Curso de BIOLOGIA MOLECULAR Básica Do Portal Educação - MÓDULO IV

Curso de
Biologia Molecular Básica
MÓDULO IV
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mesmo. Os créditos do conteúdo aqui contido são dados aos seus respectivos autores
descritos nas Referências Bibliográficas.
MÓDULO IV
TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR
Há várias técnicas em biologia molecular usadas numa ampla variedade de

estudos tais como genética de populações, estudos sobre evolução ou filogenia,
mapeamento e expressão gênica. Estas técnicas se desenvolveram a partir de
métodos básicos.
No início da década de 1970, novas maneiras de se analisar e explorar as
principais moléculas constituintes de uma célula começou a ser posta em prática.
Essas metodologias inovadoras foram chamadas de tecnologia do DNA
recombinante.
Com o desenvolvimento técnico, vários avanços significativos têm sido
obtidos através do isolamento, análise e síntese de sequência de DNA e genes, e da
introdução desses DNAs recombinantes em células vivas para o estudo da sua
função e dos mecanismos que controlam sua expressão. Atualmente, os esforços
estão voltados para o entendimento das relações entre ácidos nucleicos e proteínas
que resultam em, virtualmente, todos os eventos genéticos na célula.
1. Extração de DNA
Vários procedimentos de extração de DNA de tecidos vegetais ou de

microrganismos têm sido descritos na literatura. O que se observa em geral é que
protocolos padrão são utilizados com algumas modificações visando resolver os
problemas específicos da espécie em estudo. Os protocolos se caracterizam por
utilizar o detergente catiônico CTAB (‘cationic hexadecyl trimethyl ammonium
bromide’) no tampão de extração e são, portanto, comumente denominados de
protocolos CTAB; ou fenol.
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Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
A maioria dos protocolos de extração de DNA envolve em geral cinco etapas
básicas. Na primeira etapa, algum tipo de maceração mecânica é utilizado para
romper as paredes e membranas celulares das células microbianas, crescidas em
meio líquido e separadas desse por filtração ou centrifugação, normalmente feita na
presença de nitrogênio líquido. Na segunda etapa, as células maceradas são
ressuspendidas em um tampão de extração, contendo algum detergente (SDS no
caso da extração que utiliza fenol), antioxidantes, EDTA e agente tamponante,
visando à solubilização de membranas lipoproteicas e desnaturação de proteínas
enquanto o DNA é protegido da ação de enzimas de degradação. Esta suspensão é
submetida a uma temperatura entre 50 e 65 ºC durante 15 a 60 minutos para facilitar
a solubilização e homogeneização da suspensão. Na terceira etapa, esta suspensão
é submetida a uma extração com um solvente orgânico, clorofórmio-álcool
isoamílico. As fases, orgânica e aquosa são separadas por intermédio de
centrifugação. Nesta extração, lipídios, proteínas e a maioria dos polissacarídeos
são retidas na fase orgânica inferior, enquanto que o DNA, RNA e alguns
polissacarídeos são retidos na fase superior (aquosa). Na quarta etapa, um álcool
(isopropanol ou etanol) e sal (NaCl) são adicionados à fase aquosa. O DNA na
presença de sal e álcool forma um precipitado frequentemente visível que pode ser
peletizado1 por centrifugação. Após lavagens do precipitado com álcool, na quinta e
última etapa, este precipitado de DNA/RNA é ressuspendido em um tampão Tris-
EDTA contendo RNAse para degradar o RNA, restando apenas o DNA genômico
desejado.
2. Quantificação de DNA em gel de agarose
Após finalizar os procedimentos de extração de ácidos nucleicos deve-se

verificar a quantidade de DNA obtida. A quantidade de DNA pode ser determinada
por dois métodos: a espectrofotometria ou em gel de agarose, por leitura da
intensidade de fluorescência do brometo de etídeo. O brometo de etídeo é um
corante que se intercala nas moléculas dos ácidos nucleicos sendo que a luz
ultravioleta induz sua fluorescência. A quantidade observada sob UV é proporcional
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à massa total de DNA da amostra colocada no poço da eletroforese. Para quantificá-
la, faz-se a foto (Figura 1) em câmara polaroide (ou também câmera digital) e
compara-se a fluorescência da amostra àquela de um padrão conhecido.
Fig. 1: Fotografia de eletroforese em gel de agarose, onde as diferentes

amostras de DNA de leveduras evidenciam a presença e integridade do
DNA, juntamente com os marcadores de peso molecular (primeira e última
colunas).
Os géis de agarose são dissolvidos na presença de tampão apropriado até

se obter uma solução clara e transparente. Após a sua fusão em alta temperatura
(ou em forno micro-ondas) a solução ainda quente é colocada em um suporte ou
molde em geral, de acrílico. Após ocorrer a solidificação da matriz, cuja densidade é
determinada pela concentração da agarose, as amostras podem ser aplicadas.
Quando o campo elétrico é aplicado por meio do gel, o DNA, que é carregado
negativamente em um pH neutro, migra para o ânodo. A taxa de migração é
determinada por uma série de parâmetros dentre os quais podem ser citados:
concentração da agarose, peso molecular do DNA, conformação do DNA, voltagem
aplicada (para uma máxima resolução, a voltagem não deve ser maior que 5 V/cm –
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entenda-se pela medida em cm, a distância entre os eletrodos da cuba de
eletroforese), direção do campo elétrico e composição do tampão.
3. Reação de Polimerização em Cadeia – PCR
Até meados da década de 1980, as técnicas de Biologia Molecular estavam

limitadas pela sensibilidade dos métodos de clonagem e detecção. Esses métodos
baseavam-se na marcação isotópica de sondas de DNA capazes de detectar
quantidades ínfimas de uma dada sequência-alvo, tais como fragmentos gênicos e
mRNA. Em, 1985, um grupo de cientistas da Cetus Corporation padronizou uma
técnica por meio da qual eram geradas, a partir do DNA genômico, grandes
quantidades de um fragmento específico de DNA, correspondendo a genes
presentes como cópia única do genoma.
Essa nova e revolucionária metodologia, baseada em uma reação de
replicação in vitro, consiste na chamada Reação de Polimerização em Cadeia
(Polymerase Chain Reaction – PCR), na qual se obtém o enriquecimento de um
fragmento específico de DNA por meio de sua duplicação em modo exponencial
(Figura 2). Assim, um gene presente no genoma como cópia única pode ser
amplificado a partir de DNA genômico complexo, podendo ser posteriormente
visualizado como uma banda discreta, constituída por moléculas de DNA, por meio
de eletroforese em gel de agarose corado com brometo de etídeo.
O princípio da PCR envolve três etapas básicas, requeridas na reação de
síntese de qualquer DNA, que são repetidas por várias vezes, em ciclos:
Desnaturação térmica do DNA molde;
Anelamento de oligonucleotídeos sintéticos, que funcionam como os
iniciadores da reação de polimerização, a cada uma das fitas do DNA molde;
3) Polimerização das novas fitas de DNA a partir de cada um dos
iniciadores, utilizando cada um dos quatro dNTP como substrato da reação de
polimerização.
O processo de amplificação envolve repetidos ciclos de desnaturação
térmica do DNA molde, anelamento dos iniciadores (primers) às suas sequências
complementares e extensão dos oligonucleotídeos anelados por uma DNA
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polimerase altamente resistente à desnaturação em temperaturas elevadas. Estes
primers são sintetizados artificialmente de maneira que suas sequências de
nucleotídeos sejam complementares às sequências específicas que flanqueiam a
região alvo. Assim, os iniciadores anelam-se às fitas opostas da sequência-alvo e
são orientados de tal forma que a síntese de DNA ocorra por meio da região
compreendida entre estes. Tem-se, então, a duplicação desse segmento de DNA a
cada ciclo de reação, e a cada ciclo sucessivo dobra a quantidade de DNA
sintetizada no ciclo anterior. O resultado é o acúmulo exponencial do fragmento
específico de DNA aproximadamente a 2n, onde n é igual ao número de ciclos
realizados.
No início, o principal problema técnico foi à enzima DNA polimerase, que
perdia a atividade enzimática rapidamente a elevadas temperaturas, necessárias no
processo de desnaturação do DNA. O isolamento de enzimas termoestáveis, a partir
de organismos termofílicos, como bactérias nativas de fontes termais ou de
chaminés vulcânicas do fundo do mar, trouxe a solução para esse problema técnico.
O grande impacto dessa técnica foi à utilização da DNA polimerase
termoestável, a partir da purificação da Thermus aquaticus, a Taq DNA polimerase,
em substituição ao fragmento Klenow da DNA polimerase I de E. coli, tornando a
técnica, uma das maiores realizações da Biologia Molecular. A grande estabilidade e
eficiência dessas DNAs polimerases, aumentou a especificidade e sensibilidade da
reação, assegurando que os iniciadores estarão anelados estavelmente somente às
suas sequências perfeitamente homólogas. Além disso, houve um ganho quanto à
eficiência da reação, obtendo-se um maior rendimento do produto amplificado e
também a possibilidade de amplificação de fragmentos de DNA de maior tamanho. A
maioria das enzimas DNA polimerase usadas em PCR é obtida a partir da clonagem
e do melhoramento de seus genes, o que envolve procedimentos da tecnologia do
DNA recombinante.
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Figura 2. Representação esquemática da amplificação do DNA utilizando a técnica do PCR.
Essa metodologia apresenta uma grande versatilidade, tendo vasta

aplicabilidade, como:
Varredura e/ou sequenciamento rápido de insertos de DNA;
Estudos de expressão qualitativa e quantitativa de genes específicos;
Identificação de mRNA gerado por meio de processamento alternativo do
pré-mRNA;
Amplificação e clonagem de sequências genômicas a partir do uso de
pequenas quantidades de DNA genômico complexo;
Síntese química de genes por meio da amplificação e junção de partes de
uma sequência de DNA conhecida;
Diagnóstico por meio da detecção das sequências de DNA específicas de
um determinado patógeno;
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Teste de paternidade;
Mutagênese, sítio dirigida, de modo a obter alterações de uma ou mais
bases no DNA amplificado.
4. Parâmetros da amplificação
Em razão a grande diversidade de aplicações da PCR, cada situação pode

requerer a otimização de um protocolo específico. No entanto, o uso de um protocolo
padrão exemplifica as condições para o bom funcionamento da maioria dos
experimentos.
Uma reação típica de PCR é constituída pelos seguintes componentes:
Água MiliQ estéril;
A enzima Taq DNA polimerase e seu respectivo tampão de reação
(concentrado 10x);
Os desoxirribonucleotídeos trifosfato (dNTP: numa mistura equimolar de
dATP, dCTP, dGTP e dTTP, que irão funcionar como substrato da reação de
polimerização);
O par de oligonucleotídeos que funcionarão como iniciadores (primers) que
vêm na forma de pellets liofilizados;
E o cátion bivalente magnésio (Mg+2), que é um cofator da Taq polimerase.
É de grande importância o preparo de uma mistura (“mix”) dos componentes
para reação de PCR, desta maneira a variabilidade intrínseca é minimizada,
considerando a alta sensibilidade da técnica. Na grande maioria dos protocolos de
PCR, é usado o procedimento de partida a quente (hot start), visando maximizar a
especificidade dos primeiros ciclos da reação de amplificação. O procedimento de
partida a quente convencional envolve a adição da enzima Taq DNA polimerase a
cada um dos tubos após seu aquecimento prévio a 95ºC.
Os parâmetros a serem definidos dependem das características do DNA
molde, dos iniciadores e do protocolo de amplificação. Assim, pode-se definir um
parâmetro padrão envolvendo três etapas: desnaturação, anelamento e extensão. A
fita dupla do DNA alvo é desnaturada através da elevação da temperatura para 92 a
95 C, de 15 segundos a 1 minuto. Na etapa de anelamento, a temperatura é
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rapidamente reduzida para 35 a 60 C, dependendo essencialmente do tamanho e
sequência do primer utilizado, permitindo a hibridização DNA-DNA de cada primer
com as sequências complementares que flanqueiam a região alvo. Em seguida, a
temperatura é elevada para 72 C para que a enzima DNA polimerase realize a
extensão a partir de cada terminal 3’ dos primers. Esta extensão envolve a adição de
nucleotídeos utilizando como molde a sequência alvo, de maneira que uma cópia
desta sequência é feita no processo. Este ciclo é repetido por cerca de 25 a 40
vezes. Uma vez que a quantidade de DNA da sequência alvo dobra a cada ciclo, a
amplificação segue uma progressão geométrica de maneira que, depois de apenas
20 ciclos, são produzidos mais de um milhão de vezes a quantidade inicial de
sequência alvo. Na extensão final, a temperatura usada na etapa de extensão é
repetida por cerca de 5 a 10 minutos. Esta etapa de incubação prolongada visa
assegurar que toda população de DNA amplificada encontre-se como uma fita dupla
e de tamanho completo. Por fim, uma incubação a 4 ºC por tempo indefinido.
Esta escala de amplificação permite, portanto, iniciar com quantidades
mínimas de DNA (da ordem de alguns picogramas ou nanogramas) e terminar a
reação com grandes quantidades de DNA de uma sequência específica de
interesse.
O DNA em grande quantidade pode ser facilmente detectado a olho nu
diretamente em gel de eletroforese por meio de corantes específicos para DNA
(brometo de etídeo). Entretanto, a técnica de PCR ainda apresentava uma limitação
significativa na obtenção de marcadores moleculares anônimos distribuídos pelo
genoma. A construção de primers para amplificação via PCR dependia
essencialmente do conhecimento prévio das sequências de nucleotídeos que
flanqueiam a sequência de DNA de interesse. Para se conhecer estas sequências é
necessária a clonagem e sequenciamento da região. Em vista disso, com exceção
de alguns genes de sequência conhecida, a PCR apresentou, de início, um uso
limitado como técnica para a obtenção de marcadores moleculares.
A facilidade, rapidez, versatilidade e sensibilidade da PCR, a torna
particularmente poderosa para estudos genético-moleculares, envolvendo grande
número de indivíduos de qualquer organismo vivo.
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5. Cuidados importantes na utilização da técnica
A grande sensibilidade da técnica exige cuidados importantes na sua

manipulação e desenvolvimento. Reagentes, soluções e os materiais utilizados
devem estar livres de possíveis contaminações por DNAs exógenos. Dessa forma:
- Devem-se utilizar luvas;
- As soluções e a água devem ser de boa qualidade;
- A vidraria deve estar adequadamente preparada;
- O material plástico, tais como ponteiras, tubos tipo Eppendorf, deve ser
novo e de procedência confiável;
- Se possível, as micropipetas devem ser de uso exclusivo nos
procedimentos de PCR;
- E um local de trabalho reservado e devidamente limpo.
6. Eletroforese em gel de agarose
A eletroforese em gel de agarose é usada como método analítico e

preparativo, pois, uma vez resolvidas, isto é, separadas as moléculas de DNA, um
fragmento de tamanho específico pode ser excisado do gel e purificado para,
posteriormente ser usado em uma gama de procedimentos utilizando técnicas de
manipulação genética.
Os géis de agarose comumente preparados na rotina de laboratórios são
indicados para separar fragmentos de DNA que variam entre poucas centenas de
pares de bases até cerca de 40-50 kb. Para fragmentos com tamanhos menores, é
indicada a eletroforese em gel de poliacrilamida ou a utilização de agaroses
especiais, quimicamente modificadas.
A agarose é um polímero linear extraído de algas marinhas, e o gel é
formado por uma complexa rede desse polímero. O polímero é fundido na presença
da solução tampão adequado até que se obtenha uma preparação transparente e
homogênea. Com temperatura próxima de 60ºC, a solução é transferida para um
molde utilizado para o preparo do gel (figura). Após a gelificação, o diâmetro dos
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poros da matriz formada é diretamente proporcional à concentração do polímero
utilizada.
Em razão da presença de grupamentos fosfato, a molécula de DNA possui
carga negativa em pH neutro ou alcalino. Consequentemente, quando aplicada a um
gel e submetida a um campo elétrico, essa macromolécula migrará em direção ao
anodo, ou seja, pólo positivo (Figura 3).
Figura 3. Modelo esquemático da eletroforese, demonstrando o “poço” em que os

fragmentos de DNA são aplicados e submetidos a um campo elétrico, de maneira que os fragmentos
migrem do pólo negativo para o pólo positivo. O esquema também mostra que fragmentos de menor
tamanho migram mais rápido que fragmentos de maior tamanho.
A velocidade da migração bem como o poder de resolução de um gel

depende do tamanho e da forma da molécula. Para a visualização e a interpretação
dos resultados, são necessárias a incorporação de um agente intercalante de DNA
(brometo de etídeo) e a utilização de marcadores de massa molecular apropriados,
de maneira que migrem em paralelo às amostras de interesse.
Assim, pode-se definir um parâmetro padrão envolvendo as seguintes
etapas:
Preparar uma solução de agarose (a concentração dependerá do tamanho
da molécula de DNA a ser visualizada) em tampão TAE ou TBE (diluído). Aquecer
no forno micro-ondas até a total dissolução da agarose. Esperar a solução esfriar;
Esperar esfriar e adicionar Brometo de etídeo (10 mg/mL);
Colocar a solução, no suporte (“cama”) de eletroforese;
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Colocar o pente de modo que não forme bolhas. Aguardar o gel endurecer e
retirar o pente;
Colocar o conjunto na cuba de eletroforese, cobrindo com o tampão;
Colocar nos poços o DNA (diluído) e misturado com solução azul de
bromofenol.
Encaixar a tampa da cuba e os eletrodos de modo que o DNA migre do pólo

negativo para o positivo;
83
Ajustar a voltagem e o tempo;
Visualizar as bandas obtidas com auxílio de luz ultravioleta.
7. Fatores que afetam a migração do DNA no gel
Tamanho da molécula de DNA e concentração do gel – As moléculas

maiores migram mais lentamente em razão de um maior efeito friccional de arraste e
porque as mesmas promovem menor aquecimento em seu trajeto de migração
através dos poros do gel. O tamanho da molécula de DNA, dado em número de
pares de bases (pb), é diretamente proporcional à massa molecular que é dada em
Daltons (Da). A densidade do gel determina o intervalo de tamanho das moléculas
que podem ser adequadamente separadas. Existem diferentes tipos de marcadores
com massa molecular variando desde poucos pares de bases até dezenas de kb. O
tamanho de uma molécula de DNA pode ser determinado com precisão razoável se
um marcador de massa molecular adequado migra em paralelo com as moléculas
que estão sendo fracionadas. Quando a concentração desses marcadores é
conhecida, pode-se fazer uma estimativa visual de concentrações desconhecidas
das amostras por comparação direta da intensidade das bandas. Quantificações
mais acuradas devem ser feitas por densitometria. No entanto, onde houver
necessidade de determinar concentrações desconhecidas com alta precisão, a
espectrofotometria é a metodologia mais indicada.
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Conformação do DNA – O DNA apresenta três formas distintas que migram
em velocidades diferentes no gel de agarose (Figura 4). As formas são: circular
superenovelada (forma 1), circular relaxada (forma 2) e linear (forma 3). A motilidade
das diferentes formas pode variar de acordo com o tamanho da molécula de DNA e
também depende do diâmetro dos poros do gel, voltagem e força iônica do tampão
de corrida. A forma 1 migra mais rapidamente que a forma 3, e a forma 2 é a mais
lenta. A forma 1 é a mais rápida, em razão do seu menor diâmetro.
UV -
Circular relaxada
Superenovelada
Superenovelada Circular relaxada

+
Figura 4. Representação esquemática e também por meio de fotografia das formas
superenovelada e circular relaxada do DNA.
Agentes intercalantes – O brometo de etídeo (Figura 5) é um análogo de

base que se intercala na molécula de DNA e emite fluorescência quando exposto à
luz ultravioleta (UV). As moléculas de DNA fracionadas em géis de agarose
contendo brometo de etídeo são diretamente visualizadas na presença da luz UV, e
o limite de detecção é cerca de 10 ng/banda de ácido nucleico. A intensidade de
fluorescência é diretamente proporcional à massa molecular do fragmento de ácido
nucleico. Apesar de ser bastante ampla a faixa de UV, geralmente, o comprimento
de onda mais utilizado para detecção de ácidos nucleicos é de 300-360 nm
(nanômetros). O brometo de etídeo diminui a motilidade do DNA, e esse
retardamento na corrida se deve ao aumento no tamanho e na rigidez das formas
linear e circular relaxada. O efeito intercalante retarda a corrida da forma linear cerca
85
de 15% e é mais pronunciado no DNA relaxado, pois nesse tipo de conformação a
presença de brometo de etídeo induz à formação de superenovelamento positivo,
que acarreta aumento na motilidade eletroforética.
8.
Figura 5. Estrutura química do brometo de etídeo.
Voltagem – As moléculas de DNA migram por meio do gel com velocidade

diretamente proporcional à voltagem aplicada, essa correlação acontece até o limite
de 5V/cm, que é a distância entre os eletrodos. A linearidade é perdida quando se
aplica uma voltagem maior, então as moléculas maiores migram mais rapidamente
que as menores.
Tampão de corrida - A composição e a força iônica do tampão de corrida
influenciam na migração e na qualidade de resultado da eletroforese. Os tampões
mais usados são o TAE (Tris-Acetato-EDTA) e TBE (Tris-Borato-EDTA). O TBE tem
um custo mais alto que o TAE, porém apresenta maior capacidade tamponante,
enquanto o TAE promove uma corrida cerca de 10% mais rápida quando o DNA
apresenta-se sob forma linear. Entretanto, a capacidade de resolução de DNA de fita
dupla é semelhante nos dois tampões. A baixa força iônica promove uma migração
muito lenta, e a alta força iônica provoca alta condutividade elétrica, gerando calor e
podendo desnaturar o DNA.
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Essa técnica exige o uso de materiais perigosos e mutagênicos (luz UV e
brometo de etídeo), portanto são necessários cuidados importantes na sua
manipulação e desenvolvimento, como:
- Usar luvas para manipular géis ou soluções contendo brometo de etídeo,
que é um potente agente mutagênico;
- Usar óculos e outros equipamentos de proteção ao trabalhar com a luz UV,
já que a mesma é mutagênica;
- A agarose fundida pode eventualmente borbulhar, por isso não se deve
agitar o erlenmeyer logo após a fusão, para evitar queimaduras.
9. Eletroforese em gel de poliacrilamida
A eletroforese em gel de poliacrilamida é uma técnica amplamente usada

para a separação de biomoléculas, tais como os ácidos nucleicos e as proteínas. Os
géis de poliacrilamida são constituídos pela polimerização da acrilamida e da N,N’ –
metilenobisacrilamida, que é induzida por radicais livres, e apresentam poros de
dimensões moleculares, sendo que a separação nessas malhas é baseada tanto
nos princípios da filtração em gel como na mobilidade eletroforética das moléculas.
Nesse sentido, nesse tipo de eletroforese, as grandes moléculas têm sua migração
retardada com relação às moléculas de menor tamanho.
O sistema de poliacrilamida consiste em dois géis que apresentam
composição e função diferentes: o gel de empacotamento (concentrador) e o gel de
corrida (separador). O primeiro é constituído por uma malha de grande porosidade
(gel de poliacrilamida a 5%), e sua função é compactar a amostra em um pequeno
volume, depositando-a sobre a superfície-limite do gel separador como uma “banda
estreita”. Já o segundo é constituído de uma malha de poros menores (poliacrilamida
na faixa de 8% a 20%), com a função de separar as proteínas ou DNAs, em razão
de suas massas moleculares.
Na maioria dos casos, o tampão nos reservatórios da cuba de eletroforese
apresenta pH e força iônica diferentes do tampão usado para confeccionar o gel
(sistema descontínuo). Depois de aplicada, a amostra é arrastada por uma fronteira
de íons em movimento, que é criada quando a corrente elétrica passa através dos
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eletrodos, do pólo negativo em direção ao pólo positivo. A combinação do sistema
descontínuo do tampão com a grande porosidade do gel concentrador promove o
efeito de empacotamento da amostra, o qual é crucial para a alta resolução desse
sistema de separação.
Após a separação, as proteínas ou DNAs podem ser visualizadas segundo
diversas metodologias de coloração, detecção imunológica ou radioativa. Cada um
desses sistemas de detecção apresenta o requerimento de um protocolo específico
para sua execução. As duas principais metodologias de coloração utilizam o corante
azul brilhante de Coomassie ou sais de prata (soluções amoniacais de prata ou
nitrato de prata). A coloração de prata é cerca de cem a mil vezes, mais sensível que
a coloração de Coomassie, podendo detectar moléculas em quantidade de 0,1 a 1,0
ng em uma única banda.
Assim, pode-se definir um parâmetro padrão envolvendo as seguintes
etapas:
Montagem da cuba de eletroforese e confecção do gel de poliacrilamida. Ao
contrário da eletroforese em gel de agarose, que utiliza uma cuba horizontal para
corrida do gel, a eletroforese em gel de poliacrilamida utiliza uma cuba vertical;
Verter o gel de corrida, e assim que esse polimerizar, verter sobre ele o gel
de empacotamento e introduzir imediatamente o pente para formação dos poços;
i.
Após a polimerização, remover o pente e limpar os poços;

Adicionar o tampão aos reservatórios e aplicar as amostras;
88
Conectar os eletrodos à fonte de corrente e ligá-la. A corrente sempre irá do
pólo negativo ao pólo positivo;
Após o término da corrida, realizar a coloração para visualização do gel.
- Os reagentes acrilamida e bisacrilamida são neurotóxicos, e seus efeitos

são cumulativos, portanto é obrigatório o uso de luvas e máscara para manipulação
desses reagentes.
11. Southern Blot
A técnica de Southern blot baseia-se na hibridização entre moléculas de

DNA, fixas em um suporte, com sondas (moléculas de DNA ou RNA) marcadas,
visando à localização de sequências específicas de DNA. Esse tipo de procedimento
torna-se possível em razão da estrutura em duplas fitas das moléculas de DNA que,
quando aquecidas ou submetidas a tratamento com soluções desnaturantes, tendem
a separar-se. Essas moléculas desnaturadas, quando submetidas a um
resfriamento, em condições controladas tendem novamente a renaturar-se.
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O pesquisador Ed Southern propôs a transferência e a imobilização dos
fragmentos de DNA resultantes da digestão enzimática em um suporte sólido (Figura
6). Assim, após a digestão e a eletroforese do DNA, as moléculas presentes no gel
são transferidas para membranas, geralmente de nitrocelulose ou náilon, sendo
então hibridizado com a sonda de interesse, esse procedimento é chamado de
Southern Blot (Figura 7). Essa técnica caracteriza-se por ser menos trabalhosa, uma
vez que todos os fragmentos de DNA podem ser sondados de uma só vez.
Usar luvas ao manipular as membranas, pois estas apresentam grande

capacidade de adsorção, podendo interferir nos resultados; e também ao manipular
o gel, pois o mesmo contém brometo de etídeo - agente mutagênico.
Figura 6. Representação esquemática da montagem do sistema de transferência em um

suporte sólido. Componentes: suporte, gel de agarose, membrana de nitrocelulose ou nylon, e por
último papel absorvente.
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Figura 7. Passo a passo da técnica de southern blot. No primeiro passo, os ácidos nucleicos
são separados em gel de agarose; em seguida (passo 2) o gel é transferido para membrana de
nitrocelulose; no terceiro passo, depois de transferidos para membrana, os ácidos nucleicos são
hibridizados; então, no passo 4, ocorre a revelação; seguida, no último passo (5), da detecção das
bandas.
13. Northern Blot
Essa técnica surgiu alguns anos após o desenvolvimento da técnica de

Southern Blot e, de forma similar, tem a finalidade de detectar moléculas de RNA
separadas por eletroforese e imobilizados em um suporte. Essa metodologia permite
a análise da expressão de genes em diferentes estágios de desenvolvimento, ou de
diferentes tipos celulares, uma vez que nesse tipo de técnica são imobilizadas
moléculas de RNA, incluindo o mRNA. Assim, tal técnica apresenta grande
importância nos estudos envolvendo a expressão gênica. Enquanto no Southern Blot
a hibrização ocorre com moléculas de fita dupla (DNA), no Northern Blot ocorre com
polímeros de fita simples (RNA). Dessa forma, é frequente o pareamento
91
intramolecular de bases, promovendo um dobramento da molécula ou pareamento
de bases presentes em moléculas distintas, levando à formação de regiões de
híbridos de RNA-RNA. Assim, a migração do RNA em géis de agarose depende do
seu tamanho e do seu estado conformacional.
A realização dessa técnica implica, obrigatoriamente, a utilização de géis de
agarose adicionados de agentes desnaturantes. Geralmente, emprega-se o
formaldeído para tal finalidade, uma vez que este reage covalentemente com os
grupamentos amina de adenina, guanina e citosina, evitando a formação de
pareamento envolvendo essas bases. Como esse fenômeno pode também ocorrer
em relação à sonda no momento da hibridação, tal atividade deve ser revertida
antes da etapa de hibridação com a sonda, pela desnaturação térmica seguida de
resfriamento.
RNAses são enzimas, presentes nas células, nos tecidos, alguns fluídos
biológicos, e degradam as moléculas de RNA. A técnica em questão, deve ocorrer
em condições RNAse free, ou seja, livre de RNAses, até a transferência para as
membranas, quando então tal precaução não é mais necessária.
Para obtenção das condições RNAse free é necessário alguns cuidados
como:
Uso de luvas novas, sem talco;
Reagentes e materiais plásticos, como ponteiras e tubos tipo Eppendorf,
devem ser novos;
A vidraria e os instrumentos metálicos devem ser limpos, envolvidos em
papel alumínio e submetidos a 180 ºC por dezesseis a dezoito horas;
Os equipamentos, como cubas de eletroforese e pentes, devem ser tratados
com 0,1% de dietil pirocarbonato (DEOC), um potente inibidor de RNAse;
A água deve ser bidestilada ou Milli-Q.
Condições RNAse free durante a preparação e a execução das etapas da

técnica;
Usar luvas ao manipular as membranas e o gel;
92
Manusear o formaldeído sempre em capela de exaustão, evitando aspirar
seus vapores, que são tóxicos;
15. Western Blot
A técnica western blot, também conhecida como ensaio imunoenzimático,

refere-se à imunodetecção de proteínas em filtro de nitrocelulose, é rotineiramente
utilizado para a detecção de proteínas e em extratos proteico cru, varredura e
caracterização de polipeptídeos recombinantes, detecção de produtos de
degradação proteica, caracterização de soros e anticorpos monoclonais,
caracterização de epitopos, determinação de massa molecular, entre outros.
A técnica consiste na detecção de pequenas quantidades de proteínas
adsorvidas em uma membrana de nitrocelulose pela reação com anticorpos
específicos desenvolvidos para reconhecer o polipeptídeo em exame. O anticorpo
específico é adicionado à membrana e deixado reagir por certo período de tempo,
após o qual uma fração do anticorpo fica retida na região da membrana que contém
o polipeptídeo específico. Em um segundo estágio, esse anticorpo adsorvido
especificamente sobre o polipeptídeo é detectado com um antissoro, ou seja, um
anticorpo específico (ou segundo anticorpo/ conjugado) que foi quimicamente
modificado pelo acoplamento covalente de uma ou mais moléculas de uma enzima.
Esse reagente tem como função detectar o anticorpo específico e permitir a sua
visualização em razão da atividade enzimática associada.
Com o auxílio de substratos sintéticos para a enzima conjugada, é possível
visualizar a região do filtro onde está localizado o polipeptídeo ensaiado. O substrato
utilizado é capaz de precipitar e formar uma camada colorida exatamente onde está
localizado o segundo anticorpo e, portanto, o anticorpo específico, e, em última
instância, o polipeptídeo ao qual se quer detectar.
93
Proteínas com alta massa molecular e hidrofobicidade tornam a
transferência mais lenta;
Géis fixados não podem ser transferidos, por isso não se deve corar o gel
antes da transferência;
Bolhas entre o gel e membrana causam problemas na transferência;
Manipular as membranas sempre com luva e pinça, já que as impressões
digitais podem interferir na adsorção de proteínas;
17. Sequenciamento de DNA
O sequenciamento de DNA é um processo que determina a ordem dos

nucleotídeos em uma amostra. Existem vários métodos disponíveis, e cada um
apresenta vantagens e desvantagens. Um dos mais utilizados é o chamado método
de Sanger também conhecido como de terminação de cadeia com
didesoxirribonucleosídeo trifosfato, ele constitui a base da metodologia empregada
no sequenciamento do genoma humano. Sua estratégia consiste em identificar,
continuamente e sequencialmente durante o processo, o último nucleotídeo
incorporado na extremidade de alongamento da cadeia. Os produtos da reação
deverão também portar uma “marca” que permita detectá-los na etapa de análise. O
processo é realizado a partir de uma cadeia simples (não dupla) do DNA a ser
sequenciado, esta servirá de molde para gerar a outra metade complementar da
dupla hélice. Isto é obtido pela desnaturação da “molécula nativa” (Figura 8).
Figura 8. Representação desnaturação da molécula de fita dupla (DNA) e do fragmento a

ser sequenciado (5’→ 3’).
94
A reação de síntese se processa em condições iônicas e de pH apropriadas,
na presença da enzima DNA polimerase e de uma mistura dos 4 nucleotídeos sob a
forma de dNTPs (3’-desoxinucleotídeos trifosfatos): dATP, dCTP, dGTP e dTTP
35
sendo um deles marcado radioativamente com ³²P ou S; um dos mais utilizados é
o dATP ³²P (Figura 9.2a). Como a enzima utilizada catalisa somente o alongamento
da cadeia nascente é necessário também, a presença na reação, de um pequeno
fragmento de DNA sintético (XXX) complementar a uma região conhecida (YYY) na
extremidade 3’ do DNA molde; estas características permitirão sua hibridização no
local mencionado, e fornecerão um ponto de partida para a replicação do DNA. O
fragmento XXX, denominado iniciador ou primer, quando marcado, poderá ser
utilizado para rastrear o fragmento de DNA recém-sintetizado no lugar do dNTP. O
processo é executado em quatro reações separadas; cada uma delas, contendo
adicionalmente pequena quantidade de um, e apenas de um, dos quatro tipos de
cada dNTP sob a forma análoga de ddNTPs (2’, 3’-didesoxinucleotídeo trifosfatos)
(Figura 9.2b).
Figura 9.2. Representação química dos 3’-desoxinucleotídeos trifosfatos – dNTPs (2a), e

dos 2’, 3’-didesoxinucleotídeo trifosfatos – ddNTPs (2b).
95
As formas análogas (ddNTPs) são conhecidas como terminadores, e ao
serem incorporados à cadeia nascente bloqueiam todo processo, por não
apresentarem 3’OH que permita formar ligação com o próximo dNTP a ser
adicionado. Com todos os nucleotídeos normais (dNTPs) presentes, o alongamento
da cadeia prosseguirá até que a enzima DNA-polimerase insira um análogo
(ddNTP). Consequentemente e imediatamente, a reação de síntese irá parar no
ponto em que seu alongamento foi interrompido: na extremidade e, a molécula
estará marcada com ³²P. Os fragmentos assim obtidos, cada qual contendo um
resíduo final conhecido, pois se sabe em que tubo de reação o análogo foi
adicionado, são separados por tamanho em gel de poliacrilamida individualmente,
ou seja, um canal de análise para cada reação. Então, o gel é transferido para um
suporte de nitrocelulose (filtro).
Após autorradiografia a ordem dos nucleotídeos, na cadeia de DNA recém-

sintetizada, pode ser visualizada e obtida diretamente; esta é complementar à da
molécula sequenciada que serviu de molde. Portanto, é possível conhecer a
sequência de nucleotídeos do DNA sequenciado de 3’ para 5’ partindo-se da parte
inferior para a superior do gel (Figura 10).
96
Figura 10. Representação da sequência de nucleotídeos do DNA sequenciado de 3’ para 5’.
O método pode ser automatizado utilizando o sequenciador automático,

gerenciado por computadores com programas que leem sequencialmente e
identificam os produtos. A automatização permite executar o processo em grande
escala, já que, é possível utilizar os 4 didesoxinucleotídeos terminadores (ddNTPs)
simultaneamente, por meio da marcação por fluorescência (figura 11.4a). Em cada
reação, ou seja, para cada base (A,T,G,C) utiliza-se um fluorocromo diferente (uma
cor diferente), de modo que os produtos podem ser reunidos e a eletroforese destes
realizada em um único canal do gel de sequenciamento (figura 11.4b). O sinal
fluorescente diferencial emitido por cada fragmento, após iluminação com um feixe
de laser, identificará os produtos baseado na diferença de comprimento de onda. A
luz emitida é detectada por escaneamento do gel e a sequência deduzida por
computador (figura 11.4c). Variáveis mais modernas, mais rápidas e poderosas;
incluem a robotização total do processo com a inclusão das etapas de purificação e
da reação de síntese da cadeia do DNA.
97
Figura 11.4. Representação do sequenciamento automatizado. Na figura 4a é possível
observar os dNTPs marcados por fluorescência; em seguida, em 4b, eletroforese realizada em um
único canal do gel de sequenciamento; e por fim, em 4c, a luz emitida é detectada por escaneamento
do gel e a sequência deduzida por computador (eletroforegrama).
Existe outro método de sequenciamento de DNA que teve uma ampla

aplicação inicialmente, porém é pouco utilizado atualmente. Este é conhecido como
o método da degradação química, desenvolvido em 1977, por Maxam e Gilbert.
Essa técnica consiste no tratamento com substâncias químicas que cortam a
molécula de DNA em nucleotídeos específicos.
Os tratamentos químicos para modificação das bases e clivagem são feitos
de maneira que ocorram em G, C, G+A e T+C. Esses fragmentos gerados são
analisados em gel de poliacrilamida.
18. Projeto Genoma Humano
As primeiras discussões sobre o Projeto Genoma Humano (PGH) remontam

à década de 1980 quando o Departamento de Energia dos EUA promoveu um
workshop para avaliar os métodos disponíveis para detecção de mutações durante o
qual divulgou a ideia de mapear o genoma humano. Na mesma época foi criado na
França o Centre d’Etude du Polymorsphisme Humaine (CEPH - Centro de Estudos
98
do Polimorfismo Humano). Este centro coleta amostras de sangue e tecidos de
famílias extensas e tornou-se o principal fornecedor de material para a elaboração
dos mapas de ligação realizados pelo Genéthon.
O mapeamento do genoma humano sempre causou expectativas. Alguns
cientistas acreditavam ser impossível, enquanto outros achavam que seria um
projeto muito trabalhoso e em vão, já que as informações obtidas seriam
desencontradas; e os cientistas que reconheciam o projeto como a grande “sacada”
da biologia, transformando a biologia numa grande ciência (big science), com direito
a financiamentos gigantescos e divulgação ampla.
O Projeto Genoma Humano é um empreendimento internacional, iniciado
formalmente em 1990 e projetado para durar 15 anos, com os objetivos de identificar
e fazer o mapeamento do DNA do corpo humano, determinar as sequências dos três
bilhões de bases químicas que compõem o DNA humano, e armazenar essa
informação em bancos de dados, desenvolverem ferramentas eficientes para
analisar esses dados e torná-los acessíveis para novas pesquisas biológicas.
O PGH começou como uma iniciativa do setor público, tendo a liderança do
cientista Francis Collins, e posteriormente, a busca para decifrar o código genético
humano, também passou a ser desenvolvido pela companhia privada Celera,
liderada pelo cientista Craig Venter.
O PGH é sem dúvida o mais audacioso projeto da biologia, com a pretensão
de ter toda a sequência de genes da espécie humana, descobrir sua localização e
determinar as suas funções. O anúncio do rascunho de 98% do genoma humano
ocorreu no dia 26/07/2000, com a participação do presidente americano Bill Clinton e
do 1° ministro britânico Tony Blair. O anúncio também mostrou que a aparente
corrida não declarada entre os setores estatal e privado, envolvidos com o projeto
terminou em empate, visto que o anúncio foi conjunto. Os resultados foram
publicados em duas revistas diferentes. A revista inglesa Nature publicou o trabalho
dos pesquisadores do PGH, liderados por Francis Collins, e a norte-americana
Science, o dos pesquisadores da Celera, liderados pelo empresário-cientista Craig
Venter (Figura 12).
99
Figura 12. Capa das revistas nature e science. Foram nessas edições, que as revistas
publicaram o anúncio dos cientistas sobre o rascunho de 98% do sequenciamento do genoma
humano.
Francis Collins, diretor do projeto genoma estatal, apertou a mão de seu ex-
colega e presidente da companhia privada Celera, Craig Venter ao lado do
presidente Bill Clinton. A trégua não significa uma conciliação de pontos de vista
bem divergentes. Collins, apoiado por Clinton e Blair, quer que as informações nele
contidas sejam de domínio público. No entanto, Venter quer o direito de patentear
sequências desse código. Ele pretende lucrar com a venda de informações
determinantes para empresas farmacêuticas.
Basicamente, 18 países iniciaram programas de pesquisas sobre o genoma

humano. Os maiores programas desenvolvem-se na Alemanha, Austrália, Brasil,
Canadá, China, Coreia, Dinamarca, Estados Unidos, França, Holanda, Israel, Itália,
Japão, México, Reino Unido, Rússia, Suécia e União Europeia. Alguns países em
desenvolvimento, não incluídos na relação, participam por intermédio de estudos de
técnicas de biologia molecular de aplicação à pesquisa genética e estudos de
organismos que têm interesse particular para suas regiões geográficas. Informações
sobre estes países e suas pesquisas de contribuição para o PGH podem ser obtidas
por meio da HUGO (Human Genome Organization).
100
O Projeto Genoma poderá trazer muitos benefícios para a humanidade
como:
O conhecimento sobre como os genes contribuem para a formação de

doenças que envolvem um fator genético- como o câncer, por exemplo, levarão a
uma mudança da prática médica;
Será dada ênfase à prevenção da doença, em vez do tratamento do doente;
Novas tecnologias clínicas deverão surgir baseadas em diagnósticos de

DNA;
Novas terapias baseadas em novas classes de remédios;
Novas técnicas imunoterápicas;
Prevenção em maior grau de doenças pelo conhecimento das condições

ambientais que podem desencadeá-las;
Possível substituição de genes defeituosos por meio da terapia genética;
Produção de drogas medicinais por organismos geneticamente alterados e;
Grande impacto nas indústrias relacionadas à biotecnologia, como na área

da agricultura, produção de energia, controle do lixo, despoluição ambiental e outras.
----------- FIM DO MÓDULO IV -----------
101
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALBERTS, B.; et al. Molecular Biology of The Cell, 4. ed. 2002.
AZEVEDO, M.O.; et al. Técnicas básicas em Biologia Molecular. Brasília: UnB,

2003.
HAUSMANN, R. História da biologia molecular. Ribeirão Preto: Sociedade

Brasileira de Genética, 2002.
LEWIN, Genes VII. Oxford University Press, Inc., New York, 2000.
MAYR, E. O desenvolvimento do pensamento biológico: diversidade, evolução e

herança. Tradução de Ivo Martinazzo. Brasília: UnB, 1998.
MENEGHINI, R. Os gênios e o gene. São Paulo, 2003.
NOUVEL, P. A arte de amar a ciência. São Leopoldo: Editora Unisinos, 2001.
OLBY, R. The path to the Double Helix: the discovery of DNA. New York: Dover
Publications, 1994.
SCHEID, N.M.J; FERRARI, N.; DELIZOICOV, D. The collective scientific

knowledge production on the DNA structure. Ciência & Educação, v. 11, n. 2, p.
223-233, 2005.
SCHRÖDINGER, E. O que é vida? O aspecto físico da célula viva seguido de

mente e matéria e fragmentos autobiográficos. Tradução de Jesus de Paula Assis e
Vera Yukie Kuwajima de Paula Assis. 4. ed. São Paulo: Unesp, 1997.
102
WEAVER, W. Molecular biology: origins of the term. Science, Washington, v. 170,
p. 581-582, 1970.
ZAHA, A.; et al. Biologia Molecular Básica. Porto Alegre: Mercado Aberto, 2003.
--------------- FIM DO CURSO! ---------------
103

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TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR

Há várias técnicas em biologia molecular usadas numa ampla variedade de

Vários procedimentos de extração de DNA de tecidos vegetais ou de

2. Quantificação de DNA em gel de agarose

Após finalizar os procedimentos de extração de ácidos nucleicos deve-se

Fig. 1: Fotografia de eletroforese em gel de agarose, onde as diferentes

Os géis de agarose são dissolvidos na presença de tampão apropriado até

3. Reação de Polimerização em Cadeia – PCR

Até meados da década de 1980, as técnicas de Biologia Molecular estavam

Essa metodologia apresenta uma grande versatilidade, tendo vasta

Em razão a grande diversidade de aplicações da PCR, cada situação pode

A grande sensibilidade da técnica exige cuidados importantes na sua

6. Eletroforese em gel de agarose

A eletroforese em gel de agarose é usada como método analítico e

Figura 3. Modelo esquemático da eletroforese, demonstrando o “poço” em que os

A velocidade da migração bem como o poder de resolução de um gel

Encaixar a tampa da cuba e os eletrodos de modo que o DNA migre do pólo

7. Fatores que afetam a migração do DNA no gel

Tamanho da molécula de DNA e concentração do gel – As moléculas

Superenovelada Circular relaxada

Agentes intercalantes – O brometo de etídeo (Figura 5) é um análogo de

Voltagem – As moléculas de DNA migram por meio do gel com velocidade

8. Cuidados importantes na utilização da técnica

9. Eletroforese em gel de poliacrilamida

A eletroforese em gel de poliacrilamida é uma técnica amplamente usada

Após a polimerização, remover o pente e limpar os poços;

10. Cuidados importantes na utilização da técnica

- Os reagentes acrilamida e bisacrilamida são neurotóxicos, e seus efeitos

11. Southern Blot

A técnica de Southern blot baseia-se na hibridização entre moléculas de

12. Cuidados importantes na utilização da técnica

Usar luvas ao manipular as membranas, pois estas apresentam grande

Figura 6. Representação esquemática da montagem do sistema de transferência em um

13. Northern Blot

Essa técnica surgiu alguns anos após o desenvolvimento da técnica de

14. Cuidados importantes na utilização da técnica

Condições RNAse free durante a preparação e a execução das etapas da

15. Western Blot

A técnica western blot, também conhecida como ensaio imunoenzimático,

16. Cuidados importantes na utilização da técnica

17. Sequenciamento de DNA

O sequenciamento de DNA é um processo que determina a ordem dos

Figura 8. Representação desnaturação da molécula de fita dupla (DNA) e do fragmento a

Figura 9.2. Representação química dos 3’-desoxinucleotídeos trifosfatos – dNTPs (2a), e

Após autorradiografia a ordem dos nucleotídeos, na cadeia de DNA recém-

O método pode ser automatizado utilizando o sequenciador automático,

Existe outro método de sequenciamento de DNA que teve uma ampla

18. Projeto Genoma Humano

As primeiras discussões sobre o Projeto Genoma Humano (PGH) remontam

Basicamente, 18 países iniciaram programas de pesquisas sobre o genoma

O conhecimento sobre como os genes contribuem para a formação de

Será dada ênfase à prevenção da doença, em vez do tratamento do doente;

Novas tecnologias clínicas deverão surgir baseadas em diagnósticos de

Novas terapias baseadas em novas classes de remédios;

Novas técnicas imunoterápicas;

Prevenção em maior grau de doenças pelo conhecimento das condições

Possível substituição de genes defeituosos por meio da terapia genética;

Produção de drogas medicinais por organismos geneticamente alterados e;

Grande impacto nas indústrias relacionadas à biotecnologia, como na área

----------- FIM DO MÓDULO IV -----------

ALBERTS, B.; et al. Molecular Biology of The Cell, 4. ed. 2002.