ANÁLISIS DEL AISLADO DE PROTEÍNAS DE AJONJOLI (SESAMUM INDICUM L) CON

TRATAMIENTO DE AGUA Y SAL

POVEDA, VILCACUNDO, CARPIO, CARRILLO, 2016

INTRODUCCIÓN
Las proteínas de los alimentos de las plantas son importantes para la nutrición
humana y animal, particularmente en los países en desarrollo donde la ingesta
promedio de proteínas es menor que la requerida [1]. La producción de aislados
de proteína vegetal es de gran interés para la industria alimentaria debido a las
aplicaciones crecientes de proteínas vegetales en los mercados de alimentos,
productos nutracéuticos y alimentos funcionales. El sésamo (Sesamum indicum
L.) es uno de los cultivos oleaginosos más importantes cultivados en América
Central, África tropical y Asia oriental. La producción mundial, en 2008, fue de
3,6 millones de toneladas [2]. Las semillas de sésamo y el aceite se utilizan en
la industria alimentaria, así como en las industrias farmacéutica y cosmética,
debido a su alto contenido de aceite y proteínas con un 19% de contenido de
aceite y un 25% de contenido de proteínas. La mayoría de las proteínas
presentes en las semillas de sésamo son proteínas de almacenamiento
compuestas de globulinas (67,3%), albúminas (8,6%), prolaminas (1,4%) y
glutelinas (6,9%) [3,4]. Algunas subunidades de proteínas de sésamo
(pertenecientes a la albúmina 2S, globulinas 7S y 11S) se han caracterizado por
electroforesis y se han descrito como alergenos principales.
En la actualidad, es posible encontrar productos derivados de proteínas aisladas
de plantas tales como la soja, la quinua, la semilla de altramuz amaranto y las
nueces [5,6]. En este estudio, obtuvimos aislados de proteína de sésamo con
agua y sal a diferentes pH de precipitación

Harina de sésamo y análisis de proximidad.

La harina de sésamo se desengrasó mediante extracción con hexano (1:10 p /

v) a temperatura ambiente durante 24 horas, bajo agitación continua durante las
primeras 5 horas. Después de secar a temperatura ambiente, la harina se
almacenó a 4 ° C hasta su uso. Los métodos analíticos como la humedad, la
grasa, la fibra total y el contenido de sólidos solubles se determinaron, de
acuerdo con los métodos de la Asociación de Químicos Analíticos Oficiales
(AOAC) [7], números 9250.10, 930.09, 985.29 y 923.03, respectivamente. El
contenido de proteína de las muestras se determinó mediante el método AOAC
de micro-Kjeldahl número 920.152,% (N × 6.25). El porcentaje de carbohidratos
se calculó con las fórmulas:% de carbohidratos = 100 - (% de humedad +% de
proteínas +% de grasa +% de sólidos solubles +% de fibra total). Los contenidos
se expresaron en peso seco.

Proteína aislada obtenida de harina de sésamo

El aislado de sésamo se preparó de acuerdo con Martıínez y Añón [8] con
modificaciones. La harina desgrasada se suspendió en agua en 1:10 p / v, y la
suspensión se ajustó a pH 8,0 mediante la adición de NaOH 2M. La suspensión
se agitó durante 1 hora y luego se centrifugó a 4500 g durante 30 minutos a 25ºC.
El sobrenadante se ajustó a pH 2.0, 3.0, 4.0, 5.0 y 6.0 con HCl 2 N y se centrifugó
durante 20 minutos a 4500 g. El sedimento se suspendió en un pequeño volumen
de agua, se neutralizó con NaOH 0,1 M y se liofilizó y luego se congeló a -20 °
C. El contenido de proteína aislada se determinó utilizando el método biuret [9].

Electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio y poliacrilamida (SDSPAGE)

La PAGE nativa y la SDS-PAGE del aislado de proteína de sésamo se llevaron
a cabo de acuerdo con el método propuesto por Laemmli [10] utilizando un gel
de poliacrilamida al 4-8% y al 4-12% en un sistema de electroforesis mini-
proteico (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Las bandas de polipéptidos se tiñeron
en azul brillante de Coomassie G-250 durante 12 horas. Las masas moleculares
relativas de la proteína se determinaron mediante una comparación con los
marcadores de peso molecular (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.) Y el software
Quantity One de Chemidoc (Bio-Rad).

Análisis estadístico

Los resultados se presentan como medias ± desviación estándar de tres

repeticiones de cada experimento. Las diferencias entre los valores medios se
determinaron mediante el análisis de varianza (ANOVA). El análisis post-hoc se
realizó mediante la prueba de Tukey. Todas las pruebas se consideraron
significativas a p <0.05. El análisis estadístico se realizó utilizando el paquete de
software Prism 4 para Windows, versión 4.3 (GraphPad Software Inc.,
www.graphpad.com).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La harina de sésamo desgrasada (n = 3) se analizó para el análisis próximo. La
tabla 1 muestra los resultados de este análisis. El contenido de proteína fue alto
con 40.10%. Achouri y Boye, 2013, han reportado un contenido de proteína de
59% [4], mientras que el contenido de carbohidratos fue de 22.22%.
Se obtuvieron aislados de proteína de sésamo usando el método de precipitación
isoeléctrica con agua y NaCl 0,1 M como disolventes. Usando agua como
disolvente, el mayor rendimiento se obtuvo a pH 7.0 con un contenido de proteína
aislada de 14.72%. Usando NaCl 0.1 M como disolvente, el rendimiento más alto
a pH 4 fue de 44.6%. El NaCl fue aparentemente efectivo para solubilizar la
proteína de la harina de sésamo. Las muestras, utilizando NaCl como disolvente,
se dializaron con una membrana porosa de 5000 Da (Spectra / Por) para eliminar
el contenido de sal. El rendimiento después de la diálisis (17.2%) no tiene
diferencias estadísticas con respecto al uso solo de agua como disolvente. El
rendimiento de aislado de proteína después de la diálisis fue bajo a pH 3.0-6.0.
Además, el contenido de proteína se determinó utilizando el método de biuret
que registra el mayor contenido de proteína a pH 7.0 con un 47.4% (Tabla 2).
Todos los aislados de proteína de harina de sésamo desgrasados se analizaron
mediante electroforesis nativa-PAGE y SDS-PAGE.
La electroforesis nativa-PAGE se usó para analizar el aislado de proteína
obtenido con agua a diferentes pH de precipitación. Se encontraron bandas de
35-198 kDa. Las bandas con peso molecular correspondiente a 198 kDa
presentaron una expresión alta a pH 5.0, 6.0 y 7.0. Pueden ser agregados 11S
con alto peso molecular. Achouri et al., 2012 [3] describieron agregados 11S con
un peso molecular de 140 y 669 kDa de aislado de proteína de sésamo (Fig. 1).
Por otro lado, las muestras se analizaron con electroforesis SDS-PAGE con 2-β-
mercaptoetanol. Las proteínas solubles se caracterizaron por polipéptidos de 6,5
a 50 kDa. Estos resultados están de acuerdo con otros autores. Se encontraron
bandas de 6,5, 18-20, 28-30 y 50 kDa en todos los pH analizados. La banda de
50 kDa corresponde a globulina 7S y las bandas con 18-20 corresponden a
subunidades básicas 11S y 28-30 corresponden a subunidades de ácido 11S.
Las fracciones 11S y 7S son más abundantes a pH 5.0, 6.0 y 7.0. Finalmente,
una banda con 6.5 kDa es 2S albúmina (Fig. 2).
La electroforesis SDS-PAGE sin 2 β-mercaptoetanol se utilizó para analizar la
proteína aislada obtenida con agua. La Fig. 3 muestra polipéptidos de 6,5 kDa
con alta expresión y presentes en todos los pH analizados. A pH 5.0, 6.0 y 7.0,
observamos bandas cerca de 50 kDa.
Los aislados de proteínas obtenidos con NaCl 1M a diferentes pH se analizaron
por electroforesis SDS-PAGE en condiciones reductoras. La Fig. 4 muestra las
diferencias en la electroforética entre el aislado de proteínas de sésamo con
agua y los extraídos en presencia de NaCl 0.1 M. Los extractos obtenidos a pH
3.0, 4.0, 5.0, 6.0 y 7.0 con NaCl 0.1 M mostraron perfiles similares de proteínas
. Las proteínas aisladas estaban compuestas de polipéptidos idénticos con un
peso molecular (28-30 kDa) correspondiente a la subunidad básica del sésamo
11S y bandas con un peso molecular (18-20 kDa) correspondiente a la subunidad
básica de las globulinas proteínas del sésamo 11S. 11S es la fracción más
abundante, con bandas intensas a pH 5.0, 6.0 y 7.0. La globulina 7S corresponde
a bandas entre 45 y 50 kDa. Esas bandas están presentes en todos los ensayos
de pH. Las bandas de peso molecular de 6,5 kDa corresponden a las albúminas
de sésamo 2S. Esas bandas fueron intensas a pH 5.0, 6.0 y 7.0. Las bandas de
globulinas 11S y albúminas 2S tienen una alta expresión ya que esas bandas
son más solubles en este disolvente (Fig. 4).

DISCUSIÓN
Se sabe que las proteínas vegetales de leguminosas y no leguminosas tienen
dos de las principales clases de proteínas de almacenamiento. Estas proteínas
se denominan 7S y 11S dependiendo de sus coeficientes de sedimentación. Las
globulinas 11S son hexámeros con pesos moleculares entre 300 y 400 kDa, que
consisten en dos anillos hexagonales opuestos, cada uno de los cuales contiene
tres pares hidrofóbicamente asociados de subunidades ácidas (29-35 kDa) y
básicas (18-28 kDa) unidas de forma hidrófoba. Las globulinas 7S son
glicoproteínas con pesos moleculares entre 150 y 200 kDa [11]. La aparición de
globulinas de almacenamiento de tipo 11S y 7S en semillas de angiospermas ha
sido reconocida y aceptada [12,13]. Las albúminas 2S se han caracterizado en
diferentes proteínas vegetales, por ejemplo, amaranto, quinoa, semilla de lupino,
soja, sacha inchi y sésamo, ya que se consideran alérgenos [14]. La globulina
11S insoluble en agua y la albúmina 2S soluble son las dos principales proteínas
de almacenamiento del sésamo. La globulina de sésamo 11S tiene la estructura
oligomérica típica de las proteínas de la semilla 11S, que está compuesta por
seis subunidades [15,16]. En este estudio, las proteínas globulinas y albúminas
se obtuvieron a partir de aislados de proteínas de sésamo a diferentes pH con
agua y sal como disolvente para la extracción. Achouri et al. 2012 [3] informó que
obtuvieron polipéptidos con un peso molecular entre 10 y 100 kDa. La albúmina
2S se informó con un peso molecular de 13 kDa y la 7S se informó con un peso
molecular entre 45 y 50 kDa, de acuerdo con nuestros resultados. Se reportaron
las subunidades de ácido 11S (30-35 kDa) y la subunidad básica 11S (20-25
kDa). Nuestros resultados están de acuerdo con este estudio. India es el mayor
productor de sésamo con aproximadamente el 27% de la producción total. China,
Myanmar, México, Nigeria, Sudán, Bangladesh, Somalia y Uganda son otros de
los principales países productores de sésamo. Las semillas de sésamo
contienen cerca de 20% de proteína. El contenido de proteína de la harina
desgrasada con sésamo es de alrededor del 50%. La harina desgrasada también
contiene algunos componentes no deseados junto con la proteína de semilla de
sésamo, como la fibra, el azúcar soluble, los fitatos y los oxalatos, que pueden
eliminarse en gran medida al producir proteínas aisladas [17]. La harina de
sésamo desgrasada (40-50% de contenido proteico) es muy importante como
fuente de proteínas para el consumo humano debido a la presencia de
aminoácidos que contienen azufre, principalmente metionina [18,19]. En este
estudio, obtenemos harina de sésamo desgrasada con un 40,10% de contenido
de proteínas y un 10,8% de contenido de grasa.

CONCLUSIONES
Fue posible obtener proteínas aisladas de harina de sésamo con disolventes
como agua y NaCl 0.1 M con altos rendimientos. No se encontraron diferencias
importantes en los rendimientos cuando se usa agua o NaCl como disolvente. El
perfil de las proteínas obtenidas con NaCl 0.1 M como disolvente tiene bandas
intensas correspondientes a las globulinas de sésamo 11S y las albúminas de
sésamo 2S a pH 5.0, 6.0 y 7.0. La harina de sésamo desgrasada es una buena
fuente de proteínas para la nutrición humana y animal.

Figuras:
Fig. 1. Electroforesis electroforesis en gel de poliacrilamida nativa del aislado de
proteína de sésamo precipitado a diferentes pH. Carril 1: Estándar de peso
molecular, Carril 2: aislado de proteína de sésamo a pH 3.0, Carril 3: aislado de
proteína de sésamo a pH 4.0, Carril 4: aislado de proteína de sésamo a 5.0, Carril
5: aislado de proteína de sésamo a pH 6.0 y Carril 6: Aislado de proteína de
sésamo a pH 7.0

Fig. 2: Electroforesis Dodecil sulfato de sodio y gel de poliacrilamida

electroforesis con 2-β mercaptoetanol de proteína de sésamo aislado a
diferentes pH. Carril 1: Estándar de peso molecular, Carril 2: aislado de proteína
de sésamo a pH 3.0, Carril 3: aislado de proteína de sésamo a pH 4.0, Carril 4:
aislado de proteína de sésamo a 5.0, Carril 5: aislado de proteína de sésamo a
pH 6.0 y Carril 6: Aislado de proteína de sésamo a pH 7.0

Fig. 3: Electroforesis electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio y

poliacrilamida sin análisis de mercaptoetanol 2-β del aislado de proteína de
sésamo obtenido a diferentes pH. Carril 1: Estándar de peso molecular, Carril 2:
aislado de proteína de sésamo a pH 3.0, Carril 3: aislado de proteína de sésamo
a pH 4.0, Carril 4: aislado de proteína de sésamo a 5.0, Carril 5: aislado de
proteína de sésamo a pH 6.0 y Carril 6: Aislado de proteína de sésamo a pH 7.0

Fig. 4: Electroforesis Electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio y

poliacrilamida con análisis de 2-β-mercaptoetanol del aislado de proteína de
sésamo obtenido con NaCl 1 M a diferentes pH. Carril 1: Estándar de peso
molecular, Carril 2: aislado de proteína de sésamo a pH 3.0, Carril 3: aislado de
proteína de sésamo a pH 4.0, Carril 4: aislado de proteína de sésamo a 5.0, Carril
5: aislado de proteína de sésamo a pH 6.0 y Carril 6: Aislado de proteína de
sésamo a pH 7.0