UNIVERSIDAD PERUANA UNIÓN –FILIAL JULIACA

FACULTAD DE INGENIERIA Y ARQUITECTURA

E.P INGENIERIA AMBIENTAL

ASIGNATURA: Microbiología

TEMA: PRÁCTICA N° 8 VERDE BRILLANTE BILIS

PRESENTADO POR:
MENDOZA LUQUE, D. Margot
SUPO CRUZ, Edy
JARA APAZA, Marleny

ZENDHER CORA MONRROY

QUISPE QUISPE Cristiam

DOCENTE: SADY HARO CASILDO

30 DE AGOSTO, 2018
1. Introducción

La contaminación de los cuerpos naturales de agua es una problemática que se presenta en

la actualidad, principalmente en los países en vías de desarrollo, debido a que los desechos

domésticos e industriales se vierten a estos ecosistemas acuáticos sin tratamiento previo o

pobremente tratados y por lo que constituyen una fuente constante de deterioro del medio

ambiente. (Larrea, Rojas, Romeu Álvarez, & Mercedes Rojas, 2012)

Los coliformes son una familia de bacterias que se encuentran comúnmente en las plantas,

el suelo y los animales, incluyendo los humanos. La presencia de bacterias coliformes es un indicio

de que el agua puede estar contaminada con aguas negras u otro tipo de desechos en

descomposición. Generalmente, las bacterias coliformes se encuentran en mayor abundancia en la

capa superficial del agua o en los sedimentos del fondo. (RAMOS ORTEGA & VIDAL, 2008)

la comunidad microbiana hace que el ambiente en los trópicos sea diferente comparado

con los de regiones templadas, por lo que se sospecha que los indicadores fecales clásicos

proliferan en aguas tropicales y que son detectados a niveles que no reflejan la extensión original

de la contaminación fecal, o aún peor, se vuelven autóctonos de estos ecosistemas acuáticos

pudiendo ser aislados en ausencia de una fuente fecal conocida. El presente trabajo aborda los

principales aspectos reportados relacionados con la utilidad de las bacterias indicadoras de

contaminación fecal en la evaluación de la calidad de las aguas. (Calvo, Guillermo, 2010)

2. Objetivos.

 Detectar presencia de coliformes totales.

 Preparar los medios para las siembras.

 Realizar las siembras correspondientes.

 Realizar la tinción de Gram.

 Observar los resultados a las 24h y 48h.

3. Fundamento

El grupo coliforme constituyen un grupo heterogéneo con hábitat primordialmente

intestinal para la mayoría de las especies que involucra, es constante, abundante y casi exclusivo

de la materia fecal, su capacidad de sobrevivencia y multiplicación fuera del intestino también se

observan en aguas potables, por lo que este grupo se utiliza como indicador de contaminación fecal

en agua; encontrándose que mientras mayor sea el número de coliformes en agua, mayor será la

probabilidad de estar frente a una contaminación reciente.(Robert,2014).

Para su estudio, se dividen en dos grupos. El grupo de bacterias coliformes totales el cual

comprende a todos los bacilos Gram-negativos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados,

que fermentan la lactosa con producción de gas en un lapso máximo de 48 h. a 35°C ± 1ºC. Este

grupo está conformado por 4 géneros principalmente: Enterobacter, Escherichia, Citrobacter y

Klebsiella. (Silvia, 2004).

El grupo de coliformes fecales, está constituido por bacterias Gram-negativas capaces de

fermentar la lactosa con producción de gas a las 48 h de incubación a 44.5 ± 0.1°C. Este grupo no

incluye una especie determinada, sin embargo, la más prominente es Escherichia coli.
 3.1. Escherichia coli

Es un bacilo corto Gram negativo que se encuentra clasificado dentro de la familia

Entero bacteria (bacterias entéricas), existe como comensal en el intestino delgado de humanos y

animales. Sin embargo, hay algunas cepas de E. coli patógenas que provocan enfermedades

diarreicas. E. coli se clasifican con base en las características que presentan sus factores de

virulencia únicos, cada grupo provoca la enfermedad por un mecanismo diferente (Cortez, 2003).

3.2. Importancia del género Escherichia.

Dado que las especies del género Escherichia se hallan presentes como comensales en el

intestino humano y animal, particularmente E. Coli, estos microorganismos son utilizados como

indicadores de contaminación fecal, aunque no necesariamente indica que un alimento está

contaminado con heces, sino que indica una mala higiene en el procesamiento de los alimentos, lo

mismo ocurre en el agua. (Pérez, 2011).

3.3. Caldo verde brillante bilis

Brilliant Green Bile Lactose Broth está formulado para una presunta identificación y

confirmación de bacterias coliformes. La bilis de buey y el verde brillante inhiben el crecimiento

de bacterias grampositivas como la Clostridia que fermenta la lactosa.

La producción de gas a partir de la fermentación de lactosa se detecta incorporando el tubo

de Durham invertido, lo que indica un positivo Evidencia de coliformes fecales. Otras bacterias

coliformes no fecales también crecen en este medio, pero en su mayoría no producen cualquier

gas. Brilliant Green Bile Lactose Broth se usa para la confirmación de presuntos tubos positivos

que muestran gas. (SIGMA-ALDRICH, 2013)

4. Materiales y métodos

4.1. Materiales:

 9 tubos de ensayo con tapa

rosca
 3 tubos de ensayo con tapón
de algodón
 Matraz Erlenmeyer con tapón
de algodón
 Balanza electrónica
 Probeta
 Pipeteador
 2 pipetas de 10ml
 3 pipetas de 1ml
 Agua destilada
 9 tubos de Durham
 Un vaso preciptado
 Papel kraft
 Autoclave
 Una gradilla
 Mechero Bunsen
 Kit de Gram
 Microscopio
 Aceite de Inmersión
 Porta objeto
 Cubre objeto
 4.2. PROCEDIMIENTO:

4.2.1. VERDE BRILLANTE BILIS LACTOSA:

Pesar 3,24 gr. de verde brillante bilis lactosa (3.3gr.) en la balanza electrónica para

luego ser colocado en el matraz.

Figura 1: Pesar Figura 2: Luego de pesar

4.2.2. colocar en el Matraz

 Añadir 81ml de agua destilada al matraz con la verde brillante bilis lactosa
para luego diluirla.

Figura 3: Medir 81ml de agua destilada Figura 4:

4.2.3. Diluir
  Tomar 9 tubos de ensayo con tapa rosca y dentro de ellas colocar Tubos
de Durham previamente rotulado, tres tubos rotulados con 10-1, tres tubos
con 10-2 y tres tubos con 10-3. Luego añadir 9ml de verde brillante bilis
lactosa a cada uno de los tubos.

Figura 5: Tubos de ensayo con tubos de durham Figura 6:

colocar 9ml a cada
tubo

 Colocar 9ml de agua destilada en tres tubos de ensayo y taparlo con un

tapón de algodón, y conjuntamente con los tubos de ensayo con tapa rosca
llevarlo al Autoclave para la esterilización.

Figura 7: Esterilizar cubriendo con papel kraft y en un vaso precipitado Figura 8: Autoclave

 Luego de ser esterilizado los tubos de ensayo, realizar banco de un banco

de diluciones con los tres tubos de ensayo que contenían agua destilada,
añadiendo 1ml de la muestra original al tubo de 10-1 con una pipeta y del
mismo tubo añadir 1ml al tubo de 10-2 de igual forma para el tubo de 10-3.
 Figura 9: Añadir 1ml de la muestra original

Figura 10: Banco de Dilución

 Después de realizar el Banco de diluciones, pasar 1ml de los tubos con

tapón de algodón a los 3 tubos de ensayo con tapa rosca (verde brillante
bilis lactosa), según corresponda (10-1: 10-1-1. 10-1-2. 10.1-3, de igual
forma para los tubos 10-2 y 10-3)

Figura 11: Pasar 1ml a cada tubo

 Figura 12: 10-3 pasar 1ml a los 3 tubos

 Finalizando el procedimiento realizar un seguimiento a las 24 horas y a las 48

horas, anotando los resultados obtenidos.
4.2.4. ANALISIS MICROSCOPICO (TINCIÓN DE GRAM):

 Tomar tres portaobjetos y con la ayuda de una pipeta Pasteur colocar una
gotita de la muestra del anterior experimento en el portaobjetos y dejar
secar al ambiente para luego realizar la fijación con el Mechero Bunsen.

Figura 13: Muestra de Análisis Figura 14: Colocar una gotita Figura
15: Secado a Ambiente
  Luego de la Fijación realizar la Tinción de Gram.

LUEGO

Figura 16: Cristal Violeta por 1min y enjuagar Figura 17: Lugol por
1ml y enjuagar

LUEGO

Figura 18: Decolorante por 10 seg. y enjuagar Figura 19: Safranina

por 1min y enjuagar

Al terminar la Tinción de Gram llevar al microscopio a 100X con aceite de

inmersión, luego observar y anotar los resultados.

5. Resultados
 5.1. RESULTADOS DE LAS 24 h

Muestra 0.9 ml (A) 0.9 ml (B) 0.9ml (C) observacione

. s
+ + + Pudimos
apreciar que
en estas
muestras de
los tres tubos
de ensayo se
presenciaron,
gas y
fermentación
y perdida del
color, esto
nos quiere
10-1 decir que si
hay
producción
de
coliformes y
esto nos
indica que
son
positivos.
10-2 - - - En las
muestras de
estos tubos
se establece
que no hay
cambios en
la
producción
de gas ni de
coliformes, y
el color es el
mismo verde
claro fuerte
que lo
caracteriza
desde el
inicio.
 10-3 + + + Pudimos
apreciar que
en estas
muestras de
los tres tubos
de ensayo se
presenciaron,
gas y
fermentación
y pérdida del
color, esto
nos quiere
decir que si
hay
producción
de
coliformes y
esto nos
indica que
son
positivos.

6. Resultados

6.1. Resultados microscópicos de la M2 del rio Desaguadero.

Esta muestra trajo unos estudiantes para ver los coliformes totales, en este caso de

esta muestra se observó microscópicamente para ver gran+ y gran-. Por lo cual se tubo la

muestra en dos portaobjetos M2.1. Y M2.2.

Observación de M2 en M2.2. Descripción

En esta M2.2. se encuentra en su

mayor cantidad Gram+, en muy poca

cantidad de Gram-. esto quiere decir que no

se puede encontrar coliformes totales.

En cuanto a su morfología bacteriana

son staplylococus.

Observacion de M2 en M2.1 En esta. M2.1 se encuentra en su

mayor cantidad Gram-, en poca cantidad de

Gram+. esto quiere decir que podemos

presenciar a los coliformes totales, por lo cual

debemos de hacer Análisis microbiológico.

En cuanto a su morfología bacteria se

pudo presenciar bacilos, ya que es la forma

bacteriana de un escherichia coli.

6.2. Resultados de análisis microbiológico

Observación: en tubos de ensayo a 48 horas. Descripción

En tubos de:  En primer tubo es positivo, porque ha

10−1.1 , 10−1.2 𝑦 10−1.3 . producido gases en la superficie de la
campana.
 En el segundo también es positivo está
iniciando el cambio de color, ha producido
 gases en la superficie de la campana hay
sugerencia la presencia de una actividad
bacteriana.
 En el tercer tubo es positivo porque su
coloración cambia es muy notorio, en la base
esta cambiando de color a verde mas claro
pierde el color verde brillante y en la
superficie a producido burbujas y casi la
mitad de la campana a producido gas. En
todos los tubos hay presencia de coliformes.

En tubos de 10−2 , 10−2 𝑦 10−2  En primer tubo es negativo aun su coloración

de verde brillante se mantiene.
 En el segundo es negativo, solo en la
superficie del tuvo de ensayo ay una pequeña
cantidad de concentración de bacterias.
 En el tercero es negativo. No hay cambios

En tubos de 10−3 , 10−3 𝑦 10−3  En el primer es positivo y negativo porque en

la superficie de la campana se observa una
burbuja de gas, se está iniciando el cambio de
color. Esta dejando de ser verde brillante
 En el segundo y tercer también es positivo la
descripción es igual al de primer del primer

7. Discusiones

En los resultados microscópicos en la muestra M2.2. se observó Gram+ y en la

muestra M2.1 se observo Gram- esto podemos asegurar que se encuentras coliformes

totales y se hizo un buen procedimiento.

 En los resultados microbiológicos en 48 horas en los tubos 10−1.1 , 10−1.2 𝑦 10−1.3

son positivos ya que se notaron los cambios de color, ya no se puede presencia el color

verde brillante y han formado gases en la superficie de la campana y al medio, también

se observó burbujas y concentración de activad microbiana en la superficie del tuvo. En

el crecimiento consideramos (++) y en gas (+) esto quiere decir hay presencia de

Escherichia coli en el rio Desaguadero, por ende, es muy peligroso consumir esas aguas

porque están contaminadas y está en riesgo la salud humana.

En los tubos 10−2 , 10−2 𝑦 10−2 no se observaron ningún cambio. En el

crecimiento consideramos (-) y en gas (-) esto quiere decir hay presencia Salmonella

enterica. En 10−3 , 10−3 𝑦 10−3 su crecimiento es (+/-) y en gas (+) hay presencia de

Enterococcus faecalis. Esto coincide con los resultados microscópicos ya que se

observaron Gram+ y Gram- no pudimos encontrar a gran cantidad de coliformes totales,

esto debe de qué punto se muestrearon, también pudimos observa que en el grupo 2 en

todos los tubos hay cambios bruscos toda la campana estaban llenos de gas y el color

cambio, hubo concentraciones microbianas, esto quiere decir es que es punto de emisión.

(RAMOS & Vilardy, 2008)es

Figura 20 características bacterianas a 24-48 en 35-37ºC. fuente: (SIGMA-ALDRICH, 2013)

8. Conclusión

Llegamos en conclusión la presencia de los coliformes (Escherichia coli en el rio

Desaguadero en los en los resultados microbiológicos en 48 horas en los tubos

10−1.1 , 10−1.2 𝑦 10−1.3 que han ocurrido cambios muy notorios, han formado gases en

las campanas y presencia los cambios de color, también en los tubos 10−3 , 10−3 𝑦 10−3
su crecimiento es (+/-) y en gas (+) hay presencia de Enterococcus faecalis. A las 24 horas

también se mostraron esos cambios en los mismos tubos ya mencionadas. Esto que quiere

decir no hay una cantidad máxima de coliformes totales, esto se debe a que punto se saco

la muestra del rio Desaguadero.

Referencias
Calvo, Guillermo, M. J. (2010). Estado actual de contaminación con coliformes fecales.
Tecno.
Larrea, J. A., Rojas, M. M., Romeu Álvarez, B., & Mercedes Rojas, N. (2012).
Bacterias indicadoras de contaminación fecal en la evaluación de la calidad de
las aguas: revisión de la literatura. Cuba: Revista CENIC Ciencias Biológicas.
RAMOS ORTEGA, L. M., & VIDAL, L. (2008). ANÁLISIS DE LA CONTAMINACIÓN
MICROBIOLÓGICA. Colombia.
RAMOS, L., & Vilardy, S. (2008). ANÁLISIS DE LA CONTAMINACIÓN
MICROBIOLÓGICA (COLIFORMES TOTALES Y FECALES) EN LA BAHÍA DE
SANTA MARTA, CARIBE COLOMBIANO. Redalyc.
SIGMA-ALDRICH. (2013). 16025 Brilliant Green Bile Lactose Broth. Scielo.
Robert Pullés, M. (2014). Microorganismos indicadores de la calidad del agua potable en cuba.
Revista CENIC. Ciencias Biológicas, 45(1).
Silva, J., Ramírez, L., Alfieri, A., Rivas, G., & Sánchez, M. (2004). Determinación de
microorganismos indicadores de calidad sanitaria: coliformes totales, coliformes fecales y
aerobios mesófilos en agua potable envasada y distribuida en San Diego estado Carabobo
Venezuela. Rev. Soc. Venez. Microbiol, 24(1/2), 46-49.
Cortés-Lara, M. (2003). Importancia de los coliformes fecales como indicadores de
contaminación en la Franja Litoral de Bahía de Banderas, Jalisco-Nayarit. Rev. Biomed,
14, 121-123.

Pérez-Uz, B., de Silóniz, M. I., Torralba, B., & Vázquez, C. (2011). Metodología de esterilización
en el laboratorio microbiológico. Reduca (Biología), 3(5).
9. Anexos

Figura 21 muestra en tubo, para identificar cambios.