Práctica N° 3: Electroforesis en gel de agarosa

Grupo N° 4

ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

1
Diana Marcela Salamanca Sandoval-20132150125
1
Yenny Urrutia Rodríguez-20132150117
1
Alejandro Cardona Celi-20132150165
2
Adis Ayala Fajardo
1,2
Universidad Distrital Francisco José de Caldas.
1
Estudiantes Biología Molecular, 2Profesor.

Bogotá D.C., 14 de abril 2018

RESUMEN: La electroforesis en gel de agarosa es de las técnicas más utilizadas comúnmente para
separar moléculas en función de su carga, tamaño y forma, además de caracterizar ácidos nucleicos
de distintas procedencias. Los geles se comportan como un tamiz molecular y permiten separación
molecular. Así, moléculas de DNA de diferente tamaño van a emigrar de forma distinta en una
electroforesis en gel de agarosa. Además, si en dicha electroforesis se aplican marcadores de peso
molecular (fragmentos de DNA de tamaño conocido) se puede calcular el tamaño aproximado del
DNA en estudio, La electroforesis de ADN fue, y sigue siendo, una herramienta de importancia
primordial en el desarrollo de las técnicas del ADN recombinante o ingeniería genética, la técnica de
electroforesis a través de una matriz para analizar muestras de ADN corresponde a Vin Thorne, un
bioquímico del Instituto de Virología de Glasgow, quien a mediados de los años 60 del pasado siglo
estaba interesado en caracterizar las distintas formas de ADN que se obtenían de partículas purificadas
de polyomavirus. En este artículo se determina que la electroforesis en gel permite la visualización
de ADN plasmídico, debido al peso molecular determinado gracias al marcador Fago; por el contrario,
no se logró el óptimo reconocimiento de ADN genómico por dicha técnica en consecuencia a su mal
proceso de extracción, también atribuido a que el ADN genómico es esta muestra posee una baja
concentración lo cual se hace evidente en el momento de la construcción de la gráfica de referencia.
PALABRAS CLAVE: electroforesis, DNA genómico, técnica de cuantificación, gel de agarosa.

ABSTRACT:

KEY WORDS:

1. INTRODUCCIÓN interés, para posteriormente utilizarlos en

La electroforesis en geles de agarosa o
poliacrilamida es una de las metodologías
más utilizadas en el laboratorio con el
trabajo con ácidos nucleicos. Mediante la
electroforesis podemos separar fragmentos
de ADN y ARN en función de su tamaño,
visualizarlos mediante una sencilla tinción,
y de esta forma determinar el contenido de
ácidos nucleicos de una muestra, teniendo
una estimación de su concentración y grado
de entereza. Se puede, además, extraer del
gel los fragmentos de ADN que sean de
diferentes aplicaciones. 4
La electroforesis de ADN fue, y sigue
siendo, una herramienta de importancia
primordial en el desarrollo de las técnicas
del ADN recombinante o ingeniería
genética. La combinación de fuerzas
eléctricas y de fricción permitirá el
desplazamiento y separación en función del
tamaño o topología de diferentes moléculas
de ADN. Éste es exactamente el principio en
que se basa la electroforesis de ácidos
nucleicos. Sometidos a un campo eléctrico,
la carga neta negativa del ADN y el ARN

1
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Grupo N° 4

hará que estos se muevan en dirección al

ánodo 4
Electroforesis
Para realizar una electroforesis se requiere
de una serie de elementos descritos a
continuación y enlistados en la figura 1.

Fig 2. Marcador de peso molecular

Gel: La muestra debe colocarse sobre un

medio de soporte, con la finalidad de evitar
perturbaciones mecánicas durante la
separación. El soporte idóneo es un gel
semisólido o gelatinoso, compuesto por
polímeros que forman una especie de malla
o microporos tridimensionales a través de
Fig. 1. Elementos necesarios para una electroforesis. los cuales las moléculas avanzan, según el
peso molecular. 3
Cámara de electroforesis: La cámara de
electroforesis es un dispositivo que permite Geles de agarosa: La agarosa es un gel que
la generación de un campo eléctrico tiene la propiedad de mantenerse en estado
alrededor de un gel en el que se depositan las sólido a temperatura ambiente, que se
muestras. disuelve con facilidad en temperatura de 50
a 60°C, se torna líquida y se solidifica
Buffer de corrimiento: Este buffer está
cuando se enfría formando un gel altamente
compuesto y tiene el mismo pH que el
poroso. El gel de agarosa es la manera más
buffer con el que se prepara el gel de
efectiva de separar fragmentos de ADN que
resolución. Éste proporciona el medio para
van de 100 pb a 25 kb. 3
la transmisión de la corriente eléctrica y
mantiene el pH sin variaciones mientras se Preparación de un gel de agarosa: La
realiza el corrimiento. 1 agarosa es un polvo que para disolverse
requiere calentarse hasta la ebullición del
Marcador de peso molecular: Son una
solvente. Una vez obtenida la solución de
mezcla de moléculas de DNA o de proteínas
agarosa, antes de que se enfríe a menos de
de tamaño conocido que permiten
50°C se coloca en una cámara para formar el
determinar por comparación el tamaño de las
gel. 2
moléculas (ácidos nucleicos) contenidos en
las muestras sometidas a electroforesis. En
los marcadores moleculares de ácidos
nucleicos, éstos pueden ser bacteriófagos o
plásmidos sometidos a corte con enzimas de
restricción que generan fragmentos de
diversos tamaños.
Fig. 3. Preparación de un gel de agarosa.

2
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La concentración de agarosa se escoge según Fig 4. Migración de ácidos nucleicos por

el tamaño del ácido nucleico que se vaya a electroforesis en gel de agarosa.
analizar (Tabla 1). Visualización de las muestras: Para la
Tabla 1. Concentraciones de agarosa para visualización de los ácidos nucleicos se
geles de ácidos nucleicos utiliza un colorante fluorescente, el bromuro
de etidio (Fig. 5), que tiene la propiedad de
% Agarosa Tamaño de banda intercalarse entre las bases nitrogenadas del
DNA y el RNA. Debido a esta propiedad es
0,3 >700 pb
un agente mutagénico y debe manipularse
0,5 700pb a 25kb con cuidado. El bromuro de etidio emite
fluorescencia de color naranja cuando se
0,8 500pb a 15kb expone a la luz ultravioleta con longitud de
absorción de 254 nm, y longitud de emisión
1,0 250pb a 12kb de 366 nm.
1,2 150pb a 6kb
1,5 80pb a 4kb
2,0 100pb a 3kb
3,0 500pb a 1kb
4,0 100pb a 500pb
Fig 5. Estructura molecular del bromuro de etidio.
6,0 10pb a 100pb Su sensibilidad permite detectar cerca de 30
pg de ácido nucleico por banda (según el
grosor del gel). El bromuro de etidio es
Migración de fragmentos de ADN teratogénico, mutagénico y cancerígeno, por
lo que para este procedimiento se
La figura 4 representa la migración de las recomienda absoluto cuidado con la
moléculas de DNA en un gel de agarosa. manipulación de este compuesto. 4
Durante la electroforesis, los ácidos
nucleicos lineales con un peso molecular
alto migran al ánodo con más lentitud que 1.
los de menor peso molecular. Esto se debe a Los factores que afectan el resultado de la
que los ácidos nucleicos de peso elevado migración del ADN en la electroforesis son:
tardan más tiempo en atravesar los poros de
Tamaño del ADN: la tasa de migración del
agarosa. 2
ADN por lo general es inversamente
proporcional al log10 del número de pares de
bases que conforman la molécula. Esto
significa que las moléculas de ADN más
grandes la mayoría de las veces migran más
lentamente que las más pequeñas.(1)

Concentración de agarosa: Una molécula de

ADN migra y se distribuye de manera
diferente a medida que varía la concentración
de la matriz de agarosa. (1)

3

Conformación del ADN: Existen moléculas
de ADN que a pesar de presentar el mismo
peso molecular adoptan conformaciones
estructurales diferentes y por esta razón
migran y se distribuyen de diferente manera, y
en algunos casos generan la impresión de
tratarse de moléculas de diferente peso
molecular. (1)
Campo eléctrico: es un gradiente de potencial
que logra que haya electroforesis. Este
depende de los siguientes parámetros:(2)
- Diferencia de potencial(V): Su medida es en
voltios y define el campo eléctrico. Cuanto
mayor sea, mayor será la velocidad de
migración. En la electroforesis se considera de
bajo voltaje si se realiza entre 10-500 voltios y
de alto voltaje si se realiza entre 500-10.000
voltios.
- Intensidad (I): Su medida es en amperios y
cuantifica el flujo de carga eléctrica. Debido a
que esta relacionada con la diferencia de
potencial por la Ley de Ohm (normalmente se
encuentra entre 5-50mA), esta da cuenta de la
distancia recorrida por las moléculas.
-Resistencia (R): Su medida en ohmios y
cuanto mayor sea la resistencia del soporte,
menor será la movilidad electroforética. Esto
depende de la naturaleza del soporte, sus
dimensiones (anchura, longitud y sección) y
de la concentración del buffer empleado en la
electroforesis.
Buffer: Durante la electroforesis, ocurre una
electrolisis del agua por acción del campo
eléctrico, esto genera protones que se
aproximan al ánodo y iones hidroxilo en el
cátodo. Por esta razón, se emplea el buffer
debido a que este evita que el ánodo se
acidifique y el cátodo sea más básico, pero se
debe tener precaución en que este no afecte a
las moléculas a separar, por esto se utilizan
buffer de 0,05-0,01M. También, se debe tener
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en cuenta el pH del buffer, puesto que este
determina la carga de la muestra.(2)
Tiempo de corrida: La determinación de este
es importante debido a que un tiempo muy
corto impide el avance de las muestras para su
correcta separación, sin embargo, se ha
demostrado que los tiempos cortos minimizan
la dispersión de la muestra y el
ensanchamiento de la banda.(3)
2.
La electroendósmosis (EEO) es un fenómeno
que ocurre en algunos soportes, sobre todo en
los que aparecen cargas negativas debidas a
grupos carboxilo o sulfato, al tener contacto
con una disolución iónica. Al aplicar el campo
eléctrico, los iones y las moléculas se
desplazan según su carga, pero en su
migración se encuentra con un flujo
electroendosmótico, este consiste en un flujo
de cationes que se desplazan sobre la
superficie del soporte y otro de aniones
haciéndolo en el centro de los poros. La EEO
va en contra de la resolución de la
electroforesis debido a que las bandas de las
muestras se ensanchan y distorsionan; sin
embargo, esta contribuye a una mejor
resolución en la electroforesis.
3.
En electroforesis el bromuro de etilio es
empleado como marcador de los ácidos
nucleicos, la exposición con este compuesto
debe tener barrera que minimicen su
exposición, debido a que es muy toxico, está
clasificada como mutágeno, el cual puede
introducirse entre los pares de base de doble
hélice (Figura 1), también puede provocar
irritación en la piel, vías respiratorias y ojos.
Por esta razón este compuesto se le debe
realizar un manejo adecuado en cuanto a su
eliminación, para esto se debe realizar un
sistema que consta de un embudo con diámetro
cercano a 30 cm, en su interior se coloca dos
capas de papel filtro y una doble capa de gasa,
el embudo se dispone en un recipiente plástico,
el cual almacenara el filtrado. Sobre el
4
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revestimiento se coloca carbón activado y se enfriarse el gel de agarosa, este gel en

agrega la solución de bromuro de etidio. La
capacidad de inactivación se evalúa tomando
5 µL de solución filtrada y mezcla con 5 µL de
ADN, paralelamente se usa un control de
fluorecencia de 5 µL de ADN > 100 ng/µL
mezclado con 5 µL de solución de bromuro sin
activar. La presencia de fluorescencia en la
solución filtrada indica que la solución no está
inactiva y por tanto se debe cambiar el carbón
activado. Los residuos resultantes se disponen,
el filtrado al desagüe y Carbón activado a
residuos peligrosos.(4)
Figura 1 Efecto mutágeno del bromuro de
etidio(5)
4.
La fuerza iónica es una medida del efecto de
las interacciones ion-ion o ion – disolvente, en
una solución eletrolítica o la intensidad del
campo eléctrico en solución.
Matemáticamente es expresada como: (6)(7)
1
𝐼 = ∑ 𝑐𝑖 𝑧𝑖2
2
𝑖
electroforesis las moléculas de ADN ds
migran de manera inversamente proporcional
al log10 de sus tamaños. (8)(9)
Figura 2 Estructura de la agarosa(2)
Existen diversos buffers para electroforesis de
ADN de cadena doble, los mas usados son el
buffer TAE (Tris, ácido acético y EDTA) y el
TBE (Tris Borato EDTA). La ventaja de usar
el TAE es que es menos costoso y a diferencia
del TBE permite que las moléculas de ADN
migren 10% más rápido. Por otra parte, el TBE
es un buffer muy eficiente y no se
sobrecalienta fácilmente a grandes voltajes,
por esta razón, es usado para la resolución de
grandes fragmentos de ADN en matrices poco
concentradas. (1)
El bromuro de etidio (figura 3) se une al ADN
de doble hélice mediante intercalación, donde
el catión aromático del etidio se ubica entre
dos pares de bases adyacentes en el ADN
(figura 1) (5)

Ci= Concentración molar de cada tipo de ion

Zi= Valencia del ion

2. PARTE EXPERIMENTAL

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La agarosa es un polímero lineal de D-

Figura 3 Estructura del bromuro de etidio (5)
galactosa y 3,6anhidrido-1-galactosa (figura
2) que es extraído de algas marinas de la parte
del agar, una sustancia encontrada en la pared
celular de las algas. La disolución en caliente
de la agarosa en una solución buffer forma al

5
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ecnicas
3. Pérez HMG. Electroforesis en geles de
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actualidad e importancia. Univ Diag.
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7. Facultad de Química UNAM. Fuerza
iónica [Internet]. Teoría de Debye-
Hückel. [cited 2018 Mar 14]. Available
4. CONCLUSIONES from:
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http://www.cultek.com/aplicaciones.as
p?p=Aplicacion_Electroforesis&opc=t

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