Sunteți pe pagina 1din 41

Doina Ramona Manu Tehnici de biologie Celulară

1. Caracteristicile microscopului optic

Scopul primar al utilizării unui microscop este cel de observare a unor detalii fine într-o
imagine a obiectelor, nu doar de mărire a imaginii. Performanţa unui microscop este
exprimată ca putere de rezoluţie, adică capacitatea de a separa detalii fine ale imaginii.
Principalele caracteristici ale microscoapelor optice sunt:
Contrastul este diferenţa dintre luminozitatea diferitelor detalii din obiect, prin comparaţie cu
fundalul. Contrastul este generat de absorbţia luminii, de difracţie şi de refracţie.
Rezoluţia este cel mai fin detaliu vizibil în imagine. Puterea de rezoluţie este dată de distanţa
minimă la care două detalii ale imaginii pot fi observate distinct. Puterea de rezoluţie maximă
pentru obiectivul 40X/NA 0,65 este de aproximativ 0,5μm, pentru obiectivul 100X/NA 1,25
este de aproximativ 0,25μm. Obţinerea în mod real a acestor valori depinde de expertiza
microscopistului. Rezoluţia în microscopia cu câmp luminos poate fi calculată cu formula:

d = 1.22 x l / NAOBIECTIV + NACONDENSOR


unde d este rezoluţia în μm, l este lungimea de undă, NA sunt aperturile numerice ale
obiectivului şi respectiv, condensorului.
Conform formulei, pentru un fascicul luminos cu lungimea de undă de 0.5 μm,
NAOBIECTIV = 1.3 şi NACONDENSOR = 0.95, rezoluţia maximă pe care o poate da microscopul
optic este de aproximativ 0,26μm. Altfel spus, rezoluţia depinde de lungimea de undă a
fasciculului luminos utilizat şi de aperturile numerice ale sistemului de lentile.
Componentele unui microscop optic cu câmp luminos sunt:
1. Talpa microscopului- are rol de stativ al aparatului şi este prevăzută cu elemente de
fixare şi de reglare din exterior a fasciculului luminos.
2. Braţul microscopului- este purtător al elementelor de bază, obiectivele şi ocularele
3. Binocularul- în partea superioară sunt dispuse tuburile ocular, cu diametre standard
de introducere a ocularelor.
4. Oculare
5. Capul revolver- are 5 locaşuri în care se fixează obiectivele; permite schimbarea
rapidă a obiectivelor
6. Obiective- pe partea exterioară a obiectivelor sunt gravate : tipul corecţiei, de
exemplu acromat; mărirea transversală, de exemplu 40X; apertura, de exemplu 0,65;
lungimea mecanică a tubului (160 mm); grosimea lamelei ce acoperă obiectul
7. Butonul mişcării fine- microviza
7. Macroviza
8. Masa port- obiect permite deplasarea preparatului microscopic pe două direcţii
perpendiculare: X (transversală) şi Y (longitudinală). Deplasarea mesei port- obiect se poate
realiza prin acţionarea butoanelor concentrice. Pe faţa superioară a mesei se găsesc rigla şi
vernierul pentru deplasare longitudinală/transversală, asfel încât deplasarea se poate realiza
cu precizie de 0,1 mm. Tot pe suprafaţa superioară a mesei se găsesc suporţii reglabili.
9. Condensorul- constituit din corpul propriu-zis care conţine elementele optice şi
diafragma de apertură. Depasarea pe verticală a suportului condensorului se realizează prin
intermediul unui buton de acţionare.
10. Dispozitivul pentru iluminat. Iluminarea corectă. Sursa de lumină este focalizată

1
Doina Ramona Manu Tehnici de biologie Celulară

pe obiectul studiat. Există două tipuri de iluminare: iluminarea critică, în care filamentul
becului este sursa iluminării şi lentilele colectoare asigură formarea razelor paralele şi
iluminarea Köhler, a cărei caracteristică este prezenţa unui diafragm al lămpii, care nu trebuie
confundat cu diafragmul condensorului. Acest diafragm trebuie astfel ajustat încât doar
câmpul vizual să fie iluminat. Lămpile pentru iluminarea Köhler au şi ele lentile colectoare
care proiectează imaginea filamentului la nivelul diafragmei condensorului. Iluminarea
Köhler este iluminarea standard în tipurile de microscoape utilizate în cercetare.
11. Transformatorul
Ocularele sunt derivate din ocularul cu două lentile al lui Huygens. Designurile moderne, cu
câmp vizual lărgit, utilizează combinaţii în locul celor două lentile ale sistemului Huygens. În
majoritatea cazurilor, puterea efectivă a ocularelor utilizate este de 5X, 7x, până la 10X.
Obiectivele. Mărirea imaginii unui obiect are loc în două etape: în oculare şi în obiective.
Puterea de mărire a obiectivelor este cuprinsă între 3X şi 100X . Obiectivele au încă un
parametru denumit apertură numerică, abreviată NA, care determină puterea de rezoluţie a
obiectivelor. NA este cuprinsă între 0,1 pentru obiectivul cu puterea de mărire 3X şi 1,25 sau
chiar 1,4 pentru obiectivul cu puterea de mărire de 100X. Puterea de rezoluţie maximă a
microscoapelor optice este de 0,25μm. Aceasta înseamnă că două detalii mici din obiect pot fi
observate separat dacă ele se află la o distanţă minimă de 0,25 μm una de alta. Obiectivele cu
puterea de mărire de 10X sunt utilizate pentru o cercetare generală în patologie. Diametrul
câmpului devine de două ori mai mic la trecerea la o putere de mărire de 20X (sunt invers
proporţionale). O bună observare la microscop necesită următorii paşi: începem cu 10X/NA
0,25, continuăm cu 20X/NA 0,45, 40X/NA 0,65, 100X/NA 1,25 sau1,4. Obiectivele 10X,
20X, 40X sunt ,,obiectivele uscate", adică mediul dintre lentile şi lamă este aerul. Obiectivul
de 100X, ,,obiectivul de imersie în ulei" (o picătură de ulei special de imersie este aplicată pe
lamelă şi lentila frontală a obiectivului este cufundată în picătura de ulei). O imagine de bună
calitate poate fi obţinută cu obiective care sunt formate din cel puţin 4-6 lentile de diferite
forme, alcătuite din tipuri diferite de sticlă, fine, fixate perfect, lustruite, asamblate împreună
şi centrate. Cele mai performante obiective au până la 14 lentile.
Apertura numerică. Obiectivele cu putere mare de mărire au NA mai mare decât cele
cu putere mică. Obiectivele cu putere de mărire mai mare, captează razele luminoase sub un
unghi mai mare decât cele cu putere mai mică, unghi cunoscut sub denumirea de ,,unghi de
admitanţă", care determină NA a obiectivelor:
NA = n x sin u

unde n este indicele de refracţie şi sin u este sinus din jumătatea valorii unghiului de
admitanţă. Aceste nu poate fi mai mare de 180°, deci u nu poate fi mai mare de 90°,
sin 90°=1, NA = max.1.0 dacă mediul dintre lamelă şi obiectiv este aerul, cu n = 1.0.
NA poate fi însă mărită prin creşterea valorii n, prin imersarea lentilei frontale a
obiectivului de imersie într-un lichid. În acest caz este contracarată şi aberaţia sferică indusă
de refracţia undelor luminoase la trecerea din lamelă în aer, uleiul de imersie având indice de
refracţie asemănător cu sticla, iar obiectivele sunt mai uşor de obţinut, deoarece nu mai
necesită o aberaţie sferică puternică din construcţie. NA obţinută astfel este cuprinsă între
1.25 şi 1.40.
Condensorul. Rolul condensorului este de a umple obiectivul cu un con luminos.

2
Doina Ramona Manu Tehnici de biologie Celulară

Acest con luminos este îngust pentru un obiectiv cu NA mică, dar este larg pentru un obiectiv
cu NA mare (1.25). Părţile din obiectiv care nu sunt iluminate, nu participă complet la
formarea imaginii. Conul luminos este ajustat cu diafragma condensorului.
Apertura condensorului. Cu obiectivul de 10X, îndepărtăm ocularele şi privim prin
tub, înseamnă că ,,verificăm apertura". Se observă un cerc luminos în obiectivul iluminat,
care se numeşte apertură. Apertura nu trebuie confundată cu apertura numerică, care este un
număr, nu un cerc luminos, dar cele două caracteristici sunt strâns interconectate. Dacă se
închide diafragma condensorului, numai o mică porţiune a aperturii este iluminată.
Introducem ocularul la locul lui în tub şi privim imaginea: rezoluţia este slabă deoarece
porţiunile neiluminate ale obiectivului nu contribuie complet la formarea imaginii. Contrastul
este bun. Îndepărtăm din nou ocularul şi deschidem diafragma condensorului până când nu
mai este vizibilă în apertură. Introducem ocularul, privim imaginea. Rezoluţia este bună, dar
contrastul este slab. Dacă îndepărtăm ocularul şi închidem diafragma condensorului până
când aceasta reduce cu 15% apertura, reintroducând ocularul şi privind imaginea, se obţine
cea mai bună rezoluţie corespunzătoare obiectivului folosit, cu un contrast acceptabil. Trebuie
găsit gradul corect de deschidere a diafragmei condensorului, de la minimum (stânga) la
maximum (dreapta). Contrastul descreşte în timp ce rezoluţia creşte de la stânga la dreapta.
Trebuie găsită cea mai corectă poziţie în funcţie de ceea ce dorim să vedem la microscop.
Dacă utilizăm următorul obiectiv, de 20X sau 40X, rotim microviza pentru o imagine clară,
verificăm apertura: numai centrul va fi iluminat, deoarece apertura numerică a obiectivului
este mult mai mare. Deci, pentru obiective diferite, trebuie ,,resetată" diafragma
condensorului la o nouă poziţie optimă. În acest caz, se ajustează diafragma până când 85%
din obiectivul de 20X sau 40X este iluminat, imaginea va fi frumoasă.

Figura 1. Escherichia coli. Coloraţie Gram. Microscop optic cu câmp luminos.

3
Doina Ramona Manu Tehnici de biologie Celulară

Figura 2. Pseudomonas aeruginosa. Coloraţie Gram. Microscopie optică cu câmp


luminos.

Figura 3. Neisseria gonorrhoeae. Coloraţie Gram. Microscopie optică cu câmp


luminos.

4
Doina Ramona Manu Tehnici de biologie Celulară

Figura 4. Staphylococcus sp. în coloraţie Gram. Microscop optic cu câmp luminos.

Coloraţia Gram. Este o coloraţie foarte utilizată în bacteriologie, deoarece împarte bacteriile
în două mari categorii: bacterii Gram-pozitive şi bacterii Gram-negative. Bacteriile Gram-
pozitive rezistă la decolorare, rămânând colorate în violet, dar cele Gram-negative sunt
decolorate de alcool-acetonă şi recolorate în roşu. Se poate observa morfologia celulelor
bacteriene şi forma celulelor (coci, bacili, spirale). Diferenţele în structura peretelui bacterian
sunt evidenţiate prin coloraţia Gram (în bacteriile Gram-negative, peretele celular este format
dintr-un singur strat subţire de proteoglicani incapabil să reţină colorantul violet în etapa de
decolorare cu etanol din colraţia Gram, înconjurat de o membrană externă, care conţine
fosfolipide şi lipopolizaharide, iar bacteriile Gram-pozitive au un strat gros de peptidoglicani
răspunzător de fixarea colorantului violet).

Figura 5. Mycobacterium tuberculosis. Coloraţia Ziehl-Nielsen se aplică în cazurile


mycobacteriilor (bacilul Koch) care au în compoziţia peretelui celular acid micolic care le

5
Doina Ramona Manu Tehnici de biologie Celulară

conferă impermeabilitate la coloranţii folosiţi în tehnica Gram- germeni numiţi acid-


alcool rezistenţi (AAL).

Figura 6. Coloraţia PAS (periodic acid Schiff) - pentru fungi, paraziţi. Candida în ţesut
pulmonar.

Majoritatea tesuturilor sunt incolore, astfel că observarea lor la microscopul optic este
dificilă. Astfel au fost elaborate diverse metode de colorare ce nu doar realizează
evidenţierea diverselor componente tisulare, dar permit şi diferenţieri între diversele
ţesuturi.
Colorarea se realizează prin folosirea de amestecuri ce colorează selectiv componentele
tisulare. Majoritatea coloranţilor se comportă ca şi compuşi acizi sau bazici şi au tendinţa
de a forma legături electrostatice cu radicalii ionizabili ai ţesuturilor.

Figura 7. Frotiu sangvin în coloraţie May-Grunwald-Giemsa. Morfologia celulelor:


hematii, limfocit, polimorfonuclear, monocit, morfologia nucleilor.

6
Doina Ramona Manu Tehnici de biologie Celulară

Componentele tisulare ce se colorează cu coloranţi bazici sunt denumite bazofile, iar cele
cu afinitate faţă de coloranţii acizi sunt denumite acidofile. Exemple de coloranti bazici
sunt albastru de toluidină si albastru de metilen. Hematoxilina se comportă ca şi un
colorant bazic, colorează componentele celulare bazofile. Principalele componente
celulare realizează legaturi ionice şi reactionează cu coloranţii bazici datorită compoziţiei
în acizi a acestora (nucleoproteine şi glicozaminoglicani). Coloranţii acizi (ex. orange G,
eozina, fucsina) colorează componentele bazice prezente în proteinele citoplasmatice.
Dintre toţi coloranţii, combinaţia hematoxilinei cu eozina (HE) este cea mai utilizată în
histologie. Diferiţi coloranţi se pot combina pentru a intensifica diferenţele şi observarea
detaliilor. Coloraţia hematoxilină-eozină este utilizată pentru a face secţiunile prin ţesuturi
mai vizibile. Eozina intensifică culoarea roşie a hematiilor, intensifică contrastul în cazul
formaţiunilor de adeziune şi a altor formaţiuni extracelulare. Hematoxilina determină
coloraţia albastră a nucleilor celulari.

Figura 8. Epiteliul care mărgineşte ductul biliar(unistratificat), acoperit


cu ţesut conjunctiv dens. Microscopie optică cu câmp luminos, coloraţie
hematoxilină-eozină.

7
Doina Ramona Manu Tehnici de biologie Celulară

Figura 9. Endoteliul unui vas sangvin mare.

Figura 10. Celulele specializate pentru absorbţia nutrienţilor (celulele epiteliului


intestinal) sunt bogate în proteine, deci sunt colorate în roz. Se observă la polul
apical ,,marginea în perie”, formată din microvili. Microvilii nu pot fi observaţi decât în
ME, dar ,,marginea în formă de perie” se observă ca o linie roz-închis pe faţa lumenală.
Celulele secretante de mucus, ,,celule goblet”, comprimă celulele învecinate, dar
mucusul în coloraţie H&E este slab colorat. .

8
Doina Ramona Manu Tehnici de biologie Celulară

Figura 11. Cartilaj din disc intervertebral: fibre de colagen, substanţa


fundamentală, celule cu nuclei coloraţi în albastru- coloraţie H&E, M.O. cu câmp
luminos.

Figura 12. Celule epiteliale care mărginesc un duct pancreatic şi în jurul celulelor
epiteliale, fibre de colagen, ţesutul conjunctiv fibros şi un vas sangvin cu hematii.

9
Doina Ramona Manu Tehnici de biologie Celulară

Figura 13. Celulele epiteliale din epiderm(piele), nucleii cu nucleolii, se pot evidenţia
celulele în diviziune, pachetele de heterocromatină sunt mai mici decât nucleolii şi
colorate mai puternic în albastru.

Figura 14. Ţesut galndular cu proliferare tumorală, se observă nuclei mari ai


celulelor tumorale şi deformarea învelişului nuclear datorită materialului genetic
extracromozomal. Apar blocuri mari de heterocromatină, intens colorată.

10
Doina Ramona Manu Tehnici de biologie Celulară

Tehnici de colorare ale cromozomilor •coloraţii simple

•bandarea cromozomilor
Tehnicile convenţionale de colorare(coloraţiile simple) asigură o colorare uniformă a
cromozomilor. Ele sunt mai puţin utilizate la ora actuală datorită apariţiei posibilităţilor de
bandare cromozomială. Bazele chimice ale reacţiilor de colorare sunt insuficient
cunoscute.Colorarea cu soluţie orceino-acetică sau carminic-acetică poate fi utilizată pentru a
colora anumite domenii ale cromosomilor, rezultând un „pattern” caracteristic pentru respectivul
cromozom al unei specii. Substanţa colorabilă a nucleului a fost denumită datorită acestei
proprietăţi cromatină (E.Heitz,1927) şi s-a făcut distincţia între heterocromatină, care conţine
domeniile intens colorabile şi eucromatină care se colorează difuz. Domeniile heterocromatinice
sunt cele în care ADN este mai puternic condensat, acesta fiind motivul pentru care se colorează
intens. O altă coloraţie simplă este Giemsa, este o tehnică mai rapidă, dar asigură o mai slabă
uniformitate a colorării comparativ cu soluţia orceino-acetică. O altă coloraţie este cea cu
hematoxilină. Celulele colorate iniţial cu orceină, Giemsa, fluorocromi sau prin bandare pot fi
decolorate cu acid acetic sau amestec de acid acetic-etanol şi recolorate cu hematoxilină.
Tehnicile de bandare cromozomială duc la apariţia unei succesiuni de benzi
transversale de-a lungul cromozomilor. Aplicarea acestei tehnici de colorare permite o
identificare precisă a cromozomilor şi a diferitelor tipuri de restructurări cromozomiale.
Bandarea Giemsa este astăzi foarte frecvent utilizată şi se bazează pe tratarea
preparatelor cromozomale cu o protează, de regulă tripsina, sau pe incubarea lamelor în
soluţie citrat salină fierbinte sau tampon fosfat fierbinte, deşi există o mare varietate de
alte metode. Benzile închise la culoare conţin porţiuni bogate în A=T, sunt constituite din
heterocromatină cu replicare târzie în faza S şi conţin puţine gene active. Diferă de
benzile deschise la culoare prin proteinele cromozomale, aceste benzi conţinând
eucromatină, se replică timpuriu şi sunt bogate în GC. Extracţia diferenţiată a proteinelor
în pretratamentul de fixare şi bandare este importantă în mecanismul de obţinere a
benzilor G.

11
Doina Ramona Manu Tehnici de biologie Celulară

Figura 15. Bandare cromozomială Giemsa. Microscopul optic cu câmp luminos.

Particularităţi ale microscopului cu fluorescenţă

Microscopul cu fluorescenţă este un microscop optic care foloseşte fluorescenţa şi


fosforescenţa în loc de/împreună cu reflexia şi absorbţia luminii. Generarea luminescenţei
este consecinţa excitării unei molecule cu fotoni de lumină vizibilă sau ultravioletă, proces
denumit fotoluminescenţă, care este formal divizat în fluorescenţă şi fosforescenţă, în funcţie
de configuraţia electronică a stării de excitaţie sau de calea de emisie. Fluorescenţa este
proprietatea anumitor atomi şi molecule de a absorbi lumina la o anumită lungime de undă şi
consecutiv de a emite lumină de o lungime de undă mai mare după un anumit interval scurt,
termen denumit durată de viaţă a fluorescenţei. Fosforescenţa se produce în mod similar, dar
starea de excitaţie a moleculelor este mult mai lungă.
În cele mai multe cazuri, componenta de interes este marcată specific cu o moleculă
fluorescentă denumită fluorofor sau fluorocrom. Structura biologică urmărită este iluminată
cu un fascicul de o anumită lungime de undă specifică care este absorbită de fluorofor,
rezultatul fiind emisia unui fascicul luminos de altă lungime de undă, de altă culoare decât cel
absorbit. Componentele unui microscop cu fluorescenţă sunt: lampa cu arc xenon sau lampa
cu vapori de mercur, filtrul de excitaţie care este constituit din sticlă cu calităţi optice ridicate,
care selectează din fasciculul luminos emis de sursă, lumina cu lungimi de undă scurte care
au cea mai mare energie, oglinda dicroică sau dicromatică (termen care provine din
grecescul ,,dikhroos” care înseamnă bicolor) care se caracterizează prin reflexia luminii cu
două lungimi de undă şi filtrul de emisie. Filtrul şi oglinda dicroică sunt alese astfel încât să
se potrivească excitaţiei spectrale şi emisiei caracteristice etichetei fluorescente alese pentru
structura studiată.

Fluorescenţa este emisia de lumină care are loc în nanosecunde după absorbţie şi este
caracteristică luminii cu lungime de undă scurtă. Diferenţa dintre lungimea de undă de
excitaţie şi cea de emisie, cunoscută sub denumirea de schimb Stokes, este proprietatea care

12
Doina Ramona Manu Tehnici de biologie Celulară

face fluorescenţa atât de puternică. Prin filtrarea completă a luminii de excitaţie, fără blocarea
luminii emisiei fluorescente, este posibilă observarea doar a obiectului care este fluorescent.
Contrastul este superior tehnicilor de absorbţie în care obiectul este colorat cu agenţi care
absorb lumina. Cu coloranţi care absorb lumina, nivelul de lumină absorbită de obiectul
colorat este infinitezimal diferit de fundal în cazul obiectelor mici. În schimb, în fluorescenţă
fiecare moleculă fluorescentă este vizibilă dacă fundalul nu are proprietăţi de
autofluorescenţă.
În momentul în care compuşii fluorescenţi aflaţi în ,,stare bazală” absorb energie
luminoasă (fotoni) apar alterări în statusul electronic, vibraţional şi rotaţional al moleculei.
De fapt, energia absorbită mută un electron pe un alt orbital, mai departe de nucleu. Această
tranziţie spre o ,,stare de excitaţie” se produce foarte rapid şi conduce la mişcări de vibraţie
moleculare, în care distanţele internucleare variază în timp. Emisia fluorescentă este însoţită
de relaxarea mişcării de vibraţie moleculară şi reprezintă calea prin care fluoroforii revin la
starea bazală caracterizată prin energie mică.

Există fluorofori naturali, care au ca proprietate intrinsecă fluorescenţa, dar se


utilizează mult fluoroforii de sinteză, în special compuşi aromatici care se caracterizează
prin existenţa unor legături de tip π care mobilizează uşor electronii din orbitalii externi. Cu
cât fluoroforul deţine mai multe legături conjugate de tip π, cu atât energia de excitaţie poate
fi mai scăzută şi lungimea de undă a luminii de excitaţie este mai lungă.
O problemă a microscopiei cu fluorescenţă este obţinerea imaginii mai multor
fluorofori în acelaşi obiect. Această problemă a fost rezolvată prin sinteza organică a unor
largi game spectrale de fluorofori prin adăugarea de legături conjugate suplimentare care
permit acum utilizatorilor să aleagă fluorofori cu mici suprapuneri ale spectrului de excitaţie
şi/ sau ale spectrului de emisie.
Descoperirea proteinei fluorescente verzi (GFP) la începutul anilor ̉60, a deschis o eră
nouă în biologia celulară, prin metodele de clonare moleculară, au fost fuzionate moleculele
fluorescente cu o largă varietate de proteine sau enzime-ţintă, pentru monitorizarea proceselor
celulare în sisteme vii utilizând microscopia optică şi metode înrudite. Fluoroforii sunt
implicaţi în evidenţierea unor procese fiziologice celulare prin acumularea moleculelor
marcate cu flurofori în organite cum sunt mitocondria, reticulul endoplasmic, nucleul sau
veziculele din spaţiul sinaptic. Microscopia cu fluorescenţă este capabilă de a furniza

13
Doina Ramona Manu Tehnici de biologie Celulară

informaţii despre distribuţia unei singure specii moleculare, pe baza proprietăţilor de emisie
fluorescentă. În consecinţă, poate fi monitorizată localizarea precisă a componentelor
intracelulare marcate cu fluorofori specifici, coeficienţii lor de difuzie, caracteristicile
transportului, interacţiunea cu alte biomolecule. Practic, proprietăţile de absorbţie şi emisie
ale fluoroforilor pot fi foarte sensibile la schimbări din mediu. Spectrul de emisie şi/sau
absorbţie se poate modifica ca urmare a legării ionilor de calciu, de hidrogen sau a altor
molecule de interes, deci permite investigarea pH-ului, vîscozităţii, indicelui de refracţie,
concentraţia ionică, potenţialul de membrană, polaritatea solvenţilor în celulele vii şi ţesuturi.
În timp ce unii fluorofori permit doar estimări ale modificării concentraţiei moleculelor–ţintă
prin creşteri sau descreşteri ale fluorescenţei, alţi fluorofori permit determinări cantitative de
concentraţii. Acestea sunt posibile prin raportarea intensităţii fluorescenţei în două spectre de
emisie- absorbţie, unul caracteristic moleculei-ţintă, iar celălalt insensibil faţă de ţintă, ceea
ce permite interpretarea modificărilor fluorescenţei în condiţiile modificării concentraţiei
ţintei, şi respectiv modificării fluorescenţei datorită distanţei din celulă, unei concentrări de
colorant, unui mediu inomogen. A putut fi studiată expresia genică în celule provenite din
culturi sau în alte celule vii, dinamica organitelor celulare şi a altor compartimente celulare.
Microscopia de fluorescenţă se foloseşte pentru observarea unor preparate colorate vital,
pentru observarea lizozomilor ce au acumulat coloranţi fluorescenţi
(cum este acridin oranjul), în studiul cromozomilor (benzi fluorescente sau detectarea
cromozomului Y), în studii de imunologie (imunofluorescenţa), de histochimie si citochimie.
Microscopia de fluorescenţă a fost folosită în biologia celulară în studiul mobilităţii
proteinelor de membrana dupa fuziunea celulelor umane şi de şoarece, experienţă ce
dovedeşte fluiditatea membranei. Cu ajutorul fluorescenţei primare pot fi identificaţi:
pigmenţii: porfirinele (fluorescenţă roşie), lipocromii sau pigmentii carotenoizi
(fluoresecenţă verde), cromolipidele (fluorescenţă galben-verde), lipofuscina
(fluorescenţă roşu-brun; acizii aminati: fenilalanina, tirozina, triptofanul (fluorescenţă
albastră); unele virusuri si bacilul Koch emit o fluorescenta verde strălucitor;
dintele natural este autofluorescent, proprietate prin care se deosebeşte de cel artificial;
aminele biogene: adrenalina, noradrenalina, serotonina (fluorescenţă verde).
Cu ajutorul fluorocromării cu acridin orange se pot identifica:
acizii nucleici: ARN-ul – fluorescenţă roşie, ADN-ul - fluorescenţă verde- galben;
fibrele de colagen, elastice şi de reticulina - fluorescenţă verde;
nucleii leucocitelor au o florescenţă verde, iar citoplasma lor si eritrocitele rămân opace;

14
Doina Ramona Manu Tehnici de biologie Celulară

mucinele-fluorescenţăverde.

Figura 16. Celulă endotelială: ADN-fluorescenţă galben-verde, citoscheletul-


fluorescenţă verde.

Figura 17. Traficul vezicular într-o celulă, în fluorescenţă verde, microtubulii în


fluorescenţă roşie.

15
Doina Ramona Manu Tehnici de biologie Celulară

Figura 18. Celulă în anafază (diviziune mitotică). Microtubulii fusului de


diviziune- fluorescenţă verde, cromozomii (ADN) –fluorescenţă albastră(DAPI).

Figura 19. Celule normale şi o celulă tumorală cu cantitate mare de material


genetic-fluorocrom albastru DAPI, şi evidenţierea a numeroşi centrioli care sunt dovada
numeroaselor diviziuni şi a formării repetate a fusurilor de diviziune în celula tumorală.

16
Doina Ramona Manu Tehnici de biologie Celulară

Figura 20. Aparatul Golgi- microscopie cu fluorescenţă.

Figura 21. Reticulul endoplasmic – microscopie cu fluorescenţă

FISH-ul metafazic. Hibridizarea fluorescentă „in situ” (FISH) este o tehnică de citogenetică
moleculară prin care se urmăreşte detectarea unor anomalii cromozomiale, care nu pot fi
identificate cu precizie prin cariotipul convenţional. De exemplu, dacă cunoaştem secvenţa
unei anumite gene, dar nu ştim în care cromozom este localizată, se poate utiliza FISH pentru
identificarea cromozomului în cauză şi locaţia exactă a genei. Este utilizată în cazul
suspiciunii clinice sau citogenetice (prin cariotip) a anomaliilor de structură ale
cromozomilor: microdeleţii sau microduplicaţii, translocaţii, sau pentru identificarea
cromozomilor marker. FISH-ul pe nuclei interfazici (utilizat mai ales în diagnosticul prenatal)
stabileşte sexul genetic şi poate detecta anomalii numerice(aneuploidii)cromozomiale.

Principiul acestei metode este hibridizarea (legarea) prin complementaritate a unei sonde de
ADN cu o anumită regiune a unui cromozom. Sonda de ADN este în prealabil marcată cu
ajutorul unui fluorocrom, ceea ce o face vizibilă la microscopul cu fluorescenţă. Astfel, se
stabileşte prezenţa sau absenţa secvenţei de ADN de interes (complementară sondei), numărul
de copii ale secvenţei respective şi poziţia pe un anumit cromozom.
Tehnica este următoarea: se sintetizează o probă de ADN complementară secvenţei cunoscute
din cromozom, aşa numita sondă de ADN şi se etichetează cu un marker fluorescent, prin

17
Doina Ramona Manu Tehnici de biologie Celulară

încorporarea în timpul sintezei de nucleotide legate chimic cu un fluorocrom. Se denaturează


ADN cromozomal (obţinere de ADN monocatener din ADN dublu-catenar), se denaturează şi
proba fluorescentă de ADN, se lasă să hibridizeze porţiunile complementare ale celor două
monocatene şi în funcţie de numărul de situsuri de complementaritate se obţin semnale de
fluorescenţă sub microscopul cu fluorescenţă.
Există mai multe tipuri de sonde, în funcţie de tipul de anomalie cromozomială
suspicionată: sonde specifice unui locus, pentru identificarea deleţiilor sau duplicaţiilor
submicroscopice (care nu sunt vizibile utilizând cariotipul convenţional). Absenţa semnalului
fluorescent corespunzător sondei pe un anumit cromozom, înseamnă deleţia (absenţa) zonei
respective. Apariţia a două semnale diferite corespunzătoare sondei, indică o
microduplicaţie. Aceste sonde sunt folosite şi pentru identificarea punctelor de ruptură
cromozomiale în cazul translocaţiilor (anomalii de structură care presupun un schimb de
fragmente între doi sau mai mulţi cromozomi). Astfel de sonde pot fi utile în diagnosticarea
sindroamelor produse prin microdeleţii sau microduplicaţii cromozomiale: Williams,
Beckwith-Wiedemann, Prader-Willi, Angelman, velo-cardio-facial (Di George). Sondele
centromerice au rol în identificarea unui anumit cromozom şi/sau detectarea anomaliilor
numerice ale cromozomului respectiv.Sondele telomerice permit diagnosticarea
microdeleţiilor sau altor rearanjamente. Sondele specifice unui cromozom permit “colorarea”
întregului cromozom sau doar a unei regiuni. Prin colorarea diferită a doi sau mai mulţi
cromozomi se pot identifica mici rearanjamente în care aceştia sunt implicaţi.
În concluzie, FISH-ul metafazic aduce în plus faţă de cariotip sau de FISH-ul interfazic
detalii despre anomaliile de structură ale cromozomilor. Întrucât această metodă presupune ca
primă etapă de lucru, obţinerea unor culturi celulare (limfocite din sânge periferic sau
amniocite recoltate prin amniocenteză în săptămânile 15-17 de sarcină), intervalul minim
pentru diagnostic este de două săptămâni.

Figura 22. Punctele verzi sunt sonde de ADN complementare genelor


receptorului olfactiv, hibridizate pe o probă de ADN cromozomial pe care
anterior s-a aplicat o tehnică de bandare inversă (benzi R) după Cynthia
Friedman şi Barbara Trask-Departamentul de Biotehnologii Moleculare al
Universităţii Washington.

18
Doina Ramona Manu Tehnici de biologie Celulară

Figura 23. Cariotipul spectral-tehnica SKY.

Cariotipizarea spectrală este o tehnică de citogenetică moleculară utilizată pentru vizualizarea


simultană a tuturor perechilor de cromozomi ale unui organism în culori diferite. Probele
etichetate fluorescent ale fiecărei perechi de cromozomi sunt obţinute prin etichetarea ADN
specific cromozomilor cu fluorofori diferiţi.Deoarece există un număr limitat de fluorofori
spectral –distinctibili, se utilizează o metodă combinatorie de etichetare fluorescentă pentru a
genera mai multe culori diferite.Diferenţele spectrale generate de combinaţiile de fluorofori
sunt captate şi analizate prin utilizarea unui interferometru ataşat microscopului cu
fluorescenţă. Un software de procesare a imaginilor stabileşte o pseudoculoare pentru fiecare
combinaţie spectrală diferită, permiţând vizualizarea cromozomilor coloraţi. Această tehnică
este utilizată pentru a identifica aberaţii structurale ale cromozomilor în celule tumorale şi în
alte boli, în condiţiile în care bandarea Giemsa şi alte tehnici de bandare nu sunt suficient de
exacte.

2. Microscopul cu contrast de fază

Tehnică de m.o. în care o mică diferenţă de fază a undelor luminoase care trec printr-un
specimen biologic transparent este convertită într-o schimbare de contrast în imagine. In timp
ce lumina traversează un mediu, aceste determină o schimbare în amplitudine sau fază care
depinde de proprietăţile mediului. Ochiul uman nu poate detecta schimbările de fază, deşi
acestea sunt purtătoarele unei mari cantităţi de informaţie. Pentru ca această diferenţă de fază

19
Doina Ramona Manu Tehnici de biologie Celulară

să poată fi detectată este necesară combinarea procesului de traversare a obiectului de către


undele luminoase cu o referinţă a.î. să rezulte structura obiectului. Frits Zernicke primeşte în
1953 premiul Nobel în fizică pentru descoperirea acestei tehnici în 1930.

Diferenţa în compoziţie şi densitate din interiorul specimenului determină schimbări de fază


ale luminii care îl traversează, făcând structurile vizibile şi permiţând studierea lor vii.
Majoritatea componenţilor celulari sunt esenţial transparenţi în zona vizibilă a spectrului
luminos, cu excepţia unor pigmenţi, mai mult specifici plantelor care absorb lumina la
anumite lungimi de undă, fiind substanţe colorate. Capacitatea scăzută a celulelor vii de a
absorbi lumina este cauzată mai ales de conţinutul ridicat de apă, dar chiar si după uscare
componentele celulare sunt puţin contrastante. O cale de a rezolva aceste inconveniente este
utilizarea coloranţilor care colorează selectiv diferitele componente celulare apărând astfel
contrastul necesar unei bune observări. Dar, în multe cazuri coloraţiile nu pot fi utilizate
pentru studiul celulelor vii. Fixarea, deshidratarea, includerea şi secţionarea ce preced
colorarea pot induce modificări morfologice şi chimice. Se dezvoltă în consecinţă tehnici
alternative cum este microscopia cu contrast de fază şi microscopia de interferenţă, care se
bazează pe fenomenul de schimbare de fază a radiaţiei luminoase transmise prin structurile
biologice. Aceste diferenţe de fază care rezultă din diferenţe mici ale indicilor de refracţie şi
de grosime ale diferitelor părţi ale obiectului, pot fi uşor detectabile. Astfel, în cazul unui
obiect nonabsorbant transparent care are un indice de refracţie diferit de al mediului se
constată o schimbare a vitezei, în timp ce amplitudinea undei luminoase nu este afectată, deci
are loc o întârziere sau retardare care mai este denumită schimb de fază. După ce fasciculul
luminos părăseşte obiectul, este restabilită viteza, dar se menţine retardarea. Această retardare
sau schimb de fază este măsurabilă într-o anumită lungime de undă. Schimbul de fază creşte
direct proporţional cu diferenţa între indicii de refracţie ai obiectului şi, respectiv, mediului
înconjurător şi cu grosimea obiectului. O celulă este un asemenea obiect destul de subţire,
transparent, având un indice de refracţie foarte apropiat de cel al mediului şi care reprezintă
un obstacol în calea razelor luminoase. În timp ce o porţiune a razei luminoase traversează
celula fără a devia, deci fără modificarea amplitudinii şi a lungimii de undă, o altă porţiune a razei
luminoase este difractată şi deviată, iar o altă porţiune nu traversează obiectul.

Prin această tehnică se evită colorarea obiectului, procedură care necesită timp, este dificilă şi
nu garantează evitarea distrugerii sau alterării specimenului. Este posibilă studierea celulelor
vii, organismelor unicelulare, ciclului celular. Ţesuturile (structurile) necolorate sunt optic
neomogene, deoarece au un indice de refractie a luminii diferit. De aceea între razele care
traverseaza partea structurii cercetate cu indicele de refracţie n1 si zona cu indice de refracţie
n2 va aparea o anumita diferenţă de fază. Aceasta diferenţă de fază nu se manifestă direct,
deoarece diferenţele de drum optic sau modificările în faza undelor de lumina produse de
către aceste obiecte sunt prea mici ca să fie detectate de ochi sau pe fotografie.
În microscopia în contrast de faza diferenţele de drum optic sunt amplificate, deoarece razele
refractate sunt defazate la trecerea printr-un dispozitiv special numit placă de fază.
Dupa cum se observă în figură, razele de lumină ajung la preparat, de aici la obiectiv şi apoi la
placa de faza care este prevazută cu un sanţ inelar. Raza nerefractată trece prin inelul plăcii de
faza, care o defazează cu 1/4 fata de raza refractată ce nu trece prin acest inel. La formarea

20
Doina Ramona Manu Tehnici de biologie Celulară

imaginii se produce interferenţa celor două raze. Interferenţa dintre razele normale şi cele
defazate duce la o mărire a contrastului la limita dintre două zone cu indici de refracţtie foarte
puţin diferiţi. Rezultatul este apariţia unui halou ce creşte contrastul şi permite observarea
unor detalii invizibile la microscopul optic simplu. Pentru fiecare obiectiv exista o placă de
fază, ce se aduce în axa optica prin rotirea tamburului pe care se află montate plăcile de fază.
Microscopia în contrast de fază este folosită pentru studiul celulei vii, permiţând observarea
structurii nucleului, distribuţia organitelor în citoplasmă, modificările din diviziunea celulei,
mişcările celulare. Adesea se procedeaza la filmare prin cuplare la microscop a unui aparat
destinat acestui scop.

Avantajele microscopiei cu contrast de fază:


a. Studiul celulelor în stare vie (celule nefixate si necolorate);
b. Scoate în evidenţă unele detalii de structură care nu se pot observa la
microscopul fotonic obişnuit ca endocitoza, mişcarea cililor şi flagelilor,
diviziunea celulară, etc.;
c. Se pot studia reacţiile celulare la diferiţi agenţi fizici sau chimici;
d. Se pot studia benzile cromosomilor.

1.Aperturacondensorului

21
Doina Ramona Manu Tehnici de biologie Celulară

2.Planulobiectului
3.Plăcuţadefază
4. Planul primei imagini

Figura 24. Celule vii în cultură-studiu comparativ: a. sub microscop optic cu câmp
luminos-contrast slab al celulelor vii necolorate, b. contrast de fază în care se văd
componente celulare, nuclei cu nucleoli şi celule în diviziune, c. aceleaşi celule în
microscopie cu interferenţă:

a.

b.

22
Doina Ramona Manu Tehnici de biologie Celulară

Figura 25. Celule vii (de cultură) în microscopie cu contrast de fază. Se disting nuclei,
nucleoli, mitocondrii, diferenţieri ale membranei plasmatice.

3. Microscopul cu câmp întunecat

Microscopia în câmp întunecat se bazează pe fenomenul Tyndall, care constă în


dispersia (împraştierea) luminii de către particule foarte mici aflate în suspensie şi care
astfel devin vizibile, analog particulelor de praf aflate într-o raza de lumina puternică. În
acest caz se foloseşte o metodă de iluminare în care fasciculul care serveşte la iluminarea
obiectului nu patrunde direct în microscop: proba este iluminată cu raze oblice printr-un

23
Doina Ramona Manu Tehnici de biologie Celulară

condensor special (cardioid sau paraboloid), iar în obiectiv nu patrund decât razele
dispersate, reflectate şi refractate de particulele aflate în suspensie. Câmpul va apărea
întunecat datorită faptului că nici un fascicul luminos direct nu ajunge la obiective.
Fascicolul incident este în fiecare caz limitat de o diafragma (D) cu deschideri convenabil
alese. Astfel, apar nişte puncte strălucitoare pe fond negru, ce corespund particulelor pâna
la 30Å (1 angstrom = 1.0 × 10 -10 m, deci de aproape 100 ori mai mici decât limita de
rezoluţie a microscopului optic, care este de 200nm). Se pot astfel observa particule în
citoplasma celulelor vii, care nu pot fi văzute în microscopia obişnuită. Microscopia pe
fond întunecat se foloseşte si pentru examenul celulelor vii (microbi, protozoare) care pot
fi vazute şi la microscopul obişnuit, dar ale caror particularităţi apar cu mult mai clar pe
fond întunecat. De exemplu, studiul spirochetelor permite diagnosticul unor boli ca
sifilisul. Într-o celulă vie dintr-o cultură, nucleolul, membrana nucleară, mitocondriile şi
picăturile lipidice apar strălucitoare pe fondul întunecat al citoplasmei. Există microscoape
cu câmp întunecat cu condensoare cu imersie, fiind necesară o picătură de ulei de imersie
sau chiar apă ca mediu de imersie la contactul dintre condensor şi obiect, care permit
trecerea razelor cu oblicitate accentuată şi obţinerea de imagini fără aberaţii cromatice pe
un fond puternic întunecat. Pe de altă parte microscopia cu câmp întunecat se practică şi
pentru preparate cu contrast slab. Imaginea preparatului apare luminoasă pe fond
întunecat. Acest procedeu are la bază efectul produs de condensor, datorat fenomenului de
difracţie a luminii (în preparat) realizat printr-o iluminare laterală. Examinarea pe fond
întunecat se poate face şi la un microscop obişnuit, la care preparatul cu particule în
suspensie se plasează într-o cuvă de sticla iluminată lateral. Acest procedeu se numeşte
ultramicroscopie.

Figura 26. Hematii, polimorfonuclear şi reţeaua de fibrină în cursul procesului de


coagulare a sângelui.

24
Doina Ramona Manu Tehnici de biologie Celulară

Figura 27. Studiul componenţilor celulelor vii în microscopie cu câmp întunecat.

Microscopia electronică.
1. Microscopul electronic cu transmisie

Utilizează un fascicul de electroni pentru a mări imaginea obiectelor. Puterea de mărire a ME


este de 2 milioane de ori, în timp ce a MO este de 2000 de ori (cele mai performante
microscoape optice). Ambele tipuri de microscoape au rezoluţie limitată, impusă de lungimea
de undă în care funcţionează. ME are putere de rezoluţie mare, dată de lungimea de undă a
electronilor, denumită lungime de undă a lui de Broglie.

ME este un instrument ştiinţific care permite cercetătorilor studierea microorganismelor,


ultrastructurii celulelor, componentelor celulare, macromoleculelor, preparatelor biologice din
biopsii.
Puterea de rezoluţie este invers proporţională cu lungimea de undă a radiaţiei folosite. MO nu
vor putea reda imaginea clară a unor specimene cu dimensiuni mai mici de 0,15μm. Puterea
de rezoluţie a putut fi sensibil mărită cu ajutorul ME deoarece lungimea de undă asociată
electronului este mult mai mică decât cea a radiaţiilor vizibile sau ultraviolete utilizate de MO.
În microscopie, structurile ce pot fi distinse depind de rezoluţie, puterea de rezoluţie este dată
de distanţa minimă la care două puncte pot fi observate distinct, notată d. Rezoluţia este
limitată de difracţie.

d = 0,612 x λ/n x sinα

unde λ este lungimea de undă a radiaţiei utilizate


n este indicele de refracţie
α este unghiul de admitanţă, sub care sunt admise razele luminoase în obiective
(determină apertura numerică)

La MO rezoluţia maximă în UVeste de 0,2μm.

25
Doina Ramona Manu Tehnici de biologie Celulară

Unui fascicul de electroni îi este asociată o undă cu lungimea:

λ (nm) = h/m x v =1,23/√U

unei tensiuni de accelerare U=60kV, îi corespunde o lungime de undă λ=0,005nm şi o


rezoluţie de aproximativ 0,3nm.

Microscopul electronic convenţional este denumit TEM sau microscopul electronic de


transmisie şi utilizează un fascicul de electroni de voltaj înalt pentru a crea imaginea unui
obiect. Fasciculul de electroni este emis de un catod acicular încălzit din tungsten cuprins în
structura tunului de electroni.Fasciculul de electroni este accelerat spre anod, tensiunea de
accelerare fiind cuprinsă între 40 şi 400 keV. Cu cât această tensiune este mai mare cu atât
este mai scurtă lungimea de undă a electronilor şi cu atât este mai mare puterea de rezoluţie.
Echipamentele moderne au o putere de rezoluţie de 0,2-0,3 nm. Fasciculul de electroni
părăseşte anodul printr-un orificiu de la baza acestuia urmând un traseu asemănător cu cel
dintr-un microscop optic.Fasciculul este mai întâi preluat de un condensor, trece de cele două
lentile condensoare electrostatice şi electromagnetice şi prin diafragmele acestora, fiind
focalizat asupra preparatului, străbate preparatul care este în parte transparent pentru electroni
şi în parte, fasciculul este difractat, împrăştiat. Parte din electroni, fasciculul care a străbătut
preparatul este purtător al informaţiei despre structura specimenului, este refractat de lentilele
obiectiv şi de proiecţie, iar imaginea mărită este proiectată pe un ecran fluorescent acoperit cu
fosfor sau sulfid de zinc. Imaginea poate fi fotografiată prin expunerea unui film direct
fasciculului de electroni sau ecranul cu înaltă rezoluţie datorată fosforului, poate fi cuplat la
un sistem de lentile sau la un sistem de fibră optică prin care este cuplat la o cameră video, iar
imaginile filmate pot fi obţinute pe monitorul unui computer.
Gradul de refracţie depinde de densitatea electronilor în obiectul studiat. Cu cât este
mai mare masa atomilor componenţi cu atât este mai mare gradul de refracţie. Obiectele
biologice sunt în cea mai mare parte constituite din atomi cu masă mică (C,O,N,H) , de aceea
este necesar să preparăm obiectul prin tratare chimică, cu metale grele pentru a obţine
contrast. De asemenea, preparatul microscopic nu trebuie să fie mai subţire de 100nm, pentru
că absorbţia electronilor decurge cu creşteri de temperatură, ceea ce poate duce la distrugerea
preparatului. Rezoluţia TEM este limitată de aberaţii sferice, corectate prin hardware
HRTEM ( high resolution TEM) care permit producerea de imagini cu rezoluţie sub 0,5Å ( 50
pm), la o putere de mărire de 50 milioane de ori. HRTEM are capacitatea de a stabili poziţia
atomilor în specimene- rol în nanotehnologii.

26
Doina Ramona Manu Tehnici de biologie Celulară

Figura 28. Structura membranelor a două celule adiacente în TEM.

Figura 27.Ultrastructura celulei. Structura nucleului, sistemul de endomembrane şi


mitocondrii

Figura 29. Cisternele şi veziculele complexului Golgi în TEM.

27
Doina Ramona Manu Tehnici de biologie Celulară

Figura 30. Mitocondrii în celulă.

Figura 31. Secţiune transversală prin cili în TEM.

28
Doina Ramona Manu Tehnici de biologie Celulară

`````

Figura 33. Particule virale în TEM ( infectarea limfocitelor T helper de către particule
HIV)

Figura 34. Endocitoza în TEM.

29
Doina Ramona Manu Tehnici de biologie Celulară

Figura 35. Structura ,,triskelion” a moleculei de clatrină.

Figura 36. ADN în TEM.

Figura 37. Ultrastructura Pseudomonas aeruginosa în TEM.

30
Doina Ramona Manu Tehnici de biologie Celulară

2. Microscopul electronic cu baleiaj (SEM)

Un alt tip de microscop electronic este SEM (Scanning Electron Microscope) sau microscopul
electronic de baleiaj în care calea urmată de fasciculul de electroni este diferită de cea a
microscopului electronic de transmisie. Fasciculul de electroni este emis de un tun de
electroni ce conţine un catod cu filament de tungsten (fascicul termionic). Este folosit
tugstenul pentru că are cel mai ridicat punct de topire şi cea mai scăzută presiune de emisie de
vapori dintre toate metalele, astfel încât se pretează să fie încălzit până la emisie de electroni.
Fasciculul de electroni are o energie cuprinsă între câteva sute eV până la 40 keV. Anodul,
care este pozitiv atrage electronii emişi, cauzând accelerarea electronilor spre anod şi în jos,
prin columnă. Urmează traseul prin lentilele electromagnetice care focalizează fasciculul de
electroni spre probă. La acest nivel, electronii sunt supuşi acţiunii a două forţe în câmpul
electromagnetic. Una paralelă cu axul longitudinal şi cealaltă perpendiculară pe acest ax
Numai asupra electronilor ce înaintează paralel cu axul acţionează egal forţe radiale de pe
toate suprafeţele lentilelor. Forţele inegale ce acţionează asupra fasciculului de electroni
perpendiculari pe axă cauzează spiralarea fasciculului în raport cu axa longitudinală. După ce
fasciculul de electroni loveşte suprafaţa probei, la nivelul fiecărui punct din specimen,
fasciculul de electroni pierde energie, energia pierdută fiind convertită în alte forme: căldură,
emisia de fascicul secundar de electroni de energie scăzută, emisie de lumină
(catodluminescenţă) sau emisie de raze X. Electronii secundari emişi de probă (backscattered)
sunt preluaţi de detector secundar de electroni şi convertiţi într-un semnal care este trimis la
un ecran ca şi cel al televizoarelor obişnuite, producându-se imaginea. Monitorul SEM va
arăta imaginea corespunzătoare poziţiei fasciculului pe suprafaţa obiectului când semnalul a
fost generat, formată datorită variaţiilor de intensitate ale semnalelor. Metoda este potrivită
pentru studierea obiectelor care au suprafeţe cu proprietăţi conductive. Obiectele biologice pot
fi acoperite cu un strat fin de metale grele, de obicei este folosit aurul sau aur-platina.
Suprafaţa obiectului este baleiată de fasciculul de electroni cu energie înaltă punct cu punct,
electronii interacţionând cu atomii componenţi ai obiectului. Se emit astfel semnale care
conţin informaţii despre topografia suprafeţei baleiate, compoziţia acesteia sau alte proprietăţi
cum este conductivitatea electrică. În consecinţă, în funcţie de tipul de semnal emis, poate fi
eliberat un fascicul secundar de electroni, raze X specifice sau fascicul luminos
(catodluminescenţă). Intensitatea acestui fascicul secundar de electroni este dependentă de
unghiurile de înclinare ale suprafeţei obiectului. Acest fascicul de electroni este recepţionat şi
preluat de un detector care este dispus înclinat sub un anumit unghi deasupra obiectului, apoi
este amplificat, prelucrat şi este redată imaginea obiectului. Acest microscop poate da imagini
de o înaltă rezoluţie a suprafeţei probei, poate pune în evidenţă detalii cu dimensiuni de 1-
5nm. Imaginile au caracteristici tridimensionale, furnizează informaţii pentru înţelegerea
structurii suprafeţei. Fasciculul secundar de electroni BSE (back-scattered electrons ) este
adeseori utilizat în SEM analitică împreună cu imaginea produsă de raze X. Deoarece
intensitatea semnalului BSE este puternic dependent de numărul atomic Z al probei, BSE
poate furniza informaţii asupra distribuţiei elementelor în probă. De aceea imaginea dată de
BSE poate conţine componente cu etichetă de aur coloidal cu dimensiuni şi până la 5-10nm în
diametru, care ar fi dificil de observat in SEM cu fascicul secundar de electroni. Razele X sunt
emise când fasciculul de electroni mută un electron de pe un orbital interior al probei

31
Doina Ramona Manu Tehnici de biologie Celulară

determinând un alt electron de energie mai înaltă să umple orbitalul, cu eliberare de energie.
Aceste raze X sunt utile pentru identificarea compoziţiei , a elementelor ce compun proba de
studiat. Proba biologică de analizat în SEM trebuie să fie uscată, camera pentru probe a
microscopului fiind sub vacuum.. De aceea celulele şi ţesuturile necesită fixare chimică pentru
a conserva şi stabiliza structura acestora. Fixarea se face de obicei prin incubare într-un
tampon fixator cum este glutaraldehida, căteodată în combinaţie cu formalaldehida sau alţi
fixatori apoi postfixare cu tetraoxid de osmiu. Ţesutul fixat este apoi deshidratat prin
înlocuirea apei din ţesuturi cu etanol/acetonă şi înlocuirea acestor solvenţi cu dioxid de carbon
la presiune ridicată, care şi acesta este îndepărtat a.î. nici o interfaţă gaz-lichid nu este
prezentă în interiorul probei. Proba asfel uscată este acoperită cu un strat fin, de câţiva
micrometri, de aur-paladiu. Aurul are un număr atomic mare şi această acoperire cu aur a
probei produce un contrast topografic ridicat şi creşterea rezoluţiei , cu punerea în evidenţă a
celor mai fine detalii ale celulei .

Figura 38. Escherichia coli în SEM.

Figura 39. Pseudomonas aeruginosa ataşată la un cateter vascular. Imagine


obţinută în SEM.

32
Doina Ramona Manu Tehnici de biologie Celulară

Figura 40. Cili şi microvili în SEM.

33
Doina Ramona Manu Tehnici de biologie Celulară

Figura 41. Ribozomi pe suprafaţa reticulului endoplasmic.

Figura 42. Macrofag- fagogitarea unui bacil înSEM.

34
Doina Ramona Manu Tehnici de biologie Celulară

CITOCHIMIE

Scopul acestor tehnici este de a identifica şi localiza componenţii chimici ai celulei


d.p.d.v. calitativ şi cantitativ, dar şi dinamica organizării citochimice în diferite stadii
funcţionale. S-a putut descoperi în acest mod rolul diferitelor componente celulare în
procesele metabolice ale celulei. Citochimia este inclusă ca domeniu al unui subiect mai vast
– histochimia, care are ca scop caracterizarea şi localizarea substanţelor din celule dar şi a
materialului intercelular al ţesuturilor. Unul dintre domeniile citochimiei este strict
microscopic şi întruneşte metode fizice şi chimice utilizate pentru a detecta şi măsura
componente chimice intracelulare. Alte două domenii sunt mai strâns legate de biochimie şi
microchimie, implicând dezvoltarea şi utilizarea tehnicilor de determinare a unor cantităţi
extrem de scăzute de substanţe (picograme=10 -12 grame). Citochimia a necesitat dezvoltarea
tehnicilor de fracţionare a ţesuturilor şi a celulelor.Fracţionarea ţesuturilor constă în
îndepărtarea matricii extracelulare şi a joncţiunilor care ţin celulele unite în ţesut şi constă în
tratarea cu proteaze cum este tripsina sau colagenaza şi apoi cu agenţi chelatori ai calciului,
după care urmează disocierea mecanică în celule Fracţionarea celulelor poate fi realizată prin
şoc osmotic, prin sonicare(sub efectul ultrasunetelor), prin trecerea forţată a celulelor prin
orificii cu anumite dimensiuni sau prin omogenizarea celulelor urmată de separarea
componentelor celulare în funcţie de masă , suprafaţă sau greutate specifică (separarea
nucleilor, nucleolilor , cromosomilor, mitocondriilor , aparatului Golgi , ribosomilor ,
veziculelor de sinapsă , granulelor de secreţie , lizosomilor, etc.) prin ultracentrifugare.
Omogenizarea sau dezintegrarea mecanică a celulei prin metode chimice ( soluţii de sucroză
în diferite concentraţii care pot separa de exemplu dintr-un ţesut hepatic patru fracţiuni:
nuclei, mitocondrii, microsomi şi substanţe solubile şi dintr-un ţesut glandular cinci fracţiuni
ce conţin granule secretorii sau în mediu nepolar = metoda Behren de separare a
nucleilor ) .De multe ori aceste fracţiuni pot fi heterogene, fracţiunea de mitocondrii separată
din ţesut nervos conţine şi terminaţiuni nervoase şi mielină sau o fracţiune de microsomi
include fragmente de reticul endoplasmic, împreună cu ribosomii ataşaţi şi chiar complex
Golgi sau alte membrane. Ţesutul hepatic oferă o fracţiune mitocondrială omogenă.
Dezintegrarea mecanică a celulei poate fi realizată prin sonicare (utilizarea ultrasunetelor).

Centrifugarea diferenţiată este o metodă de separare a fracţiunilor subcelulare în


funcţie de mărime şi densitate, utilizând centrifugi obişnuite sau ultracentrifuga analitică
pentru particule mici cum sunt virusurile sau macromoleculele (acizii nucleici şi proteinele)
care poate determina şi coeficientul de sedimentare al acestor particule exprimat în unităţi
Svedberg (S), care este proporţional cu masa moleculară a particulelor. De exemplu, ARN t de
4S are G = 25,000 Da. Îmbunătăţirile aduse acestei tehnici au condus la centrifugarea în
gradient de densitate : tubul de centrifugă este încărcat cu faze cu densităţi diferite, de
exemplu sucroză care variază ca densitate între 1.6 şi 0.5 de la fundul tubului de centrifugă.
Amestecarea acestor soluţii cu gradient de densitate, creează în final un gradient continuu,
după care se aplică materialul de centrifugat la vârful tubului şi este centrifugat până găseşte
echilibru cu gradientul. Se utilizează ca gradient de densitate apa grea, soluţia de clorură de
cesiu sau medii cu coeficienţi de partiţie diferiţi, iar pentru a evita schimbări drastice ale

35
Doina Ramona Manu Tehnici de biologie Celulară

presiunii osmotice se foloseşte un mediu macromolecular cum este glicogenul sau Ficoll ,
gradientul în acest caz fiind unul de viscozitate.

Un alt domeniu de interes în acest capitol este microchirurgia (utilizarea


micropipetelor, microacelor, microelectrozilor, microtermocuplurilor care sunt introduse în
celule cu ajutorul unor aparate speciale care controlează mişcarea acestor instrumente/aparate
sub microscop şi care secţionează şi extrag părţi din celulă, injectează substanţe, măsoară
variabile electrice sau realizează transferuri intercelulare ).

Fixarea este procesul de conservare a structurii şi în unele cazuri şi a compoziţiei


chimice a celulei. Tipul de fixator este ales în funcţie de tipul de analiză aplicată celulei. De
exemplu, pentru studierea nucleului şi cromosomilor, sunt utilizaţi frecvent fixatorii acizi,
cum este soluţia Carnoy ce conţine etanol şi acid acetic glacial în proporţie de 3:1 sau soluţia
Bouin care conţine acid picric, formaldehidă şi acid acetic glacial. Acetona, formaldehida, sau
glutaraldehida, care produc denaturări minime şi conservă sistemele enzimatice sunt fixatorii
folosiţi pentru studiul activităţii enzimatice. Majoritatea acestor fixatori citologici acţionează
asupra structurii proteice a celulei producând punţi prin legături chimice între moleculele
proteice (formaldehida prin punţi de metilen, sărurile de crom oxidează şi produc punţi de
crom, clorura de mercur produce punţi de mercur între proteine), fără a afecta structura
celulei. Fixatorii pot să solubilizeze şi să extragă însă anumite lipide, electroliţi şi
carbohidraţi solubili.

Tetraoxidul de osmiu este utilizat pentru investigarea celulei sub microscopul


electronic. Acizii nucleici din celule nu leagă tetraoxidul de osmiu, cu lipidele formează esteri
instabili de osmiu, iar proteinele au o structură omogenă, nu coagulează.Oricum, comparând
imaginea unei celule vii cu cea a unei celule fixate, s-a constatat că fixatorii nu introduc
artefacte.

Criouscarea ţesuturilor constă în îngheţarea rapidă a acestora în baie de azot lichid la


temperatura de –160 până la -190°C sau în heliu lichid la 0° K(0 absolut), urmată de
deshidratarea în vacuum la temperatură joasă ,de –30 până la -40°C.În aceste condiţii apa din
ţesuturi este transformată în fază gazoasă şi rezultă deshidratarea. Compoziţia chimică a
celulei se menţine. Structura celulară se menţine de asemenea cu mici excepţii determinate de
cristalele de gheaţă.

Secţionarea cu criotomul, microtom răcit cu dioxid de carbon lichid, adică un


microtom introdus într-o cameră cu temperatură joasă denumită criostat, cu care se efectuează
secţionarea ţesuturilor proaspete sau fixate pentru studii de citochimie, după ce au fost incluse
în parafină.

Coloraţia citologică utilizează coloranţi sub formă de soluţii ale unor compuşi
aromatici, de două tipuri: acizi sau bazici, după cum gruparea cromoforă este acidă sau
bazică. Este metoda prin care pot fi vizualizate sub microscop diferite substanţe din celulă.

Mai întâi aceste substanţe trebuie imobilizate în locaţia originală. Prin fixare poate fi realizat
acest scop în studiul moleculelor non-difuzibile cum sunt proteinele, lipidele,

36
Doina Ramona Manu Tehnici de biologie Celulară

nucleoproteinele, dar imobilizarea substanţelor difuzibile cum sunt carbohidraţii şi ionii este
dificilă.Criouscarea sau criosubstituţia au un rol fundamental în acest caz.

Substanţele pot fi identificate prin:

1.reacţii chimice asemănătoare celor utilizate în chimia analitică, dar adaptate


ţesuturilor

2.reacţii specifice unor grupuri de substanţe

3.metode fizice.

Pentru a demonstra existenţa şi localizarea proteinelor, acizilor nucleici, lipidelor,etc.


în interiorul celulei, sunt utilizaţi agenţi cromogeni care se leagă selectiv de anumite grupări
specifice ale acestor molecule, cu formarea în cel mai bun caz, a unor legături covalente.

Exemple:

Detectarea proteinelor se poate face prin reacţia Millon, în care nitratul de mercur
interacţionează cu tirozina producând un precipitat roşu, prin reacţia cu hidroxid de diazoniu,
care interacţionează specific cu tirozina, triptofanul şi histidina, formând un complex colorat.
O interacţiune specifică cu arginina se produce dacă secţiunile tisulare sunt tratate cu α-naftol
şi hipoclorit de sodiu (testul Sakaguchi); aşa sunt detectate histonele, proteine bogate în
arginină.

Detectarea acizilor nucleici prin coloraţii citochimice depinde de proprietăţile celor


trei componente ale nucleotidelor: acidul fosforic, pentozele şi bazele purinice şi
pirimidinice. Mai depind de gradul de polimerizare al polinucleotidelor. Atât ADN cât şi
ARN absorb în ultraviolet la 2600 Ǻ, în prezenţa bazei nitrogen. Dezoxiriboza prezentă în
ADN este responsabilă pentru reacţia Feulgen, caracteristică acestui tip de acid nucleic
(secţiunile de ţesut fixate sunt supuse unei hidrolize blânde a acizilor nucleici care produce
digestia ARN, iar în molecula de ADN hidrolizează legăturile glicozidice, expunând gruparea
aldehidică a dezoxiribozei, urmată de tratare cu reactiv Schiff). Acidul fosforic este
responsabil pentru proprietăţile bazofile ale ADN şi ARN, astfel coloranţi bazici cum este
azurB sau verde metil dau o reacţie specifică cu acizii nucleici.
Detectarea lipidelor. Picăturile lipidice pot fi evidenţiate cu tetraoxid de osmiu care
colorează în negru cei mai mulţi acizi graşi nesaturaţi sau prin colorare cu Sudan III sau
Sudan IV, care difuzează pur şi simplu în bistraturi lipidice sau liposomi. Sudan negru B se
dizolvă şi în fosfolipide şi colesterol, iar sulfatul albastru Nil detectează acizi graşi şi
fosfolipide. Tratarea celulelor cu săruri de crom urmată de hemateină acidă localizează
fosfolipide.

Detectarea enzimelor impune conservarea sistemelor enzimatice prin criofixare,


urmată de secţionare în criostat. Unele enzime rezistă şi la fixare chimică în acetonă la
temperaturi joase, în formaldehidă sau glutaraldehidă. Detectarea enzimelor implică
incubarea secţiunilor cu substrat specific enzimei. De exemplu, pentru detectarea activităţii
fosfatazei alcaline, se incubează ţesutul cu ester fosforic al β-naftolului. Hidroliza eliberează

37
Doina Ramona Manu Tehnici de biologie Celulară

β-naftol, care în prezenţa sării diazoniu dă un compus azocolorat, localizat la nivelul situsului
activităţii enzimatice. Un alt exemplu, peroxidaza, care poate fi localizată cu un substrat
incolor, benzidina care este transformată în compus colorat cu H2O2 în prezenţă de
peroxidază.

Metode citochimice bazate pe determinări prin metode fizice sunt:

◙ imunocitochimia

◙ tehnica autoradiografiei

◙ citofotometria

◙ microincinerarea

◙ microscopia de fluorescenţă

Imunocitochimia

Antigenele (Ag)

Antigenele sunt substanţe care determină din partea organismului un răspuns imun,
cu producerea de anticorpi (Ac). Antigenele trebuie să aibă următoarele proprietăţi :

1.imunogenitate – capacitatea de a induce formarea Ac


2.reactivitate specificã cu anticorpul a cărui formare a indus-o.

Tipuri de antigene

· antigene de diferenţiere care pot fi prezente în celule embriofetale (HCG, AFP,

CEA), în celule adulte normale şi în celulele corespondente tumorale (filamente intermediare


ale citoscheletului sau molecule de adeziune intercelulară);

· antigene de citotip sunt moleculele de tip secretor (alfalactalbumina, caseina), molecule

de tip neuroendocrin (cromogranin, neuronspecific enolaza), hormoni;

· receptori hormonali steroidieni, care reprezintă şi un factor prognostic bine cunoscut

în clinica şi terapia tumorilor hormonodependente;

· oncogene şi produsele lor implicate în oncogeneză (p53, cerb2),

38
Doina Ramona Manu Tehnici de biologie Celulară

cu implicaţii în tratamentul genetic al tumorilor;

· factori de proliferare evidenţiabili cu IMH (Ki67, PCNA), utili într-o

monitorizare mai atentă a terapiei din unele tumori, terapie altfel foarte agresivă;

· antigene virale si microbiene (HPV, CMV, Pneumocistis carinii)

Anticorpii (Ac)

Anticorpii sunt imunoglobuline produse de plasmocite, după recunoaşterea unui Ag


străin.

Dintre cele 5 clase de imunoglobuline, Ig G sunt cele mai frecvent utilizate în IMH.

Anticorpii policlonali se produc prin imunizarea unui animal cu o molecula purificată

specifică (imunogen) care conţine antigenul de cercetat.

Ac monoclonal este caracterizat printr-o specificitate mare şi cunoscută pentru un antigen.


Reacţtia dintre un Ag (sau un epitop al sau) şi un Ac este nu numai foarte specificăci şi foarte
stabilă; formarea acestor complexe imune stă la baza identificării componentelor antigenice
celulare.

Metode IMH

· metoda directă - se foloseşte un substrat cromogen ataşat la Ac primar, direct


împotriva Ag pe care vrem să îl evidenţiem; tehnica este simplă, dar sensibilitatea ei este
redusă şi nu permite o diluare excesivă a anticorpului primar

· metoda indirecta are două sau mai multe faze, foloseşte un substrat cromogen care
este ataşat la un Ac secundar; Ac primar nemarcat este legat în porţiunea sa antigenică de un
Ac secundar marcat cu peroxidază de care este legat un sistem de relevare ; această tehnică
este mai sensibilă permite vizualizarea Ag existente în concentraţii mici. Pe de altă parte,

39
Doina Ramona Manu Tehnici de biologie Celulară

Ac primari anti specie (antişoarece, antiiepure, anticapră) sunt puţin numeroşi. Această
tehnică este utilizată cel mai frecvent.

Cele mai importante tehnici de acest tip au fost descoperite pentru a evidenţia antigene atât în
microscopia optică cât şi în microscopia electronică, prin cuplarea anticorpului primar,
respectiv secundar cu un fluorocrom sau cu o moleculă opacă pentru fasciculul de electroni.
De exemplu, pe un complex imun nemarcat Ag-Ac se fixează un anticorp secundar marcat cu
fluoresceină, formându-se un complex vizibil la microscopul cu fluorescenţă sau un anticorp
secundar marcat cu feritină în cazul microscopului electronic. Metoda cu imunoferitină poate
fi utilizată pentru localizarea virusurilor în ţesuturi sau pentru evidenţierea secreţiei de
imunoglobuline în plasmocite.

Marcajul vizual

Existenţa mai multor cromogeni diferit coloraţi pentru o anumită enzimă permite
colorarea succesivă cu diferiţi Ac şi pentru localizarea mai multor Ag pe aceeaşi secţiune.În
toate cazurile în care se utilizează un sistem oarecare de imunoperoxidază, cromogenul
preferabil este 3,3’ diaminobenzidina (DAB) ce determină o coloraţie maro deoarece
benzidina în prezenţa peroxidazei este transformată de peroxidul de hidrogen în substanţă
colorată. DAB oxidată astfel interacţionează cu tetraoxidul de osmiu, fixatorul utilizat în
microscopia electronică. Alt cromogen este aminoetilcarbazolul (AEC) care determină
formarea unui precipitat roşu.

40
Doina Ramona Manu Tehnici de biologie Celulară

Autoradiografia

Una dintre cele mai importante tehnici ale citochimiei se bazează pe utilizarea
substanţelor marcate radioactiv, cu radioizotopi. Aceştia sunt încorporaţi în celule şi apoi
localizaţi cu o emulsie fotografică. Mai exact, tehnica se bazează pe capacitatea izotopilor de
a acţiona asupra cristalelor de bromură de argint din emulsia fotografică.

Metoda citofotometrică

Mai multe componente celulare pot absorbi specific lumina ultravioletă. De exemplu,
maximul de absorbţie al acizilor nucleici este de 2600 Å, în timp ce maximul de absorbţie al
proteinelor este de 2800 Å. Anumite reacţii citochimice de colorare dau o absorbţie specifică
în spectrul vizibil, a.î. pot fi analizate cantitativ cu citofotometre.

Microincinerarea

Este utilizată în studiul componentelor minerale ale celulei şi constă în încălzirea


secţiunii de ţesut până la 525˚C şi observarea cenuşei la microscopul cu câmp
întunecat.Oxizii de fier apar coloraţi în roşu. Acizii nucleici datorită conţinutului ridicat de
fosfor, dau o cantitate mare de cenuşă. Microincinerarea poate fi aplicată şi în microscopie
electronică, specimenul fiind incinerat prin bombardament cu fasciculul de electroni.
Informaţii despre compoziţia chimică a celulei pot fi obţinute prin difracţie.

41