DETERMINACIÓN DE CARBOHIDRATOS COMO

AZUCARES TOTALES POR EL METODO DE FENOL

SULFURICO

OBJETIVOS

 Aplicar uno  de los procedimientos estudiados en clase.
 Conocer el porcentaje de azúcares totales en una muestra de miel.
 Calcular la absorbancia de la muestra.

FUNDAMENTO

Los   carbohidratos   abarcan   uno   de   los   mayores   grupos   de   compuestos

orgánicos encontrados en la naturaleza, y juntamente con las proteínas
forman los constituyentes principales del organismo vivo, además de ser
la   mas   abundante  y   económica   fuente   de  energía   para   el   hombre.   La
glucosa   es   el   monosacárido   mas   importante   y   constituye   la   unidad
estructural de los polisacáridos de mayor importancia.

El método de Dubois y cols. (1956) fue el utilizado para la cuantificación
de los azúcares totales: 

A alícuotas de 0.4 ml de muestra se le añadieron 0.4 ml de fenol al 5% y
posteriormente 2 ml de H2SO4  concentrado, agitándose la mezcla. A los
30 minutos de acabado el proceso se midió la absorbancia a 490 nm. La
recta de calibrado se realizó con distintas concentraciones de glucosa. 

Los ácidos urónicos generan una respuesta menor que la glucosa al test
del fenol­sulfúrico. Por ello las fracciones enriquecidas en ácidos urónicos
daban resultados minusvalorados del contenido en azúcares totales. Para
 solucionar   este   problema,   especialmente   importante   en   las   fracciones
pécticas, se realizó una curva patrón con ácido galacturónico para el test
del fenol­sulfúrico y los resultados se rectificaron del siguiente modo: 

Con   el   contenido   en   ácidos   urónicos   de   la   muestra,   obtenido   por   el

método   de   Blumenkratz   y   Asboe­Hansen   (1973),   se   calculó   la
absorbancia a 490 nm que darían de estar solos en ella. A la absorbancia
a 490 nm de la muestra problema se le resta la que darían sus urónicos.
De este modo obtuvimos la absorbancia de los azúcares neutros, y por lo
tanto   su   contenido.   Ahora   solo   quedó   sumar   las   cantidades   de   ácidos
urónicos y azúcares neutros para obtener el total de azúcares presentes. 

MATERIALES

 Muestra de alimento(miel de abeja).
 Balanza analítica.
 Glucosa anhidra p.a
 Agua destilada
 Solución de fenol al 5%(bi destilada).
 Ácido sulfúrico concentrado.
 Espectrofotómetro.

PROCEDIMIENTO

Se  sigue de acuerdo al flujo de preparación de la muestra mostrado mas
adelante.
También de acuerdo al modelo de la curva padrón que se muestra para la
elaboración de la muestra.
CURVA PADRÓN: (MÉTODO DE FENOL SULFÚRICO­ AZÚCARES
TOTALES)

 A  partir del padrón dc glucosa, cuya concentración es: 0,01 %  (0,1 g/
1000   ml)   (glucosa)   se   prepara   la   curva   padrón   conforme   los   datos
indicados a bajo.
 En  forma   semejante  se hace   las   lecturas   de  las   absorbancias   de  la
muestra   problema.   Para   ello   se   toman   alícuotas   de   0,1;   0,2   ml   de
filtrado   y   se   completa   a   volumen   para   1,0   mL   con   agua   destilada.
Seguidamente se hacen las lecturas a 490 nm.

Número Padrón  H2O Fenol  H2SO4 Concentración Absorvancia

de tubo de (ml) (5%) (ml)  g/ml (490nm)
glucosa (ml)
1 0.1 0.9 1.0 5.0 100,2100 ?
2 0.2 0.8 1.0 5.0 200,2850 ?
3 0.3 0.7 1.0 5.0 300,4600 ?
4 0.4 0.6 1.0 5.0 400,7500 ?
5 0.5 0.5 1.0 5.0 500,85 ?
6 0.6 0.4 1.0 5.0 ? ?
7 0.7 0.3 1.0 5.0 ? ?
8 0.8 0.2 1.0 5.0 ? 0.189
9 0.9 0.1 1.0 5.0 ? 0.239
10 1.0 0.0 1.0 5.0 ? 0.270
Blanco 0.0 1.0 1.0 5.0 ? ?

 Después de agregar el Fenol, debe adicionarse el H2SO4
 Esperar 30 minutos y realizar las lecturas de absorbancia
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

Pesar 5,0 gr de
muestra

Disolver 100 ml H2O

Baño María 5 min.

Filtración

Completar a 100 ml

Filtrado (líquido) Residuo (descartar)

1/100 ml de
Filtrado

12.5/50 ml

Fenol sulfúrico (1
ml)
RESULTADOS Y CÁLCULOS

Muestra de Miel

Para ello:
 Se pesó 5.028g, se disuelve en  100ml con H2O.
 Luego llevamos a baño maría por 5 minutos.
 Se filtra.
 Se extrae 1ml y enrasamos a 100; de esta mezcla extraemos 25ml y 
nuevamente enrasamos a 100ml

Determinamos la concentración

Entonces: 1000ml  0.1g. glucosa

0.1ml  X
 X = 0.1 x 0.1
1000
X = 10ug/ml

# de  Muestra  Muestra  Agua  Fenol  Ácido 

Tubo Padrón  de Miel  Destilada  (ml) Sulfúrico 
(ml) (ml) (ml) (ml)
1 0.1 0.0 0.9 1.0 5.0
2 0.2 0.0 0.8 1.0 5.0
3 0.3 0.0 0.7 1.0 5.0
4 0.4 0.0 0.6 1.0 5.0
 5 0.5 0.0 0.5 1.0 5.0
6 0.6 0.0 0.4 1.0 5.0
7 0.7 0.0 0.3 1.0 5.0
8 0.8 0.0 0.2 1.0 5.0
9 0.9 0.0 0.1 1.0 5.0
10 1.0 0.0 0.0 1.0 5.0
11 0.0 0.0 1.0 1.0 5.0
12 0.0 0.1 0.9 1.0 5.0
13 0.0 0.2 0.8 1.0 5.0
14 0.0 0.5 0.5 1.0 5.0

El tubo # 1 presenta un color claro amarillo.
En el resto del tubo naranja claro de mayor a menor hasta #11.
Luego medimos la absorvancia: a 490nm

Número Padrón  H2O Fenol  H2SO4 Concentración Absorvancia

de tubo de (ml) (5%) (ml)  ug/ml (490nm)
glucosa (ml)
1 0.1 0.9 1.0 5.0 10 0.110
2 0.2 0.8 1.0 5.0 20 0.220
3 0.3 0.7 1.0 5.0 30 0.355
4 0.4 0.6 1.0 5.0 40 0.375
5 0.5 0.5 1.0 5.0 50 0.550
6 0.6 0.4 1.0 5.0 60 0.590
7 0.7 0.3 1.0 5.0 70 0.680
8 0.8 0.2 1.0 5.0 80 0.189
9 0.9 0.1 1.0 5.0 90 0.239
10 1.0 0.0 1.0 5.0 100 0.270
Blanco 0.0 1.0 1.0 5.0
Obtenemos los valores de:

A = 0.0409
B = 0.0094
R2 = 0.99
Absorvancia de la  muestra:  del tubo #10 = 0.55
Y = A +Bx
 0.55 = 0.0409 + 0.0094x
x = 54.1606383
Para de determinar:
 54.16  0.5ml
x  100ml
x = 10832.1ug = 10.8321mg
 10.8321  25ml
x  100ml
x = 43.3285mg
  43.3285  1ml
x  100
x = 4332.85mg = 4.33285g

Entonces:
4.33285  5.07g
x  100g
Azúcares totales = 85.46%
Otra manera:
5.07  100%
4.33285  x
x = 85.46%
En 5 gramos de miel, hay 4.33285 gramos de azúcares totales, lo que 
representa el 85.46%.

DISCUSIÓN

 La reacción que se produjo en los tubos de la curva padrón con los
de   la   muestra   fueron   exotérmicas,   debido   al   calentamiento
excesivo     de   estas,   teniendo     que     esperar   10   minutos   para   su
enfriamiento.
 El fenol sulfúrico deshidrata el azúcar formando:

Pentosas Metil furfural

Hexosas Hidroximetil furfural

CONCLUSIONES

 Hay que tener cuidado de la cantidad de muestra diluída ya que
esta depende del resultado óptimo de la práctica.
  El azúcar es deshidratado debido a la presencia del  ácido fenol­
sulfúrico.
 La   temperatura   de   las   soluciones   influye   positivamente   o
negativamente, según los otros compuestos.
 En la miel se encuentra la fructuosa libre acompañada siempre de
glucosa y sacarosa

BIBLIOGRAFÍA

 Norman Potter, “Tecnología de los alimentos “

 R. Matissek, F.M. Schnepel, G. Steiner, 1992
“Análisis   de   los   Alimentos”,   2da   Edición,   Editorial   Acribia   S.A.
Zaragoza­ España.

 www.wikipedia.com