LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR EXTRACCIÓN DE RNA

29 de Noviembre de 2016

Cristian Andrés Ríos

Gabriel Ramírez
Grupo 4

Profesora Adís Ayala Fajardo

RESUMEN
A nivel molecular existen variedad de técnicas para la extracción del ARN una de ellas es
mediante Microprep, el cual consiste en un aislamiento rápido de ARN de células cultivadas
(células bucales, suero, coagulo obtenido de plasma entre otros) en donde solo se utiliza un
paso de extracción mediante la unión a una columna con Buffer, lo que permite la extracción
del ARN en 10 minutos. Este informe tiene como objetivo mostrar la aplicación de la extracción
del ARN mediante Microprep logrando una pureza del ARN relación 1.8 y una eficiencia de
recuperación de 1x106 células.

PALABRAS CLAVES
ARN, extracción de ARN, RNAsa, Buffer.

ABSTRACT
At the molecular level there are a variety of techniques for the extraction of RNA, one of them
is by Microprep, which consists of a rapid isolation of RNA from cultured cells (buccal cells,
serum, plasma clot obtained among others) where only one Extraction step by binding to a
Buffer column, allowing RNA extraction in 10 minutes. This report aims to show the application
of RNA extraction by Microprep achieving a purity of RNA of relation 1.8 and a recovery
efficiency of 1x106 cells.

KEYWORDS
RNA, Extraction RNA, RNAsa, Buffer.

Universidad Distrital Francisco José de Caldas, Seminario Biología Molecular

OBJETIVO
Extracción de RNA mediante Microprep de
ARN.
MARCO TÉORICO
ARN
El ácido ribonucleico (ARN) es una
molécula biológica presente en
prácticamente todos los seres vivos, y
también en ciertos virus.
Imagen No 1. Tomado de Google Imágenes
El ARN es una molécula químicamente muy
cerca del ADN y también generalmente se
sintetiza en las células a partir de un molde
de ADN que se trata de una copia.
Las células vivas utilizan especialmente
ARN como un portador intermedio de
genes para sintetizar las proteínas que
Universidad Distrital Francisco José de Caldas, Seminario Biología Molecular
necesitan. El ARN puede realizar muchas
otras funciones y en particular intervenir en
reacciones químicas de metabolismo
celular.
Químicamente, el ARN es un polímero lineal
consiste en una cadena de
nucleótidos. Cada nucleótido contiene un
grupo fosfato, un azúcar (la ribosa) y una
base nucleica o base nitrogenada.
Los nucleótidos están unidos entre sí por
enlaces fosfodiéster.
Hay cuatro bases de nucleótidos en el
ARN: la adenina, la guanina, citosina y
uracilo.
El ARN tiene muchas similitudes con
el ADN, pero con algunas diferencias
importantes: un punto de vista estructural,
el ARN contiene residuos de ribosa que el
ADN contiene la desoxirribosa , que hace
que el ARN químicamente menos estable,
mientras que la timina ADN se sustituye por
uracilo que tiene las mismas propiedades
de búsqueda de base con adenina.
Funcionalmente, el ARN está generalmente
en las células como cadena sencilla, es
decir, de cadena simple, mientras que el
ADN está presente en la forma de dos
cadenas complementarias que forman una
doble hélice.
Por último, las moléculas de ARN presentes
en las células son más cortas que el ADN del
genoma, el tamaño que van desde decenas
a miles de nucleótidos, en contra de unos
pocos millones de unos pocos millones de
nucleótidos a ácido desoxirribonucleico
(ADN).
En la célula, el ARN se produce por la
transcripción a partir del ADN situada en el
núcleo. Por consiguiente, el ARN es una
copia de una región de una cadena del
ADN.
Las enzimas que copian el ADN → ARN se
denominan ARN polimerasas.
2
El ARN así producido puede tener tres tipos
de funciones: pueden ser portadores de la
información genética de uno o más genes
que codifican las proteínas (denominado
ARN mensajero), que pueden adoptar una
estructura secundaria y terciaria estable
realizar funciones de catalizador (por
ejemplo, el ARN ribosoma), pueden
finalmente servir como una guía o plantilla
para funciones catalíticas realizadas por
factores proteicos (que es por ejemplo el
caso de microRNAs). [1]
Técnica Miniprep
Una miniprep es una extracción de
naturaleza plasmídico de un cultivo
bacteriano. El método más común para
ellos es romper las células de dicho cultivo
mediante un choque alcalino de modo que
solo permee selectivamente su ADN
plasmídico. [2] La miniprep es la técnica
inicial de purificación y concentración de
ADN plasmídico para cualquiera de sus
posibles fines, entre los que se destaca la
clonación.
Imagen No 2 Column for RNA isolation
tomado de google imágenes
Inhibidores para las RNasas
El hígado de rata contiene una proteína que
actúa como un poderoso inhibidor de la
RNasa pancreática, pero sin afectar a la
Universidad Distrital Francisco José de Caldas, Seminario Biología Molecular
RNasa T1 ni a RNasa vegetales. La heparina
inhibe también la RNasa pancreática. La
arcilla bentonita es un poderoso inhibidor
de la RNasa y se emplea comúnmente para
evitar la degradación de RNA durante su
aislamiento. El sulfato de polivinilo se ha
empleado a menudo de manera similar. El
piro carbonato de dietilo (“Baycovin”) ha
sido utilizado también como inhibidor de la
RNasa, especialmente en la extracción de
ácidos nucleicos. [3]
Técnicas de PCR
RT-PCR (reacción en cadena de polimerasa-
transcripción inversa)
Se utiliza para la detección y amplificación
de ARN. Permite estudiar la expresión de
determinados genes (su traducción a
proteínas). En primer lugar se extrae el ARN
total de las células en estudio y se separa la
fracción correspondiente al mensajero
(ARNm). Tras purificarlo el ARN se
transcribe a ADN mediante una
transcriptasa inversa, por cada molécula de
ARNm se sintetiza una molécula de cADN
mono catenaria que posteriormente se ha
de convertir en bis catenaria utilizando una
ADN polimerasa (la rTth ADN polimerasa de
Thermus thermophilus es un enzima
recombinante y termoestable que actúa
como transcritasa inversa y como ADN
polimerasa simultáneamente). A partir de
aquí se aplica la técnica de PCR lo que
permite una detección de la expresión de
ARNm mucho más sensible que con
Northern blot o con hibridación in situl76.
La secuencia del fragmento amplificado se
determina mediante secuenciación
automática de ADN.
3
Aplicación en dermatología METODOLOGIA

La RT-PCR puede ser aplicada al ARN Guía de laboratorio No 8 EXTRACCIÓN DE

extraído de mínimos volúmenes de sangre ARN; Guía creada por Adís Ayala
o en material archivado como extensiones Fajardo/Biología Molecular, Universidad
en laminillas así como en secciones de Distrital Francisco José de caldas.
tejidos. Por ello, la RT-PCR es muy útil para
detectar la presencia de virus ARN (como el
virus del sarampión) y el análisis
citogenético molecular de translocaciones
RESULTADOS
cromosómicas.

Esta técnica se puede usar por ejemplo

para detectar la expresión proteica de
antígeno específico prostático en células
(detección de micro metástasis o células
tumorales circulantes).

Cómo amplificar el transcripto de la

Beta Actina a partir del RNA extraído

La actina es una familia de proteínas

globulares que forman los microfilamentos.
La actina es una de las proteínas más
abundantes entre los eucariotas y se
encuentra presente en todo el citoplasma.

Para la amplificación es necesario

identificar la secuencia de mARN que
codifica para Beta Actina, para así hacer uso
de enzimas de restricción.
Grafica No 1 Resultados ARN de saliva
Luego por métodos físicos o químicos
como el uso de columna o electroforesis se
extrae el fragmento de interés y es llevado
a una variante de PCR llamado RT-PCR
(reacción en cadena de la polimerasa con
transcripción inversa) usando la enzima
transcriptasa inversa. [5]

Universidad Distrital Francisco José de Caldas, Seminario Biología Molecular

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CÁLCULOS
1. Calculo de relación.
Por medio de una regla de tres simple
tenemos:
Remplazando los valores de laboratorio en
(1) tenemos
ARN células de saliva
Relación:
(0,032 + 260) -1,550) = 0,93
(0,263+280) -0.760)
2. Calculo del ratio del ARN
A + 260
𝑅𝑎𝑡𝑖𝑜 =
A + 280
Reemplazando estos valores en (2) por los
obtenidos en los resultados
0,032 + 260 260,032
𝑅𝑎𝑡𝑖𝑜 = = = 0,92
0,263 + 280 280,263
RatioARN= 0,92
3. Calculo de pureza
La pureza se calcula teniendo en cuenta:
 Relación (valor esperado) Los valores
esperados para ADN y ARN son 1.8 y 2.0
respectivamente de acuerdo al método
experimental más utilizado en biología
molecular (Molecular Cloning By
Maniatis). El valor de esta relación es
más pequeño cuando hay presencia de
proteína o fenol. Valores muy pequeños
son inapropiados para determinaciones
cuantitativas de ácidos nucleicos.
Universidad Distrital Francisco José de Caldas, Seminario Biología Molecular
ARN saliva:
2 → 0.93 = 46,5%
100% → x%
ANÁLISIS Y DISCUSIÓN
Varios factores pueden incidir en la
concentración del ARN que se obtiene tras
el proceso de extracción y purificación.
Entre ellos: la cantidad de células, el
volumen de muestra que se extrae y la
conservación óptima de la muestra. [4]
Las concentraciones de ARN que se
reportan en el presente trabajo, están
afectadas por los diversos factores que
intervienen desde la extracción de la
muestra (saliva del paciente), hasta el
último paso de extracción del ARN.
La pureza del ARN no se acercó a 2 como se
evidencia en los cálculos fue de 0,92 este
resultado menor puedo estar influenciado
por proteínas que absorben en 280 nm, la
calidad de la muestra es un factor
importante ya que no sabemos el estado de
salud del paciente.
La extracción basada en spin basket
formats, utilizan membranas, generalmente
de fibra de vidrio, sílice derivatizado, o
membranas de intercambio iónico, con lo
cual los ácidos nucleicos se unen a la
membrana, haciendo pasar el lisado a
través de la membrana por acción de fuerza
centrífuga. Este método presenta las
facilidades:
5
-Comodidad y facilidad, capacidad de
automatizar, capacidad de fabricación de
membranas de varias dimensiones
Aunque consigo también presenta
desventajas como:
-Se puede tapar por material particulado,
puede retener ácidos nucleicos no
deseados de gran tamaño como gDNA
principalmente.
Por lo que se vuelve fundamental el
cumplimiento de los protocolos de
manipulación, pH, temperatura y reactivos
desnaturalizantes y de lavado.
La mayoría de los procedimientos comunes
para la extracción de ARN se llevan a cabo
en presencia de agentes inhibidores de
RNasa, típicamente fuertes
desnaturalizantes como guanidina, SDS
(dodecil sulfato de sodio), o compuestos
basados en fenol que reducen el riesgo de
degradación del ARN, es necesario que el
desnaturalizante este en contacto con el
tejido celular, en el momento que se
interrumpen las células, lo cual es una
dificultad para tejidos duros como diente y
hueso. [5]
CONCLUSIONES
 Los datos expresados por el
espectrofotómetro fueron
corroborados teóricamente, dando
como resultado para el Ratio del RNA
0.94 comparados con 0,92 teóricos y la
pureza del RNA siendo 52,5%
comparados contra 46,5% teóricos esto
corrobora la confiabilidad y eficacia de
la técnica empleada.
 Esta técnica permite una extracción
rápida y limpia del ARN teniendo los
cuidados y destreza necesarios. De
Universidad Distrital Francisco José de Caldas, Seminario Biología Molecular
repetir esta práctica se espera mejorar
la relación de pureza por encima de 1.8,
dado que con la pureza obtenida no se
pueden tener resultados confiables.
 No es indispensable comprar los Kits
que están disponibles comercialmente
para la extracción de un RNA de alta
calidad, contrario a lo que aparentan la
mayoría de los protocolos revisados en
la red, tales como Trizol, Purelink o
MagMAX-96 RNA total.
REFERENCIAS
[1] ARN [en línea]: http://queesela.net/arn/.
Servidor: Google, Día: 27 de noviembre del
2016, Hora: 21:58.
[2] Miniprep fundamento [en línea]:
http://es.slideshare.net/glexirodriguez/extr
accion-de-acidos-nucleicos-lab-genetica-
unah-27425914. Servidor: Google, Día: 28 de
noviembre del 2016, Hora: 17:30.
[3] R.L.P. Adams, R.H. Burdon, A.M.
Campbell, R.M.S. Smellie. Bioquímica de los
ácidos nucleicos de Davidson (1980).
Department of Biochemistry. University of
Glasgow. Editorial REVERTÉ, S.A. Barcelona
(Madrid); Pág 167.
[4] ARN [en línea]:
http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_art
text&pid=S0864-02892013000300010
Servidor: Google, Día: 27 de noviembre del
2016, Hora: 21:58.
[5] Thermo Fisher scientific
https://www.thermofisher.com/co/en/hom
e/references/ambion-tech-support/rna-
isolation/general-articles/the-basics-rna-
isolation.html
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ANEXO

Se anexa los resultados arrojados por el

espectrofotómetro.

Universidad Distrital Francisco José de Caldas, Seminario Biología Molecular

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