Sunteți pe pagina 1din 17

UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA

LA MOLINA

FACULTAD DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS


DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS Y
PRODUCTOS AGROPECUARIOS
INFORME N°3
DETERMINACIÓN DE LA DIGESTIBILIDAD IN VITRO DE LA
PROTEINA
(Método multienzimático pH variable)

Curso : Alimentación y Nutrición Humana

Profesora : Dra. Ritva Repo-Carrasco Valencia

Integrantes:

 Llactacondor Orcorr, Noemí


 Mamani Abad, Janet
 Maucaille Rojas, Malory Rocio
 Pablo Ñaupari, Flora Patricia
 Pacora Ibarra, Eric Gabriel

Grupo : C* (Miércoles de 11:00 – 1:00 pm)

Mesa : 2

Fecha del experimento: 12/09/18

Fecha de entrega de informe: 19/09/18

2018 – II
I. INTRODUCCIÓN

La digestibilidad se define como el porcentaje de un nutriente dado, que se digiere (es


decir que desaparece) a su paso por el tubo gastrointestinal, este proceso es comúnmente
expresado en términos de coeficiente que es el porcentaje digerido de cada principio
nutritivo. Las pruebas de digestibilidad permiten calcular por diferencia el grado de
desaparición de los nutrientes debido a la absorción, además de conocer el contenido de
Nutrientes Digestibles Totales (Frías, 2007).
La digestión de las proteínas comienza en el estómago con la acción de pepsina y
continúa en el intestino delgado con enzimas pancreáticas como tripsina, quimiotripsina,
aminopeptidasas y carboxipeptidasas. Se calcula que un 25 % de las proteínas de la
dieta se absorben como dipéptidos y tripéptidos. Los aminoácidos se absorben en
presencia de sodio y tanto éstos como los dipéptidos y tripéptidos se absorben
rápidamente. Las dipeptidasas y tripeptidasas pueden hidrolizar posteriormente estos
péptidos a aminoácidos, pero algunos alcanzan intactos la circulación sanguínea.

Tras la digestión de proteínas, los aminoácidos son transportados al hígado, donde se


regula el flujo de aminoácidos de la dieta que entra en la circulación sistémica. El
hígado transamina y oxida los aminoácidos sobrantes. En la práctica, el exceso de
proteínas (aminoácidos) en la dieta de un sujeto sano da lugar a un aumento de la
eliminación urinaria de nitrógeno. El hígado es el lugar principal de metabolización de
aminoácidos esenciales, con excepción de los aminoácidos ramificados, que apenas se
degradan en el eje enterohepático y son más bien metabolizados por otros tejidos
periféricos; por ejemplo, sólo un 2 % de la leucina de la dieta es oxidada en el hígado
(León, 2005).

Estudiar el proceso de digestibilidad de las proteínas es muy importante ya que, estas


cumplen funciones vitales especificas en el organismo como construir y regenerar los
tejidos, reguladora con la formación de hormonas, enzimas y vitaminas; es por ello que
la siguiente practica presenta como objetivo principal, conocer un método seguro y
práctico para la determinación del grado de digestibilidad in vitro de proteínas, con
bastante aproximación a las condiciones reales; utilizando para la hidrolisis un sistema
multienzimático de tripsina, quimiotripsima y peptidasa.
II. MARCO TEORICO
2.1 PROTEÍNAS

Todos los tejidos vivos contienen proteínas. Se distinguen químicamente de los


lípidos y de los hidratos de carbono por contener nitrógeno. Son polímeros de
aminoácidos (hay 20 distintos) unidos por enlaces peptídicos. Una proteína puede
contener varios cientos o miles de aminoácidos y la disposición o secuencia de
estos aminoácidos determina la estructura y la función de las diferentes proteínas.
Algunas son estructurales (como el colágeno del tejido conectivo o la queratina que
se encuentra en pelo y uñas), otras son enzimas, hormonas, etc (Carbajal 2013).

De los 20 aminoácidos que se combinan para formar las proteínas, algunos pueden
ser sintetizados por el organismo, por lo que se denominan no esenciales (alanina,
arginina, ácido aspártico, asparragina, cisteína, ácido glutámico, glutamina, glicina,
prolina, serina y tirosina). Hay otros, los denominados aminoácidos esenciales o
indispensables que, sin embargo, no pueden ser sintetizados por el hombre por lo
que tienen que ser aportados por los alimentos, por la dieta, condicionando su
esencialidad. Estos son: histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina,
fenilalanina, treonina, triptófano y valina (Carbajal 2013).

2.2 LAS PROTEÍNAS EN LOS ALIMENTOS.

Las proteínas y sus productos de degradación también son componentes


importantes de los alimentos, pues contribuyen directamente al sabor de los mismos
y son precursores de los componentes aromáticos y la sustancia de color que se
forma mediante las reacciones térmicas y/o enzimáticas que ocurren durante la
obtención, preparación y almacenamiento de los mismos (Fennema, 2000).

Según su solubilidad en los cereales se distinguen cuatro fracciones proteicas. Las


albuminas que son solubles en soluciones Salinas diluidas y las globulinas que son
solubles en soluciones salinas diluidas, las prolaminas que son solubles en etanol al
50- 80% y las glutelinas que son solubles en álcalis (pH 12) y ácido (pH 2). En el
maíz están fracciones representantes al 4, 2, 55, 39% respectivamente. Las
albuminas y las globulinas o proteínas citoplasmáticas tienen funciones metabólicas
y estructurales se localizan principalmente en el embrión en la periferia de un grano
y se caracterizan por un elevado contenido de lisina (Cerón 2006).

2.3 ALTERACIÓN DE LAS PROTEÍNAS

Durante el almacenamiento, la preparación y el procesamiento de los alimentos


para el consumo, éstos se someten a distintos tratamientos que provocan efectos, en
ocasiones benéficos y en ocasiones dañinos. Desde el punto de vista de la nutrición,
y el mayor daño que puede ocurrir la pérdida de aminoácidos indispensables, pero
también hay que considerar que en algunos casos se dan cambios negativos en las
propiedades funcionales, sensoriales y la textura (Badui, 1999).

El proceso más común es el tratamiento térmico, donde se propician diferentes


reacciones en las que llegan a intervenir todos los compuestos presentes; algunos de
los cambios se presentan en función de la intensidad del tratamiento. Una de las
transformaciones más significativas es un cambio (positivo o negativo) en el valor
de la relación de la eficiencia proteica, comportamiento que se ha comprobado en
proteínas de leguminosas, leche, huevo, soya, etc. Por ejemplo, la leche, mejora su
eficiencia proteica con un calentamiento aligero como la pasteurización, esto
debido a que las proteínas se desnaturalizan y expone sus enlaces peptídicos, lo que
facilita el ataque por parte de las enzimas proteolíticas digestivas, aprovechándose
mejor sus aminoácidos; pero los calentamientos fuertes como la deshidratación y la
condensación, así como el pHs alcalinos reducen su digestibilidad y el valor
nutritivo (Badui, 1999).

2.4 DIGESTIBILIDAD DE PROTEINAS

La digestibilidad de un alimento se define como la proporción de nitrógeno del


mismo que es absorbido tras su digestión. la digestibilidad de la proteína se mide a
partir de balances de nitrógeno, ya que las proteínas se degradan en péptidos y
aminoácidos libres durante la digestión en el hombre, este valor se encuentra
intervalo de 95 a 97% para el huevo, la leche y el queso; para la carne y las
leguminosas entre 94 y 78 % respectivamente para la nariz es 85% que disminuye a
70% tras las procesos térmicos y se y de refinación que lleva durante su
transformación a cereal de maíz (Fennema, 2000).

Cuadro 1. Digestibilidad de las proteínas en varios alimentos

Fuente: Cerón (2006)

Aunque el contenido de aminoácidos representa el principal indicador de calidad de


la proteína, su verdadera calidad depende de la forma en que los aminoácidos son
utilizados y aprovechados por el organismo. Por ello, la digestibilidad puede afectar
la calidad proteica; sin embargo, existen otros factores que pueden influir, como son
los factores antinutrimentales, que son aquellas sustancias presentes en el alimento,
que tienen la capacidad de reaccionar o interferir con un nutrimento, disminuyendo
su disponibilidad en el organismo. En la mayor parte de los refinados de proteínas
vegetales y de lso concentrados de las mismas se encuentran inhibidores de tripsina
y quimiotripsina, los cuales inhiben la hidrolisis total de las proteínas de las
leguminosas y de las oleaginosas por las proteasas pancreáticas. Las proteínas de
los alimentos vegetales contienen y también otros factores antinutrimentales, como
taninos y filatos; siendo estos últimos quienes intervienen con las proteínas y los
minerales (Cerón 2006)
2.4 MÉTODOS EMPLEADOS PARA DETERMINAR LA DIGESTIBILIDAD DE
LA PROTEÍNA EN ALIMENTOS

La calidad nutritiva de las proteínas puede valorarse por métodos biológicos,


químicos o enzimáticos (Cerón 2006).

- Métodos Biológicos: Se basan en la ganancia de peso en la retención de


nitrógeno en ensayos con animales alimentales alimentados con dietas que
contenga la proteína a analizar; estos métodos generalmente son caros y
conlleva unas largas jornadas de trabajo.
- Métodos Químicos: Se calcula el valor nutritivo de la proteína
determinando su contenido de aminoácidos comprando su riqueza en
aminoácidos esenciales con la de una proteína patrón ideal; generalmente se
utiliza el patrón dado por la FAO.
- Método Enzimático: Se basa en crear un medio muy similar al organismo,
digiriéndose las proteínas con enzimas como la pepsina y la pancreatina o
con una mezcla de tripsina, quimiotripsina y peptidasa intestinal porcina.
Estos métodos tienen la ventaja de poder determinar la cantidad de la
proteína en alimentos que han sido sometidos a algún proceso y son
relativamente menos costosos que los métodos biológicos. Se ha demostrado
que los métodos in vitro e in vivo tiene una correlación entre 0,9 y 0,99 por
lo que se recomienda utilizar los métodos in vitro en estudios nutricionales

2.6 SOYA

El frijol de soya es una leguminosa al igual que el chícharo, el frijol, la lenteja y el


garbanzo. A diferencia de otras leguminosas (o cualquier tipo de vegetal), el frijol
de soya “fija” su propio nitrógeno, lo que le permite producir los nueve
aminoácidos esenciales con un papel clave para la vida humana (fenilalanina,
isoleucina, leucina, lisina, metionina, treonina, triptófano, valina e histidina). El
frijol de soya también contiene los dos ácidos grasos esenciales: ácido linoleico y
ácido linolénico. Estas dos cualidades, la cantidad/calidad de proteína (proteína
“completa”) y la grasa, son las que lo hacen uno de los más benéficos y singulares
cultivos de la naturaleza; y verdaderamente notable en el reino vegetal. El frijol de
soya contiene aproximadamente 38% de proteína, lo que representa un porcentaje
elevado para las plantas (comparativamente, el trigo no tiene más de 15% de
proteína). Adicionalmente, toda esa proteína es proteína completa, lo que significa
que contiene todos los aminoácidos en las proporciones correctas, necesarios para
sostener la vida humana. Las proteínas completas se encuentran con mayor
frecuencia en las fuentes cárnicas, las que también contienen colesterol. Por dicha
razón y debido a que el frijol de soya es una proteína sin colesterol, la soya
representa una alternativa sólida para la carne desde el punto de vista de la
nutrición, y una fuente de proteína ideal para los vegetarianos (ASA 2009).

2.6.1 Harina de soya

La harina de soya se elabora a partir de las hojuelas de soya desgrasadas


ligeramente tostadas; las hojuelas de soya son lo que queda en el proceso después
de que se ha triturado el frijol de soya para la producción de aceite. La harina de
soya tiene un color ligeramente amarillo y la textura de la harina de trigo integral.
Puede usarse con éxito en empanizados salados, para hornear, para alimentos
sofritos o fritos en abundante aceite (ASA 2009).

La harina de soya es diferente a la de trigo principalmente de tres maneras


relevantes:

- Contenido de proteína: La harina de soya tiene, en promedio, 50% de proteína


contra 15% de proteína de la harina de trigo de alta proteína.
- Composición de la proteína: La harina de soya no contiene gluten (que se
requiere para la formación y elasticidad de la masa). La harina de trigo si
contiene gluten.
- Contenido de grasa: Diferentes cantidades de aceite de soya se retiran de la
harina de soya para crear harinas con diferentes propiedades funcionales:

· Con grasa completa (sin eliminación de aceite) con rico sabor, pero con
corta vida de anaquel.
· Baja en grasa (de la cantidad de la grasa completa).
· Desgrasada (virtualmente sin aceite) con larga vida de anaquel,
prácticamente no susceptible a la rancidez.

III. MATERIALES Y METODOS

3.1. Muestras:
 Harina de soya
 Caseina

3.2. Materiales:
 Beaker
 Cronómetro
 Termómetro
 Micropipeta de 20-200 μL
 Micropipeta de 100-1000 μL
3.3. Reactivos:
 Tripsina de páncreas de puerco (Tipo IX) con 14 190 unidades BAEE/mg de
proteína.
 Quimiotripsina de páncreas de bovino (Tipo I) 60 unidades/mg de polvo.
 Peptidasa de intestino de puerco (Grado III) 40 unidades/g de polvo.
 Caseína
 NaOH 0.1 N
 HCl 0.1 N

3.4. Equipos:
 Balanza analítica
 Baño maría
 Potenciómetro

3.5. Procedimiento:
 En 2 beaker se prepararon 5 mL de suspensión (6.25 mg de proteína/mL) con
agua destilada. En el primer beaker, como se requería de 31.25 mg de proteína,
se pesó 0.0989 g de harina de soya; en el otro beaker para la caseína, como se
considera proteína pura aislada, se pesó 31.25 mg.
 Se agregaron 5 mL de H2O(d) a cada beaker.
 Se ajustó el pH a 8.0 con HCl y/o NaOH 0.1 N.
 Se añadió 5 mL de la solución multienzimática.
 Se incubó a baño maría a 37°C
 Se midió la disminución de pH durante los primeros 10 minutos, en intervalos
de 1 minuto.
IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES
A continuación, se presenta la ecuación de regresión lineal obtenida por la digestibilidad
aparente in vivo en ratas, ya que se ha encontrado que está relacionada con la caída del
pH en una suspensión proteica después de los 10 minutos de digestión con la solución
multienzimática.

Y = 210.464 – 18.103 X I

Donde:
Y = porcentaje de hidrolisis de la proteína.
X = pH de la suspensión proteica luego de los 10 minutos de digestión con el sistema
multienzimático.
Cuadro 1. Recolección de datos de pH durante los primeros 10 minutos de digestión
proteica, con intervalos de 1 minuto.
TIEMPO CASEINA SOYA
0 8.02 8.14
1 7.02 7.61
2 6.83 7.48
3 6.75 7.4
4 6.67 7.3
5 6.63 7.23
6 6.59 7.17
7 6.62 7.16
8 6.62 7.11
9 6.55 7.09
10 6.53 7.07

Con los datos de pH obtenidos en el cuadro 1 a los 10 minutos, estos son introducidos
en la ecuación 1 como variable X y se obtiene el porcentaje de hidrolisis proteica en las
muestras de caseína y soya.

Cuadro2. Porcentaje de hidrólisis de proteína.


Muestra Porcentaje de hidrolisis
de la proteína
Caseína 92. 25
Soya 82. 48
A continuación con los datos obtenidos en el cuadro1 se procederá a realizar un gráfico
de pH versus tiempo de incubación de cada muestra, teniendo con tiempo máximo 10
minutos.
8.5

7.5
pH

6.5

6
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
tiempo (s)
CASEINA SOYA

Grafico 1: variación del pH en el proceso de digestión in vitro durante los 10 minutos


de incubación con la solución multienzimática

En el cuadro 1 se observa que la caseína tiene mayor caída de pH que la muestra de


soya. Frías (2007), menciona que el rápido declive de pH está causado por la liberación
de grupos carboxilos de las cadenas proteicas por las enzimas proteicas. En el caso de la
caseína al parecer libero más grupos carboxilos que la muestra de soya es decir la
hidrolisis fue mayor y esto se corrobora en el cuadro 2.
En el cuadro 2 se observa que el porcentaje de hidrolisis de la proteína para el caso de la
caseína es mayor que la soya es decir la digestibilidad de la caseína también es mayor,
esto se deberá en gran parte por el origen de la proteína en el caso de la caseína de
origen animal y el de la soya de origen vegetal. Shiaung y Liang (2005), menciona que
la calidad de las proteínas de origen vegetal es generalmente inferior a las proteínas
animales, ya que carecen de ciertos aminoácidos. Además, la digestibilidad proteica en
vegetales, es afectada tanto por la configuración y secuencia de aminoácidos como por
la fibra, taninos, fitatos y diversos factores antifisiológicos. Otro factor que influye en la
digestibilidad, es el hecho de que algunas proteínas en los vegetales, se encuentran en
forma de cuerpos proteicos rodeados de material celuloso que impide la acción de las
enzimas.
Frías (2007), indica que la digestibilidad ideal es 100% y que las proteínas de origen
animal poseen una buena digestibilidad, lo que implica una buena absorción, mientras
que las de origen vegetal la suele tener generalmente inferior. Esta sería la razón por la
cual el valor de la digestibilidad de la muestra de soya es inferior que el de la caseína.
Shiaung y Liang (2005), reportan para el caso de la caseína una digestibilidad verdadera
de 99,19% un valor cercano menciona Suarez et al., (2006) quien indica que la
digestibilidad relativa para la caseína es del 100%. Estos valores son relativamente
mayores a los encontrados en la práctica por lo cual se infiere que se cometió algunos
errores de toma de datos u otro.
La puntuación de una proteína refleja su contenido en aminoácidos en comparación con
la proteína ideal. Sin embargo, cuando se necesita conocer la utilización de los
aminoácidos en el organismo es necesario realizar la corrección del valor del puntaje
según la digestibilidad proteica (Suarez et al., 2006).

V. CONCLUSIONES
 La digestibilidad de la caseína es mayor que la soya y se debería al origen de la
proteína en el caso de la caseína (animal) y para la soya (vegetal) porque según
menciona la literatura las proteínas de origen vegetal carece de ciertos aminoácidos
o también podría ser que algunas de las proteínas vegetales se encuentren rodeados
de material celulósico que impiden la acción enzimática.

VI. CUESTIONARIO
6.1 ¿Son los ensayos in vitro mejores que los ensayos en vivo?
Los métodos in vitro se basan en las comparaciones realizadas y la aproximación de sus
resultados a los ensayos in vivo, según Hsu et al., (1977) menciona que para determinar
el método de digestibilidad in vitro de proteínas se investigó la correlación con la
digestibilidad in vivo. Donde se examinó distintos sistemas enzimáticos los cuales
incluían combinaciones de tripsina, pepsina – tripsina, tripsina – quimiotripsina y
tripsina – quimiotripsina – peptidasa. Los coeficientes de correlación fueron 0.79, 0.72,
0.80 y 0.74 respectivamente. Los métodos en mención in vitro no han sido ampliamente
aceptados, ya que no había correspondencia con los datos in vivo.
Según Vásquez (2006), menciona que para determinar la digestibilidad in vitro
empleando se utilizó un sistema multienzimático de tripsina, quimiotripsina y peptidasa,
donde se encontró una correlación 0.90 y un error estándar de 2.23 en relación al
método in vivo aplicado a ratas. El método in vitro simula los procesos bioquímicos que
se llevan en los métodos in vivo ya que estos utilizan sistemas enzimáticos complejos.
Según Vásquez (2006), menciona que la digestibilidad verdadera considera la pérdida
fecal endógena, además los alimentos que presentan una mayor cantidad de fibra tienen
una menor digestibilidad. Es por ello que al realizar un ensayo in vitro hay variables que
no se toman en cuenta o son difíciles de controlar, estos factores influyen en el error de
los ensayos in vitro.

6.2 Diga cuales son las ventajas y desventajas del uso del ensayo realizado en la
práctica.

Ventajas
 Es un método rápido
 Presenta correlación con los métodos in vivo
 Es un método práctico y sencillo
 Los coeficientes de digestibilidad pueden ser determinados simultáneamente en
un gran número de muestras.
 El tiempo requerido por muestra es mínimo en comparación con otras técnicas.
 Se requiere únicamente una muestra pequeña para determinar la digestibilidad.
Desventajas
 No se utiliza todo el sistema multienzimático que se analiza en un sistema in
vivo.
 Al no utilizar el sistema multienzimático completo, hay factores que inhiben la
digestibilidad de las proteínas y no son tomados en cuenta.
 No se considera la pérdida fecal endógena que es considerada en el cálculo de la
digestibilidad verdadera.

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS


 ASA (American Soybean Association). 2009. La soya, sus productos y
aplicaciones. Consultado el 15 de setiembre del 2018. Disponible en:
http://thesoyfoodscouncil.com/wp-content/uploads/Soyfoods-101.pdf
 BADUI, D. 1999. Quimica de los Alimentos. 3era Edicion. Editorial Pearson
Education. Mexico.
 CARBAJAL, A. 2013. Manual de Nutrición y Dietética. Universidad
Complutense de Madrid. España. Consultado el 15 de setiembre del 2018.
Disponible en: https://www.ucm.es/data/cont/docs/458-2013-07-24-cap-5-
proteinas.pdf.
 CERÓN, A. 2006. DEterminacion de la digestibilidad “In Vitro” de la proteína,
contenido de fitatos y lisina disponible en variedades criollas de maíz del estado
de Hidalgo. Consultado el 15 de setiembre del 2018. Disponible en:
http://dgsa.uaeh.edu.mx:8080/bibliotecadigital/bitstream/handle/231104/632/Det
erminacion%20de%20la%20digestibilidad
%20invitro.pdf;jsessionid=0ABA83F11355B8067A08C68336AA5D8F?
sequence=1
 FENNEMA, O. 2000. Quimica de Alimentos. 2da Edicion. Editorial Acribia.
Zaragoza, España.
 FRÍAS, B. 2007. Evaluación de la capacidad digestiva de juveniles
de Centropomus undecimalis (Bloch, 1792) sobre diferentes ingredientes
proteínicos. Tesis de maestría, Facultad de Ciencias del Mar, UCN, Coquimbo,
Chile 130 pp.
 HSU, H; VAVAK, D; SATTERLEE, L. Y MILLER, G. 1977. A multienzyme
technique for estimating protein digestibility. Journal of Food Science. 42 (5):
1269 – 1273.
 LEÓN, M.2005. Proteínas en nutrición artificial (en línea). EDIKAMED S.L. 21
p. Consultado 15 de sep. 2018. Disponible
https://www.senpe.com/documentacion/monografias/senpe_monografias_protein
as_NE3.pdf
 SHIAU, S. LIANG, H. 1995. Carbohydrate utilization and digestibility by
tilapia, Oreochromis niloticus x O. aureus, are affected by chromic oxide
inclusion in the diet. Journal of Nutrition 125: 976-982
 SUÁREZ, M. KIZLANSKY, A. LÓPEZ L. 2007. Evaluación de la calidad de las
proteínas en los alimentos calculando el escore de aminoácidos corregido por
digestibilidad. Nutrición hospitalaria. 21 p. Consultado el 15 de setiembre del
2018. http://www.dialnet.unirioja.es/servlet/articulo?codigo=2249602.
 VASQUEZ, C. 2006. Alimentación y nutrición. Manual Teórico – Práctico.
Segunda Edición. Impreso en España.