INSTITUTO POLITÉCNICO

NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

INGENIERÍA BIOQUÍMICA

LABORATORIO DE METODOS DE ANALISIS

PRACTICA: SEPARACION DE PROTEINAS POR
ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA

ALUMNO: SALVADOR HERNANDEZ JUAN

GRUPO: 4IM2 SECCION: 3

PROFESOR: GONZÁLEZ ACUÑA CAROLINA

Objetivos
 Efectuar la separación de proteínas de diferentes muestras mediante la
técnica de electroforesis en gel de poliacrilamida.
 Determinar cuál es el tamaño “óptimo” de poro del gel, para mejorar la
separación de cada una de las muestras.

Fundamento.
La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según la movilidad
de estas en un campo eléctrico a través de una matriz porosa, la cual finalmente las
separa por tamaños moleculares y carga eléctrica.
La poliacrilamida es un soporte empleado frecuentemente en electroforesis en gel,
es químicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser preparado de
forma rápida y reproducible. Forma, además, geles transparentes con estabilidad
mecánica, insolubles en agua, relativamente no iónicos y que permiten buena
visualización de las bandas durante tiempo prolongado. Además tiene la ventaja de
que variando la concentración de polímeros, se puede modificar de manera
controlada el tamaño del poro. La electroforesis en geles de poliacrilamida puede
realizarse en el rango de pH de 2 a 11, sin embargo la desaminación de las
proteínas o las reacciones hidrolíticas pueden ser severas a valores de pH inferiores
a 3 y superiores de 10. La mayoría de las proteínas con puntos isoeléctricos
comprendidos entre pH 4 y 7,5, son separadas en geles con pH entre 8 y 9.
Resultados
Tabla 1. Características de los electroferogramas a diferentes %T

%T
Característica 5.5 7.5 10 12.5
Longitud del gel antes de teñir [cm] (l) 6.5 6.6 6.5 6.0
Longitud del gel después de teñir [cm] (l') 7.0 6.9 7.0 6.3
Distancia recorrida por el colorante [cm]
(f) 5.5 5.3 5.0 4.7
Suero 8 14 13 8
Leche
bronca 2 5 7 6
Clara 4 9 10 7
Leche
No de bandas en: comercial 2 7 8 6

Tabla 2. Movilidad electroforética relativa promedio

 Log
Valores de m de la Valor Movilidad (Mx100)
proteína seleccionada promedio electrofórética #
%T Muestra [cm] de m [cm] relativa (M) Bandas
Suero 5.4 5.5 5.7 5.53 0.9336 1.9701 8
Leche
comercial 4.3 4.4 4.35 0.7344 1.8659 2
Leche
5.5 bronca 5.7 5.8 5.75 0.7627 1.8823 2
Clara 5.7 5.6 5.6 5.63 0.9538 1.9794 4
Suero 4.5 4.5 4.5 4.46 0.8049 1.9057 14
Leche
comercial 3.6 3.5 3.55 0.6406 1.8066 7
Leche
7.5 bronca 5.2 5.2 5.2 0.9384 1.9724 5
Clara 2.0 1.9 1.8 1.9 0.3429 1.5351 9
Suero 2.9 3.2 3.1 3.06 0.5687 1.754 13
Leche
comercial 2.1 2 2.05 0.3807 1.5805 8
Leche
10 bronca 2.2 2.2 2.2 0.4085 1.6112 7
Clara 4.5 4.2 4.25 0.7892 1.4302 10
Suero 2.0 2.2 2.4 2.2 0.4457 1.6490 8
Leche
comercial 2.0 2.0 2.0 0.4057 1.6082 6
Leche
12.5 bronca 3 3 3.0 0.6079 1.7838 6
Clara 0.7 0.7 0.8 0.73 0.1479 1.1699 7

Grafica de Ferguson y = -0.0476x + 2.2424

R² = 0.9893
2
1.9 y = -0.0424x + 2.0915
R² = 0.8202
1.8
1.7 y = -0.0284x + 2.0644
R² = 0.3108
1.6
Log M

1.5 y = -0.1062x + 2.4715

R² = 0.9147
1.4
1.3
1.2 suero
1.1 Lche comercial
1 Leche bronca
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Clara
%T
 Tabla 3. Valor de pendiente y ordenada al origen de cada muestra
Muestra Pendiente Ordenada al origen
Suero -0.0476 2.2424
Leche comercial -0.0424 2.0915
Leche bronca -0.0284 2.0644
Clara -0.1062 2.4715

Tabla 4. Segunda proteína más abundante en la muestra

Muestra Proteína Peso molecular (Da)
Suero Seroalbumina 67000
Leche comercial Caseina 25000
Leche bronca Caseina 25000
Clara Conalbumina 78000

 Concluya acerca del tamaño molecular relativo de las proteínas y sus

cargas eléctricas relativas al pH del regulador de trabajo (8.7 a 9.1)
La pendiente nos muestra la razón de cambio de movilidad debida a la
concentración de acrilamida, por lo tanto, una pendiente grande nos indica que se
trata de una proteína grande ya que con pequeños cambios en la concentración la
movilidad disminuye, en cambio una proteína de bajo peso molecular a pesar de
que se incremente concentración de acrilamida gracias a que tiene un bajo tamaño
molecular, puede continuar avanzando a través de la malla.
La proteína más grande es la que se encuentra en la muestra de clara por tener una
pendiente mayor, posteriormente la de la leche comercial, luego la de suero y
finalmente la de leche bronca.
Como la movilidad depende de la carga, con la ordenada al origen podemos
determinarla, la proteína con mayor movilidad por carga es la que se encuentra en
la clara, seguida por la del suero, luego la de leche comercial y finalmente la de
leche bronca.
La densidad de carga, de igual manera, se puede observar con la ordenada al
origen, ya que va de la mano con el concepto de carga neta relativa, por lo que la
proteína con mayor densidad de carga es la que se encuentra en la clara, seguida
por la del suero, luego la de leche comercial y finalmente la de leche bronca.
 Diga cual %T recomienda para la separación de las proteínas de cada
muestra ¿Por qué?
Para suero se recomienda 7.5%, para leche comercial y bronca 10% y para la clara
10% porque en esas concentraciones se observa un mayor número de bandas y
con mejor resolución, que indica que hay una mejor separación de proteínas.
  Escriba la reacción completa para la copolimerización de la acrilamida
y la bisacrilamida por radicales libres ¿Qué función tiene el TEMED y el
persulfato de amonio?

Función TEMED: tiene la capacidad de existir como un radical libre y actúa como
un catalizador adicional para la polimerización.
Función persulfato de amonio: El persulfato de amonio en presencia de TEMED
forma radicales libres de oxígeno e induce la polimerización del monómero de
acrilato para formar un polímero lineal, estos monómeros lineales están
interconectados por la reticulación con el monómero de bis-acrilamida para formar
una malla con poros.

 Mencione una aplicación de la electroforesis preparativa y una de la

electroforesis analítica
Electroforesis preparativa: La electroforesis preparativa tiene aplicaciones de
biología molecular, una de ellas, es el aislamiento y purificación de fragmentos de
DNA y RNA
Electroforesis analítica: se puede emplear para evaluar la pureza e integridad de las
muestras de ácido nucleico después de la extracción de sus fuentes , así como el
éxito de la fragmentación de la muestra y el porcentaje de oligonucleótidos de
longitud completa después de la síntesis.

 Defina velocidad de migración y movilidad electroforética

Movilidad electroforética:
La movilidad electroforética (μ) es una magnitud característica de la partícula o
molécula que refleja la velocidad relativa a la fuerza del campo, la movilidad
electroforética depende de la carga y del tamaño de la partícula.
Velocidad de migración: La velocidad de migración de las partículas es
directamente proporcional al producto de su carga efectiva y el gradiente de
potencial eléctrico e inversamente proporcional al coeficiente de fricción relativo y
forma de la molécula, o sea a la resistencia que le ofrece el medio.

 Defina el termino electroferograma

Un electroferograma es la representación gráfica de la separación de moléculas
mediante electroforesis.
 ¿Qué otros catalizadores pueden utilizarse en la electroforesis?
-Persulfato de amonio y 3-dimetilamino propio-nitrilo (DMAPN).
-Peróxido de hidrógeno, sulfato de hierro y ácido ascórbico.
Discusión.
Al observar la gráfica de Ferguson se puede notar que aunque el comportamiento
de las rectas no es igual, todas tienen la misma tendencia descendente, esto nos
dice que aumentar la concentración de poliacrilamida reduce la movilidad de los
analitos por lo tanto, una pendiente grande nos indica que se trata de una proteína
grande ya que con pequeños cambios en la concentración la movilidad disminuye,
en cambio una proteína de bajo peso molecular a pesar de que se incremente
concentración de acrilamida gracias a que tiene un bajo tamaño molecular, puede
continuar avanzando a través de la malla.
La proteína más grande es la que se encuentra en la muestra de clara por tener una
pendiente mayor, posteriormente la de la leche comercial, luego la de suero y
finalmente la de leche bronca.
Con los datos obtenidos con el gel, podemos determinar que las concentraciones
de acrilamida para el tamaño óptimo del poro para cada muestra es de suero 7.5%,
leche comercial y bronca 10% y clara 10% ya que a estas concentraciones
obtuvimos una mayor resolución, un número mayor de bandas.
Aunque la proteína de leche bronca y leche comercial es la misma, las diferencias
obtenidas pueden deberse al tratamiento que se le da a la leche comercial el cual
podría modificar algunas de las características de la caseína.
Conclusión.
 Se efectuo la separación de proteínas de muestras de suero, leche bronca,
leche comercial y clara.
 Las concentraciones de acrilamida para el tamaño optimo del poro para cada
muestra es de suero 7.5%, leche comercial y bronca 10% y clara 10%.
 La proteína de mayor tamaño es la conalbumina, posteriormente la caseína
y por último la seroalbumina.
 La conalbumina presenta una mayor carga con respecto a la caseína y la
seroalbumina.
Bibliografía:
 Kischinevsky (2005) Manual de prácticas biología molecular de la célula,
UNAM, México , pp 52-56
 Universisad Buenos Aires (1968) Electroforesis aplicaciones biológicas y
clínicas, Buenos Aires, pp 236-237
 Reacción de polimerización
http://nptel.ac.in/courses/102103047/module3/lec13/5.html consultado: 01
mayo de 2018