Taller 5.

Controles de calidad para muestras biológicas

Coordina: Andrés C García Montero,

Banco Nacional de ADN, Salamanca.
Ponentes: Carmen García Macías,
Servicio de Patología Molecular, CIC, Salamanca .
Rosa Pinto Labajo,
Banco Nacional de ADN, Salamanca.
Anna Bosch Comas,
Biobanco IDIBAPS, Barcelona
Andrés C García Montero,
Banco Nacional de ADN, Salamanca.
Taller 5: Controles de calidad para muestras biológicas

Controles de calidad de ácidos

nucleicos

Dra. Rosa María Pinto Labajo. Área de Control de

Calidad
Banco Nacional de ADN Carlos III- Universidad de
Salamanca
CRITERIOS DE CALIDAD DE ADN Y ARN

Concentración

Pureza

Integridad

Funcionalidad

Trazabilidad

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 CONCENTRACIÓN

- Espectrofotometría:

Cada molécula absorbe la energía radiante a una longitud de onda

específica, a partir de la cual es posible extrapolar la concentración de un
soluto en una solución.

Ley de Lambert-Beer: una relación lineal entre

absorbancia A (DO) y concentración
A = DO = αlc (1)

α : coeficiente de extinción molar (probabilidad de que el

fotón sea absorbido por el material a esa λ
l: distancia que recorre la luz para atravesar el material
c: concentración

1 unidad de absorbancia en 1cm de trayectoria óptica para

ADN de doble cadena = 50 µg/ ml y para ARN = 40 µg/ ml
 CONCENTRACIÓN

- Espectrofotometría: Nanodrop ND1000

Ventajas:
- concentración y pureza
La capacidad de absorción a una λ específca de las
posibles sustancias contaminantes
- sencillo, rápido y económico

Incovenientes:
-basa la cuantificación en la medida de absorbancia 260 nm
de todos los nucleótidos
ADN degradado
ADN monocatenario
oligonucleótidos
ARN
-No discrimina entre ADN y ARN
-No aporta información sobre la integridad
 CONCENTRACIÓN DE ADN

- Fluorimetría :

Fundamento: determinación de la concentración en función de la fluorescencia

emitida por un fluoróforo de unión específica al ADN de doble cadena.
Cuantificación relativa: necesario realizar una recta patrón con
un ADN estándar (íntegro) de concentración conocida

PicoGreen®, SYBR Green ®, QuantiFluor™

Ventajas:
- concentración e integridad
Unión exclusiva a ADN de doble cadena

Inconvenientes:
- coste elevado, metodología más compleja (gran precisión)
-No aporta información sobre la pureza del ADN

RELACIÓN PicoGreen®/ Nanodrop ND1000

R< 1
 CONCENTRACIÓN DE ADN
Promedios Nanodrop
MEDIDAS DE CONCENTRACIÓN (ng/ul))
Método: precipitación con sales
<>
“salting out”
A 118,00
B 187,30
C 479,50
D 256,50
E 104,80

Picogreen PromediosPicogreen
MEDIDAS DE CONCENTRACION
MEDIDAS DE CONCENTRACION (ng/ul)) (ng/ul))
<> 1 2 3 <>
A 98,29 96,78 97,40 A 97,49
B 168,27 170,30 161,98 B 166,85
C 408,33 418,98 415,83 C 414,38
D 216,74 217,24 216,49 D 216,82
E 96,11 92,24 90,88 E 93,08

Ratios pico/nano

A 0,83
B 0,89
muestra óptima de ADN: R > 0.8 C 0,86
D 0,85
E 0,89
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

concentración Nanodrop ND1000

A4 B3 B6 B9 B10 C2 C3
ng/ µl 58,8 65,8 68 50 45.5 45,5 42

concentración PicoGreen®
A4 B3 B6 B9 B10 C2 C3
ng/ µl 50 50 50 12.5 11 25 31.2

RELACIÓN PicoGreen®/ Nanodrop

A4 B3 B6 B9 B10 C2 C3
0,85 0,76 0,74 0,25 0,24 0,55 0,74
 CONCENTRACIÓN DE ARN
- Fluorimetría :

Metodología: RT-PCR a tiempo real

Fundamento: determinación de la concentración en función de la fluorescencia emitida por un
fluoróforo de unión al ADN sintetizado
Los fluoróforos pueden ser de dos tipos: a) fluoróforos con afinidad por el ADN
b) sondas especificas para fragmentos del ADN

Cuantificación relativa: necesario realizar una recta patrón con un ADN estándar
(íntegro) de concentración conocida.

Ventajas:
- concentración e integridad mediante el cálculo de los valores de ciclo de umbral o Ct
Hay que tener en cuenta que el tamaño de los fragmentos amplificados es
limitado
- detección de contaminación por ADN
- funcionalidad
Inconvenientes:
- coste elevado, metodología más compleja, interpretación de los resultados
- no aporta información sobre presencia de contaminantes en la muestra
 PUREZA

Capacidad de absorbancia a una λ determinada de las posibles sustancias contaminantes

presentes en una solución de ADN .

A280: proteínas, fenol (A270)

A230: sales caotrópicas, fenol, hidratos de carbono

RELACIÓN DE ABSORBANCIAS

< 1,6 Contaminación c. aromáticos

A260/A280 1,8 – 2,0 PUREZA ÓPTIMA
ADN > 2,1 Contaminación ARN

A260/A230 2.0-2.2 PUREZA ÓPTIMA

2,0 - 2,1 PUREZA ÓPTIMA

A260/A280
≥ 1.8 Pureza aceptable
ARN
A260/A230 ~2,0 PUREZA ÓPTIMA
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 PUREZA

ADN alta pureza ARN alta pureza

A260/280: 1.87 A260/280: 2,04

A260/230: 2.46 A260/230: 1,68
Contaminación con fenol

ng/µl: 255.1
A260/280: 1.68
A260/230: 1.25

Precipitación
con etanol y sales
ng/µl: 140.0
A260/280: 1.90
A260/230: 2.37
 Relación A260/230

sales caotrópicas,
A230 fenol,
hidratos de carbono

Puede resultar muy variable dependiendo del tampón que utilicemos

como blanco en la medida del espectrofotómetro

muestras concentración A260/280 A260/230

10-3 56,18 1,91 -6,6
10-4 57,36 1,97 -6,8
10-5 57,7 1,91 -7,25
Buffer TE
10-6 56,7 1,87 -6,39
10-8 54,8 1,88 -5,95

muestras concentración A260/280 A260/230

10-3 55,78 1,9 2,25
10-4 55,98 2,01 2,39
10-5 55,41 1,94 2,26 Buffer kit
10-6 54,83 2,01 2,3 bolas magnéticas
10-8 53,2 2,03 2,35
Si diluimos una muestra a la mitad de concentración en un tampón salino la
relación 260/280 se mantiene constante (la muestra tiene la misma pureza), sin
embargo el ratio 260/230 disminuye por el efecto del incremento proporcional de
sales respecto al ADN

ng/µl: 131.6
A260/280: 1.89
A260/230: 2.26

dilución 1/10

ng/µl: 11.1
A260/280: 1.86
A260/230: 1.72
 INTEGRIDAD

ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

agarosa 0,7% ≥ 50 ng agarosa 1%

gDNA
28 S
18 S

integridad: una única banda definida integridad: bandas ribosomales 28S

en la parte superior del gel y 18S discretas en proporción 2:1
2:1
pureza: detección de presencia de pureza: detección de presencia de
ARN en la parte inferior del gel ADN en la parte superior del gel
 CONCENTRACIÓN E INTEGRIDAD

Agilent 2200 TapeStation system

Quantitative range:
10-100 ng/ µl 25-500 pg/ µl

-Uso de geles multi-línea y microfluídos que permiten un ensayo semiautomático.

-Simplifica el manejo de muestras

-Requiere muy poca cantidad de muestra

-Permite evaluar la concentración y la integridad de una muestra

 Integridad del ADN: DIN
DIN: DNA integrity number
Valor del 1 al 10 que define la integridad de una muestra de ADN
10: valor de una muestra íntegra
1: valor de una muestra con alto nivel de degradación

20445: DIN 8. 9 amplifica todas las bandas por Long PCR

múltiple (17,05 kb).

Amplif 5000 pb: DIN 6.2 amplifica hasta 5 kb.

13-21 FFPE: DIN 1.5 amplifica débilmente 600 y 300 pb.

Amplifica con intensidad 200 pb.

4B-04 Qiagen: DIN 1.5 amplifica débilmente 300 pb.

Amplifica con intensidad 200 pb.

5B-43 f/C: DIN 1.3 amplifica débilmente 300 pb.

Amplifica con intensidad 200 pb.
Integridad del ARN: RINe
RINe: RNA integrity number

10: valor de una muestra íntegra

1: valor de una muestra con alto nivel de degradación

RINe= RIN 2100 Bioanlyzer (Agilent)

RIN <6 ARN degradado

RIN > 7 Arrays
RIN > 4-7 qRT-PCR

RINe es una medida repetitiva pero puede diferir

del valor de RIN (en la misma muestra).
 FUNCIONALIDAD DEL ADN

DIGESTIÓN del ADN con ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

1 2

λ-HindIII

23 kb
 FUNCIONALIDAD E INTEGRIDAD DEL ADN
LONG PCR MÚLTIPLE

Long PCR Múltiple: 5 parejas de oligonucleótidos (primers) simultáneamente

amplificación en 6 cromosomas diferentes
ADN molde: 10 ng/ µl
amplicones entre 17.5 kb y 2.0 kb

PUNTUACIÓN
1 2 3 4 5 6 7

intensidad
λ-Hind III fuerte débil Calidad del ADN
1 2 3 4 5 6 7 H20 kb
kb

23.1 17.5 10 9.5 10-9.5: muestra ótpima

9.4 7.0 8 7.5
6.5
5.0 7 6.5 ≥ 6.5: muestra aceptable
4.3
3.0 5 4.5
2.4 4.5: muestra calidad
2.3
2.0 3 2.5 comprometida
2.0

‹ 4.5: rechazar muestra

4.5: muestra calidad comprometida

enviar al investigador informando de su calidad

 TEJIDOS FFPE

ADN (van Beers et al., 2006)

pb
- ADN muy fragmentado

- modificaciones químicas
del ADN por formalina

años: 11, 6, 22, 20,18, 11, 8 , 7 , 19, 17, 16,

Funcionalidad del ADN

- PCR múltiple (100 ng ADN molde) 4 amplicones de 100, 200, 300, 400 pb

7 muestras amplificaron fragmentos ≥ 200 pb CGH array

(comparative genomic hybridisation)
 TEJIDOS FFPE
6 muestras extraídas de tejidos parafinados con el método kit QiAamp® mini
(Qiagen) diferentes edades de bloque.

11 10 7 6 2 A 2B
pb 100 ng molde
M
1000
800
600 600 pb
400

Con este método la capacidad

pb M 11 10 7 6 2 A 2B de amplificación de 4 de las 6
1000
900 muestras está limitada a 200
700
500
pb .
300 pb
300
200
100
La edad del bloque no estaría
pb M 11 10 7 6 2A 2B relacionada con la capacidad de
1000
900
amplificación de la muestra.
700
500
300
200 200 pb
100
 FUNCIONALIDAD DE ARN
REACCIÓN DE RT-PCR

- funcionalidad: síntesis de cDNA (ADN complementario) a partir de ARN

mediante una retro-transcriptasa y amplificación de secuencias específicas de
ADN.
- pureza: si hay ADN en la muestra la amplificación de una región
interexónica dará lugar adicionalmente a un producto mayor del esperado.

primer

5’ 3’ gDNA
intrón exón

5’ 3’ RNA cDNA
amplicón
 FUNCIONALIDAD DE ARN

Resultado PCR utilizando cDNA como molde:

kb M 1 2 3
3.0 M: marcador tamaño molecular
1: gDNA (control de la PCR)
1500 pb

1.0
2: cDNA
3: cDNA con contaminación de
0.5 400 pb ADN genómico
 TRAZABILIDAD
Laboratory Integrated Management System
- Etiquetas y lectores de
códigos de barras

- Microtubos 2D-coded

- Automatización (Robots)

www.bancoadn.org
 TRAZABILIDAD

IDENTIFICACIÓN DE SEXO: PCR de Sexo

SEXO: amplificación gen ZF (Fredsten y Villesten, 2004)

cromosoma X: inserción de un elemento Alu de 423 pb
cromosoma Y: no existe elemento Alu

PCR sexo
λ-Hind III 1 2 3 4 5

1560 pb
B1
1137 pb

hombre mujer
 TRAZABILIDAD

PERFIL GENÉTICO por MICROSATELITES o STR´s

STR´s: “ Short Tandem Repeats”

-secuencias cortas de 2-7 pb que se repiten a lo largo de todo

el genoma
-el número de repeticiones es único en cada individuo
-la amplificación de estas regiones constituye el perfil o huella
genética del individuo

5 pares de oligonucleótidos PCR MÚLTIPLE

CHLC (Cooperative Human Linkage Center) markers

Sheffield JC et al (1995), Gastier JM et al (1995)

 TRAZABILIDAD

VALIDACIÓN DEL PROTOCOLO

AND molde 100 ng

50% Hi-Gel Matrix (Biotools) y 0,7% agarosa estándar

4 individuos en dos reacciones de PCR diferentes una con Tm a 55ºC y

otra con Tm a 58ºC
1 2 3 4
φx174 HaeIII

310
281 / 271

234
194
118
 TRAZABILIDAD

A = 2
¿qué muestra
es A?
A 1 2

2
Células en cultivo

ADN en solución A (11130)

MUCHAS GRACIAS

www.bancoadn.org

bancoadn@usal.es
EPICENTRE Forum 5 (3)
|Multiplex PCR Amplification of STRs from DNA Isolated with the MasterAmp™ Buccal Swab DNA Extraction
Kit|
Haiying Grunenwald, Epicentre Technologies
Introduction
Short Tandem Repeats (STRs) consist of short (3-7 bp), repetitive sequence elements that are distributed throughout the
human genome. The highly polymorphic nature of these markers makes them powerful tools for human identification.
STRs are often used by laboratories performing parentage determination, forensic analysis, genetic linkage map
construction, or any other application requiring genetic profiling.1
Typically for genetic analysis, at least two STRs are simultaneously amplified in a single-tube PCR reaction (multiplex
PCR). Success in multiplex PCR depends on both the quality of the genomic DNA used in the analysis and the PCR
amplification conditions. Standard techniques used to obtain genomic DNA for STR analysis often involve blood draws
and lengthy isolations. We have shown that the MasterAmp™ Buccal Swab DNA Extraction Kit can be used to isolate
human genomic DNA from buccal (cheek) cells in less than one hour without blood draws.2 Here, we demonstrate
multiplex PCR amplification of five sets of STRs from four individuals using MasterAmp PCR reagents and human
genomic DNA isolated with the MasterAmp Buccal Swab Kit.
Methods
Isolation of human genomic DNA using the MasterAmp Buccal Swab DNA Extraction Kit
Human genomic DNA was isolated from buccal cells of four different individuals using the MasterAmp Buccal Swab
DNA Extraction Kit. The procedure is outlined in Table 1. The extracted DNA was resolved on a 1% agarose gel and
visualized by ethidium bromide staining.
Table 1. MasterAmp Buccal Swab DNA Extraction Protocol Outline.
1. Thoroughly rinse subject's mouth twice with water.
2. Press the brush firmly against the inside of the cheek and rotate the brush 20 times. Move the brush to the
other cheek and repeat.
3. Place the brush into the tube containing DNA Extraction Solution and rotate.
4. Mix by vortexing and incubate the tube at 60°C for 30 minutes.
5. Mix by vortexing and incubate the tube at 98°C for 10 minutes. Repeat.
6. Pellet debris by centrifugation at 4°C for 5 minutes.
7. Carefully transfer the supernatant (containing the genomic DNA) to a new tube and store at -20°C.
Multiplex PCR amplification of CHLC markers
Cooperative Human Linkage Center (CHLC) markers are a group of STRs consisting of tri- and tetranucleotide
repeats.3,4 The CHLC marker loci are highly polymorphic. Genomic DNA from different individuals are differentiated
by the number of copies of these repeats contained within the amplified regions. PCR products from CHLC loci range
between 100-300 bp. Since our study involved one female and three males, we selected 5 sets of CHLC primers that
amplify regions of both the X chromosome (four sets of primers) and the Y chromosome (one set of primers). These
primers were also selected to minimize the possibility of generating PCR products of similar size.
The isolated human genomic DNA was PCR amplified using the following 5 sets of CHLC primers: DXS7132,
GATA31E08, DYS390, GATA175D03, and DXS6789. Primer sequences, location, and expected PCR product length
for each primer set are listed in Table 2. To determine the optimal multiplex PCR conditions, preliminary reactions
were carried out with genomic DNA from one individual using the MasterAmp PCR Optimization Kit. MasterAmp
PCR PreMix A was the optimal PreMix for this multiplex PCR reaction (data not shown). Each 50 µl multiplex PCR
reaction contained 25 pmoles of each primer, 1X MasterAmp PCR PreMix A (50 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl,
1.5 mM MgCl2, 200 µM each dNTP), 15 µl of buccal DNA (84-250 ng), and 1.25 units of MasterAmp Taq DNA
Polymerase. The samples were incubated at 94°C prior to the addition of MasterAmp Taq Polymerase. Then the
samples were incubated at 94°C for 2 minutes, followed by 30 cycles of: 1 minute at 94°C, 1 minute at 55°C, and 1
minute at 72°C; followed by 4 minutes at 72°C. Fifteen microliters of each reaction were resolved by electrophoresis on
a 3% agarose gel and visualized by ethidium bromide staining.
Results
Figure 1 shows the human genomic DNA isolated using the MasterAmp Buccal Swab DNA Extraction Kit. The
extracted DNA has a high molecular weight.

Figure 1. Human genomic DNA extracted from buccal cells. Approximately 5% (8.5 µl)
of the extracted human genomic DNA was separated on a 1% agarose gel. DNA was
visualized by ethidium bromide staining. Lane M, DNA ladder; Lanes 1-4, human genomic
DNA from 4 different individuals.

Four of the five sets of CHLC primers: DXS7132, GATA31E08, GATA175D03, and DXS6789, amplify regions of the
X chromosome, whereas DYS390 amplifies a region of the Y chromosome. For the female sample, we expected to see
no amplification from primer set DYS390 (Y chromosome), and therefore no PCR product in the 205-221 bp range.
The other four primer sets were expected to result in either one or two PCR products depending on heterozygosity. For
the male samples, a single PCR product from each of the five primer sets was expected.
Figure 2 shows the multiplex PCR results. The amplification products from the female sample are shown in Lane 2 and
amplification results from the three male samples are shown in Lanes 4, 6, and 8. As expected for the female sample
(Lane 2), there is no amplification product between 205-221 bp from DYS390. There is one PCR product in the 118-
150 bp size range from DXS6789; two PCR products from GATA175D03 due to heterozygosity (in the size range 170-
186 bp); one product at approximately 250 bp from GATA31E08 (226-254 bp); and two PCR products in the size range
283-299 bp from DXS7132, again due to heterozygosity. For the male samples in Lanes 6 and 8, there is clearly a
single PCR product from each of the five primer sets. Lane 4 shows the appearance of a doublet at ~230 bp from
DYS390 and GATA31E08 (DYS390 produces products between 205-221 bp and GATA31E08 produces products
between 226-254 bp), and therefore this sample also shows amplification from each primer set. Multiplex PCR analysis
of these CHLC markers resulted in four distinct patterns for these four individuals (Figure 2). Further statistical analysis
would be needed to determine the significance of these comparisons.
 Figure 2. Multiplex PCR amplification of CHLC markers from
buccal DNA. Multiplex PCR of five sets of CHLC markers was
carried out using human genomic DNA extracted from buccal cells as
described in the text. Fifteen microliters of each reaction were
resolved on a 3% agarose gel and visualized by ethidium bromide
staining. Lanes 1, 3, 5, 7, 100 bp DNA ladder; Lane 2, multiplex PCR
from a female sample; Lanes 4, 6, and 8, multiplex PCR from the
three males samples. Multiplex PCR products in Lanes 2, 4, 6, and 8
correspond to the human genomic DNA samples shown in Figure 1 in
Lanes 1, 2, 3, and 4, respectively.

Summary
Human genomic DNA isolated from buccal cells using the MasterAmp Buccal Swab DNA Extraction Kit was an
excellent template for the multiplex PCR amplification of STRs. This DNA extraction system is both fast and non-
invasive. In addition, use of the MasterAmp PCR Optimization Kit made it easy to determine the optimal conditions for
the multiplex PCR analysis.
References
1. Edwards, A. et al. (1991) Am. J. Hum. Genet. 49, 746.
2. Watson, J. (1997) Epicentre Forum 4 (1), 6.
3. Sheffield, J.C. et al. (1995) Hum. Mol. Genet. 4, 1837.
4. Gastier, J.M. et al. (1995) Hum. Mol. Genet. 4, 1829.