Carbohidratos en microalgas: determinación comparativa por TLC, LC-MS sin

derivación, y el método fotométrico de timol-ácido sulfúrico

Los carbohidratos de algas se investigan para muchas aplicaciones potenciales, por

ejemplo, energías renovables o humanos productos de salud, lo que revela la necesidad
de diferentes métodos analíticos adecuados para el uso respectivo. En este estudio, Se
examinaron 46 especies de microalgas por su contenido y composición de
carbohidratos. Un método TLC con Las placas de gel de sílice impregnadas con
Na2HPO4 y un método de LC-MS se desarrollaron y validaron para fines cualitativos y
análisis cuantitativo de monosacáridos. La biomasa de algas se hidrolizó con HCl, se
purificó con anión SPE / intercambio de cationes y analizado en placas de gel de sílice
con diferentes sistemas de disolventes. Por comparación, el mismo las muestras se
separaron sin derivación en una columna HILIC. Para el contenido total de
carbohidratos, una fotometría se usó el método de timol-ácido sulfúrico y valores entre
16.5% (Mychonastes sp.) y 71.6% (Porphyridium purpureum) mostró la alta
variabilidad del contenido de azúcar en las diferentes algas. Con el método TLC, rápido
y la separación simple y la estimación cualitativa de los ocho monosacáridos principales
en los hidrolizados de algas fue posible. Los resultados indicaron que la glucosa estaba
presente en cada alga filtrada, la presencia de galactosa, manosa, ramnosa, arabinosa,
xilosa, ribosa y fucosa dependían de las especies analizadas. En comparación, el El
método LC-MS reveló la presencia de los mismos monosacáridos. La glucosa era el
principal monosacárido con un contenido dependiente de la especie entre 5.6% y 66.8%.
Se detectaron manosa, galactosa, ramnosa y xilosa en la mayoría de las especies de
algas en cantidades más altas (hasta 15%, 7%, 3% y 17%, respectivamente). Arabinosa,
ribosa y fucosa solo estuvieron presentes en concentraciones más bajas (<5%).
En resumen, una comparación de los diferentes métodos reveló que el método TLC es
una simple evaluación
método para detectar los componentes principales de los carbohidratos de algas. Para la
cuantificación de los azúcares individuales
el método LC-MS y para la determinación de los carbohidratos totales el método
colorimétrico de timol-ácido sulfúrico
son más adecuados.

hidrólisis de los polisacáridos, pero evite demasiada degradación de

monosacáridos [6]. Otro enfoque prometedor para evitar la formación
de productos de degradación como furfural o hidroximetilfurfural es
escisión selectiva de polisacáridos de algas por hidrólisis enzimática [7].
Después de una hidrólisis exitosa, el análisis de carbohidratos es muy complejo
campo. Se desarrollaron muchos métodos para determinar los aspectos cualitativos y
composición cuantitativa de carbohidratos de matrices complejas. Para la cuantificación
del contenido total de carbohidratos, algunos procedimientos colorimétricos
como fenol- [8] o métodos basados en antronas [9] están disponibles, dando
resultados buenos y robustos con poco esfuerzo en muy poco tiempo. El problema
de estos métodos es la pobre selectividad analítica. Información detallada
sobre la composición de monosacáridos no se puede generar. por
investigaciones cualitativas detalladas, algunos métodos de TLC [10, 11] con
materiales de separación a base de sílice están establecidos. Estos abren el

oportunidad de identificar monosacáridos incluso en mezclas complejas.

Sin embargo, la resolución de separación de algunos métodos de TLC sigue siendo
deficiente
debido a la estructura muy similar de muchos carbohidratos. Impregnación
de placas de TLC con sales inorgánicas como hidrógeno disódico
el fosfato [12] o el ácido bórico [13] también pueden mejorar la resolución
como el uso de la cromatografía de capa fina de alto rendimiento (HPTLC)
placas [14]. Aunque la separación de la mayoría de los monosacáridos puede ser
exitosa, la cuantificación con los métodos de TLC no es posible. por
cuantificación precisa de monosacáridos, métodos analíticos tales como
los métodos de cromatografía de gases [15,16] y HPLC [17] se utilizan con frecuencia.
Algunos estudios sobre la composición de carbohidratos en algas, determinados con
Los métodos de HPLC están disponibles [18]. La mayoría de los métodos tienen un
elemento esencial
paso de derivatización para mejorar el rendimiento y la detección de la separación
sensibilidad [19]. La derivatización de muestras a menudo es compleja, costosa
y una fuente de errores analíticos, evitar esto podría mejorar
el uso de HPLC para el análisis de carbohidratos.
Ha habido pocos intentos en la literatura actual de usar HPLC
análisis de carbohidratos con muestras no derivadas. Un estudio informó
el uso de columnas basadas en ciclodextrina para oligosacáridos no derivatizados
[20], otro la separación de algunos monosacáridos con anión
cromatografía de intercambio [21], o para algunos mono y oligosacáridos
[22] con HILIC (cromatografía líquida de interacción hidrófila)
columna. De hecho, las columnas de HILIC parecen ser prometedoras para los
carbohidratos
separación porque diferentes compuestos polares se pueden analizar con este
método [23]. Sin embargo, la resolución de separación [24,25] generalmente parecía
ser más bajo sin derivatización, pero con detección de MS, bueno
se pueden lograr sensibilidades [25].
El objetivo de este estudio fue el análisis de los carbohidratos
composición en varias especies de algas con diferentes métodos: un TLC
método para cualitativo rápido y fácil y cuantitativo aproximado
análisis, un método de HPLC sin derivatización para la caracterización de
composición de monosacáridos y un método fotométrico para un total rápido
cuantificación de sacáridos.

2. Métodos
2.1. Cultivo
Cultivo y cosecha de 46 especies de algas se realizó como
descrito previamente [26]. Especies analizadas con números de cepas y
origen se muestran en la Tabla 2.
2.2. preparación de la muestra
Se llevaron a cabo experimentos preliminares para optimizar la hidrólisis
procedimiento: Scenedesmus obtusiusculus A189 biomasa se hidrolizó para
1, 2 y 4 h con 1, 2, 4 y 6 N HCl a 100 ° C. Los hidrolizados fueron
analizado con TLC. Intensidades de mancha de monosacáridos de los diferentes
hidrolizados se compararon y los cromatogramas examinados para el
presencia de otros puntos.
Para el análisis de azúcar, una cantidad de 20 mg de biomasa de algas liofilizada
se hidrolizó con 1 ml de HCl 2 N durante 2 ha 100 ° C. Luego, el
la muestra se diluyó con 4 ml de agua desionizada y se filtró a través de un
Filtro de jeringa de 0.22 μm (Roth, Alemania). 2.0 mL de la muestra fue
lavados cartuchos SPE de intercambio catiónico / aniónico (Strata® ABW,
Phenomenex®, EE. UU.) Para eliminar el ácido y las proteínas restantes. los
cartucho fue enjuagado con 2.0 ml de agua desionizada para garantizar cuantitativa
elución de los carbohidratos. Las muestras se almacenaron a 4 ° C hasta
análisis.
2.3. Análisis TLC
Para el análisis de CCF [12, modificado], placas de gel de sílice de 20 × 20 cm
(Merck, gel de sílice 60 GF254) se impregnaron sumergiéndose en
15 minutos en 250 ml de una solución de Na2HPO4 0,2 M en agua destilada.
Posteriormente, las placas se secaron a 22 ° C y 40% de humedad relativa

(controlado por aire acondicionado) en una campana extractora durante la noche. 10 μL

de
las muestras se aplicaron en bandas de 5 mm de ancho con una jeringa de microlitros.
Las bandas estaban espaciadas a 10 mm de distancia, una distancia de 10 mm era
mantenido a los bordes izquierdo y derecho, y 15 mm de distancia a la
borde inferior de la placa. La distancia de separación fue de 17 cm. Dos
Se utilizaron diferentes fases móviles: a) acetato de etilo: n-propanol: acético
ácido: agua (2: 4: 2: 1 v / v / v / v) yb) acetonitrilo: agua: ácido acético
(91: 12: 6 v / v / v). Las placas de TLC se desarrollaron de la siguiente manera: a) - b) -
a) (desarrollo I) o a) - a) (desarrollo II). El desarrollo fue
realizado en cámaras gemelas (VWR, Alemania). Cámara
la saturación se logró mediante la adición de un cartón de filtro (10 × 20 cm) en
un canal con 40 mL de fase móvil durante 30 min. Fase móvil de 40 mL
se llenaron en el segundo canal y se usaron para el desarrollo de TLC.
Entre los desarrollos, las placas se secaron cuidadosamente en un humo
capucha.
Para la detección, las placas se secaron a temperatura ambiente en un humo
campana, rociada con aproximadamente 20 ml de una solución de 2 g L-1
timol en ácido sulfúrico metanólico al 10% (v / v) y calentado a 100 ° C durante
30 minutos. Después de enfriar durante 1 h, las placas de TLC se digitalizaron y el
spots analizados con UVP Vision WorksLS Adquisición y Análisis
Software (UVP, Upland, EE. UU.). La calibración se realizó con una mezcla de
ocho monosacáridos (glucosa, galactosa, manosa, ramnosa, arabinosa,
xilosa, ribosa y fucosa) que se trató de la misma manera que
muestras y se aplicó a las placas de TLC. Para cada placa individual,
Se registraron líneas de calibración separadas aplicando 1, 2 y 4 μL de
la mezcla de sacáridos. Una mancha del mismo tamaño que las manchas de azúcar en
la parte superior de la placa TLC se utilizó como blanco. Calibración separada
para cada placa de TLC era necesario debido a las ligeras diferencias en
color de fondo después de pulverizar y calentar la placa.

2.4. Análisis LC-MS

La siguiente configuración del instrumento se utilizó para el análisis: Shimadzu
LC-20 AD Cromatógrafo de líquidos con el automuestreador SIL-20AHT y
Horno de columna CTO-10AS (ajustado a 20 ° C). Una columna HILIC (LUNA®
HILIC
250 × 4.6 mm, Phenomenex®, EE. UU.), Conectado a un guardia HILIC
columna (Phenomenex®, EE. UU.) para la separación. Como fase móvil
Una solución de formiato amónico 0,2 M y como fase móvil acetonitrilo B
con 0,2% de ácido fórmico. El gradiente fue el siguiente: tiempo
0-2 min 88% B, a 27 min 60% B, a 30 min 50% B, 30-40 min 50% B,
a 41 min 88%, 41-50 min 88% B. La detección fue realizada por APCI-MS
análisis (espectrómetro de masas Shimadzu LCMS-8030 Liquid Chromatograph,
Shimadzu Co., Kyoto, Japón). Tres SIM diferentes (ion seleccionado
monitoreo) en modo de ionización negativa se midieron: m / z = 149
(pentosas), m / z = 163 (desoxicohexosas) ym / z = 179 (hexosas).
Primero, ocho monosacáridos (rib, xyl, ara, rha, fuc, man, gal y
glc) se analizaron individualmente para identificar los tiempos de retención de la
pico único. Una mezcla de azúcares se trató como las muestras de algas
(ver arriba) y utilizado para la calibración. Para el análisis de los hidrolizados de algas,
Se diluyeron 300 μL de las muestras preparadas (ver Sección 2.2)
con 700 μL de acetonitrilo. Para el análisis de las hexosas, 5 μL de la sustancia diluida
muestras inyectadas, y 25 μL de las muestras diluidas para el
otros azúcares, respectivamente.
Los datos se analizaron con LabSolution (Shimadzu) usando el
aplicación de integración de pico manual. Para el análisis cuantitativo, el pico
se usaron áreas de un pico de cada azúcar (ver Fig. 3) para la calibración
y cuantificación en los hidrolizados de algas.
2.5. Carbohidratos totales
El contenido total de carbohidratos se analizó con el timol sulfúrico
método ácido [27] como se describió previamente [26]. 100 μL de
las muestras preparadas (ver Sección 2.2) se diluyeron con 900 μl de destilación
agua. La calibración se realizó con soluciones de glucosa en concentraciones
de 0.01-0.1 g L-1. Los valores en blanco se prepararon con 100 μL
agua destilada. 100 μL de muestras diluidas, soluciones de calibración o

agua destilada (en blanco), se agregaron a 300 μL del reactivo de timol

(1 g de timol L-1 en ácido sulfúrico concentrado).
2.6. Validación
El proceso de validación de los tres métodos se llevó a cabo como un
protocolo de control interno para asegurarse de que todos los métodos fueran aplicables
para el análisis de carbohidratos en la biomasa de algas. El procedimiento de validación
se realizó según lo sugerido por AOAC [28] y la Comisión Europea
[29]. La biomasa A189 de Scenedesmus obtusiusculus ("biomasa de prueba") fue
utilizado para el proceso de validación La Tabla 1 contiene un resumen de la
parámetros utilizados.
2.6.1. Precisión del método
Se prepararon seis muestras independientes de la biomasa de prueba y
analizado con los diferentes métodos. El azúcar simple (TLC y LC) o
se calculó el contenido total de carbohidratos (método de timol-ácido sulfúrico)
para cada muestra Después del cálculo de la media y estándar
desviación (SD), la precisión del método se calculó como estándar relativo
desviación (RSD) según la siguiente ecuación:
RSD
Dakota del Sur
media
[%] = × 100 (1)
2.6.2. Límite de detección / cuantificación
La determinación se basó en la relación señal / ruido. Para LC
método, se inyectaron 5 μL de un blanco que contenía un 70% de acetonitrilo
veces. Para cada ejecución, la diferencia entre el pico más alto y el más bajo fue
calculado. Se utilizó la media de los seis valores más 3,3 veces la SD
para el cálculo del límite de detección (LOD). La media de los mismos seis
valores más 10 veces SD se utilizó para el cálculo del límite de
cuantificación (LOQ). Para TLC y el método de timol-ácido sulfúrico, media
y SD de seis valores en blanco (ver Secciones 2.3 y 2.5) fueron utilizados para
cálculo de LOD y LOQ.
2.6.3. Linealidad
Para el método TLC y LC, se utilizaron tres líneas de calibración de 6 puntos
registrado para cada monosacárido cuantificado. Regresión lineal del
la línea de calibración media reveló la linealidad (R2). Para carbohidratos totales
contenido (método del timol), diez líneas de calibración de 6 puntos (ver Sección 2.5)
se registraron, se calculó R2 de la línea de calibración media.
2.6.4. Tasa de precisión / recuperación
Para la investigación de la precisión, la tasa de recuperación (RR) de spiked
muestras fueron analizadas Para el análisis TLC, 20 mg de la biomasa de prueba
se mezcló con las siguientes cantidades de cada monosacárido: glc
6.7 o 1.7 mg; hombre 2.9 o 0.8 mg; gal 2 o 0,6 mg; ara 0,9 o 0,1 mg; rha
0.9 o 0.3 mg; fuc 0,2 o 0,1 mg; xil 100 o 50 μg; costilla 70 o 40 μg. por
el análisis LC-MS, la biomasa de prueba se mezcló con 0.5 o 1.0 mg de cada

azúcar (dos repeticiones por cantidad). Se prepararon muestras enriquecidas y

analizado como las muestras no enriquecidas. Después de la cuantificación de cada uno
azúcar, la tasa de recuperación se puede calcular con la siguiente ecuación:
RR
CC
do
[%] =
-
× 100 1 2
3 (2)
(Contenido de azúcar C1 en muestras enriquecidas [mg]; contenido de azúcar C2 en
muestras no enriquecidas)
muestra [mg], y cantidad enriquecida en C3 [mg]). Para timol-sulfúrico
método ácido, se mezclaron 10 mg de biomasa de prueba con 3 mg o 1 mg de
los monosacáridos antes mencionados (análisis por separado para cada
azúcar, tres réplicas cada uno). El contenido total de carbohidratos se calculó
para muestras enriquecidas y no enriquecidas y los RR calculados de acuerdo con
Eq. (2)
3. Resultados y discusión
3.1. Hidrólisis
El procedimiento de hidrólisis se desarrolló con biomasa del verde
algas Scenedesmus obtusiusculus y evaluadas con el método TLC.
Las bajas concentraciones de ácido (1 N) o el corto tiempo de hidrólisis (1 h) dieron
como resultado
baja intensidad de manchas de monosacáridos y varios puntos adicionales. En
comparación, si el HCl estaba demasiado concentrado (≥4 N) o la hidrólisis
demasiado tiempo (> 3 h), manchas muy débiles o sin azúcar en TLC podrían ser
detectado, lo que indica que los azúcares se degradaron. El punto más alto
intensidades y el menor número e intensidad de puntos adicionales
se detectaron para hidrólisis con HCl 2 N durante 2 h (datos no mostrados).
Por lo tanto, se concluyó que bajo estas condiciones, la hidrólisis de algas
polisacáridos fue completa y la degradación de monosacáridos
era aceptablemente bajo Para lograr un alto rendimiento de muestra, esto
se aplicó el procedimiento para todas las especies de algas. No se puede descartar, que
las condiciones óptimas de hidrólisis difieren entre las especies, dependiendo de la
tipo de polisacáridos específicos de algas. Por lo tanto, para análisis especiales
tareas de condiciones de hidrólisis, como tipo y concentración de ácido,
tiempo de hidrólisis y temperatura, necesitan ser optimizados.
3.2. TLC
Se analizó la biomasa de 46 microalgas para la composición de
carbohidratos por TLC. Dos ejemplos de cromatogramas de capa delgada son
dado en la figura 1. El cromatograma I muestra una buena separación de gal, glc,
hombre, ara, fuc y rha tanto en la mezcla estándar como en las algas
hidrolizados Aunque xyl y costilla no se podían separar claramente,
sin embargo, este procedimiento dio los mejores resultados. En el cromatograma II,
costilla
revela un solo punto pero xyl y fuc no estaban separados. En combinación
de ambos cromatogramas, detección de todos los monosacáridos principales en
biomasa de algas con un LOD de aprox. 1.0% DW (250 ng) fue posible
(Tabla 1). Los cromatogramas revelaron claras diferencias en el
composición de la fracción de azúcar. Por ejemplo, Pirula salina SAG 2.95

no contenía a ningún hombre sino a xyl, Tetradesmus wisconsinensis SAG 3.99

contenido
no rha y Tetraselmis suecica CCAP 66 / 22C era muy rico en glc
(Figura 1). En general (Tabla 2), glc y gal fueron detectados en biomasa de todos
especies de algas. Los resultados también muestran que el hombre faltaba en cuatro
hidrolizados de biomasa Rha se encontró en 19 de las especies, costillas en 22 y
xyl en 25. Ara fue muy rara y solo se encontró en 10 especies. Promover
se detectaron manchas en los cromatogramas de los hidrolizados de algas.
Cerca de la línea de inicio, aparecieron algunos puntos que podrían ser ácidos urónicos.
los
los puntos cerca de la línea del frente pueden ser algunos restantes, no hidrolizados
oligosacáridos o algunos productos de degradación de la hidrólisis. Era
encontró que el método TLC era muy adecuado para investigaciones cualitativas
de la composición de monosacáridos de matrices complejas como algas
hidrolizados El método es fácil de usar, económico y permite una rápida
visión general sobre la composición de monosacáridos de una muestra.
Sin embargo, el uso del cromatograma I para la validación mostró que el
el análisis cuantitativo no fue confiable. La resolución de separación fue
solo lo suficientemente alto para la cuantificación de cinco monosacáridos (gal, glc,
hombre, ara, rha). La baja precisión (RSD 7-17%) y la linealidad (R2 abajo
a 0.937) indicó que los contenidos solo se podían estimar aproximadamente.
Solo ara mostró un buen valor para la tasa de recuperación (110%),
Los RR de glc, gal, hombre y rha fueron pobres (40-60%). Sin embargo,
la cuantificación se realizó para comparar los valores calculados con el
otros metodos. Para la mayoría de las algas, glc era el monosacárido principal,
seguido por hombre o gal Los otros azúcares ocurrieron solo en trazas o
no estaban presentes en la biomasa. Después de agregar los valores individuales
(Fig. 2, columna 1; Tabla 2, "Total TLC"), Monoraphidium griffithii SAG

202-13 mostró el más bajo (3.9%) y Porphyridium purpureum SAG 1380-1d el

contenido total más alto (41.5%) de carbohidratos. En resumen, el método TLC es muy
adecuado para obtener una visión general sobre los principales monosacáridos en la
biomasa de algas, pero la cuantificación no es confiable Sin embargo, una evaluación
semicuantitativa de la monosacáridos en los hidrolizados de algas es posible. 3.3. LC-
MS El análisis de los azúcares individuales por LCMS mostró que cada monosacárido
(a excepción de la costilla) muestra dos picos principales, suponiendo que los anómeros
se separaron similar a Koizumi [30] resumido para Separación por HPLC en columnas
de carbono grafitado. La siguiente área se calcularon relaciones para los dos picos
principales de los monosacáridos (expresado en%): glc 38/62, gal 39/61, hombre 91/9,
rha 84/16, fuc 45 / 55, xyl 17/83 y ara 33/67. Como la relación de área de los dos picos
era específico y constante para cada monosacárido, la cuantificación fue posible
utilizando solo uno de los picos para calibración y muestra análisis, respectivamente.
Esto abrió la oportunidad de cuantificar con esto método, a pesar de que en una mezcla
de azúcar, no todos los picos fueron separados en basilea. Para cada azúcar, al menos un
pico podría separarse claramente suficiente para usarlo para la cuantificación (Fig. 3).
Varios métodos con derivatización [31,32] se informaron para la separación de
azúcares, pero sin una resolución anomer. Otros estudios con derivatización-menos los
métodos mostraron una separación incompleta y sin anómero [23,33] o analizaron solo
unos pocos monosacáridos [34,35].

La validación mostró que el método LC-MS es adecuado para cuantitativa e

investigaciones cualitativas de azúcares simples en complejo hidrolizado matrices. La
linealidad de las líneas de calibración es muy buena (r2> 0.9976). El LOD (0.05-0.9%
DW o 9-170 ng, respectivamente) es

en un rango similar al presentado para otros métodos sin derivatización

[35]. De lo contrario, los LOD hasta el rango de fmol se informan para algunos
métodos que utilizan muestras derivatizadas para el análisis [36]. El rango RR es
entre el 56% (xyl) y el 112% (fuc). La precisión oscila entre 1.3%
(glc) a 22.3% (fuc).
Los datos de LC-MS mostraron que glc era el azúcar principal, mostrando
contenidos entre 5,6% (Monoraphidium griffithii SAG 202-13) y
66.8% (Scenedesmus ovalternus SAG 52.80). Gal estaba a menudo presente,
revelando valores de hasta 7%. Solo en dos hidrolizados de algas, no se
detectado (Scenedesmus ecornis SAG 2332 y Cylindrotheca fusiformis
CCAP 66 / 22C). El hombre se distribuyó muy desigualmente. Mientras que algunas
algas
como Dunaliella salina SAG 184.80 no contenía a ningún hombre, Mychonastes
sp. A313 mostró un valor del 15%. Rha podría detectarse en muchas algas
especie, pero solo en cantidades más pequeñas (<3%), a excepción de Scenedesmus
vacuolatus SAG 211-11n (10.9%). Xyl ocurrió en cada segunda alga
(25 de 46 especies) con contenidos inferiores a LOQ y un máximo de 17,2%
(Porphyridium purpureum SAG 1380-1d). Rib fue detectado en muchos
especie, con cantidades de 0.5 a 1.0%. Ara solo se encontró en
Mesotaenium caldariorum A31 con una cantidad del 2.7%. Fuc apareció
en varias especies con cantidades inferiores al 5,6%. Después de agregar el
valores únicos, Mychonastes sp. A317 mostró el más bajo (19,2%) y
Porphyridium purpureum SAG 1380-1d el más alto (82.9%) carbohidrato total
contenido. La mayoría de las especies mostraron valores entre 25% y 30%

3.4. Carbohidratos totales

Las 46 especies de algas probadas revelaron contenidos totales de carbohidratos,
determinado con el método del timol-ácido sulfúrico, en un rango de
16.5% (Mychonastes sp. A313) a 71.6% (Porphyridium purpureum SAG
13801-1d) (Tabla 2 y Fig. 2, columna 3); la mayoría de las algas mostraron un valor de
aprox. 25% Con eso, todos están claramente por encima del LOQ (9.5%)
calculado durante la validación del método de timol-ácido sulfúrico. El RR
indica que todos los monosacáridos a excepción de xyl (192%) y fuc
(-1%) se puede cuantificar correctamente aunque se realizó la calibración
solo con glucosa Posiblemente la xilosa da un producto de reacción que es más
color intensivo que la glucosa, lo que resulta en señales más fuertes y más altas
RR. Lo mismo ocurre vise-versa con fucosa, que no se pudo recuperar
con este método: el producto de reacción podría mostrar absorbancia en
diferentes longitudes de onda por lo que no se puede encontrar a 509 nm. Considerando
el
buena linealidad (R2 0.997), precisión (RSD 3.2%), y ya mencionado
resultados, el método del timol-ácido sulfúrico representa una buena opción
método para la determinación simple y rápida de carbohidratos totales en
biomasa de algas. Comparado con la cuantificación usualmente utilizada con
antrona o fenol-ácido sulfúrico, tiene las ventajas de que el timol es
menos tóxico que el fenol y no fotosensible como el reactivo de antrona.
3.5. Comparación de métodos
Tanto el método TLC como el LC-MS abrieron la oportunidad de cuantificar
azúcares simples en los hidrolizados de algas. En general, los valores calculados
con los diferentes métodos correlacionados (Tabla 2): si el contenido CH
determinado con TLC fue bajo, también se obtuvieron valores bajos con
LC-MS y lo mismo para aquellos con altos contenidos. Con ambos analíticos
métodos, glc se identificó como el monosacárido principal (TLC media:
11.4%; media LC: 20.3%), seguido por el hombre (5.1% y 8.2%), gal (3.5%
y 3.4%) y rha (2.5% y 1.9%). Xyl se encontró en varias especies,
pero no fue posible la cuantificación con el método TLC. Rib apareció en
muchos hidrolizados de algas, las cantidades fueron pequeñas (LC significa 0,7%). Fuc
y ara podría ser cuantificado solo en pocas especies, lo que indica que este
los carbohidratos raramente se encuentran en las algas. Ortiz-Tena y col. [16] reportado
resultados similares Los autores encontraron glc ser el principal monosacárido
(hasta 66% DW) y gal, rha, man, rib, xyl, ara y fuc en variable
cantidades en P. purpureum, C. vulgaris, D. salina y S. ovalternus,
determinado con LC-MS con derivatización. McConnell y Antoniewicz
[15] también informaron un alto contenido de glc (entre 10 y 50% DW) en
Biomasa de C. vulgaris pero cantidades menores (menos del 10% DW) de gal, hombre,

ara y xyl, medido con GC-MS. Sin embargo, la comparación con

los datos de la literatura deben considerarse con precaución, porque el contenido de CH
y la composición de las microalgas depende en gran medida de la cultura
condiciones [37].
Los valores de azúcares individuales calculados con LC-MS son más altos que
determinado con TLC. Estos resultados se muestran en la Fig. 4 para el principal
monosacáridos glc, gal y hombre y el contenido total de carbohidratos.
Los valores de TLC se representaron frente a los valores de LC. Regresión lineal (negro
línea) revelado para glc, hombre y contenido total de carbohidratos valores más bajos

para TLC que para LC. Esto también está subrayado por los valores medios
(Tabla 2). Para gal, se obtuvieron valores similares con los dos métodos;
la línea de regresión lineal es casi idéntica a la línea punteada que representa
resultados iguales con ambos métodos.
Para la comparación del contenido total de carbohidratos medido con
el método del timol-ácido sulfúrico (Tabla 2 y Fig. 2), los valores para el
los azúcares individuales con LC-MS y el método TLC, respectivamente, se sumaron
arriba. Para la mayoría de las algas, el método del ácido thymol-sulfuric reveló similar
valores (media 33,0%), al método LC-MS (media 33,6%). Fig. 5 A también

subrayado esto. Sin embargo, el análisis de la Fig. 5 B revela algunos

valores con mayores varianzas. La diferencia entre LC y timol sulfúrico
los resultados del método ácido varían, especialmente en carbohidratos totales inferiores
contenido (<30% DW), de -40% a + 60%. Para un total más alto
contenido de carbohidratos, la diferencia es de ± 20% menor. Importantemente
menor contenido total en comparación con LC y el método thymol se
calculado con el método TLC (19.1%). Esto era de esperar ya que
El método del timol detecta cada azúcar, incluso los oligosacáridos hidrolizados.
Comparado con el LC-MS, con el método TLC los valores de fuc,
xyl y costillas faltan y por lo tanto un LOQ más alto y el RR más bajo
se calcularon, resultando en el valor más bajo para CH total (excepto
Cylindrotheca fusiformis CCAP 66 / 22C). Todos los tres métodos indicados
que Porphyridium purpureum SAG 1380-1d, Scenedesmus ovalternus SAG
52.80, y Tetraselmis suecica CCAP 66 / 22C reveló la mayor
contenido de carbohidratos de todas las algas probadas.

4. Conclusión
En resumen, el método de timol-ácido sulfúrico es adecuado para
y un análisis de CH total sencillo y proporciona resultados válidos con simples
requisitos de equipos analíticos. Excepto por xyl y fuc todos los monosacáridos
se cuantifican con precisión, pero no hay distinción cualitativa
posible. Por el contrario, el método TLC permite distinguir entre
al menos ocho monosacáridos diferentes que se producen en matrices complejas
como hidrolizados de algas con bajo esfuerzo técnico. Es utilizable como
método de detección para la detección de los monosacáridos principales en
biomasa de algas. Semi-cuantitativos resultados pueden ser obtenidos. El nuevo
El método LC-MS desarrollado proporciona la separación de ocho azúcares sin
paso de derivatización con una columna HILIC. Cualitativo y cuantitativo
el análisis fue posible, sin embargo, la cuantificación debe optimizarse en
estudios adicionales. En comparación con el método de TLC y timol, LC
el análisis proporciona los resultados más detallados, pero el análisis de muestras es más
costoso al menos por el factor 104 por muestra.
Contribuciones de autor
C. Schulze y S. Mundt concibieron y diseñaron el estudio; DO.
Schulze realizó experimentos con el método de timol-ácido sulfúrico
e interpretó los datos analíticos; A. Strehle, C. Schulze y S.
Merdivan evocó el método TLC y LCMS y realizó el
mediciones. C. Schulze y S. Mundt escribieron el manuscrito con
entrada, revisión y aprobación de todos los autores.
Expresiones de gratitud
Gracias al Ministerio Federal Alemán de Investigación y Educación
para ayuda financiera (número de concesión: 03SF0446B). La Sra. M. Schmidt es
gracias por la excelente asistencia técnica. John Williams, PhD es agradecido
para revisar la ortografía del manuscrito.