1

Maribel Dolande
Lic. en Bioanálisis. Universidad de Carabobo, Núcleo Aragua.
Magíster Scientiarum en Micología.
Universidad Nacional Experimental “Francisco de Miranda”.

Vera Reviakina
Médico Microbiólogo. Universidad Central de Venezuela
Magíster Scientiarum en Micología.
Universidad Nacional Experimental “Francisco de Miranda”.

María Mercedes Panizo

Lic. en Bioanálisis. Universidad Central de Venezuela.

Magíster Scientiarum en Micología.
Universidad Nacional Experimental “Francisco de Miranda”.

Giuseppe Ferrara

Lic. en Bioanálisis. Universidad Central de Venezuela

Especialista en Micología Médica

Fotografías: Maribel Dolande

Cámara Digital HP R927
Para el uso de las fotografías favor comunicarse con el correo electrónico:
maribeldolande@gmail.com

Agradecimientos:
A: Laboratorios Pfizer de Venezuela S.A. Rif.: J- -00006860-7 por la segunda edición de
este manual (2009), especialmente a Cecil Fandiño y Jatson Mendoza por darnos el apoyo
para plasmar nuestra experiencia en la identificación de levaduras y pruebas de
susceptibilidad, contribuyendo a facilitar la orientación y diagnóstico
de la candidosis invasora

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 Índice

Contenido Página
Prólogo 4
Introducción 5
Diagnóstico de Laboratorio 8
Identificación de Levaduras
Pruebas rápidas 9
Pruebas convencionales 12
Morfología de las principales levaduras de interés médico 15
Identificación por métodos automatizados 23
Pruebas de Susceptibilidad 27
Bibliografía 35
Anexos 39

3
 PRÓLOGO A LA SEGUNDA EDICIÓN

Hoy en día es indispensable que cada laboratorio de microbiología realice la identificación

de levaduras hasta género y especie. El incremento de la morbi-mortalidad por candidiasis
invasora, causada no solamente por Candida albicans, sino también por otras especies del
género que superan a C.albicans, lo justifica plenamente. Por otra parte, la terapéutica
antifúngica a elegir dependerá de esta información, por lo tanto es importante conocer
cuando y cómo deben realizarse las pruebas de susceptibilidad a los antifúngicos.

Con la segunda edición de este “Manual de Identificación y Pruebas de Susceptibilidad de

Levaduras a los Antifúngicos”, queremos compartir nuevamente nuestra experiencia, así
como orientar y concienciar al microbiólogo sobre la importancia de identificar las
levaduras de importancia médica de manera confiable. Para ello hemos revisado y
actualizado el manual, incluyendo una sección sobre métodos de identificación
automatizada de levaduras (con consejos, curiosidades y “trucos” sobre el uso de estos
métodos) y nueva información sobre las pruebas de susceptibilidad a los antifúngicos.

Esperamos que este manual sea de utilidad y que sirva como instrumento para motivar a los
microbiólogos a incursionar en el diagnóstico micológico, ya que la implementación de
estas pruebas en sus laboratorios les permitirá, no sólo ofrecer un diagnóstico confiable,
sino conocer la epidemiología y el perfil de susceptibilidad de las levaduras más frecuentes
en sus instituciones hospitalarias.

No nos queda más que invitarlos a revisar su contenido y agradecer una vez más a
Laboratorios Pfizer S.A. por apoyarnos y dejarnos plasmar nuestra experiencia al editar este
manual.

Maribel Dolande
Vera Reviakina
Ma. Mercedes Panizo
Giuseppe Ferrara

4
 INTRODUCCIÓN

La incidencia creciente de las infecciones fúngicas invasoras y nosocomiales, en las

últimas décadas, es una causa importante de morbi-mortalidad en pacientes
inmunodeficientes [1]. Este aumento se debe, entre otras razones, a la mayor supervivencia
de los pacientes inmunodeprimidos, debido a los avances en diagnóstico, cirugía y
tratamientos farmacológicos desde finales del año 1960, en muchas enfermedades que
entonces eran incurables [2,3]. Este hecho ha traído como consecuencia complicaciones
iatrogénicas, que han favorecido la aparición de infecciones oportunistas. Las
inmunodeficiencias primarias o adquiridas, los tratamientos con antibióticos de amplio
espectro, fármacos antineoplásicos e inmunosupresores, transplantes de órganos sólidos y
médula ósea, alimentación parenteral, empleo de catéteres intravenosos, procedimientos
para aumentar la supervivencia de neonatos pretérmino, la prolongada permanencia en las
Unidades de Cuidados Intensivos (UCI), entre otras causas, constituyen los factores
predisponentes de mayor riesgo para desarrollar una infección fúngica invasora grave [4-
12].

Dentro de las infecciones fúngicas invasoras, la candidiasis es la más frecuente en los

pacientes con factores de riesgo para adquirirla. Ésta micosis es producida por un grupo de
levaduras pertenecientes al género Candida, para el que se han descrito aproximadamente
163 especies, siendo Candida albicans la especie mas importante y mas frecuentemente
aislada. Estos agentes levaduriformes son cosmopolitas y constituyen parte de la microbiota
del hombre, colonizando mucosas del tracto gastro intestinal en un 60%, boca 40%, vagina
15 % y piel en un 6% aproximadamente [2,3,13].

La candidemia es la forma clínica que se presenta con mayor frecuencia, observándose un

aumento progresivo de esta entidad entre los pacientes internados en la UCI (que reciben
antibióticos, terapia inmunosupresiva, nutrición parenteral), así como también en los
pacientes expuestos a procedimientos médicos invasores, tales como catéteres
intravasculares, hemodiálisis y cirugía abdominal [14].

Las especies del género Candida que se aíslan con mayor frecuencia son: C. albicans, C.
parapsilosis, C. tropicalis, C. glabrata, C. krusei y C. lusitaniae, entre otras, pero esta
frecuencia puede variar según el centro hospitalario y las distintas unidades médicas del
mismo, e incluso según el país, la región y hasta de un año a otro. Aunque C. albicans sigue
siendo la especie más frecuentemente aislada, se está observando una disminución en su
frecuencia debido al incremento en el aislamiento de especies de Candida no-albicans en
todo el mundo [1].

A continuación se describen las características propias que presentan las distintas especies
del género Candida, su localización anatómica en el cuerpo humano y los diversos factores
de virulencia que poseen.

C. albicans es componente de la microbiota de la piel, tracto gastrointestinal y genitales.

Aproximadamente del 2 al 15% de los pacientes colonizados por esta especie pueden
desarrollar candidiasis diseminada y la mortalidad relacionada a candidemia puede
llegar a 79%, debido principalmente a factores de virulencia como adherencia a células

5
epiteliales y endoteliales, producción de enzimas hidrolíticas, formación de pseudohifas e
hifas, modulación antigénica y a los diversos factores de riesgo que presenta el hospedero.
[6,9].

C. parapsilosis forma parte de la microbiota habitual de la piel. Se aísla con frecuencia en

pacientes pediátricos con factores de riesgo como nutrición parenteral y uso prolongado del
catéter (transmisión exógena). También posee factores de virulencia como adherencia y
producción de enzimas hidrolíticas. A ésta especie se le atribuye una mortalidad cercana al
30%, mientras que la mortalidad media de otras especies es del 78% en candidiasis
diseminada [6,15].

C. tropicalis posee la mayor capacidad invasora y se considera que entre el 50 a 60% de los
colonizados por ésta especie desarrollan candidiasis invasora. Los pacientes más afectados
son aquellos con enfermedades hematológicas o receptores de médula ósea y la transmisión
es endógena en los primeros días de hospitalización en ausencia de profilaxis antifúngica
[6,10].

C. glabrata y C. krusei se aíslan con mayor frecuencia de pacientes con antecedentes de

profilaxis antifúngica con fluconazol, no portadores de catéter y sin terapia antibiótica
previa a la candidemia. C. glabrata es la menos virulenta de todas las especies, sin embargo
presenta la segunda tasa de mayor mortalidad después de C. krusei y ésta última se aísla
frecuentemente en pacientes con neoplasia hematológica [6,11].

C. lusitaniae forma parte de la microbiota del tracto respiratorio y gastrointestinal. Son

esporádicos los casos de infección nosocomial por esta especie y la transmisión puede ser
de origen endógeno o exógeno. Se ha publicado la existencia de cepas sensibles a
anfotericina B, aunque algunos autores consideran que esta especie posee resistencia
intrínseca a dicho antifúngico [6,12,16].

Otras especies de levaduras distintas al género Candida también pueden causar infección
nosocomial y son catalogadas como levaduras emergentes. Entre ellas se encuentra
Malassezia globosa, considerada ahora como el agente causal de pitiriasis versicolor; es
una levadura lipofílica, coloniza la piel y puede producir infección invasora en enfermos
inmunodeprimidos. Trichosporon asahii (beigelii), ha sido aislado de pacientes
hospitalizados críticamente enfermos, con manifestaciones clínicas de endocarditis,
fungemia y peritonitis asociada a diálisis. Rhodotorula se ha descrito en varios casos de
fungemia y se relaciona con el uso de catéter intravenoso; ésta levadura se ha aislado del
agua, aire, suelo, productos lácteos, piel, pulmones, orina, heces y de las manos del
personal de salud (aislada frecuentemente junto con C. parapsilosis) [6,17].

Debido al incremento en la prevalencia de las micosis, se ha hecho necesario desarrollar

sustancias antifúngicas para tratar éstas infecciones. Las primeras fueron los polienos y la
fluorocitosina, luego los imidazoles, posteriormente los triazoles y recientemente las
equinocandinas, sordarinas y azoles de última generación, entre otros. Con el desarrollo de
los triazoles, específicamente fluconazol e itraconazol, se inició la profilaxis antifúngica y
la terapia empírica en pacientes inmunodeprimidos con sospecha clínica de micosis. Estas
indicaciones trajeron como consecuencia cambios epidemiológicos, como la aparición de

6
cepas con resistencia secundaria a los antifúngicos y la sustitución de especies sensibles por
otras con resistencia intrínseca [18].

En la última década se han estandarizado varias técnicas para la realización de las pruebas
de susceptibilidad a los antifúngicos, con el fin de detectar la sensibilidad y/o resistencia in
vitro y correlacionarla con la clínica del paciente y su evolución. Por ello, es muy
importante identificar y conocer el perfil de susceptibilidad de las distintas especies de
Candida aisladas de pacientes con infecciones graves, en cada centro de salud, en cada
región y país, ya que la epidemiología y la aparición de resistencia en las mismas es
dinámica.

Como se ha señalado previamente, las diversas especies de Candida pueden causar el

mismo cuadro clínico, desde una candidiasis superficial hasta una infección invasora, por lo
que el pronóstico y opciones terapéuticas difieren dependiendo de la especie aislada. Es
vital y necesario contar con laboratorios de microbiología y personal capacitado en el área
de micología, para así disponer de un diagnóstico oportuno y certero. Esto proporcionará
una valiosa información sobre la epidemiología fúngica de nuestros centros de salud y
además contribuirá a establecer pautas terapéuticas adecuadas para el paciente.

7
 DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO

Las bases del diagnóstico micológico en el laboratorio son [4,6,19-29]:

• Toma de muestra
• Examen directo
• Cultivo
• Identificación de levaduras
• Pruebas de susceptibilidad

Muestra: la toma y tipo de muestra es el paso más importante para lograr el aislamiento del
agente causal en toda infección, por lo que se debe elegir la más adecuada según la
impresión diagnóstica del médico. Es necesario cumplir las normas de asepsia y seguir las
recomendaciones según el tipo de muestra a tomar, así tendremos mayor probabilidad de
visualizar y aislar el agente etiológico responsable de la enfermedad.

Examen directo: es un paso esencial que no se debe omitir en el diagnóstico micológico.

Con este procedimiento podemos visualizar las estructuras fúngicas presentes en la
muestra, así como evaluar la cantidad y calidad de la misma, lo que orientará o confirmará
la sospecha clínica al poder realizar un diagnóstico preliminar de manera rápida y precisa.

Existen diversos procedimientos para realizar el examen directo. Entre ellos tenemos los
que se realizan entre lámina y laminilla (examen al fresco, KOH + tinta parker, tinta china)
y las tinciones (las más frecuentemente usadas son Gram, Giemsa y Ziehl Neelsen). Con
cualquiera de éstos procedimientos se podrá visualizar:
• blastoconidias
• cantidad, morfología y tamaño de las blastoconidias
• N° de gemaciones
• pseudohifas y/o hifas
• Tipo de células presentes (células epiteliales, leucocitos, macrófagos, etc.)

Blastoconidias

Hifas
Leucocitos

Figura 1. Examen directo al fresco. Pueden observarse blastoconidias, hifas

ramificadas y leucocitos.

8
Cultivo: una vez tomada la muestra, se procederá a sembrarla en los medios de cultivos
habituales para el aislamiento de hongos. En micología se utilizan los siguientes medios:
• Medios generales: Sabouraud dextrosa agar (SDA) es el medio universal para el
aislamiento de hongos, tanto filamentosos como levaduriformes.
• Medios selectivos: son aquellos medios que contienen antibióticos para inhibir la
flora microbiana y/o saprófita asociada, permitiendo el crecimiento solo de hongos
patógenos; entre ellos se encuentran el Mycosel o Dermasel que contiene
cloranfenicol y actidiona, el agar Sabouraud más cloranfenicol (S+C) y la infusión
cerebro-corazón más cloranfenicol (BHI, Brain Heart Infussion).
• Medios enriquecidos: son medios altamente nutritivos que favorecen el
aislamiento de hongos patógenos de lento crecimiento y se utilizan para evidenciar
el dimorfismo de los mismos, como agar sangre y agar BHI incubados a
temperatura de 37°C.
• Medios diferenciales: se utilizan para inducir alguna propiedad específica del
agente aislado, lo cual es esencial para su identificación taxonómica; entre ellos se
encuentran el agar cromogénico para Candida, agar bilis, agar corn meal, agar urea
y agar Gorodkowa, entre otros.

Identificación de levaduras: es un procedimiento integrado por una serie de pruebas

fisiológicas y bioquímicas que son necesarias para identificar el género y la especie de la(s)
levadura(s) aislada(s) de la muestra analizada.

1. Pruebas rápidas: con el empleo de estas pruebas se pueden identificar género y

especie de algunas levaduras de forma rápida en un tiempo no mayor de 48 horas de
manera confiable.

a. Producción de tubo germinal o filamentización en suero: consiste en colocar

una pequeña porción de una colonia obtenida de un cultivo de 24 horas en
0,5 ml de suero e incubar a 37°C por 2 horas. Esta prueba es positiva para C.
albicans, quien produce un tubo fino y continuo, sin constricción en el lugar
de origen.

Figura 2. Tubo germinal de Candida albicans (400x)

9
b. Producción de clamidoconidias: para obtener esta estructura de resistencia
característica de C. albicans, es necesario utilizar el medio de bilis agar y/o
corn meal agar (CMA), colocando en el mismo una pequeña porción de la
colonia de levadura, incubando a 28°C por 24-48 horas.

Figura 3. Clamidoconidias en el medio de Corn Meal agar (400x)

c. Resistencia a la actidiona o cicloheximida (Mycosel): la mayoría de las

especies de Candida no-albicans son sensibles a la actidiona por lo que no
crecen en éste medio; son pocas las que son resistentes a dicho antibiótico y
la especie más importante resistente al mismo es C. albicans.

d. Producción de color en medio cromogénico: empleando el medio de

CHROMAgar Candida, se obtiene un color característico según la especie,
al término de la incubación por 24 a 48 horas a 28 o 37°C. El fundamento se
basa en la detección de actividades enzimáticas por parte de las levaduras
mediante la hidrólisis específica de un substrato cromogénico en presencia
de un indicador.
Hasta ahora, en nuestra experiencia, tanto en el medio producido por
Oxoid® como en el de Becton Dickinson® se pueden identificar 3 especies
con una alta confiabilidad por el color de la colonia. C. tropicalis produce
colonias lisas, cremosas de color azul intenso o colonias verde azuladas
oscuras y ambas con tono metálico; C. krusei produce colonias de color rosa
pálido, de aspecto velloso o ligeramente aterciopelado, opaco o seco y de
superficie plana; C. albicans produce colonias de color verde esmeralda,
brillantes, lisas y cremosas.
Es importante recordar que C. dubliniensis se comporta fenotípica y
bioquímicamente igual a C. albicans y por lo tanto también produce colonias
verdes, haciendo indistinguible una especie de la otra, aunque algunos
autores señalan que C. dubliniensis produce colonias de color verde oscuro y
no crece a 42°C. La única diferencia entre ellas se realiza por biología
molecular, técnica no siempre disponible en nuestros laboratorios.
Las colonias con otros colores obtenidos en el medio cromogénico, requieren
pruebas complementarias adicionales para identificar la especie de Candida
correspondiente.

10
 Nosotros recomendamos la utilización de éste medio para obtener
aislamiento primario a partir de muestras clínicas proveniente de pacientes
críticamente enfermos con sospecha clínica de candidiasis, y así ofrecer una
orientación preliminar en la confirmación de la impresión diagnóstica. Esto
permite instaurar una terapia antifúngica adecuada y eficaz en el menor
tiempo posible.
Otra ventaja importante que nos ofrece el uso del medio cromogénico es la
detección de 2 o más especies de Candida que pueden estar presentes en la
muestra y que no es posible detectar en los medios de cultivos habituales.

Candida krusei

Candida albicans

Candida tropicalis

Figura 4. Crecimiento de varias especies del género Candida en el medio de Mycosel

(izquierda) y Chromagar Oxoid® (derecha).

(a) (b)
Figura 5. Crecimiento de especies del género Candida en el medio Chromagar
Becton Dickinson®. (a) Candida albicans (izq) y Candida krusei (der). (b) Candida
albicans (izq) y Candida tropicalis (der).

11
 e. Prueba de crecimiento en cloruro de sodio (NaCl) al 6,5%: permite
diferenciar fenotípicamente C. albicans de C. dubliniensis. Consiste en
preparar una suspensión de la levadura sospechosa a 0,5 McFarland y
agregar 25 µl de esta suspensión a un tubo de ensayo con 1 ml de NaCl al
6,5% y una gota de extracto de levadura al 10%; posteriormente se incuba a
37 ºC por un máximo de 72 horas. Si al término de este tiempo se obtiene
turbidez y crecimiento en el tubo la identificación corresponderá a C.
albicans. El resultado contrario, sin turbidez y sin crecimiento,
corresponderá presuntivamente a C. dubliniensis. Es importante guardar este
aislamiento para su confirmación posterior por técnicas de biología
molecular.

f. Prueba de termotolerancia: ésta consiste en incubar las colonias de levaduras

a temperatura de 42 a 45 °C. La mayoría de las especies de Candida no
albicans, no crecen a temperaturas mayores de 37°C.

g. Hidrólisis de urea: con esta prueba se pone en evidencia la actividad de la

enzima ureasa presente en algunas especies de levaduras. La hidrólisis de
urea se produce en el medio de agar Urea de Christensen, después de
inocular a la levadura en proceso de identificación en el medio por 48 horas
a 28°C. Una prueba positiva se manifiesta por el viraje de color del medio
naranja a fucsia. Entre los géneros de levaduras que son ureasa positivos
están Cryptococcus, Rhodotorula y Trichosporon.

Resultado Resultado
negativo positivo

Figura 6. Hidrólisis de urea

2. Pruebas convencionales: consisten en la implementación de una serie de

procedimientos que requieren un mayor tiempo de incubación para llegar a la
identificación de género y especie de la levadura que no pudo ser identificada con
las pruebas rápidas.

12
a. Características morfológicas
Macroscópicas: en medios sólidos se observa el aspecto de las colonias
(mucosa o brillante, opaca o mate, butirosa o plegada, lisa, rugosa, levantada o
plana, aterciopelada), tamaño y color. En medios líquidos, como el caldo Malta,
se observan características como la formación de velo, anillo o sedimento, según
el requerimiento de oxígeno por parte de la levadura.
Microscópicas: en medio líquido observaremos forma, tamaño y reproducción
de las levaduras, empleando para ello el caldo Malta. Se inocula una porción de
la colonia y se incuba por 3 días a 28°C. En medio sólido se observará la
disposición de las blastoconidias y formación de pseudomicelio, característicos
para cada especie de Candida. Para ello se usará el método de Dalmau, que
consiste en sembrar por estrías una porción de la colonia en el medio de CMA y
se le coloca encima una laminilla cubre objeto; posteriormente se incuba a 28°C
por 24 a 48 horas y luego se observa en el microscopio la morfología
característica para cada especie.

b. Reproducción sexual: esta propiedad es inducida empleando el medio de

agar Gorodkowa, el cual favorece la formación de ascas en aquellas
levaduras que poseen reproducción sexual. Consiste en sembrar una porción
de la colonia en dicho medio e incubar a 28°C por 21 días; durante la
incubación se realizan las coloraciones de Kufferath o Wirtz a los 7, 14 y 21
días, con el fin de observar la morfología típica (en forma de sombrero,
circulares, con muescas ecuatoriales, etc.) y número de ascosporas por ascas.
La formación de ascas es característica de algunos géneros de levaduras
como Saccharomyces, Pichia y Zigosaccharomyces, que tienen fase sexual
descrita.

c. Pruebas bioquímicas y fisiológicas

Fermentación de azúcares (zimograma): se fundamenta en la propiedad que
tienen las levaduras de utilizar los azúcares en anaerobiosis, lo cual se evidencia
por la producción de gas. Los azúcares más utilizados son: glucosa, maltosa,
sacarosa, galactosa, trehalosa y lactosa en concentración al 2% y rafinosa al 4
%. Los azúcares se preparan en medio basal (peptona, extracto de levadura y
agua). La formación de gas (CO2) se detecta incorporando al medio líquido un
tubo de Durham invertido. La observación se hace diariamente, debido a que el
gas se puede reabsorber.

Técnica
• Preparar una suspensión de la levadura en estudio bien turbia (patrón N°
4 Mc Farland).
• Añadir 3 gotas de la suspensión a los tubos que contienen los azúcares
antes mencionados con el tubo de Durham invertido, agitar suavemente e
incubar a 28°C por 21 días, observando diariamente.
• Interpretar e identificar según tabla de identificación de levaduras

13
 NOTA: todo azúcar fermentado es asimilado, pero no todo azúcar
asimilado es fermentado.

Asimilación de azúcares o carbohidratos (auxanograma): se fundamenta en

la propiedad que tienen las levaduras de utilizar azúcares como fuente de
carbono en condiciones de aerobiosis. El medio basal sólido para el
auxonograma está exento de azúcares y alcoholes.
Técnica
• Fundir el medio H-S (Yeast Nitrogen Base, agar noble y agua). Este
medio está preparado en tubos con tapa de baquelita, a razón de 20 ml.
Después de fundido se debe mantener a una temperatura aproximada de
40 °C.
• Preparar 1 ml de una suspensión de la levadura en estudio bien turbia
(patrón N° 4 Mc Farland) en solución salina estéril 0,85% por cada tubo
a utilizar.
• Añadir la suspensión al medio H-S previamente fundido, mezclar
suavemente por inversión, verter en placas de petri de 90 mm de
diámetro y dejar solidificar a temperatura ambiente.
• Colocar sobre las placas discos de papel de filtro impregnados con los
siguientes carbohidratos: glucosa, maltosa, sacarosa, inositol, lactosa,
celobiosa, rafinosa, melibiosa, eritritol, ramnosa, galactosa, dulcitol,
xilosa y trehalosa.
• Incubar a 28 °C por 24 a 72 horas.
• Lectura e interpretación: se considera la prueba de asimilación positiva si
hay crecimiento de la levadura alrededor del disco y es negativa si no
hay crecimiento.

Glu Mal
Glu Mal

Mal Sac
Sac
Tre Xil
Xil
Tre

(a) Cel
(b)

Figura 7. Prueba de asimilación de azúcares o auxanograma. (a) Patrón de

asimilación de Candida albicans y (b) Candida tropicalis.

14
 Asimilación de nitratos (KNO3): consiste en la utilización de nitratos por las
levaduras como única fuente de nitrógeno. Se utiliza un medio basal con glucosa
y deben usarse como controles positivos urea o KNO3.

Técnica
• Fundir 20 ml del medio basal de carbono, el cual está dispensado en
tubo, y mantenerlo a una temperatura aproximada de 40 °C.
• Preparar 1 ml de una suspensión de la levadura en estudio bien turbia
(patrón N° 4 Mc Farland) en solución salina estéril 0,85%.
• Añadir la suspensión al medio de carbono fundido, mezclar suavemente
por inversión y verter en placas de petri de 90 mm de diámetro; dejar
solidificar a temperatura ambiente.
• Colocar sobre la placa dos discos de papel de filtro: uno impregnado con
solución de peptona como control y otro con solución de nitrato (KNO3).
• Incubar a 28 °C por 24 a 48 horas.
• Lectura e interpretación: crecimiento de la levadura alrededor del disco
con KNO3 y del disco control se considera una prueba positiva para la
asimilación de nitratos.

Principales especies del Género Candida y Cryptococcus

Se han descrito más de 160 especies de levaduras pertenecientes al género Candida

aproximadamente, y cerca de 10 especies son las que se aíslan con mayor frecuencia como
agentes causales de candidiasis invasora.

Candida es una levadura que, dependiendo de la especie, presentará una morfología

característica que ayudará en la identificación. Dentro de esa diversa morfología podemos
observar formas redondas o globosas, ovaladas, cilíndricas, pequeñas o grandes; su
gemación puede ser uni, bi o multipolar y además puede formar o no pseudomicelio.

Bioquímicamente asimilan y fermentan carbohidratos y no hidrolizan la urea. Los géneros

de levaduras que hidrolizan urea son Cryptococcus, Rhodotorula y Trichosporon.

A continuación se describen las características morfológicas macro y microscópicamente

más resaltantes de las levaduras de importancia médica que se aíslan con mayor frecuencia
[30].

Candida albicans

Morfología macroscópica (SDA): colonias de crecimiento rápido, cremosas, de color

blanco o ligeramente crema, lisas, convexas, de aspecto mate u opaco. En agar
cromogénico se observan colonias de color verde claro o verde esmeralda, ligeramente
brillantes, lisas y convexas. Crecen en Mycosel y a 42°C.

15
(a) (b) (c)

Figura 8. (a) C. albicans en S+C. (b) C. albicans: colonias verdes en medio

cromogénico. (c) C. albicans y C. tropicalis en medio Mycosel (izquierda) y
cromogénico (derecha).

Morfología microscópica (CMA): produce pseudohifas ramificadas con blastoconidios de

tamaño regular redondos y gemantes, de paredes lisas, dispuestos en acumulo o racimos en
los puntos de constricción de la pseudohifa; pueden o no estar presente las clamidoconidias
características de ésta especie. Las clamidoconidias son estructuras redondas, de pared
gruesa y lisa, con inclusiones citoplasmáticas; por lo general se ubican en posición terminal
en la pseudohifa, aunque también pueden presentarse intercaladas. En el medio de Bilis
agar podemos observar las clamicoconidias con las mismas características descritas.

Candida albicans produce tubo germinal, liso y continuo después de 2 horas de incubación
en suero a 37 °C; esta es otra característica micromorfológica que ayuda en la
identificación.

Figura 9. Tubo germinal de Figura 10. C. albicans Figura 11.

Candida albicans en CMA (100X) Clamidoconidias (400X)

Candida glabrata

Morfología macroscópica (SDA): colonias de crecimiento rápido, cremosas, de color

blanco o beige, lisas, convexas, de aspecto ligeramente brillante. En agar cromogénico se

16
observan colonias de color amarillo ocre, moradas o marrón claro, ligeramente brillantes,
lisas y convexas. No crece en Mycosel y crece a 42 °C.

(a) (b)

Figura 12. Candida glabrata. (a) En SDA. (b) En Mycosel (izq. y no se observa
crecimiento) y medio cromogénico (der).

Morfología microscópica (CMA): no produce pseudohifas o pseudomicelio. Se observan

blastoconidios pequeños, ovalados con gemación uni o bipolar; son de paredes lisas y finas.

(a) (b)

Figura 13. Candida glabrata en CMA. (a)100X. (b) 400X.

Candida parapsilosis

Morfología macroscópica (SDA): colonias de crecimiento rápido, cremosas, de color

blanco o ligeramente crema, lisas, convexas, de aspecto mate u opaco. En agar

17
cromogénico se observan colonias de color crema o marrón claro, lisas y convexas. No
crece en Mycosel y no crece a 42°C.

Figura 14. Candida parapsilosis en S+C

Morfología microscópica (CMA): produce pseudohifas ramificadas con blastoconidios

pequeños ovalados o alargados, de paredes lisas, dispuestos en pequeños racimos a lo largo
de la pseudohifa. Los blastoconidios pueden presentar gemaciones y la pseudohifa, en la
mayoría de los casos, presenta un aspecto curvo por uno de sus lados.

Figura 15. Candida parapsilosis en CMA (400X)

Candida tropicalis

Morfología macroscópica (SDA): colonias de crecimiento rápido, cremosas, de color

blanco, lisas, convexas, de aspecto mate u opaco. En agar cromogénico se observan
colonias de color azul púrpura intenso u oscuro con brillo metálico, son lisas y convexas.
No crece en Mycosel, aunque hay cepas que presentan un crecimiento débil y crece a 42°C.

18
 (a) (b)

Figura 16. Candida tropicalis. (a) En SDA. (b) En Mycosel (izq. y no se observa
crecimiento) y medio cromogénico (der).

Morfología microscópica (CMA): produce pseudohifas ramificadas con blastoconidios de

tamaño regular redondos u ovalados únicos o en pequeños grupos con poca gemación, de
paredes lisas, distribuidos espaciosamente a lo largo de la pseudohifa. Raramente produce
clamidoconidios y de presentarse son muy escasos. También pueden producir el tubo
germinal después de la incubación en suero por 2 horas a 37°C, pero la diferencia está en
que el tubo que germina de la célula madre presenta una constricción en el punto de salida,
y el diámetro es mayor o grueso, el tubo no es contínuo, ni fino como el que produce C.
albicans.

(a) (b) (c)

Figura 17. Candida tropicalis en CMA. (a) 100X. (b) y (c) 400X

Candida krusei

Morfología macroscópica (SDA): colonias de crecimiento rápido, cremosas, de color

beige, vellosas, planas, opacas, de aspecto seco y con el borde micelial en cultivos con más

19
de 5 días de incubación. En agar cromogénico se observan colonias de color rosa pálido a
rosadas, secas, planas y vellosas o aterciopeladas. No crece en Mycosel y si crece a 42 °C.

(a) (b)
a b

Figura 18. Candida krusei. (a) En SDA. (b) En Mycosel (izq. y no se observa
crecimiento) y medio cromogénico (der).

Morfología microscópica (CMA): produce pseudohifas largas, ramificadas ligeramente

gruesas o robustas con blastoconidios alargados o cilíndricos de tamaño medio y paredes
lisas, agrupados a intervalos regulares, dispuestos como troncos cruzados.

(a) (b)

Figura 19. Candida krusei en CMA. (a) 100X. (b) 400X.

Candida lusitaniae

Morfología macroscópica (SDA): colonias de crecimiento rápido, cremosas, de color

crema, lisas, convexas y brillantes. No crece en Mycosel y si crece a 42°C.

20
Morfología microscópica (CMA): produce pseudohifas ramificadas cortas y curvas en
forma de S, con cadenas cortas de blastoconidios globosos y alargados, de tamaño regular y
paredes lisas.

Figura 20. Candida lusitaniae en CMA (400X)

Candida guilliermondii

Morfología macroscópica (SDA): colonias de crecimiento rápido, cremosas, de color

crema a rosa pálido, lisas, planas y brillantes. No crece en Mycosel y no crece a 42°C.

Morfología microscópica (CMA): produce pseudohifas finas y cortas, blastoconidios muy

pequeños ovalados con poca gemación, agrupados en racimos en los puntos de constricción
de la pseudohifa.

Figura 21. Candida guilliermondii en CMA (400X)

21
Cryptococcus neoformans

Morfología macroscópica (SDA): colonias de crecimiento rápido, cremosas, mucosas y

brillantes, lisas, convexas, de color crema a marrón a medida que aumentan los días de
incubación. En agar cromogénico producen un color café o marrón brillante. No crece en
Mycosel y no crece a 42°C. Son ureasa positiva.

(a) (b)

Figura 22. Cryptococcus neoformans. (a) En SDA. (b) En Mycosel (izq. y no se observa
crecimiento) y medio cromogénico (der).

Morfología microscópica (CMA): se observan blastoconidios redondos, globosos y

ovalados, grandes, de pared gruesa y lisa; pueden presentar gemación polar o multipolar y
no producen pseudohifas. En el interior del blastoconidio pueden observarse a veces
inclusiones citoplasmáticas. La presencia de cápsula es característica de las levaduras
pertenecientes a este género y se evidencia en preparaciones con tinta china.

Figura 23. Cryptococcus Figura 24. Cryptococcus neoformans

neoformans en tinta china (400X) en CMA (400X)

22
 Métodos automatizados para la identificación de levaduras

En las últimas décadas se han desarrollo métodos comerciales, manuales y automatizados,

basados en la asimilación de nutrientes. Entre los comerciales de ejecución manual se
encuentran API 20C®, API Candida®, Auxacolor®, Candifast®, Fungichrom®,
Fungifast® y RapID Yeast Plus (Remel)®; entre los comerciales automatizados están Biolo
YT Microplate®, ID32C®, Microscan RYID (Rapid Yeast identificación)®, Vitek YBC
(Yeast Biochemical Card)®, Vitek 2 YST®, Vitek 2 ID-YST® y MIS Microbial ID®
(análisis de ácidos grasos). Estos últimos se encuentran actualmente disponibles en el
mercado al alcance de los laboratorios de microbiología, con la ventaja de son más rápidos
que los métodos convencionales, fáciles de utilizar y requieren el empleo de softwares para
la identificación de las diferentes taxa [20-22,24,31]. En Venezuela los sistemas
automatizados disponibles son: Microscan RYID®, Vitek YBC® y Vitek 2 YST®.

El sistema Microscan RYID® (Siemens) es un sistema automatizado para la identificación

de levaduras aisladas en muestras clínicas, que mide principalmente actividades
enzimáticas, usando sustratos cromogénicos e identificando las levaduras en un período de
4 horas. Las pruebas cromogénicas rápidas están basadas en la detección de enzimas
preformadas en un microorganismo desconocido, de este modo, el medio de cultivo en el
que ha crecido el organismo influirá en los resultados de la prueba, debido a que promueve
la expresión de diferentes enzimas [32-35].

El MicroScan® (Siemens) consta de una placa de 96 pocillos de microdilución con 27

sustratos deshidratados: 13 de aminoácidos ß-naftilamidas, 3 de carbohidratos, 9 de
sustratos nitrofenilos, 1 de 3-indoxil fosfato y urea. Además, el panel incluye dos pocillos
control para ayudar a interpretar las reacciones: control ß-naftilamida (BNAC) y control
nitrofenilo (NPC). Los resultados de las reacciones bioquímicas son empleados para crear
perfiles numéricos de nueve dígitos, que son comparados con una base de datos numérica
de identificación de organismos que provee el sistema, o se realiza la interpretación
automática mediante el AutoScan-4 o Walkaway. Las identificaciones se consideran
correctas cuando el porcentaje de identificación obtenido es superior o igual a 85 %
[32,35,36].

Figura 25. Panel Rapid Yeast Identification . MicroScan® RYID

23
El Vitek Yeast Biochemical Card® (YBC) (bioMerieux) es un sistema automatizado útil
para la identificación rápida de levaduras clínicamente importantes. Consiste en una tarjeta
de plástico con 30 pocillos, 26 de los cuales son pruebas bioquímicas convencionales y 4
controles negativos. Se usa en conjunto con un sistema automatizado, que incluye un
ordenador programado, incubador lector, módulo envase, módulo sellador y la impresora.
La tarjeta de plástico, después de su inoculación con la levadura en estudio, se incuba a
30ºC durante 24 o 48 h y es leída de forma automática. Las identificaciones consisten en la
conversión de los resultados de las pruebas bioquímicas en un número de nueve dígitos,
que posteriormente se compara con los códigos de la base de datos del ordenador. Las
respuestas se expresan en una o más posibilidades, siendo considerada una identificación
correcta de la levadura cuando el porcentaje de identificación es igual o superior al 85%
[36-41].

Figura 26. Tarjeta YBC Yeast Biochemical Card. Vitek®YBC

El Sistema Vitek 2 YST® (bioMerieux) es un sistema automatizado para la identificación

de levaduras. Consiste en una tarjeta de plástico con 64 pocillos, de los cuales 4 son para
detección de aminopeptidasas, 25 para asimilación de carbohidratos, 1 para hidrólisis de
esculina, 3 para glucosidasas, 3 para asimilación de KNO3 y compuestos nitrogenados, 9
para asimilación de ácidos orgánicos y 1 para hidrólisis de urea. Después de la inoculación
de la tarjeta con la levadura en estudio, se incuba a 35ºC durante 18 h y es leída de forma
automática. El software compara el conjunto de reacciones de las pruebas con las
reacciones suministradas en la base de datos para cada organismo. Se calcula un valor de
concordancia (porcentaje de probabilidad) que representa el nivel de comparación entre las
pruebas bioquímicas observadas y el patrón habitual de cada organismo; si existe una
concordancia excelente el valor de la probabilidad es del 99%. Se considera que la
identificación de la levadura es correcta cuando el porcentaje de identificación es igual o
superior al 85% [36-41].

24
 Figura 27. Tarjeta Vitek 2® YST

Claves para el uso de equipos automatizados para identificación de levaduras

Antes de implementar el uso de un equipo automatizado para la identificación de

levaduras, debe existir personal capacitado en el uso e interpretación de las pruebas de
identificación convencional, así como en el uso del equipo automatizado y en la
interpretación de los resultados generados por el mismo.

Los métodos automatizados pueden identificar levaduras entre 4 a 72 horas, lo cual

representa una gran ventaja para el laboratorio y el manejo clínico del paciente. Pero estos
métodos no han podido sustituir por completo a los convencionales, debido a que pueden
presentar problemas, sobre todo al momento de identificar levaduras de aislamiento poco
frecuente o raras, por lo tanto, deben ir acompañados de pruebas adicionales para asegurar
una identificación adecuada.

Es necesario conocer y utilizar pruebas complementarias para apoyar la

identificación realizada por estos sistemas, como la visualización morfológica con la
utilización del medio agar harina de maíz. Los trabajos de St-Germain et al., y Pincus et al.,
[22,32] apoyan esta afirmación, ya que encontraron que el porcentaje de identificación de
levaduras de aislamiento clínico aumentaba cuando se incluía junto con la identificación
automatizada la visualización de la morfología microscópica usando CMA, recomendando
su uso en paralelo a la utilización de los sistemas automatizados. Otra recomendación
importante para solucionar este problema es incluir el uso de medios cromogénicos. Este
medio es capaz de identificar presuntivamente 3 géneros de levaduras generando colores
diferentes para cada una de ellas y puede discriminar además la pureza del aislamiento. Por
lo tanto, la morfología microscópica y el medio cromogénico son alternativas de fácil
implementación en un laboratorio de microbiología para apoyar la identificación de
levaduras en forma automatizada.

Es muy importante mantener un control de calidad estricto para el uso de estos equipos. Las
casas comerciales que los distribuyen no disponen de cepas de control de calidad para
identificación, por lo tanto el laboratorio debe adquirirlas en una colección de

25
microorganismos confiable, que le garantice las propiedades morfológicas y fisiológicas de
las cepas a adquirir.

Los equipos automatizados representan una herramienta valiosa para el diagnóstico de

levaduras en la rutina del laboratorio, sin embargo, la experiencia del microbiólogo
continúa siendo una fortaleza importante para asegurar la calidad de los resultados.

Tabla 1. Características de los sistemas automatizados disponibles en Venezuela21

Características Walkaway RYID ® Vitek YBC® Vitek 2 YST ®

Fabricante Dade Microscan Inc Vitek System (bioMerieux) Vitek System (bioMerieux)

№ Especies 40 36 51

№ Pruebas 27 26 47

Principio ID Asimilación e hidrólisis Asimilación Asimilación

Inoculo 8 McFarland 2 Mcfarland 2 Mcfarland

Tiempo incubación 4 horas 24-48 horas 18 horas

Temperatura 35 º C 30 º C 35 º C

Pruebas adicionales Si Si Si

Biotipo Perfil 9 números No No

Software + % P Si Si Si

Lectura Visual y Automatizada Automatizada Automatizada

ID: identificación; %P: probabilidad: porcentaje de probabilidad

26
 Pruebas de susceptibilidad a los antifúngicos

Durante la década de los años 60 y hasta finales de los años 80, no se justificaba la
utilización de pruebas de susceptibilidad a los antifúngicos, debido a las escasas opciones
terapéuticas existentes para el tratamiento de las micosis profundas. Los fármacos
disponibles para estas patologías estaban circunscritos principalmente a la anfotericina B y
la 5-fluorocitosina [19]

Debido al incremento de las micosis emergentes y reemergentes, a partir de la década del

80 hasta nuestros días, sumado al aumento de pacientes con factores de riesgo para
desarrollar una micosis invasora, la industria farmacéutica ha desarrollado otros
antifúngicos como alternativas terapéuticas, motivo por el cual se hizo necesario el
desarrollo e implementación de las pruebas de susceptibilidad.

En el año 1985, el comité nacional de estándares de laboratorios clínicos norteamericano

(NCCLS), realizó una encuesta a diferentes laboratorios para conocer que tipo de pruebas
realizaban para evaluar la susceptibilidad a los antifúngicos, encontrando que cada
laboratorio tenía una metodología distinta. Al evaluar los resultados obtenidos por
Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) observaron que los valores reportados variaban en
más de 500 veces [19].

Los resultados de estas encuestas, motivaron a la NCCLS, actualmente CLSI (Comité

Internacional de Estándares de Laboratorio), a crear un subcomité para el estudio y
estandarización de las pruebas de susceptibilidad a los antifúngicos en levaduras del género
Candida y en Cryptococcus neoformans, dando lugar a la elaboración y publicación del
manual M27-P en 1992. Este subcomité siguió trabajando hasta que en 1997 aprobaron
definitivamente el documento M27-A, en el 2002 y 2008 publicaron las actualizaciones al
mismo M27-A2 y M27-A3 respectivamente. Este manual se utiliza como método de
referencia para realizar la prueba de susceptibilidad por microdilución en caldo para la
obtención de la CMI a los antifúngicos que se ensayen [19,42]. Tomando como base estas
publicaciones, en Europa también se creó un comité para la estandarización de pruebas de
susceptibilidad. Fruto de esto es el EUCAST (European Committee for Antifungal
Susceptibility Tests), el cual ha realizado importantes contribuciones al mejoramiento de
los manuales ya existentes, además de crear su propio documento de referencia.

Con esta información, podemos dividir los métodos para la determinación de la

susceptibilidad en dos grupos:

1. Métodos de dilución (M27-A2/CLSI y EUCAST) para la determinación de la CIM

por microdilución en caldo. Estos métodos por su complejidad están restringidos a los
centros de referencia (Figura 27). En la Tabla 2 se resumen las condiciones necesarias
para la realización de estos métodos y en la Tabla 3 los puntos de corte establecidos
para la lectura de los antifúngicos ensayados.

27
 Figura 28. CMI por microdilución en caldo.

Tabla 2. Condiciones de los métodos de referencia basados en la determinación de la

CIM por microdilución en caldo.

Condiciones M27-A2 (CLSI) EUCAST

RPMI1640 + 2% glucosa con
Medio de cultivo RPMI1640 con MOPS. pH 7
MOPS. pH 7
Inóculo 0,5 -2,5x103 UFC/ml 1-5x105 UFC/ml

Rango de
Fluconazol: 0,5 – 256 µg/ml
concentración de
Anfotericina B, Voriconazol, Itraconazol, Caspofungina: 0.06 – 32 µg/ml
los antifúngicos
Temperatura 35°C

24 horas. Si no hay suficiente

Tiempo de 48 h. Candida spp.
crecimiento del control incubar 24
incubación 72 h. Cryptococcus spp.
h mas.
Lectura Visual Espectrofotométrica (405 nm)
La CIM será la concentración del
AB: menor concentración con 100%
último pocillo con un valor de
de inhibición.
densidad óptica menor que el 50%
Azoles y Caspofungina:
del valor del control de
CIM (Pto. Final) concentración más baja que presente
crecimiento, es decir 50% de
una reducción sustancial de la
inhibición para fluorocitosina,
turbidez con respecto al control de
azoles y equinocandinas y 100 %
crecimiento ~ 50% (CIM-2)
de inhibición para anfotericina B.
Cepas de
C. parapsilosis ATCC 22019 y C. krusei ATCC 6258
referencia

28
Tabla 3. Puntos de corte aprobados por el CLSI. M27-A2. Concentración en µg/ml

Antifúngicos S S-DD R
Fluconazol ≤8 16 - 32 ≥ 64
Itraconazol ≤ 0.125 0.25 – 0.5 ≥1
Voriconazol ≤1 2 ≥4
Caspofungina [21] ≤2 ---- ≥4
S: susceptible. S-DD: susceptible dosis dependiente. R: resistente

Si bien es cierto que estos son los métodos de referencia, tienen varias desventajas, entre las
que se encuentran: la técnica es muy delicada, el medio de cultivo utilizado (RPMI 1640) es
muy costoso y se contamina fácilmente, es necesario disponer del antifúngico
químicamente puro suministrado por el laboratorio que obtuvo la patente del mismo, entre
otras. Debido a estas razones, son métodos de difícil implementación en un laboratorio de
microbiología de rutina. Conociendo estas debilidades, el CLSI posteriormente estandarizó
la realización de pruebas de susceptibilidad a los antifúngicos por el método de difusión en
agar, publicadas en el documento M44-A.

2. Métodos de difusión en agar (M44-A-CLSI y/o Etest). Con el primero se determina

la sensibilidad o resistencia cualitativa con discos, a través de la medición del diámetro
de un halo de inhibición medido en milímetros (Figura 28). Con las tiras de Etest se
determina CIM en µg/ml (Figura 29). Estos métodos son los que se utilizan en los
laboratorios asistenciales, debido a que son sencillos, rápidos y fáciles de interpretar;
tienen una concordancia con el método de referencia de 90% para el disco y 96% para
el Etest. (Ver Tabla 4).

Figura 29. Difusión en agar Figura 30. Etest

con discos

29
 Tabla 4. Puntos de corte para el método de difusión con discos (M44-A, CLSI).

Diámetro del halo en mm

Discos
S S-DD R
Fluconazol
≥ 19 15-18 ≤ 14
(25 µg)
Voriconazol
≥ 17 14-16 ≤ 13
(1 µg)
S: susceptible. S-DD: susceptible dosis dependiente. R: resistente

Actualmente, es necesario implementar las pruebas de susceptibilidad a los antifúngicos,

sobre todo cuando el agente causal involucrado es una levadura de importancia médica,
aislada de pacientes críticamente enfermos y con factores de riesgo para el desarrollo de
una candidiasis invasora y/o diseminada, con el fin de conocer su comportamiento in vitro.
Esto permitirá posteriormente establecer pautas terapéuticas que ayuden a minimizar la
resistencia en los centros de salud.

Es importante utilizar controles de calidad en las pruebas de susceptibilidad a los

antifúngicos, independientemente del método. Las cepas de referencia recomendadas por el
CLSI son C. parapsilosis ATCC 22019 y C. krusei ATCC6258. También se deben
controlar ciertos parámetros para confiar en los resultados de la prueba, entre ellos: inóculo
a partir de un repique no mayor a 24 horas, temperatura de incubación 35°C, pH del medio
de cultivo y solución buffer según el caso y el adecuado mantenimiento de las drogas
antifúngicas, entre otras. A continuación se anexan las tablas con los valores de referencia
para CMI por microdilución en caldo y por difusión.

Tabla 5. Rango de CMI a los antifúngicos por método de microdilución en caldo para
las cepas de referencia usadas como control de calidad.

Anfotericina B Fluconazol Itraconazol

Levadura Referencia CMI CMI CMI CMI CMI CMI
50% 90% 50% 80% 50% 80%
ATCC
C. krusei 0,5 0,5 – 2 32 16 - 64 <0,015 0,13 – 0,5
6258
ATCC
C. parapsilosis 0,25 0,25– 1 4 2–8 <0,015 0,06 – 0,25
22019
ATCC
C. glabrata 0,25 0,5 8 16 0,13 0,5
90030
Fuente: Departamento de antifúngicos. Instituto Carlos Malbrán. Buenos Aires. Argentina. Octubre 2007.
CMI 50%: concentración mínima del antifúngico que inhibe el crecimiento de la levadura en un 50%. CMI
90%: concentración mínima del antifúngico que inhibe el crecimiento de la levadura en un 90%.

30
Tabla 6. Diámetro (mm) de la zona de inhibición de las cepas de referencia usadas
como control de calidad. Método de difusión por disco para fluconazol y voriconazol.

C. parapsilosis C. krusei
Antifúngico
ATCC 22019 ATCC 6258
Fluconazol (25 µg) 22 - 33 -------
Voriconazol (1 µg) 28 - 37 16 - 25
Fuente: Manual M44-A. Method for antifungal disk diffusion susceptibility
of yeasts. 2004. Vol. 24. N° 15. Pág. 11.

Tabla 7. Diámetro del halo (mm) de la zona de inhibición para el método de difusión
con NEO-SENSITABS.

NEO- Diámetro del halo (mm) CIM (µg/ml)

SENSITABS Sensible Intermedia Resistente Sensible Resistente
Anfotericina B ≥ 15 14 – 10 < 10 ≤1 ≥4
Fluconazol ≥ 19 18 – 15 ≤ 14 ≤8 ≥ 64
Itraconazol ≥ 15 14 – 10 < 10 ≤ 0,12 ≥1
Voriconazol ≥ 17 16 - 14 ≤ 13 ≤1 ≥4
Fuente: Guía de trabajo práctico. Dpto. de Micología. INEI. ANLIS. Dr. Carlos Malbrán.
Buenos Aires. Argentina. Octubre 2007.

Los métodos comerciales existentes, como ETEST y NEO-SENSITABS, están basados en

el manual del CLSI y para su realización deben seguirse estrictamente las instrucciones del
fabricante, para poder interpretar los resultados obtenidos.

A continuación se presentarán una serie de figuras como guías para la interpretación

adecuada de las pruebas de susceptibilidad por difusión con Etest y discos.

31
Susceptibilidad por el método de difusión con Etest en Müeller Hinton modificado
Voriconazol: 0,012 µg/ml. Itraconazol: 0,016 µg/ml

Figura 20. CIM por ETEST, en medio MH modificado

Susceptibilidad por el método de difusión Etest en Müeller Hinton modificado.

Fluconazol: 0,50 µg/ml. Anfotericina B: 0,016 µg/ml

32
 Susceptibilidad por el método de difusión con discos en Müeller Hinton modificado.
Se muestra la forma correcta donde realizar la lectura de los halos de inhibición.

Susceptibilidad por el método de difusión con discos en Müeller Hinton modificado.

Se muestra la forma correcta donde realizar la lectura de los halos de inhibición. La
cepa presenta fenómeno “trailing” (sobrecrecimiento) con los discos de Fluconazol y
Voriconazol. Debe seguirse la norma para la lectura (80% de inhibición de
crecimiento) sin tomar en cuenta el fenómeno de sobrecrecimiento que se observa.

33
 Susceptibilidad de una cepa de Candida albicans resistente a Fluconazol.
Etest Fluconazol: 32µg/ml. Disco de Fluconazol: 8 mm.

Susceptibilidad de una cepa de Candida albicans con efecto “trailing”

(sobrecrecimiento). La lectura debe realizarse siguiendo la norma (80% de inhibición
de crecimiento) y sin tomar en cuenta el fenómeno de sobrecrecimiento. Voriconazol:
0,19 µg/ml (sensible). Itraconazol: 4 µg/ml (resistente).

34
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dilution antifungal susceptibility testing of yeasts; approved standards. Wayne PA: NCCLS
22: 1-29.

38
 ANEXOS

MEDIOS DE CULTIVOS

Agar Sabouraud

Dextrosa 40 gr
Peptona 10 gr
Agar 15 gr
Agua destilada 1000 ml

Hervir en baño de María el agua y el agar hasta disolución completa. Agregar la dextrosa y
peptona agitar y llevar a esterilización en autoclave a 121°C, 15 lb por 15 minutos.

Nota: En la práctica diaria es suficiente añadir al medio 20 gr de dextrosa.

Agar Sabouraud más cloranfenicol

Agar Sabouraud fundido 1000 ml

Solución de cloranfenicol 10 ml

Disolver 100 mg de cloranfenicol en 10 ml de alcohol 95° y agregar al medio. Autoclavar a

121°C, 15 lb por 15 minutos y distribuir en placas o tubos.

Agar Malta

Extracto de Malta 30 ml
Agar 15 gr
Agua destilada 1000 ml

Disolver en baño de María, ajustar pH a 5.5, esterilizar en autoclave a 121°C, 15 lb por 15

minutos y distribuir en tubos y/o placas.

Caldo Malta

Extracto de Malta 15 ml
Agua destilada 1000 ml

Ajustar el pH a 4.0. Distribuir 5 ml del medio por tubo, esterilizar en autoclave a 121°C, 15
lb por 15 minutos.

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Corn Meal Agar (CMA)

Corn meal agar 17 gr

Dextrosa 2 gr
Sucrosa 3 gr
Extracto de levadura 1 gr
Agua destilada 1000 ml

Disolver en agua destilada caliente todos los componentes y esterilizar en autoclave a

121°C, 15 lb por 15 minutos. Dispensar en placas o tubos.

Medio de Bilis agar (Feo)

Bilis en polvo (Bacto Oxgall) 20 gr

Agar 1 gr
Cloranfenicol 0,25 gr
Agua destilada 1000 ml

Mezclar los componentes y calentar en baño de María por 15 minutos, distribuir 2 ml del
medio en tubos 13 x 100 y esterilizar en autoclave a 121°C, 15 lb por 15 minutos, pH final
7,0

Agar Urea de Christensen

Peptona 1 gr
Dextrosa 1gr
Cloruro de sodio 5 gr
Fosfato de potasio monobásico
(KH2PO4) 2 gr
Rojo de fenol 0,012 gr
Agua destilada 1000 ml

Disolver en baño de María y ajustar el pH a 6,8, agregar 15 gr de agar, distribuir 4,5 ml por
tubo y esterilizar en autoclave a 121°C, 15 lb por 15 minutos. Agregar 0,5 ml de sal de úrea
al 20% previamente esterilizada por filtración. Inclinar.

Medio de Gorodkowa agar

Glucosa 0,1 gr
Peptona 1 gr
Cloruro de sodio (NaCl) 0,5 gr
Agar 2 gr
Agua de chorro 100 ml

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Ajustar el pH a 7,0, distribuir en tubos a razón de 5 ml en cada uno, esterilizar en autoclave
a 121°C, 15 lb por 15 minutos y luego inclinar.

Coloración de Ascas

- Kufferath modificado
Colorante de Ziehl Neelsen
Alcohol clohrídrico: ácido clohrídico concentrado al 1% en alcohol de 95%
Azul de metileno al 1%
Técnica
• Hacer un extendido en una lámina con la suspensión de la levadura, dejar secar y
fijar al calor.
• Cubrir la preparación con el colorante de Ziehl Neelsen y calentar hasta la emisión
de vapores, mantener caliente durante 5 minutos. Lavar con agua corriente.
• Decolorar con el alcohol clohrídrico y lavar con agua.
• Colorear con azul de metileno al 1%, durante 1 minuto, lavar con agua y dejar secar.
• Los ascosporos se colorean de rojo y las células vegetativas de azul.
(Los ascosporos de Schizosaccharomyces no son ácido resistentes)

- Coloración de Wirtz
Solución de Bicromato de potasio al 1%
Solución de Verde de Malaquita al 5%
Solución alcohólica de Safranina, según Fleming:
Alcohol etílico absoluto 50 ml
Agua destilada 21 ml
Safranina 0,5 gr
Técnica
• Fijar el frotis y cubrir con solución de bicromato de potasio al 1% por 15 segundos.
• Lavar la preparación y cubrir la lámina con la solución acuosa de verde de
Malaquita al 5%, calentar hasta la emisión de vapores por 5 minutos.
• Lavar
• Contracolorear con solución alcohólica de safranina por 30 segundos. Lavar y secar.
• Los ascosporos se colorean de verde, ascas de rosado claro y las células vegetativas
de rojo

Medio auxanográfico para asimilación de carbono (Haley-Stándar).

Yeast Nitrogen base 0,67 gr

Agar noble o lavado 20 gr
Agua destilada 1000 ml

Dispensar 20 ml en tubo tapa de rosca, esterilizar en autoclave a 121°C, 15 lb por 15

minutos.

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- Preparación de las soluciones a base de carbohidratos para impregnar discos de
papel para la asimilación de carbonos

Preparar soluciones al 20% de cada carbohidrato a ensayar en agua destilada, esterilizar por
filtración y conservar en refrigeración.

Se coloca una capa de discos estériles de 0,25 pulgadas (6 mm de diámetro) en placas de

Petri y con una jeringa se coloca una gota de la solución de carbohidrato a cada disco, éstos
se dejan secar entre 48 a 72 horas a temperatura ambiente. Los discos impregnados con
inositol, rafinosa y maltosa requieren una segunda saturación.

Medio auxanográfico para asimilación de nitrógeno (Delf)

Yeast Carbon base 12 gr

Agar noble o lavado 20 gr
Agua destilada 1000 ml

Dispensar 20 ml en tubo tapa de rosca, esterilizar en autoclave a 121°C, 15 lb por 15

minutos.

Medio para la prueba de Fermentación de carbohidratos sin indicador

Peptona 2,5 gr
Extracto de levadura 2,5 gr
Agua destilada 100 ml

• Disolver los componentes en agua destilada

• Distribuir alícuotas de 5 ml en tubos de 12 x 120 mm, que contengan el tubo de
Durham invertido.
• Autoclavar a 121°C, 15 lb por 15 minutos.
• Agregar al medio basal 1 ml de la solución de azúcar al 20%, previamente
esterilizada por filtración.
• Guardar en refrigeración.

Medios de cultivos para las pruebas de susceptibilidad de difusión con discos

Medio de Mueller Hinton agar

Para 1 litro de Mueller hinton seguir las instrucciones del fabricante y agregar 20
gramos de glucosa y 100 µl de la solución stock de azul de metileno. Autoclavar por 15
minutos a 1 atmósfera. Dejar enfriar a 50°C y dispensar 25 ml por placa de petri.

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Solución Stock de Azul de Metileno

Preparar la solución stock, agregar 0,1 g de azul de metileno en 20 ml de agua

destilada (5mg/ml) concentración final en el medio de cultivo será de 5µg/ml.

Medio de RPMI1640 agar

Los componentes se preparan en dos soluciones separadas: RPMI x2 y agar x2.

Solución 1: RPMI 2%G x2

RPMI 1640 10,4 g

MOPS 34,5 g
Glucosa 19 g
Agua destilada estéril CSP 500 ml

Disolver en frío. Ajustar pH a 7 con NaOH 10 M. Llevar a 500 ml con agua destilada en
probeta y comprobar el pH 7. Esterilizar por filtración.
Calentar y mantener a 65°C.

Solución 2: Agar x2 (30g/l)

Bacto agar 15 g
Agua destilada 500 ml

Calentar y agitar hasta disolver completamente el agar. Autoclavar por 15 minutos a 121°C.
Enfriar y mantener a 65°C.

Una vez mantenidas ambas soluciones a 65°C, se mezclan evitando la formación de

burbujas en la siguiente proporción: 500 ml de la solución 1 y 500 ml de la solución 2.
Dispensar 20 ml en placa de Petri de 90 mm. Las placas con el medio solidificado se
guardan sin secar a 4°C. Antes de su utilización se secan destapadas, durante 20 minutos a
37°C.

Medios de cultivo comerciales

Con respecto a los medios de cultivos comerciales disponibles como agar Mycosel® o
Dermasel®, Chromagar Candida por Oxoid® o Becton Dickinson®, es importante seguir
las instrucciones del fabricante para garantizar la calidad del producto.

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