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DETERMINAÇÃO DO COEFICIENTE VOLUMÉTRICO DE OXIGÊNIO EM


BIORREATORES AERADOS E AGITADOS COM INDEPENDÊNCIA DA
SENSIBILIDADE DO ELETRODO

Conference Paper · September 2016

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5 authors, including:

Marcel Otavio Cerri Marcelo Perencin de Arruda Ribeiro


São Paulo State University Universidade Federal de São Carlos
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Mateus Nordi Esperança Alberto C Badino


Federal Institute of Education, Science and Technology of São Paulo Universidade Federal de São Carlos
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DETERMINAÇÃO DO COEFICIENTE VOLUMÉTRICO DE
OXIGÊNIO EM BIORREATORES AERADOS E AGITADOS COM
INDEPENDÊNCIA DA SENSIBILIDADE DO ELETRODO

M. O. CERRI1, R. M. M. G. P.RIBEIRO1, M.P. A.RIBEIRO2, M. ESPERANÇA2, A. C. BADINO


JUNIOR2
1
Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho" - Faculdade de Ciências Farmacêuticas
2
Universidade Federal de São Carlos, Departamento de Engenharia Química
E-mail para contato: gribeiro.renata@gmail.com

RESUMO - A taxa de transferência de oxigênio, fundamental em


bioprocessos envolvendo o cultivo celular aeróbio, pode ser medida em
biorreatores a partir da concentração de oxigênio dissolvido (OD) na fase líquida.
O biorreator convencional é o mais empregado de todos os reatores, em todas as
escalas de produção. Em especial, em cultivos aeróbicos onde aeração e agitação
são essenciais para suprir a demanda de oxigênio por microrganismos, células ou
vegetais. O objetivo é a proposta de uma nova metodologia para tratamento de
dados de kLa em biorreatores convencionais com independência de tempo de atraso
do eletrodo de oxigênio (e), assim evitar dificuldades encontradas na metodologia
dependente da sensibilidade do eletrodo (ke), pois o método tradicional não é
possível considerar a variação sofrida pela película estagnada na ponta do
eletrodo de oxigênio no meio líquido, de acordo com o tipo de fluido, rotação do
impelidor e vazão de gás imposta ao sistema. Com a nova metodologia empregada
os resultados apresentam-se mais robustos, confiáveis e precisos.

INTRODUÇÃO
A maioria dos bioprocessos industriais com microrganismos são realizados de forma aeróbia ou
aeróbia facultativa, sendo o oxigênio essencial no suprimento de energia para o metabolismo celular
nesse tipo de cultivo. Por atuar em processos de reoxidação das coenzimas nas reações de
desidrogenação da glicólise, no ciclo de Krebs e no processo de produção de energia “química”
transformando as moléculas de adenosina difosfato (ADP) em moléculas de adenosina trifosfato
(ATP), a sua presença é fundamental não apenas para o crescimento celular, mas também na síntese de
produtos, transporte, e outras atividades celulares (Schimidell, 2001; Berg et al., 2007).

Embora existam muitos modelos de biorreatores empregados em processos biotecnológicos, o


biorreator do tipo tanque agitado e aerado é o mais empregado de todos os reatores, por isso é conhecido
como convencional ou padrão, em todas as escalas de produção, desde os laboratórios de pesquisa até
as indústrias de bioprocessos. Esse reator apresenta características instrumentais e operacionais muito
interessantes em cultivos aeróbicos onde a aeração e agitação são essenciais para suprir a demanda de
oxigênio por microrganismos, células e/ou vegetais, permitindo as transferências de massa, calor,
movimento e homogeneização das suspensões (Charles, 1985) .

A taxa de transferência de oxigênio em biorreatores com diferentes condições operacionais e


geométricas, é determinada a partir do coeficiente volumétrico de transferência (kLa), que pode ser
obtido a partir de métodos químicos e físicos (na ausência de microrganismos) ou através de métodos
biológicos (na presença de biomassa) (Kargi e Moo-Young, 1985; Moutafchieva et al., 2013). Dentre
os diferentes métodos de medição de kLa descritos na literatura, a técnica com entrada e saída de gases
(método dinâmico) é a mais amplamente utilizada, devida a sua simplicidade.

Esse método de determinação de kLa proposto por (Taguchi e Humphrey, 1966)) parte de uma
análise física na qual tem-se inicialmente a remoção do oxigénio dissolvido da fase líquida, pelo
borbulhamento de algum outro gás no biorreator, como por exemplo o nitrogênio. Posteriormente,
quando a concentração de oxigênio na fase líquida for igual a zero ou praticamente nula, inicia-se a
aeração do meio com uma vazão conhecida de oxigênio gasoso, até a saturação do líquido e a alteração
(aumento) sofrida na concentração de oxigênio líquido é medida, descrevendo a variação da
concentração de oxigênio dissolvido ao longo do tempo, assumindo que kLa permanece constante
(Bandaiphet e Prasertsan, 2006; Cerri, 2009; Patel e Thibault, 2009). Nesta expressão, C é a
concentração de oxigénio dissolvido (OD) na fase líquida e Cs é a solubilidade do oxigénio nessa fase:
𝐶
𝑙𝑛 (𝐶 ) = 𝐾𝐿 𝑎 . 𝑡 (1)
𝑠

O valor de kLa, por conseguinte, pode ser determinada a partir do declive de ln (1-C/CS) por
tempo. Embora essa metodologia seja considerada adequada para o estudo de influências operacionais
sofridas na transferência de oxigênio, deve-se considerar que o atraso no tempo de eletrodo (e), pode
ocasionar em valores não verdadeiros na determinação de transferência de oxigênio, especialmente em
processos que remetem altos valores de e, que pode ser encontrado a partir da leitura do oxigênio
dissolvido no meio. O valor de τe é o tempo necessário para a leitura para atingir 63,2% de saturação.
Porém, nesse tipo de metodologia, a resistência do líquido não é levada em consideração, apenas a
resistência interna do eletrodo, ocasionando em medições menos precisas. No método dinâmico, por
exemplo, utilizar uma equação de primeira ordem por apresentar problemas, devido à dificuldade em
avaliar ke e kLa separadamente.

A metodologia proposta no presente trabalho, permite a determinação da sensibilidade do


eletrodo (ke) e coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio (kLa) em função do tempo
simultaneamente a partir do método de entrada e saída de gases, eliminando erros causados pelo
retardamento da sonda medidora da concentração de oxigênio dissolvido, sendo mais preciso e robusto.

MATERIAIS E MÉTODOS

Biorreator
Os experimentos foram realizados em biorreator comercial tipo tanque agitado e aerado, TEC-
BIO-FLEX Tecnal, Brasil. O biorreator dispõe de volume total de 7,5 L, utilizando 5,0 L dos mesmos,
com altura do líquido 0,205 m. O sistema dispõe de quatro chicanas opostas diametralmente com
largura de 0,015 m, o diâmetro interno do biorreator é 0,190 m e diâmetro externo 0,217 m. O sistema
foi montado utilizando dois impelidores do tipo turbinas Rushton, com uma distância de 0,045 m entre
um e outro, com seis lâminas. A distância entre o aspersor e o fundo do recipiente é 0,030 m e a
distância do impelidor inferior ao final do eixo 0,010 m.

Fluido

Para determinação do coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio (kLa), utilizou-se água


destilada á 28°C como fluido

Eletrodo de oxigênio dissolvido

Utilizou-se o eletrodo de oxigênio In Pro® 6800 da Mettler Toledo, com sensor de 12 mm,
provido de membrana de silicone.

Parâmetros operacionais

Os experimentos foram realizados em triplicata, em sete diferentes condições de agitação (400,


500, 600, 700, 800, 900 e 1000 rpm) e em duas diferentes condições de aeração (2,5 e 5,0 L.min-1).

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Como descrito na literatura, a concentração de oxigênio dissolvido no método de enriquecimento
com gases é obtida a partir das equações:
𝑑𝐶𝑒 𝑑𝐶
= 𝐾𝑒 (𝐶 − 𝐶𝑒 ) (2) e = 𝐾𝐿 𝑎 (𝐶𝑠 − 𝐶) (3)
𝑑𝑡 𝑑𝑡

Onde C é a concentração de oxigênio dissolvido, Cs é a concentração máxima de saturação de


oxigênio no meio, Ce é a concentração de oxigênio inicial determinado pelo sistema de medição. A fim
de garantir uma medição precisa, Ce é considerado nulo e C = Ce. Linearizando a Equação 3, tem-se:
𝑑𝑙𝑛(𝐶𝑠 −𝐶)
− = 𝑘𝑙𝑎 (4)
𝑑𝑡

Ou seja, a inclinação do gráfico de -ln(Cs-C) versus tempo é constante e igual ao kLa. Aplicando
a função exponencial em ambos os lados da Equação 4, temos:
𝐶 −𝐶
− 𝐶 𝑆− 𝐶 = 𝑒 −𝐾𝐿𝑎 (𝑡−𝑡0 ) (5)
0 𝑆

𝐶 = 𝐶𝑠 + (𝐶0 − 𝐶𝑠 )𝑒 −𝑘𝑙𝑎(𝑡−𝑡0 ) (6)


Sabe-se que a concentração de oxigênio dissolvido (OD) também pode ser expresso como sendo:
𝐶
𝑂𝐷 = . 100% (7)
𝐶𝑆

No entanto a resposta do eletrodo de oxigênio refere-se à tensão gerada pelo oxigênio dissolvido,
em termos de pressão. Assim sendo, o oxigênio dissolvido é exposto em função da tensão (ODe) por:
𝐶𝑒
𝑂𝐷𝑒 = . 100% (8)
𝐶𝑆

Dessa forma, reescrevendo as equações 2 e 3 como 9 e 10, respectivamente, e considerando CS=


100, temos o oxigênio dissolvido exposto em função da tensão lida.
𝑑𝑂𝐷𝑒
= 𝑘𝑒 (𝑂𝐷 − 𝑂𝐷𝑒 ) Com 𝑂𝐷𝑒 (0) = 𝑂𝐷𝑒0 (9)
𝑑𝑡

𝑂𝐷
= 𝐾𝐿 𝑎 (100 − 𝑂𝐷) Com 𝑂𝐷 (0) = 𝑂𝐷0 (10)
𝑑𝑡

Resolvendo a Equação 10, tem-se o perfil da concentração de oxigênio dissolvido em função do


tempo:

𝑂𝐷 = 100 + (𝑂𝐷0 − 100) 𝑒 −𝑘𝐿𝑎 (𝑡−𝑡0 ) (11)

Substituindo a equação 11 em 9, temos a derivada do oxigênio dissolvido lido pela tensão em


função do tempo:
𝑑𝑂𝐷𝑒
= 𝑘𝑒 (100 − 𝑂𝐷𝑒 ) + 𝑘𝑒 (𝑂𝐷0 − 100) 𝑒 −𝑘𝐿𝑎 (𝑡−𝑡0 ) (12)
𝑑𝑡

Ao substituir, na equação 3, o valor de C exposto na equação 6, temos a variação da concentração


de Ce em função do tempo. Assim:
𝑑𝐶𝑒
= 𝑘(𝐶𝑠 + (𝐶0 − 𝐶𝑠 )𝑒 −𝑘𝑙𝑎(𝑡−𝑡0 ) − 𝐶𝑒 ) (13)
𝑑𝑡

Que pode ser reorganizada e reescrita como:


𝑑𝐶𝑒
= 𝑘(𝐶𝑠 − 𝐶𝑒 ) + 𝑘(𝐶0 − 𝐶𝑠 ) 𝑒 −𝑘𝑙𝑎(𝑡−𝑡0 ) (14)
𝑑𝑡

Multiplicando a equação acima pelo fator integrante exponencial (kt), tem-se a equação abaixo:
(𝐶 −𝐶 )
𝐶𝑒 = 𝐶𝑒0 e(−𝑘(𝑡−𝑡0 )) + 𝐶𝑠 [1 − 𝑒 (−𝑘(𝑡−𝑡0 )) ] + 𝑘 (𝑘−𝑘𝑙𝑎)
0 𝑠
[𝑒 −𝑘𝑙𝑎(𝑡−𝑡0 ) − 𝑒 −𝑘(𝑡−𝑡0 ) ] (15)

Assim como feito anteriormente, reescrevendo a equação 15 em função da concentração de


oxigênio dissolvido, e admitindo CS= 100, temos a equação geral de oxigênio dissolvido
temporariamente em função da tensão
𝑘𝑒
𝑂𝐷𝑒 = 𝑂𝐷𝑒0 e(−𝑘(𝑡−𝑡0)) + 100 [1 − 𝑒 (−𝑘(𝑡−𝑡0)) ] + (𝑘 (𝑂𝐷 − 100)[𝑒 −𝑘𝑙𝑎(𝑡−𝑡0) − 𝑒 −𝑘(𝑡−𝑡0) ] (16)
𝑒 − 𝑘𝐿 𝑎)

Na qual t0 é o tempo em que a corrente de ar é aberta. H dois parâmetros ajustáveis na Equação


16, ke e kLa. Porém, se assumirmos ke = 0,14 s-1(medida experimental da sensibilidade do eletrodo), a
partir de dados experimentais externos, o valor de kLa estimado sofrerá erros em sua avaliação, uma
vez que a transferência de massa na fase líquida depende do tipo de fluido, rotação, conformação dos
impelidores e vazão de gás imposta ao sistema, variando consequentemente o tempo de resposta do
eletrodo de oxigênio dissolvido. Assim, a suposição de que ke não depende da transferência de massa
na fase líquida é claramente um fator que conduz a erros nos valores encontrados.

Uma forma de diminuir os erros gerados é a regressão linear da Equação 11, assim:
𝑂𝐷−100
− ln (𝑂𝐷 ) = 𝐾𝐿 𝑎 (𝑡 − 𝑡0 ) (17)
0 −100

Porém, observa-se que em um curto período de tempo, a leitura de oxigênio dissolvido levando
em conta o tempo de atraso do eletrodo de primeira ordem torna-se linear em relação a leitura do
oxigênio dissolvido. Dessa forma, a inclinação da reta obtida é o valor do kLa, que pode ser
equacionando a partir da derivada de primeira ordem abaixo.
𝑑𝑙𝑛 (𝑂𝐷𝑒 −100) 𝑑𝑙𝑛 (𝑂𝐷−100)
− = = 𝐾𝐿 𝑎 (18)
𝑑𝑡 𝑑𝑡

A relação acima pode ser facilmente resolvida a partir da Equação 12:


𝑑𝑂𝐷𝑒 1 𝑂𝐷 −100
0
= 𝑘𝑒 [1 + (100− ) 𝑒 −𝑘𝐿𝑎 (𝑡−𝑡0 ) ] (19)
𝑑𝑡 (100−𝑂𝐷𝑒 ) 𝑂𝐷 𝑒

Que ao ser destrinchada pode ser reescrita como:


𝑑𝑙𝑛 (100−𝑂𝐷𝑒 ) 𝑂𝐷 −100
− = 𝑘𝑒 [1 − (𝑂𝐷𝑜−100) 𝑒 −𝑘𝑙𝑎 (𝑡−𝑡0 ) ] (20)
𝑑𝑡 𝑒

Resolvendo a equação acima tem-se que a partir de uma certa região, ln (100 − 𝑂𝐷𝑒 ) passa a ser
linear em relação ao tempo. Dessa forma:
𝑑 𝑂𝐷 −100
𝑘𝑒 𝑑𝑡 [1 − (𝑂𝐷𝑜−100) 𝑒 −𝑘𝑙 𝑎 (𝑡−𝑡0 ) ] = 0 (21)
𝑒

Diferenciando o termo entre parênteses na Equação 21, tem-se de forma resumida:


𝑑𝑙𝑛 (𝑂𝐷𝑒 −100)
− = 𝐾𝐿 𝑎 (22)
𝑑𝑡

Por conseguinte, uma vez que a Equação 20 é igual a Equação 22 (na região linear), pode-se
correlacionar ke e kLa por:
𝐾𝐿 𝑎
𝑘𝑒 = 𝑂𝐷0 −100 −𝑘 𝑎 (𝑡−𝑡 ) (23)
[1− ( )𝑒 𝐿 0 ]
𝑂𝐷𝑒−100
Obtendo assim ke usando a Equação 23 acima.

A fim de identificar uma região adequada do gráfico de -ln (100 − 𝑂𝐷𝑒 ) em função do tempo,
para avaliar o kLa instantâneo. Assim, a Figura 1 abaixo representa a curva de kLa obtido a partir da
Equação 19.

0,10 100

0,08 80
kLa instantâneo (s-1)

-ln (100 – ODe)


0,06 60
Faixa
0,04 Escolhida 40
Faixa
0,02 20 Escolhida
0,00 0
0 50 100 150 200 250 300 350 400 0 50 100 150 200 250 300 350 400
Tempo (s)
Tempo (s)

(a) (b)

Figura 1 – kLa instantâneo em função do tempo (a) e −ln(100 − 𝑂𝐷𝑒 ) em função do tempo (b)

Como mostrado anteriormente na Figura 1, a região onde a variação de kLa foi a menor, não
variando sistematicamente, sendo o mais constante e com baixo grau de ruído foi selecionada para o
ajuste linear. Depois de usar Equação 18 para estimar kLa, os valores de ke foram determinadas para
cada ponto de dados na região linear, como mostrado na Figura 2. O valor ke foi calculado em cima da
média dos valores de ke instantâneo dentro do intervalo selecionado, obtidos em um processo utilizando
água á 28°C.

0,20
0,18
0,15
ke instantâneo (s-1)

0,13
Faixa
0,10 Escolhida
0,08
0,05
0,03
0,00
0 25 50 75 100 125 150 175 200

Tempo (s)

Figura 2 – ke instantâneo (s-1) versus tempo (s)


Os dados obtidos experimentalmente para as quatorze associações diferentes foram tratados na
nova metodologia e são apresentados na Figura 3 abaixo:

0,05 0,07

0,045 0,065

0,04 0,06

ke instantâneo (s-1)
kLa instântaneo (s-1)

0,035 0,055

0,03 0,05

0,025 0,045

0,02 0,04

0,015 0,035

0,01 0,03
300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100

Rotação (rpm) a Rotação (rpm) b

Figura 3 – kLa (a) e ke (b) instantâneos em água 28 ºC com aeração 2,5 L.min-1 (■) e 5,0 L.min-1 (●)

Verifica-se através da Figura 3, que kLa e ke apresentam o mesmo comportamento, aumentando


com o aumento da rotação, deixando claro que utilizar ke fixo e igual a 0,14 s-1 superestima o valor
verdadeiro, por não levar em conta alterações externas que ocorrem no sistema. Por exemplo, a
resistência do líquido não é levada em consideração, apenas a resistência interna do eletrodo,
ocasionando em medições menos precisas. O aumento de ke com o aumento do fluxo de ar comprova
o esperado, pois um aumento na taxa de fluxo de ar leva a uma diminuição na resistência do meio
líquido (RL).

Pela Figura 3 observa-se que em menores rotações, como 400 e 500 rpm, os valores de ke são
mais destoantes quando comparados ao de 900 e 1000 rpm. Assim sendo, em processos que é imposta
uma maior rotação aos impelidores, diminui-se a chance de erro causada pelo tempo de atraso de
leitura, reafirmando que o tempo de atraso do eletrodo varia de acordo com a rotação imposta ao
sistema e o aumento na taxa de fluxo de ar leva a uma diminuição na resistência meio líquido,
minimizando o erro de leitura do eletrodo.

Ao contrário do valor superestimado de ke, o resultado que a metodologia antiga retorna de kLa
é um valor abaixo do verdadeiro. Na condição do sistema com água a 28°C, com rotação imposta de
400 rpm e vazão de 2,5 L.min-1, no modelo de cálculo com atraso do eletrodo fixo o valor de kLa
encontrado é 0,0103 s-1 enquanto na nova metodologia, independente da sensibilidade do eletrodo, o
valor para o mesmo processo é 0,0147 s-1. Pois no novo cálculo, atribui-se a incorporação da resistência
do líquido ao valor de ke e não no de kLa.

Esses resultados mostram-se coerentes ao longo de todos os experimentos, consolidando o novo


método proposto.
CONCLUSÃO
A nova metodologia, capaz de avaliar o kLa e ke mostrou-se satisfatória perante a necessidade de
estimar ke previamente obtido em ensaios correlacionados. Por levar em consideração a reologia do
fluido, a rotação e a vazão de gás impostas ao sistema, a avaliação dos dados tratados a partir desse
método é claramente mais confiável, robusta, simples e retorna menor chance de erros, superando as
limitações relacionadas ao tempo de atraso do eletrodo de oxigênio, resultando em valores kLa
estatisticamente mais confiáveis e de acordo com os fenômenos envolvidos na transferência de
oxigênio.

REFERÊNCIAS
BANDAIPHET, C.; PRASERTSAN, P. Effect of aeration and agitation rates and scale-up on oxygen
transfer coefficient, k(L)a in exopolysaccharide production from Enterobacter cloacae WD7.
Carbohydrate Polymers, v. 66, n. 2, p. 216-228, Oct 27 2006.

BERG, J. M.; TYMOCZKO, J. L.; STRYER, L. BIOCHEMISTRY. 6. 2007. 1026.

CERRI, M. O. Hidrodinâmica e Transferência de Oxigênio em Três Biorreatores Airlift de Circulação


Interna Geometricamente Semelhantes. 2009. (Doutorado). Engenharia Química, Universidade
Federal de São Carlos, São Paulo.

CHARLES, M. Fermenter Design and Scale-up. In: (Ed.). Comprehensive Biotechnology 1st Edition
The Principles, Applications and Regulations of Biotechnology in Industry, Agriculture and Medicine.
USA, 1985. p.57-75.

KARGI, F.; MOO-YOUNG, M. Transport phenomena in bioprocess. In: PRESS, P. (Ed.).


Comprehensive Biotechnology. 1, v.2, 1985. p.5-56.

MOUTAFCHIEVA, D. et al. EXPERIMENTAL DETERMINATION


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PATEL, N.; THIBAULT, J. Enhanced in situ dynamic method for measuring K(L)a in fermentation
media. Bioch. Eng. J., v. 47, n. 1-3, p. 48-54, Dec 1 2009. ISSN 1369-703X.

SCHIMIDELL, W. Biotecnologia Industrial. São Paulo: Edgard Blücher Ltda, 2001.

TAGUCHI, H.; HUMPHREY, A. Dynamic method of the volumetric oxygen transfer coefficient in
the fermentation systems. Journal of Fermatation Techonology, v. 44, p. 881-889, 1966.

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