Comentarios breves sobre el tema

Se realizó la cromatografía en capa fina y en columna de la extracción (maseración en acetona) del

chile de árbol y así poder observar los diferentes tipos de componentes que posee el chile.

Fundamento teórico

La IUPAC define a la cromatografía, como un método físico de separación mediante el cual los
componentes de una mezcla se separan por distribución de dos fases: una estacionaria y otra móvil.
El proceso de separación de cada sustancia es el resultado de un equilibrio entre dos conjuntos de
fuerzas contrapuestas: las de propulsión, promovidas por el flujo de la fase móvil y las fuerzas de
retención, originadas por la fase estacionaria. De este modo, cada sustancia migra de manera
diferencial, conforme a sus propias características físicas y al tipo de fuerzas intermoleculares entre
ambas.
La cromatografía es un método analítico empleado ampliamente en la separación, identificación y
determinación de los componentes químicos en mezclas complejas.

La cromatografía fue inventada por el botánico ruso Mikhail Dwettpoco después del inicio de siglo
XX. Hizo pasar pigmentos vegetales (macerado de algas) como clorofilas y xantofilas, a través de
columnas de vidrio empacadas con CaCO 3 dividido finamente. Las especies separadas aparecían
como bandas coloridas sobre la columna, lo cual explica el nombre que se escogió para el método
(del griego chroma que significa “color” y gmphein que significa “describir”).

La cromatografía es una técnica en la cual los componentes de una mezcla son separados con base
en las velocidades a las cuales son pasados a través de una fase estacionaria por el flujo de una
fase móvil gaseosa o liquida. Las separaciones están basadas en las diferencias en la velocidad de
migración entre los componentes de la muestra.

Todos los métodos tienen en común el empleo de una fase estacionaria y una fase móvil. Fase móvil:
solvente que mueve los solutos a través de la fase estacionaria. Fase estacionaria: esta fija en el
sistema.

En esta práctica se emplearon dos tipos de cromatografía:

Cromatografía en capa fina:

Se emplea alúmina (Al 2O3) o gel de sílice como fase estacionaria y una fase móvil orgánica. El
adsorbente se deposita en forma de capa delgada de vidrio o de plástico y la acción capilar que
posee la misma hace subir el disolvente (eluyente) desde un depósito situado en la parte inferior de
la placa.

Un disolvente acertado es aquel que mueve la muestra a mitad de camino de la altura alcanzada por
el frente en la placa. Cuando se emplea un sistema mixto de disolventes, debe elegirse
cuidadosamente la mezcla, prepararla con cuidado y emplearla cuidadosamente.

Para el revelado de los componentes de la placa se utiliza la luz UV, ya que una parte de las
moléculas absorben aquella luz y aparecerá una mancha obscura sobre un fondo luminoso.
Cromatografía en columna:

La cromatografía en columna utiliza una columna de vidrio vertical que se llena con un soporte solido
adsorbente (fase estacionaria: los más utilizados son gel sílice y alúmina. La muestra que se quiere
separar se deposita en la parte superior de este soporte. El resto de la columna se llena con el
eluyente (disolvente que constituye la fase móvil que, por efecto de la gravedad, hacer mover la
muestra a través de la columna. Se establece un equilibrio entre el soluto absorbido en la fase
estacionaria y el disolvente eluyente (disolvente que constituye la fase móvil, y el disolvente eluyente
que fluye por la columna). Debido a que cada uno de los componentes de una mezcla establecerá
interacciones diferentes con la fase estacionaria y la móvil, serán transportados a diferentes
velocidades y se conseguirá su separación. Así de manera similar a otros tipos de cromatografía, las
diferencias en las velocidades de desplazamiento a través del sólido, se corresponden con
diferencias en los tiempos de elución por la parte inferior de la columna para cada uno de los
componentes de la muestra original, que se recogerán en fracciones diferentes.
Objetivo

Elegir mediante cromatografía en capa fina el eluyente(s) más adecuados para separar los diferentes
pigmentos de un producto natural por cromatografía en columna.

Hipótesis

Si se sabe que la cromatografía es un método físico de separación mediante el cual los

componentes de una mezcla se separan por distribución de dos fases: una estacionaria y otra móvil.
Dicho lo anterior se espera separar los diferentes pigmentos que existen en un chile de árbol,
pretendiendo extraer la mayoría de ellos, utilizando varios eluyentes.

Variable dependiente e independiente

Dependiente: La eficiencia de la extracción, la actividad del gel de sílice y los volúmenes de cada
eluyente.

Independiente: Dimensiones de la columna, las mezclas de cada eluyente y la fuente de los

pigmentos.
Material y reactivos

 Frascos de vidrio de 250mL

 Porta objetos
 3 vasos de precipitados de 250mL
 Un agitador de vidrio
 Capilares de vidrio
 Encendedor
 Dos pipetas 5mL/1mL
 Una bureta de 50 mL
 20 tubos de ensaye
 Un embudo talle corto
 Un soporte universal
 Pinzas de doble presión
 Algodón
 Una gradilla
 3 pipetas Pasteur
Reactivos:

 Agua
 Etanol
 Acetato de etilo
 Hexano
 Agua
 Acetona
 Sal

Técnica (redactada)

Cromatografía en capa fina

Antes de iniciar la CCF se dejó macerar el chile de árbol en 50mL de acetona durante un periodo de
una semana. Ya lista la maceración de toman 3 capilares y se ponen al fuego con un encendedor
para poder formar la punta y así (de una muestra pequeña) poder extraer el macerado.

En un vaso de precipitado de prepara la mezcla de gel de sílice y acetato de etilo para poder formar
las cromatoplacas con los porta objetos. Se realizan las pruebas de los eluyentes con una mezcla de
los mismos, se debe de considerar que los eluyentes son volátiles por lo que se deben dejar tapados
en los frascos d vidrio de 250mL. Después de saber cuáles son los eluyentes adecuados se debe de
hacer una mezcla de los mismos en los frascos conteniendo una cantidad de 4mL de los dos
disolventes.

Ya listas las cantidades de los eluyentes se procede a verterlos en los frascos, procurando que estén
bien cerrados.

Se preparan las cromatoplacas con el gel esparciéndolo por el porta objetos esperando a que se
sequen y con el capilar poder tomar una pequeña muestra del macerado y colocarlo a un 1cm de
altura de la cromatoplaca. Procedemos a colocarlos en los frascos donde colocó la mezcla de
eluyentes. Esperamos a que el eluyente suba y separe la muestra en sus componentes.

En algunos casos, la separación de la muestra se puede observar sin la necesidad de la luz UV.

Eluyentes

Ideales.

Cromatografía en columna
En una bureta de 50mL se coloca en el fondo un pequeño trozo de
algodón tratando de que no quede tan apretado, después en un soporte
universal se coloca la bureta. Ya colocada, en la bureta se vierte 1cm de
sal seguido del gel de sílice aproximadamente 20cm sin dejar que se
seque ya que puede producirse una ruptura de la misma, después se le
coloca 1cm más de sal.

Se etiquetan 20 tubos de ensaye y se colocan en la gradilla.

En un vaso de precipitado se coloca acetato de etilo, hexano y la muestra

de chile procurando que esté en estado sólido, después se le adhiere a la
columna colocando la mezcla de eluyentes y así evitar que el gel de sílice
quede seco.

Poco a poco se verá la separación de los componentes de la muestra.

En los tubos de ensaye se colocarán las muestras (estado acuoso) que vayan bajando de la bureta.

Ya obtenidas las muestras en los tubos de ensaye se realiza (de nuevo) la CCF.
Diagrama de flujo

CCF
Cromatografía en columna

Esquemas de los aparatos

Campana de extracción
Resultados

Análisis de resultados

La cromatografía en capa fina es un método de análisis cualitativo económico, rápido y fácil cuyo
propósito es la separación de componentes mediante una fase estacionario y una móvil se
fundamenta en la diferencia de polaridad entre los componentes de la mezcla.
Es útil para analizar el número de componentes de un compuesto y su importancia radica en que en
la separación se pueden extraer por separado y analizar qué tipo de compuesto es el que se tiene
presente, además que es un paso previo a la cromatografía en columna pues aquí se pueden elegir
los mejores eluyentes y las mezclas de estos para el tipo de compuesto que se está analizando por
ser rápido y sencillo.
El uso de la cromatografía en capa fina es amplio siendo útil en el estudio de impurezas, para llevar
el control de una reacción además de optimizar el sistema de columna.
En total se obtuvieron veinte colorantes, estos se obtuvieron en diferentes proporciones siendo el
amarillo claro y el naranja claro quienes se encontraron en mayor proporción, el de menor cantidad
fue el amarillo claro, la separación se debió a que sus polaridades fueron a fines a los eluyentes
utilizados.

Conclusiones

En el desarrollo de esta práctica se comprendió que la movilidad de los componentes de una

muestra que se desee separar, depende de la afinidad que tenga con la fase móvil y la polaridad que
presente esta última, ya que ese factor crucial para que pueda realizase una separación
cromatografía apta. A pesar de que es una técnica muy sencilla de realizase existen inconvenientes
que alteran los resultados de la misma ya sea los componentes de la muestra en este caso del chile
de árbol o las condiciones que afectan la fase móvil, disminuyendo su cantidad al vaporizarse o el
deterioro de la fase estacionaria.

Bibliografía

- Dupont Durst H. Química Orgánica Experimental. México: Reverté; 2007. P. 78-96.

- R. Keese, R.K. Müler, T.P. Toube. Métodos de Laboratorio para Química Orgánica. México: Limusa;
1990. P. 41-51.

- Xorge Alejandro Domínguez S. Química Orgánica Experimental. México: Limusa; 1992. P. 105-08.
Cuestionario

1. ¿A qué grupo de compuestos pertenecen los pigmentos?

R= Carotenoides y xantofilas.

2. ¿A qué se debe que estos compuestos sean coloridos?

R= Carotenoides: son los responsables de la gran mayoría de los colores amarillos,

anaranjados y rojos presentes en los alimentos vegetales. Entre mayor sea la intensidad del color,
mayor será el contenido de carotenoides.

Xantofilas: son compuestos químicos pertenecientes al grupo de los carotenoides que poseen uno o
más átomos de oxígeno en su estructura. Se encuentran de forma natural en muchas plantas y
presentan también acción fotosintética. Estos pigmentos, más resistentes a la oxidación que las
clorofilas, proporcionan sus tonos amarillentos y parduzcos a las hojas secas.

3. Explique la diferencia entre cromatografía de adsorción y partición.

R= Cromatografía de partición: La mayoría de las sustancias tendrán distinta solubilidad en

diferentes solventes. Si una sustancia se pone en contacto con dos solventes que no se mezclan
entre sí, se distribuirá entre los dos solventes en relación a su solubilidad en cada uno. Se llama
efecto de partición a la distribución de un soluto entre dos o más solventes que no se mezclan. El
solvente o el líquido que es atrapado por el medio del sostén sea este papel, gel, sílice o alúmina, se
llama fase estacionaria. Al solvente revelador se le llama fase móvil.

Cromatografía de adsorción: La cromatografía de adsorción o liquido-sólido, es la forma clásica de

cromatografía de líquidos. La adsorción se lleva a cabo cuando hay una concentración más alta en la
superficie de un sólido que en la solución circundante. La adsorción se refiere al enlace de una
sustancia a la superficie de otra. Generalmente los adsorbentes usados en cromatografía son el
carbón mineral, el gel de sílice, y la alúmina.

4. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de la cromatografía en capa fina en comparación con
la cromatografía en columna?

R= Cromatografía en columna: Las separaciones en la cromatografía en columna pueden

realizarse por reparto, adsorción o intercambio iónico. El estado físico del adsorbente ha de ser de tal
manera que permita el empaquetamiento uniforme de la columna y el flujo libre de disolvente a
través de ella.

Cromatografía en capa fina: Cromatografía en papel y electro cromatografía. En todos los casos se
emplea una capa plana y relativamente delgada de una materia que a la vez es el soporte o bien que
recubre una superficie de vidrio, plástico o metálica. La fase móvil se mueve a través de la fase
estacionaria por capilaridad, a veces ayudada por gravedad o por aplicación de un potencial
eléctrico. En la actualidad la cromatografía en plano se centra en la técnica de la capa fina, que es
más rápida, tiene mejor resolución y es más sensible que su alternativa en papel.

5. Explique la diferencia que existe entre el adsorbente utilizado en cromatografía en capa

delgada y el de columna. Hacer una lista en orden creciente de actividad.

R= En columna: Puede usarse cualquier medio adsorbente siendo los más generales la
celulosa, gel de sílice, alúmina oxido de magnesio, oxido de cálcico y carbón activo (para
separaciones por adsorción y de intercambio iónico). Se emplea para la separación de mezclas o
purificación de sustancias a escala preparativa. Como fase estacionaria se usa, generalmente, gel de
sílice o alúmina dentro de una columna. La elección del disolvente es crucial para una buena
separación. Dicho disolvente pasa a través de la columna por efecto de la gravedad o bien por
aplicación de presión (cromatografía flash). La columna se prepara mezclando el soporte con
disolvente.

Capa delgada:

 Sílice gel (se utiliza en el 80% de las separaciones)

 Óxido de Aluminio o Alúmina (ácida, neutra o básica)
 Celulosa (Nativa o micro-cristalina)
 Poliamidas

Estos adsorbentes deben tener las siguientes características:

 Tamaño de partícula pequeño

 Diámetro de poro grande
 Área superficial grande
 Homogeneidad
 Alta pureza

6. Hacer una lista de los eluyentes usados comúnmente en cromatografía en columna y capa
delgada en orden creciente de polaridad.

 Hexano

 Acetato de etilo

 Acetona

7. Lista de la capacidad de adsorción de los grupos funcionales de los compuestos orgánicos.

R=

7.1. ¿Qué compuesto es más retenido una amina o un alqueno, ejemplifique en una capa
cromatográfica?
 R= Un alqueno, por su polaridad.

8. ¿Cómo se prepara el capilar para aplicar la muestra en la cromatoplaca?

R= Se le aplica calor para así poder romperlo cuidando que quede un orificio no muy grande.

9. ¿Por qué es necesario que la cámara de elusión esté saturada con los vapores del eluyente?

R= Por que así será más fácil el arrastre de los pigmentos y no se secará la placa.

10. Explique cada uno de los siguientes términos:

 Eluyente: solvente que se usa en técnicas de cromatografía para extraer un compuesto que
se quiere separar de otra fase.

 Eluato: la sustancia que se separa o sale de la columna después de cada extracción.

 Elución fraccionada: Aparato de elución fraccionada electroforético tiene una columna con una
rotación conjunta de sello en el que un delgado chorro de elución búfer es dirigido a través de
la luz de la columna electroforética en una dirección perpendicular a la de migración
electroforética. El contenido de la columna se gira en relación con el jet estacionario o se gira
el jet con respecto a la columna. El sistema puede emplear electroforesis en solución libre o
en columnas empaquetadas.

 Adsorción: Es un proceso por el cual átomos, iones o moléculas son atrapados o retenidos en
la superficie de otra sustancia o material.

 Partición: La separación se basa en las diferencias de solubilidad de los componentes de la

mezcla en las fases estacionaria y móvil.

 Elución: se produce por el flujo de una fase móvil a través de la fase estacionaria.

 Adsorbente: es un sólido que tiene la capacidad de retener sobre su superficie un componente

presente en corrientes líquidas o gaseosas. Se caracteriza por una alta superficie específica y
por su inercia química frente al medio en el que se va a utilizar.

 Actividad del adsorbente: El nivel de actividad de la adsorción depende de la concentración de

la sustancia en la solución, la temperatura y la polaridad de la sustancia.

 Afinidad por el adsorbente: es que la sustancia ceda a la capacidad de capilaridad del

adsorbente y eluya a través de él.

11. ¿Cómo se clasifica la cromatografía en función de su fase estacionaria?

 Naturaleza de
Clasificación
fase estacionaria
Líquido-líquido: partición
Naturaleza Líquido
Líquido-sólido: adsorción, cambio iónico, exclusión, afinidad.
de fase
Gas-líquido (CGL)
móvil Gas
Gas-sólido (CGS)

12. ¿Cuál es la función de la fase móvil y como se lleva a cabo la separación en la cromatografía de
adsorción?

R= Su función es eluir los componentes de la mezcla a separar a través de la fase estacionaria.

La cromatografía de adsorción se lleva a cabo mediante el uso de una fase estacionaria donde se
observará la elución de los componentes de la mezcla, los cuales serán eluidos por el disolvente,
que es la fase móvil.

13. ¿Cómo se prepara la papilla para la cromatografía en capa fina?, por lo menos dos métodos.

R= Se machaca con ayuda de un mortero y pistilo hasta hacer polvo la sílica, luego se añade el
disolvente. También se puede hacer en un vaso de precipitados y con una varilla de vidrio, agitando
constantemente hasta formar la papilla.

14. ¿Cuándo es conveniente activar una placa y cómo se activa?

R= Antes de que se puedan usar las placas generalmente deben ser calentadas para retirar el
agua que actúa como una impureza y evita una buena separación. La magnitud de calor depende del
tipo de separación que se requiere para compuestos hidrófilos o polares, el secado al aire o con un
secador de pelo son generalmente suficiente; para los compuestos hidrofóbicos o no polares es
necesario un calentamiento más intenso. Las placas de óxido de aluminio y de gel de sílice con
adhesivo requieren ser secadas al aire durante aproximadamente 30 min. Y después ser activadas
en un horno a 100°C alrededor de 30 min. Las placas de celulosa deberán secarse al aire libre
durante 30 min. y activarse al horno durante 10 min. a 105°C.

15. ¿Qué espesor debe tener la fase estacionaria en una C.C.D.?

R= No debe ser espesa ni muy aguada, debe deslizarse solo por la placa al momento de
prepararla.

16. Al comparar los RF de dos componentes se encontró que eran iguales, ¿podría pensarse que se
trata del mismo compuesto? Explique brevemente.

R= Si, esto se concluye debido a que si ambos componentes eluyen de la misma manera,
significa que tienen una polaridad muy semejante, por lo tanto, podría inferirse que se trata del
mismo componente.

17. Explique brevemente si existe una relación entre la cantidad de adsorbente y las dimensiones de
la columna para una mezcla.
 R= Entre más grande sea una columna, más adsorbente se necesitará, esto para observar mejor
la separación de los componentes; además de necesitar más disolvente para continuar la elución y
evitar la sequedad del sistema.

18. ¿Cómo debe de ser la polaridad del eluyente al empacar una columna?

R= La polaridad del eluyente debe ser mayor

19. Con relación al Rx:

19.1 ¿Cuándo se usa el Rx en cromatografía en capa delgada?

R= Cuando no se cuenta con un compuesto con polaridad conocida, y por lo tanto elusión
conocida, que se pueda usar como referencia en la C.C.D.

19.2 ¿Qué significa la obtención de Rx igual a uno?

R= Que el compuesto y el eluyente tienen la misma polaridad, incluso hasta mayor la de este
último.

19. ¿Cuál es el orden de polaridad en que salen los compuestos de una cromatografía en columna?

R= En la cromatografía de columna las moléculas de una mezcla son separadas en base a la

afinidad de las moléculas por la fase estacionaria o por la fase móvil. Si una molécula A tiene más
afinidad por la fase estacionaria que la B, B bajará más rápido que A.

 Hexano

 Éter de petróleo
 Benceno
 Tolueno
 Éter etílico
 Cloroformo
 Acetato de etilo
 Cloruro de metilo
 Dicloroetano
 Acetona
 Etanol
 Metanol

20. ¿A qué se le llama frente del eluyente en cromatografía en capa delgada? Demuéstrelo en una
placa.
 R= Es la línea donde acaba la elusión, si se
rebasa dicha línea se corre el riesgo de que los
componentes separados se esparzan a lo largo de la
parte posterior de la placa.

21. ¿Cómo se controla la salida de los componentes en una cromatografía en columna?

R= Se controla con la llave de la bureta, se va colocando los distintos pigmentos en tubos de

ensayo, a los que se les denominará como fracciones.

22. ¿Por qué no debe dejarse secar la columna cromatografía? En caso de que se fracture ¿qué se
recomienda hacer?

R= Porque de no ser así la fase estacionaria se contraería y agrietaría. Se debe rehidratar con
más eluyente si esto ocurre.

23. ¿Por qué es importante que las muestras a separar por cromatografía deban estar lo más secas
posible?

R= Para que no interfiera el agua con la elución, por medio del disolvente, de los componentes de
la muestra.

24. ¿Por qué al cargar una columna se recomienda que la muestra lleve la mínima cantidad de
disolvente?

R= Las cantidades altas de flujo dan malas separaciones, el promedio es de 3 a 4mL/min. en una
columna de 40 cm de altura aprox.

25. ¿Qué pH presenta la alúmina? Mencione los tres casos.

R= Presenta tres pH: alúmina ácida pH de 4.5, alúmina básica pH de 10.0 y alúmina neutra pH
de 8.0.

26. ¿Por qué cuando se usa alúmina como adsorbente no se recomienda usar acetona como
eluyente?

R= Porque se desnaturaliza y queda pegada en las paredes de la columna.

27. ¿Cuáles son los pasos a seguir para la preparación de una placa preparativa?

R= Las separaciones en capa fina características se realizan en placas de vidrio o plástico que se
recubren con una capa delgada y adherente de partículas finamente divididas, esta capa constituye
Ia fase estacionaria. Las partículas son semejantes a Ias de Ia cromatografía en columna. Las capas
finas preparadas sobre vidrio se denominan cromatoplacas o placas simplemente.

28. ¿Cuál es la aplicación de la cromatografía en placa preparativa?

R= La elección de un eluyente ideal para cromatografía en columna.

29. ¿Qué diferencia existe entre cromatografía en capa delgada analítica y cromatografía en placa
preparativa?

R= La preparativa se emplea generalmente para elegir un eluyente o mezcla de eluyentes ideal

para cromatografía en columna. La analítica ya cuenta con un eluyente ideal y registra R x, es decir,
se analiza la elusión de los componentes para arrojar un valor numérico final.

30. ¿Cómo se clasifican los reveladores en forma general?

R= Químicos y físicos.

31. Cuando una sustancia orgánica no se revela con I 2 o luz UV, ¿qué otros reveladores pueden
usarse para observar la sustancia?

R= Con reveladores químicos específicos para los componentes separados.