica fue el efecto del pH sobre el desarrollo del
color, que se origina por la reacción entre iones férricos y iones tiocianato, estos fueron
los resultados.
Tabla 5. Resultados del efecto
del pH sobre la reacción entre
el ion férrico y el ion tiocianato
Tubo pH A 480 nm
1 .0
1 0 0.843
2 1 0.934
0 .8
3 2 0.938
4 7 0.009
A 480 nm

0 .6
5 8 0.005
0 .4

0 .2

0 .0
0 2 4 6 8
pH

Figura 5. Efecto del pH sobre el desarrollo del color, podemos

observar que a pH ácidos la reacción colorida para determinar
iones férricos, utilizando tiocianato, no afecta de manera tan
significativa como a pH alcalinos
EFECTO DE ALGUNOS ANIONES SOBRE LA REACCION.
Este es el último factor que fue evaluado, la presencia de aniones sobre el desarrollo del
color y, por ende, en la determinación de iones férricos los resultados fueron los siguientes.
Tabla 6. Resultados del efecto de diferentes
aniones sobre la reacción entre el analito (Fe3+) y
el cromógeno(SCN-)
A 480
ANION A 480 final ΔA 480
inicial 7
TARTRATO 0.911 0.904 0.007
FOSFATO 0.902 0.85 0.052
FLUORURO 0.913 0.232 0.681
OXALATO 0.915 0.145 0.77

A 4 8 0 in ic ia l
A B S O R B E N C IA 4 8 0 n m

0 .8
A 4 8 0 fin a l

0 .6

0 .4

0 .2

0 .0
O O
T T
A A
R F
T S
R O
A F
T L
F
O O
R T
U A
R L
O A
X
U O

A N IÓ N

Figura 6. Efecto de algunos aniones sobre la reacción del mensurando y el cromógeno, en

orden creciente, el ion tartrato causa menos interferencia que el ion oxalato.
Tabla 7. Resultados generales de los parámetros ideales para la determinación de iones
Fe3+, utilizando como cromógeno SCN-.
Parámetro Valor optimo
pH 2
Tiempo Al instante (0 minutos)
Concentración de iones SCN- 40000
(RELACION)
Límites de concentración con % Ep 20.83-72.92 µM
minimo
 Aniones que interfieren (en orden Tartrato<Fosfato<<Fluoruro<Oxalato
creciente)
Límite de detección del método. LDD 0.380

DISCUSIÓN DE RESULTADOS EXPERIMENTALES.

Uno de los trabajos más importantes de un químico analista es saber y comprender distintos
factores que afectan un análisis espectrofotométrico, en donde se ven parámetros básicos
que no son muy difíciles de comprender para la determinación de un mensurando o un
analito en particular.
Para poder conocer en que rangos trabajar debemos conocer dos parámetros importantes 8
el límite de detección y el límite de cuantificación para lo cual en nuestra practica solo se
determinó el límite de detección (LDD), el cual se define como la mínima señal detectada
del analito por el equipo y que puede ser distinguida del error, si observamos la tabla 1,
podemos decir que el límite de detección para nuestro caso es de 0.380, es decir,
absorbancias por debajo de 0.380 no son confiables ya que puede representar valores que
no corresponden al analito y por ende tienen muchos factores que pueden causar
interferencias originando errores.
Ahora bien generalmente a concentraciones menores o concentraciones mayores, la
relación que existe entre concentración y absorbancia es afectada, por lo cual en estas
regiones de la curva es poco favorable trabajar, ya que no siguen la ley de Bouguer-
Lambert-Beer, la cual nos dice que la absorbancia es directamente proporcional a una
concentración determinada, pero tambien nos indica que bajas y altas concentraciones no
se recomienda trabajar esto debido a que la ley mencionada con anterioridad es una ley
limite, a altas concentraciones, se originan desviaciones negativas debido a que a estas
concentraciones la distancia media de las moleculas es tan pequeña que cada una afecta
la distribución de cargas vecinas afectando directamente la capacidad de absorción a
determinadas longitudes de onda las concentraciones recomendadas son de 0.01 Mol/L.
Esto no sucede a bajas concentraciones, sin embargo tambien a bajas concentraciones
aumenta el error y no se sigue la ley ya mencionada, esto se da gracias a que debido a que
la distribución de las moleculas puede afectar la interacción con la radiación en un tiempo
dado, de tal manera que el sistema puede confundir la señal del analito como si se tratara
del blanco, por lo cual se determinó el LDD ya mencionado, con lo cual podemos conocer
a que concentraciones de Fe3+ no habrá interferencias o errores. Por lo cual en la figura 1
y 1.1, se grafican en cada uno una curva tipo, en donde podemos distinguir claramente 13
puntos en la figura 1, este último punto tiene presenta una desviación negativa, por lo cual
lo eliminamos (figura 1.1) y se observa el aumento del coeficiente de correlación.
Otro parámetro que se estudio fue el error fotométrico utilizando el método de Ringbom el
cual no solo nos proporciona este parámetro si no que a su vez nos arroja el intervalo de
concentración donde existe un error muy pequeño. En este método como podemos
observar en la figura 3 se tiene un gráfico de absortancia contra el logaritmo base 10 de la
concentración de iones férricos, el grafico presenta una forma sigmoide típica del método
de Ringbom, este método tiene la peculiaridad de que en una parte de la sigmoide presenta
“linealidad” la cual nos presenta en que intervalos de concentraciones el error es minino, y
bueno es este caso el error fotométrico mínimo es de 2.79% y la sensibilidad del método es
muy alta por lo cual el más mínimo cambio de concentración será detectado, y es muy
importante en el análisis de muestras ya que de nada nos sirve tener un buen químico, si
la técnica empleada no ofrece resultados confiables para determinar ese analito, este
intervalo se puede observar entre el tubo 4 al tubo 9, las concentraciones a las que
corresponden estos tubos podemos verlas de rojo en la tabla 2, mientras que la gráfica de
Ringbom y la región en donde existe el mínimo error fotométrico se pueden observar en la
figura 2 y 2.1, respectivamente.

En cuanto al tiempo de estabilidad del complejo formado se sabe que la reacción que ocurre
entre el ion férrico y el ion tiocianato da origen al complejo hexakis(tiocianato)ferrato (III)
FeSCN[FeSCN]6+, se trata de una reacción reversible en donde tambien conoces que
inmediatamente de que se forma el complejo, existen otras moleculas que están sufriendo
una separación, por lo observado en la tabla 3 y en la figura 3, podemos observar que el 9
tiempo en el cual se debe leer los tubos es inmediatamente después que se le agrega el
cromógeno o el analito dependiendo que tengas en tus tubos de preparación, y bueno la
estabilidad tiene mucho que ver con la reversibilidad de la reacción, que depende de una
gran variedad de parámetros, como la concentración de los iones, temperatura a la cual se
realiza la reacción, etc, pero de manera particular podemos deducir que en cuanto al
complejo estudiado en esta práctica es prácticamente inestable, se pierde en el momento
0, es decir al mismo tiempo que se forma se revierte esa formación, puede explicarse con
el coeficiente de reacción Qc, que a su vez procede de la ecuación para la obtención del
coeficiente de equilibrio Kc, y bueno este coeficiente de reacción nos indica que si el
coeficiente de equilibrio es menor que el coeficiente de reacción los productos generados
en una reacción en equilibrio deben transformarse en reactivos y la reacción neta procede
a la izquierda. Por los datos obtenidos podemos decir que la reacción neta tiende hacia los
reactivos, por lo cual, si se desea realizar un análisis cuantitativo de iones férricos, utilizando
como cromógeno aniones tiocianato las lecturas de absorbancia se deben obtener
inmediatamente después de mezclarlos.
El siguiente factor estudiado fue la concentración de tiocianato que se utilizó como
cromógeno, y bueno sabemos que el cromógeno, es una molécula que es capaz de
reacción con el analito y es capaz de absorber energía a determinada longitud de onda de
la región visible del espectro electromagnético generalmente estos cromógenos poseen una
“complejidad” en cuanto a su arquitectura molecular es decir, es contiene muchos
electrones deslocalizados que le confieren esta capacidad de absorción de energía, sin
embargo en nuestra práctica se estudió como cromógeno un cromógeno que nos originan
un compuesto de coordinación que a pesar de carecer de dobles enlaces, es capaz de
absorben energía por la cantidad de electrones que se encuentran en él, adema de que el
fierro confiere colores muy llamativos, en nuestra experiencia podemos observar en la figura
4 que a mayor concentración de cromógeno la interacción la absorbancia serán mayores
y bueno esto tiene lógica ya que a mayor concentraciones, se darán más colisiones o
choques efectivos que originaran las formación de complejos que podrán sr detectados por
el equipo, lo mismo sucede de lado contrario entre menos cromógeno tengas, menos
colisiones efectivas, que se traduce en menos absorbancia.
Continuando con los factores estudiados se puede observar en la tabla y grafica 5, los
resultados. El valor óptimo de pH es de 2.0, esto sucede básicamente al pKa del ácido
tiociánico que es de 0.89, es decir que a valores de pH por debajo de este el ácido se
encontrara totalmente proto nato y será difícil que done su protón, por lo cual no se forma
el complejo y no se observa absorbancia máxima, pero a valores un poco mayores la
absorbancia aumenta considerablemente, de pH 0 al 1, lo cual quiere decir que ya existen
mayores iones tiocianato para formar el complejo, sin embargo a pH, se observa el máximo
de absorción porque, es justo ahí donde se llevan mayores colisiones entre el analito y el
cromógeno estudiado. Por otro lado, a pH elevados, con una gran concentración de álcalis,
a 7 y 8 la interferencia es considerablemente grande ya que el color prácticamente
desaparece, dando absorbancias prácticamente nulas, esto se produce ya que los iones
hidroxilo secuestran prácticamente todos los iones férricos, dando origen al hidróxido de
fierro que necesita de al menos 3 de estos iones, y resulta lógicas estas absorbancias
porque prácticamente todo el analito fue desplazado a los iones hidroxilo.
Como último factor es determinar que la matriz en donde se encuentra disuelto mi analito
no contenga iones que puedan interferir en el análisis, y si los existen y no se pueden
purificar, al instante o si la purificación destruye a mi analito debemos elegir uno que en el 10
cual haya la menor interferencia posible en la cuantificación del mensurando, algunos
aniones estudiados fueron el oxalato y iones fluoruro que en ese caso, muestran
interferencia, que podríamos decir no es tan considerable la interferencia, pero esto porque
sucede y bueno la explicación surge en las propiedades químicas de estos aniones, el
fluoruro y el oxalato interaccionaron de manera más eficaz con el ion amonio que con el
propio fierro, además de que el oxalato es un anión que forma sales más estables con el
fierro, solo en presencia de potasio, formando complejos de coordinación, por otro lado el
anión fluoruro no requiere de más electrones a su al rededor debido a que ya posee su
octeto. Por otro lado, el fosfato monoácido y el tartrato fueron sales en las cuales se observó
un efecto hipocrómico bastante considerable, debido a que se trata de aniones que poseen
gran afinidad por los iones férricos, formando compuestos probablemente insolubles que
hacen que se pierda completamente la interacción del cromógeno con el analito.
CONCLUSIONES

 El estudio y conocimiento de los factores que afectan un método

espectrofotométrico es de gran importancia en la determinación de un mensurando.
 Se debe trabajar en los intervalos de concentración en donde el error fotométrico
sea mínimo, y si algo resulta erróneo, es por atribuciones al analista o instrumentos
y no al equipo.
 Si todos los factores están dentro de parámetros establecidos y conocidos, se
emitirán resultados confiables que se traducirá en resultados con calidad.

BIBLIOGRAFIA

 Coronas-Ceresuela J. (2013) Química básica para ingenieros. Ed. UNE. España.

Pp. 223
 Fuentes-Arderiu X, Castiñeiras-Lacambra M.J, Queraltó-Compañó J.M. (1998)
Bioquímica Clínica. Ed. Reverte S.A; España. Pp. 196
 Reacciones reversibles. Aspectos prácticos del equilibrio químico. Disponible en
https://goo.gl/3XqesF (consulta 04/2018).
 UANL. (2011). Determinación de hierro con 1.10 fenantrolina. Disponible en
https://goo.gl/Am5oZm (consulta 04/2018).