“Año del dialogo y la reconciliación nacional”

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

CURSO:
Microbiologia Medica

DOCENTES:
Dr. Reyes Chavez, Daniel
Blgo. Cruz Ojeda, Rosa
Blgo. Silupu Garcia, Carmen

INTEGRANTES:
Calle Troncos Edwin
Chuquillanqui Ruiz Fernanda
Florindez Sandoval Anthony
Gonzales Torres Darwin.
Guzman More Alejandro
Madrid Siancas Josselyn
Navarro Curay Ricardo
Olivares Vilcherrez Diana
Remicio Saavedra Valeria
Suncion Cruz Daniela

TURNO:
Viernes 6:00 pm – 9:35 pm

PIURA - PERU
2018

1
 Índice

Introducción
Objetivos
Marco teórico..…………………………………............................................................ 05
Hemocultivo……..………………...………………………………………………..….05
Indicaciones…………………………………………………………………….05
Toma de muestra………………………………………………………………..05
Transporte al laboratorio………………………………………………………..07
Recepcion y procesamientos……………………………………………………08
Coloracion GRAM …………………………………………………………………….15
Antibiograma ………………………………………………………………………….. 20
Medicion de los halos …………………………………………………………………..22
Interpretación de los resultados ………………………………………………………...22
Staphylococcus Aureus ………………………………………………………………...27
Fisiología y estrucrura ………………………………………………………….28
Patogenia e inmunidad …………………………………………………………31
Epidemiologia…………………………………………………………………………..33
Manifestaciones Clinicas ………………………………………………………………33
Diagnostico de laboratorio …………………………………………………………….38
Tratamiento y Prevencion ……………………………………………………………...40
Conclusiones…………………….………………………...............................................43
Bibliografía…………………………..............................................................................44

Anexos………………………………………………………………………………….45

2
 INTRODUCCIÓN

El Perú es el país con mayor número de personas afectadas de tuberculosis

multidrogorresistente (TBMDR), es decir con resistencia simultánea a isoniacida (INH)
y rifampicina (RIF), y uno de los veinte países con mayor severidad de la enfermedad en
el mundo. Cada año se informan más de 1800 personas que ingresan al tratamiento de TB
MDR, de ellos, el 80% son casos de TB MDR, por lo que se informa de aproximadamente
1500 personas como casos comprobados de TB-MDR por el Ministerio de Salud
(MINSA).

La identificación de la resistencia a la rifampicina se realiza mediante la detección

de las mutaciones más significativas del gen rpoB (que codifica la subunidad β de la ARN
polimerasa). Para probar el alto nivel de resistencia a la isoniazida, se examina el gen
katG (que codifica para la catalasa peroxidasa) y para probar el bajo nivel de resistencia
a la isoniazida, se analiza la región promotora del gen inhA (que codifica para la NADH
enoyl ACP reductasa).

El GenoType MTBDRplus permite un resultado rápido de la muestra de paciente

pulmonar y del material de cultivo. También para el diagnóstico de pacientes después de
la falla del tratamiento y la recaída, con anamnesis desconocida y originada en áreas de
alta prevalencia de TB-MDR, así como para el diagnóstico de pacientes en países con TB
de alta prevalencia y regiones de TB-MDR de alta carga, el uso de GenoType
MTBDRplus es razonable. La prueba está basada en un PCR multiplex que genera
múltiples productos de amplificación (sondas) los cuales, mediante una hibridación
reversa, reconocen las mutaciones génicas (en forma de bandas sobre la tira) más
frecuentes asociadas con la resistencia a isoniacida y rifampicina. Finalmente, la prueba
también se puede aplicar con fines de detección para desarrollar planes de acción contra
la TB.

3
Objetivos:

4
 Marco Teórico

GenoType MTBDR plus

Implementación de la prueba de ensayo lineal - Genotype MTBDRplus

Perú es uno de los países del continente americano con una alta carga de TB-
MDR y TB extremadamente resistente (XDR). Hasta el 2010, el diagnóstico de la TB-
MDR se realizaba por métodos relativamente rápidos, el método colorimétrico Griess
proporcionaba resultados positivos en 10 días y el método de observación directa
(MODS; método rápido en medio liquido) en 7 días ; además de diagnosticar la TB, estos
dos métodos también podían determinar la resistencia a INH y RIF. A pesar de su bajo
costo y que presentan buenos resultados bajo condiciones bien controladas, no dejan de
ser pruebas de cultivo, por lo que se exponen a altos índices de contaminación, y su
utilización es limitada, sobre todo en lugares donde el transporte de muestras cumple un
rol importante. Finalmente, para diagnosticar TB-XDR se utiliza el método de cultivo de
proporciones agar en placa (APP), que evalúa la resistencia a 11 drogas, incluidas 5 de
primera línea y 6 de segunda línea en un periodo de 90 días . Hasta el año 2010, la
detección de casos de TBMDR, TB-XDR y TB-monorresistente a RIF e INH estaba
estabilizándose utilizando los métodos rápidos Griess y MODS, así como el método APP
para la confirmación del patrón completo de resistencia; sin embargo, con el ingreso de
la prueba Genotype MTBDRplus en el 2011, se incrementó la detección de casos nuevos
en menos tiempo (Anexo 1).
Cuando hablamos de la TB, uno de los principales problemas en el ámbito
nacional es el aumento de los casos de TB-MDR. Frente a este problema, el INS a través
del Laboratorio de Referencia Nacional de Micobacterias (LRNM), comenzó a
investigar en el 2008 todas las pruebas para el diagnóstico de TB-MDR, sobre todo los
recomendados por la OMS . Como resultado de esta búsqueda propusieron la
implementación de la prueba molecular Genotype MTBDRplus, un ensayo de sonda
lineal que permite confirmar el diagnóstico de Mycobacterium tuberculosis (MTB) en
muestras de esputo y cultivo, además de su resistencia a RIF e INH en 3 a 5 días.

Para la implementación del Genotype MTBDRplus en el LRNM-INS fue

importante la intervención y el apoyo de la Estrategia Nacional de Prevención y Control
de la Tuberculosis (ESNPCT), quien comenzó en 2009 las coordinaciones con los

5
especialistas extranjeros para la transferencia de esta metodología, la adecuación de la
infraestructura del laboratorio y la adquisición de equipos que serían necesarios para
realizar este ensayo. Seguidamente, se capacitó al personal profesional y técnico que
asumiría la puesta en marcha de la prueba molecular rápida, y a mediados del 2010 se
llevó a cabo la validación del ensayo de sonda lineal Genotype MTBDRplus en
condiciones bien controladas, obteniéndose una sensibilidad de 95,2 y 96,9% para
detección de TB-MDR en muestras de esputo y cultivo, respectivamente. Con estos
resultados, en 2011, la prueba molecular se puso al servicio de la población en general.
Finalmente, en 2013 en coordinación con la ESNPCT se logró incluir el Genotype
MTBDRplus en la Norma Técnica de Salud (NTS) para la Atención Integral de las
Personas afectadas por Tuberculosis, donde se normó que todo paciente con TB tiene
derecho a acceder a una prueba rápida y que el Genotype sirva como una prueba de
tamizaje para la detección de TB-MDR, para posteriormente conocer el patrón completo
de resistencia por el método de susceptibilidad a drogas de primera y segunda línea (APP).

La implementación de esta prueba conllevó a procesos muy importantes para la

institución. Aunque se tuvo que asumir algunos desafíos, se pudo llevar a cabo la puesta
en marcha del ensayo.

Un reto importante fue que el ensayo molecular requería de una infraestructura

adecuada, es decir, un laboratorio de alto riesgo (nivel III) donde se pueda manipular
muestras infectadas con MTB, lo cual se pudo conseguir adaptando el LRNM-INS. Por
otro lado, adquirir esta metodología no solo era una gran oportunidad para el laboratorio
sino también para el país, ya que era la primera vez que se trabajaría con una metodología
molecular rápida (3 a 5 días para obtener el resultado) para el diagnóstico de TB-MDR a
nivel nacional. En general, la implementación del Genotype se realizó gracias al
esfuerzo y compromiso de los integrantes del LRNM, directivos del INS e integrantes
de la ESNPCT, donde cada uno de ellos pudo intervenir en la operatividad técnica
especializada, acondicionamiento del laboratorio, adquisición de equipos, gestión para la
introducción en la NTS, así como búsqueda de financiamiento para la sostenibilidad de la
prueba

La prueba de sonda lineal Genotype MTBDRplus en la actualidad.

La prueba de sonda lineal Genotype MTBDRplus se implementó en el LRNM-
INS en 2011, y desde entonces se viene realizando con regularidad. Esta prueba se puede
realizar a partir de muestras de esputo de pacientes con baciloscopía positiva, y a partir de

6
aislados de cultivos en medios sólidos y líquidos. Con la implementación del Genotype
se ha podido cubrir cada vez más la demanda del diagnóstico de TB, es así que desde el
2011 hasta el 2015, la cobertura del diagnóstico se ha incrementado de 5 al 60% ( Anexo
2) . Así mismo, la cobertura de la prueba Genotype a partir de muestras de esputo de
pacientes con baciloscopía positiva, se ha incrementado de 3% en el año 2011 hasta 46%
en el 2015 ( Anexo 3) .

Por otro lado, varias ventajas para el control de la TB se han obtenido con la
implementación de la prueba Genotype en el LRNM-INS. Primero, el tiempo de emisión de
resultados de un paciente con TB-MDR, se ha reducido de 90 a 5 días.

Genotype®MTBDRplus
La prueba molecular Genotype®MTBDRplus, es un método que permite identificar las
mutaciones más frecuentes asociadas con la resistencia a las drogas antituberculosas de
primera línea: isoniacida (INH) y rifampicina (RIF). En Pacientes con TBP FP,
Pacientes con TB FN o extrapulmonar con cultivo positivo; Antes o durante el
tratamiento
Es Directa en muestras de esputo e indirecta en cultivos positivos Se necesita un volumen
de muestra en esputo la capacidad de 3 a 5 mL y en aislamiento es mayor a 10 UFC
El envase utilizado para la muestra en esputo es un frasco de boca ancha, de no menos
de 50 mm de diámetro, de material plástico transparente, resistente a roturas, para poder
observar la calidad de la muestra y en aislamiento son tubos de vidrio de 20x150 mm o
20x125 mm, con tapa rosca.
El esputo debe provenir del árbol bronquial y obtenida después de un esfuerzo de tos y
el cultivo en medio sólido de 25 a 30 días con más de 10 colonias
Muestras de pacientes diagnosticados con tuberculosis pulmonar, frotis positvos nuevos
y antes tratados (recaidas, abandonos recuperados y fracasos a medicamentos de primera
línea)
No se debe usar para monitorear respuesta al tratamiento La prueba para medicamentos
de segunda línea para identificar XDR en: MDR multitratados, fracasos y contactos
El tiempo para emitir resultado de laboratorio es de 5 a 7 dias.

TIPOS DE GENOTYPE :

7
 1. GENOTYPE MTBC

La prueba GenoType MTBC es una prueba cualitativa in vitro a partir de material

cultivado para la diferenciación de las siguientes especies / cepas que pertenecen al
complejo Mycobacterium tuberculosis (MTBC): M. tuberculosis / M. canettii, M.
africanum, M. microti, M. bovis subsp. bovis, M. bovis subsp. Caprae, y M. bovis BCG.

La prueba GenoType MTBC se basa en la tecnología DNA • STRIP. Todo el

procedimiento se divide en tres pasos:

a. Extracción de ADN a partir de material cultivado (medio sólido / líquido; no se

proporcionan los reactivos necesarios)

b. Una amplificación múltiple con cebadores biotinilados

c. Una hibridación inversa.

Cada tira incluye 3 zonas de control:

- una zona de control de conjugado (CC) para verificar la unión del conjugado en
la tira y una reacción cromogénica correcta

- una zona de control interno (IC) que documenta una reacción exitosa de
extracción y amplificación de ADN

- una zona de control de género (GC) que documenta la presencia de un miembro

del género Mycobacterium

La prueba está indicada como una ayuda para el diagnóstico y está diseñada para uso en
instalaciones médicas y laboratorios médicos.

2. GENOTYPE MYCOBACTERIA DIRECT

Este es un ensayo comercial novedoso basado en la amplificación basada en la secuencia

de ácido nucleico (NASBA) y las técnicas de tira de ADN, que permite la detección
basada en la amplificación del ARNr 23S de MTBC, M. avium, M. intracellulare, M.
kansasii y M. malmoense. directamente a partir de muestras clínicas descontaminadas.

8
La principal diferencia es su capacidad para detectar simultáneamente cinco especies de
micobacterias de interés clínico directamente de muestras clínicas, lo que elimina la
necesidad de esperar los resultados del cultivo.

9
 3. GENOTYPE MTBDRPLUS

Es un ensayo de sonda de línea molecular que contiene sondas específicas para el

complejo M. tuberculosis, así como sondas para mutaciones que confieren resistencia a
la rifampicina (RIF) y un subconjunto de las mutaciones que confieren resistencia a
isoniacida (INH).

Utiliza tiras reactivas de nitrocelulosa (tecnología DNA Strip) que contienen regiones
parciales de los genes rpoB, katG e inhA fijadas sobre ella. La prueba está basada en un
PCR multiplex que genera múltiples productos de amplificación (sondas) los cuales,
mediante una hibridación reversa, reconocen las mutaciones génicas (en forma de bandas
sobre la tira) más frecuentes asociadas con la resistencia a isoniacida y rifampicina. Esta
prueba es novedosa, útil y rápida para la detección de la resistencia a drogas
antituberculosas.

Una tira de Genotype®MTBDRplus contiene 27 bandas de reacción: 21 bandas que

señalan las mutaciones (once bandas wild type (WT) es decir no presenta mutaciones y
diez bandas de resistencia a antibióticos (MUT)) y seis bandas control (CC: control de
conjugado, AC: control de amplificación, TUB: control de complejo M. tuberculosis y
controles de amplificación para los locus (genes) rpoβ, katG e inhA).

10
 4. GENOTYPE MTBDRsl ( VER 2.0 )

Es una prueba cualitativa in vitro para la identificación del complejo Mycobacterium

tuberculosis y su resistencia a fluoroquinolonas (FLQ, por ejemplo, ofloxacina y
moxifloxacina) y aminoglucósidos / péptidos cíclicos (AG / CP; inyectable de
antibióticos como kanamicina, amiyar, capreomicina y viomicina) de muestras de esputo
con baciloscopía positiva o negativa y muestras cultivadas.

Las siguientes especies están incluidas en el Complejo de M. tuberculosis causante de

tuberculosis (TB): M. tuberculosis, Sr. africanum, Sr. bovis subsp, Sr. Bovis BCG, Sr.
Microti, Sr. Canettii, y Sr. Pinnipedii.

La detección de la resistencia a la FLQ se habilita mediante la detección de las mutaciones

asociadas a la resistencia más significativas de gyrA y genes gyrB (que codifican la
subunidad A y la subunidad B de la girasa de ADN, respectivamente). Para la detección
de resistencia a AG / CP, el gen 16S rRNA (rrs) es examinado, para la detección de
resistencia a kanamicina de bajo nivel, se examina la región promotora del gen eis (que
codifica para la acetiltransferasa Eis).

11
MUESTRAS CON LAS QUE SE TRABAJA

De la mayoría de las personas con sospecha de TB pulmonar, el personal de salud podrá

obtener una muestra de esputo a través de la expectoración en un envase de boca ancha
,para ser examinada en el laboratorio. La recolección de una buena muestra de esputo
permitirá que el laboratorista realice la baciloscopía, por medio de la cual podrá o no
visualizar a través del microscopio el M. tuberculosis y determinar si el paciente ha
desarrollado la enfermedad.

 Para realizar una buena toma de esputo:

 La muestra se debe recoger en la primera hora de la mañana, al levantarse y en

ayunas, en un frasco.

 Enjuáguese la boca con agua antes de recoger la muestra, y en caso de tener

dentadura postiza retíresela.

 Tenga a mano el frasco que le entregaron en el laboratorio para recoger la muestra

de esputo, gargajo, pollo o flema, y destápelo.

 Tome aire profundamente llenando los pulmones tanto como le sea posible.

 Tenga a mano el frasco que le entregaron en el laboratorio para recoger la muestra

de esputo, gargajo, pollo o flema, y destápelo.

 Tome aire profundamente llenando los pulmones tanto como le sea posible.

 Capacidad de 30-50ml

 Material claro o transparente.

12
  El recipiente debe tener tapa de rosca y boca ancha

 Número de muestras:

Debido a que la eliminación de bacilos no es continua, es imprescindible analizar tres

muestras de cada tosedor, obtenidas de acuerdo a las siguientes indicaciones:

Para diagnóstico se requieren tres muestras.

a) La primera cuando se identifique al tosedor.

b) La segunda al despertar a la mañana siguiente a la toma de la primera muestra.

c) La tercera al entregar la segunda en la unidad de salud

 Colocar en la pared del envase una etiqueta con los siguientes datos:

a) El nombre del paciente.

b) El nombre de la unidad de salud donde se recolectó la muestra.

c) La fecha de recolección.

d) Indicar si la muestra es para diagnóstico o para control de tratamiento.

e) El número de muestra

Algunos pacientes no pueden expectorar para obtener la muestra de esputo. En estos casos
es necesario realizar diferentes procedimientos como:

• Esputo inducido (en ancianos o en personas que no pueden expectorar): Es un

procedimiento sencillo para obtener una muestra de esputo a través de la inhalación
profunda de un aerosol de suero fisiológico (agua con sal) que provoca en el paciente una
tos profunda (por irritación bronquial), lo cual permite eliminar secreciones pulmonares.
Estas muestras suelen ser diluidas o acuosas y deben estar marcadas como ‘inducidas’
para que no se confundan con saliva en el laboratorio.

• Aspirado gástrico (en niños menores de 5 años): El aspirado gástrico por sondaje
nasogástrico (SNG) se realiza insertando un tubo por la nariz del paciente y pasándolo
dentro del estómago. La idea es obtener una muestra del esputo que ha sido expectorado
y después tragado. El SNG permite extraer secreción gástrica a través del aspirado por
sonda nasogástrica. El SNG suele hacerse durante la mañana debido a que el paciente
tiende a tragar esputo durante la noche. Generalmente el SNG se realiza sólo cuando no

13
se puede obtener una muestra por inducción o broncoscopía. Muchas veces se usa para
obtener una muestra de niños.

• Broncoscopía (en pacientes adultos BK negativos para definir diagnóstico). Es la

recolección de secreciones bronquiales por aspiración, a través del canal del
broncofibroscopio (que es el instrumento para realizar este procedimiento). Esta muestra
es válida para el estudio citológico de neoplasias y bacteriológico de algunos gérmenes
como el M. tuberculosis.

En baciloscopia tenemos 2 tinciones:

 Tinción Ziehl Neelsen: sirve para demostrar la presencia de bacilos acido-alcohol

resistente (BAAR) en muestras pulmonares y extrapulmonares.Detecta de 5000
a 10 000 BAAR por ml de muestra y se necsitan mínimo 2 muestras; presenta
especificidad de 90 % y la sensibilidad varia , en la primera presenta 30-40% y en
la segunda muestra 65-80%.

 Tinción Auramina Rodamina: es mas rápida que la tinción Ziehl Neelsen solo
requiere de 2 a 3 min y recomendada en laboratorios con alta carga de
baciloscopia.

En los cultivos se pueden utilizar 2 tipos:

 Solidos :

- Cultivo Ogawa: permite recuperar a M.Tuberculosis de cualquier muestra

clínica. Presenta alta sensibilidad :101.102 bacterias viables /ml muestra,
como principales componentes tiene al huevo , verde malaquita, y solución de
sales. Incrementa de 20-25% mas al diagnostico directo y permite identificar
especies , ya que es exclusivo para M.tuberculosis.

 Liquidos :

- BACTEC460: método radiométrico que detecta el crecimiento

microbacteriano midiendo la cantidad de 14CO2 producido por la metalización
14
de sustrato marcado con C.Tiempo de detección de 10 a 12 dias para
M.tuberculosjs .Permite aislar, identificar y estudiar la suceptibilidad a drogas.

- MGIT960:detecta el crecimiento de M,tuberculosis mediante un compuesto

fluorescente ( pentahidrato de rutenio) sensible al O2 como indicador de

14
 crecimiento. La lectura es rápida y el tiempo de detección es de 10 días. Es
de gran capacidad de análisis ( 960muestras ).

En el caso de personas sobre las que existe sospecha de tener TB extrapulmonar, se

obtendrán muestras que no son de esputo. La muestra obtenida de estas personas depende
de cuál es la parte del cuerpo afectada. Por ejemplo, se obtienen muestras de orina de
personas con sospecha de TB del riñón y se obtienen muestras de fluido a través de
punción lumbar del área alrededor de la columna en personas con sospecha de meningitis
TB (TB de las membranas situadas alrededor del cerebro).

Todo material biológico obtenido (líquido o biopsia) se remitirá a laboratorio en 2

muestras de cada una. Las muestras del líquido se remitirán para estudio bacteriológico
(baciloscopía y cultivo) y las muestras de biopsia se enviarán de la siguiente manera: una
muestra conservada en suero fisiológico, para el estudio bacteriológico (bacteriología y
cultivo) y la segunda muestra conservada en formol para estudio anatomopatológico. A
todos los pacientes con TB extrapulmonar se les debe solicitar además baciloscopía y
cultivo de esputo para descartar TB pulmonar.

Algaritmo para confirmar TB en el Peru según sucepstibilidad a isoniacida y rifampicina

15
El principal soporte para el diagnóstico de laboratorio de la infección por M. tuberculosis
(MTB) se basa en la utilización combinada de la baciloscopia y el cultivo. La baciloscopia
tiene baja sensibilidad (40 a 60 %) en casos confirmados de tuberculosis pulmonar
requiriendo al menos 10 000 bacilos/ml para ser detectado por personal calificado en la
lectura de las placas . El cultivo es más sensible pudiendo detectar entre 10 y 100
bacilos/ml de esputo , no obstante puede requerir de seis a ocho semanas para el
asilamiento del bacilo.

Se utiliza la prueba molecular de GENOTYPE, cultivos positivos con no menos de diez

colonias y en esputo con baciloscopía positiva (mínimo una cruz), aunque tambien se
incluyen baciloscopia negativa .

Kit de contenidos

N° de test
Kit de componentes 1 de 2 (2-8°C)
12 96
Tiras de membrana recubiertas con sondas específicas 12 2x 48
(MTBDRplus VER 2.0 STRIPS)
La solución de desnaturalización (DEN) contiene <2% de 0.3 ml 2x 1.2 ml
NaOH, colorante
El tampón de hibridación (HYB) contiene <10% de 20 ml 120 ml
tensioactivo aniónico, colorante
La solución de lavado rigurosa (STR) contiene> 25% de un 20 ml 120 ml
compuesto de amonio cuaternario, <1% de tensioactivo
aniónico, colorante
La solución de enjuague (RIN) contiene un tampón <1% de 50 ml 3x 120 ml
NaCl, <1% de tensioactivo aniónico
Concentrado de conjugado (CON-C) contiene fosfatasa 0.2 ml 1.2 ml
alcalina conjugada con estreptavidina, colorante
El tampón de conjugado (CON-D) contiene tampón, 1% de 20 ml 120 ml
reactivo de bloqueo, <1% de NaCl
Concentrado de sustrato (SUB-C) contiene <70% de 0.2 ml 1.2 ml
dimetilsulfóxido, <10% de cloruro de 4-nitro azul tetrazolio,
<10% de 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato
El tampón de sustrato (SUB-D) contiene un tampón, <1% 20 ml 120 ml
MgCl2, <1% NaCl
Bandeja, hoja de evaluación. 1 por unidad 1 por unidad
Instrucciones de uso, plantilla. 1 por unidad 1 por unidad
Kit de componentes 2 de 2 (20°C)
La mezcla de amplificación A (AM-A GT MTBDRplus VER 0.15 ml 4x 0.3 ml
2.0) contiene tampón, nucleótidos, polimerasa Taq
La mezcla de amplificación B (AM-B GT MTBDRplus VER 0.53 ml 4x 1.05 ml
2.0) contiene sales, cebadores específicos, colorante

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Material requerido pero no incluido en el kit

- Papel absorbente.
- Pipetas ajustables para 10, 20, 200 y 1000 μl.
- Gabinete de seguridad clase II
- Guantes desechables - Puntas de pipeta estériles desechables con filtro.
- Kit de extracción de ADN (GenoLyse® o GXT DNA / RNA Extraction Kit, consulte el
capítulo Información para pedidos), así como el equipo necesario
- Cilindro graduado
- Tubos de PCR, libres de ADNasa y ARNasa.
- Reactivos para el cultivo de micobacterias, así como el equipo necesario (cuando se
deben utilizar muestras cultivadas)
- Reactivos de descontaminación de muestras y equipos necesarios. - Baño de agua con
agitación + plataforma de agitación o TwinCubator (instrumento para hibridación
manual) o instrumento de hibridación automatizada
- Termociclador
- temporizador
- pinzas
- Agua (destilada)
- Agua (grado de biología molecular, para controles negativos)

Procedimiento

Preparación
Las muestras clínicas deben procesarse utilizando el método NALC / NaOH. Después de
la descontaminación, el sedimento celular debe resuspenderse en un máximo de 1 a 1,5
ml de tampón fosfato. Cuando se analizan muestras de pacientes, los volúmenes más altos
pueden dificultar la sensibilidad de la prueba. Debido a la posible falta de homogeneidad
de la muestra, la muestra descontaminada debe mezclarse antes de extraer la alícuota que
se analizará; De lo contrario, la sensibilidad de la prueba podría verse influenciada.
Cuando la muestra se va a cultivar, el cultivo se puede realizar en medio sólido (por
ejemplo, Loewenstein-Jensen, Middlebrook) o en medio líquido (por ejemplo, MGIT
(BD Diagnostics, Franklin Lakes, EE. UU.)).

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Extracción de ADN

Todos los pasos a realizar en laboratorio de Procesamiento:

• Limpie a fondo todas las superficies de la campana, así como las superficies externas de
todo el equipo en la campana con un 5% de Lysol, seguido de un 1% de lejía.
• Rocíe los guantes con 1% de lejía antes del trabajo.
• Para la preparación de soluciones de limpieza:
• El baño de agua debe encenderse primero al ingresar al laboratorio para permitir el
tiempo suficiente para que la temperatura se equilibre. Se debe insertar un termómetro en
el baño de agua para medir la temperatura de operación (que no corresponde a la lectura
digital).
El kit de extracción de ADN GenoLyse® permite la extracción manual rápida y fácil de
ADN bacteriano genómico de muestras de pacientes, cultivos líquidos y sólidos para su
uso posterior con la prueba MTBDRplus versión 2 de Hain GenoType ". Almacene todos
los componentes del kit a 2-8 ° C. En caso de que la solución de ADN se almacene durante
un período prolongado, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo.

Extracción de ADN de cultivo líquido.

• Pipetear 1 ml de cultivo líquido directamente en un vial cónico.
• Centrifugar durante 15 minutos a 10.000 x g en una centrífuga de mesa estándar.
• Descarte el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento en 100 µl de tampón de
lisis (A-LYS) mediante vórtice.
• Incubar la muestra durante 5 minutos a 95 ° C en un baño de agua. Brevemente girar
hacia abajo.
• Agregue 100 µl de tampón de neutralización (A-NB) al lisado y agite en vórtex la
muestra durante 5 segundos.
• Gire hacia abajo durante 5 minutos a toda velocidad y use directamente 5-10 µl del
sobrenadante para la PCR
.

Extracción de ADN de cultivo sólido

• Pipetee 300μl de agua de grado molecular en suficientes 200μl de tubos con tapa de
rosca para 1 tubo por cultivo.

18
• Utilice un bucle de inoculación desechable estéril de 1 μl para recolectar bacterias de
medios con suficiente crecimiento.
• Incubar 20 min a 95 ° C en el baño de agua.
• Incubar 15 min en baño ultrasónico.
• Centrifugar durante 15 minutos a 10.000 x g en una centrífuga de mesa estándar.
• Descarte el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento en 100 µl de tampón de
lisis (A-LYS) mediante vórtice.
• Incubar la muestra durante 5 minutos a 95 ° C en un baño de agua. Brevemente girar
hacia abajo.
• Agregue 100 µl de tampón de neutralización (A-NB) al lisado y agite en vórtex la
muestra durante 5 segundos. • Gire hacia abajo durante 5 minutos a toda velocidad y use
directamente 5-10 µl del sobrenadante para la PCR..

Extracción de ADN directamente de muestras de pacientes.

• Las muestras de esputo deben descontaminarse de acuerdo con el procedimiento de

descontaminación de muestras.
• Después de la suspensión del sedimento en tampón fosfato, use una pipeta Pasteur
desechable para pipetear 500 μl de muestra descontaminada en un tubo de
microcentrífuga de 1.5 ml con tapón de rosca.
• Centrifugar durante 15 minutos a 10.000 x g en una centrífuga de mesa estándar.
• Descarte el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento en 100 µl de tampón de
lisis (A-LYS) mediante vórtice.
• Incubar la muestra durante 5 minutos a 95 ° C en un baño de agua. Brevemente girar
hacia abajo.
• Agregue 100 µl de tampón de neutralización (A-NB) al lisado y agite en vórtex la
muestra durante 5 segundos.
• Gire hacia abajo durante 5 minutos a toda velocidad y use directamente 5-10 µl del
sobrenadante para la PCR.

Amplificación

Todos los reactivos necesarios para la amplificación, como la polimerasa y los cebadores,
se incluyen en las Mezclas de Amplificación A y B (AM-A y AM-B) y están optimizados

19
para esta prueba. Después de descongelar, gire AM-A y AM-B brevemente y mezcle
cuidadosamente pipeteando arriba y abajo. Pipetee AM-A y AM-B solo en una habitación
libre de ADN contaminante. La solución de ADN debe agregarse en un área de trabajo
separada.

Preparar para cada muestra:

After DNA extraction with GenoLyse®

– 10 μl AM-A
– 35 μl AM-B
– 5 μl DNA solution
Final volumen: 50 μl

Determine el número de muestras (número de muestras que se analizarán más muestras

de control). Prepare el número de tubos necesarios. Prepare una mezcla maestra que
contenga AM-A y AM-B y mezcle cuidadosamente pero a fondo (no mezcle en vórtex).
Alternativamente, el contenido de un tubo de reacción AM-A puede transferirse
completamente a un tubo de reacción AM-B. Esto conducirá a una mezcla maestra de
0,68 ml para 12 reacciones de amplificación (kit de 12 pruebas) o, respectivamente, 4x
1,35 ml para reacciones de amplificación 4x24 (kit de 96 pruebas). Tenga en cuenta que
la mezcla maestra debe prepararse cada vez. Alícuota de 45 μl en cada uno de los tubos
de PCR preparados y agrega 5 o 10 μl de agua (ver arriba) a una alícuota (control
negativo). En un área de trabajo separada, agregue 5 o 10 μl de solución de ADN a cada
alícuota (excepto para el control negativo).

Perfil de amplificación:

Cuando utilice un termociclador de Hain Lifescience con la preinstalación respectiva,

seleccione el protocolo "MDR DIR" para muestras clínicas o el protocolo "MDR CUL"
para muestras cultivadas.

20
 Especimenes clinicos Muestras cultivadas

15 min 95°C 1 ciclo 1 ciclo

30 sec 95°C
20 ciclo 10 ciclo
2 min 65°C

25 sec 95°C
40 sec 50°C 30 ciclo 20 ciclo
40 sec 70°C

8 min 70°C 1 ciclo 1 ciclo

Velocidad de calentamiento ≤2.2 ° C / seg ≤2.2 ° C / seg. Los productos de

amplificación se pueden almacenar entre +8 y –20 ° C.

Hibridación
Cuando utilice un instrumento de hibridación de Hain Lifescience, consulte el documento
"Visión general de los programas de equipos" disponible en www.hain-lifescience.com
para obtener el nombre del protocolo de hibridación que se utilizará. El siguiente
protocolo describe la hibridación manual utilizando un baño de agua o un TwinCubator.

Preparación
Caliente el baño de agua de agitación a 45 ° C (la desviación máxima tolerada de la
temperatura deseada es de +/– 1 ° C) o encienda TwinCubator. Las soluciones de
precalentamiento HYB y STR a 37-45 ° C antes del uso. Los reactivos deben estar libres
de precipitados (sin embargo, tenga en cuenta que la solución CON-D es opaca). Mezclar
si es necesario. Caliente los reactivos restantes a excepción de CON-C y SUB-C a
temperatura ambiente. Usando un tubo adecuado, diluya el concentrado de conjugado
(CON-C, naranja) y el sustrato (SUB-C, amarillo) 1: 100 con el búfer respectivo (CON-
C con CON-D, SUB-C con SUB-D) en Las cantidades necesarias. Mezclar bien y llevar
a temperatura ambiente. Para cada tira, agregue 10 μl de concentrado a 1 ml del búfer
respectivo. Diluir el CON-C antes de cada uso. El SUB-C diluido es estable durante 4
semanas si se almacena a temperatura ambiente y está protegido de la luz.

1. Dispense 20 μl de solución de desnaturalización (DEN, azul) en una esquina de cada

uno de los pocillos utilizados.

21
2. Agregue a la solución 20 μl de muestra amplificada, pipetee hacia arriba y hacia abajo
para mezclar bien e incube a temperatura ambiente durante 5 minutos.
Mientras tanto, saque las tiras del tubo con unas pinzas y márquelas con un lápiz debajo
del marcador de color. Siempre use guantes cuando maneje las tiras.
3. Agregue cuidadosamente a cada pocillo 1 ml de tampón de hibridación precalentado
(HYB, verde). Agite suavemente la bandeja hasta que la solución tenga un color
homogéneo.
Tenga cuidado de no derramar la solución en los pozos vecinos.
4. Coloque una tira en cada pozo.
Las tiras deben estar completamente cubiertas por la solución y el lado recubierto
(identificable por el marcador de color cerca del extremo inferior) debe mirar hacia arriba.
Con unas pinzas, dé vuelta las tiras que podrían haberse girado cuando se sumergieron en
la solución. Limpie cuidadosamente las pinzas después de cada uso para evitar la
contaminación. Esto también se aplica a todos los pasos siguientes.
5. Coloque la bandeja en un baño de agua con agitación / TwinCubator e incube durante
30 minutos a 45 ° C.
Ajuste la frecuencia de agitación del baño de agua para lograr una mezcla constante y
completa de la solución. Para permitir una transferencia de calor adecuada, la bandeja
debe sumergirse en el agua a al menos 1/3 de su altura.
6. Aspirar completamente el tampón de hibridación.
Por ejemplo, use una pipeta Pasteur conectada a una bomba de vacío.
7. Agregue 1 ml de Solución de lavado rigurosa (STR, rojo) a cada tira e incube durante
15 minutos a 45 ° C en un baño de agua con agitación / TwinCubator.
8. Trabajar a temperatura ambiente desde este paso adelante. Eliminar completamente la
solución de lavado riguroso.
Vierta la Solución de Lavado en un contenedor de desechos y retire todo el líquido
restante girando la bandeja hacia abajo y golpeándola suavemente sobre un papel
absorbente.
Esto también se aplica a todos los demás pasos de lavado.
9. Lave cada tira una vez con 1 ml de solución de enjuague (RIN) durante 1 minuto en la
plataforma de agitación / TwinCubator (vierta el RIN después de la incubación).
10. Agregue 1 ml de conjugado diluido (ver arriba) a cada tira e incube por 30 minutos
en la plataforma de agitación / TwinCubator.

22
11. Retire la solución y lave cada tira dos veces durante 1 minuto con 1 ml de solución
de enjuague (RIN) y una vez durante 1 minuto con aprox. 1 ml de agua destilada (por
ejemplo, usar una botella de lavado) en la plataforma de agitación / TwinCubator (verter
la solución cada vez).
Asegúrese de eliminar cualquier rastro de agua después del último lavado.
12. Agregue 1 ml de sustrato diluido (ver arriba) a cada tira e incube protegido de la luz
sin agitar.
Dependiendo de las condiciones de la prueba (por ejemplo, temperatura ambiente), el
tiempo de incubación del sustrato, es decir, el tiempo hasta que las bandas son claramente
visibles, puede variar entre 3 y 20 minutos. Los tiempos de incubación prolongados del
sustrato pueden llevar a un aumento de la tinción de fondo y pueden afectar la
interpretación de los resultados.
13. Detenga la reacción tan pronto como las bandas sean claramente visibles enjuagando
brevemente dos veces con agua destilada.
14. Con unas pinzas, retire las tiras de la bandeja y séquelas entre dos capas de papel
absorbente.

Evaluación e interpretación de los resultados.

Pegar las tiras y guardarlas protegidas de la luz. Se incluye una hoja de evaluación en el
kit. Al usar esta hoja de evaluación, pegue las tiras desarrolladas en los campos
designados alineando las bandas CC y AC con las líneas respectivas en la hoja. Por
razones técnicas, las distancias entre las sondas individuales en las tiras pueden variar
ligeramente.

23
 Para una evaluación precisa, por lo tanto,
use la plantilla provista y alinéela por
separado para cada locus con la banda de
control de Locus correspondiente.
Determine el estado de resistencia y anote
en la columna correspondiente. Como ayuda
para la interpretación, los ejemplos de
evaluación se dan en el capítulo siguiente.
Cada tira tiene un total de 27 zonas de
reacción (ver figura).

Nota: La tira no se muestra en tamaño original

Control de conjugado (CC)

Se debe desarrollar una línea en esta zona, que documente la eficacia de la unión del
conjugado y la reacción del sustrato.

Control de Amplificación (AC)

Cuando la prueba se realiza correctamente, un amplicón de control se unirá a la zona de
Control de Amplificación.
En caso de un resultado de prueba positivo, la señal de la zona de Control de
Amplificación puede ser débil o incluso desaparecer por completo. Esto podría deberse a
la competencia de las reacciones individuales durante la amplificación. En este caso, la
prueba se realizó correctamente y no tiene que repetirse.
Cuando solo se desarrollan las bandas CC y CA, esto representa un resultado negativo
válido. Una banda de CA faltante en caso de un resultado de prueba negativo indica
errores durante la configuración y / o el rendimiento de la reacción de amplificación, o la
presencia de inhibidores de la amplificación. En este caso, el resultado de la prueba no es
válido y la prueba debe repetirse con la muestra correspondiente.

Complejo de M. tuberculosis (TUB)

24
Esta zona se hibrida, por lo que se sabe, con amplicones generados por todos los
miembros del complejo Mycobacterium tuberculosis. Si la zona TUB es negativa
mientras no se desarrolle un patrón de resistencia evaluable, la muestra analizada no
contiene bacterias pertenecientes al complejo M. tuberculosis y no puede ser evaluada
por este sistema de prueba. En casos raros, la zona TUB puede ser negativa mientras se
desarrolla un patrón de resistencia evaluable. Si es así, se debe sospechar la presencia de
una cepa que pertenece al complejo M. tuberculosis y se debe repetir la prueba (ver más
abajo, "caso especial" n. 3).

Controles de locus (rpoB, katG e inhA)

Las zonas de control de locus detectan una región genética específica para el locus
respectivo. En caso de un resultado de prueba positivo (tipo salvaje evaluable y patrón de
bandas de mutación), las señales de las bandas de control de locus pueden ser débiles.

Sondas de tipo salvaje

Las sondas de tipo salvaje comprenden las regiones de resistencia más importantes de los
genes respectivos (ver figura 1, así como las tablas 1, 2 y 3). Cuando todas las sondas de
tipo salvaje de un gen se tiñen de forma positiva, no hay una mutación detectable dentro
de las regiones examinadas. Esto indica que la cepa probada es sensible al antibiótico
respectivo. En caso de una mutación, el amplicón respectivo no puede unirse a la sonda
de tipo salvaje correspondiente. La ausencia de una señal para al menos una de las sondas
de tipo salvaje indica una resistencia de la cepa probada al antibiótico respectivo.
Cada patrón que se desvía del patrón de tipo salvaje indica una resistencia de la cepa
probada. El patrón de bandas obtenido con las sondas rpoB permite sacar una conclusión
acerca de una resistencia RMP de la tensión probada, el katG y el patrón de bandas inhA
sobre una resistencia INH.

Sondas de mutacion
Las sondas de mutación detectan algunas de las mutaciones mediadoras de resistencia
más comunes (ver tablas 1, 2 y 3). En comparación con las otras sondas, las señales
positivas de las sondas de mutación rpoB MUT2A y MUT2B pueden mostrar una
intensidad de señal más baja.

25
En casos raros, cuando la banda rpoB MUT3 es positiva, se puede detectar una tinción
débil en la banda rpoB WT8, lo que se considera negativo.
Cada patrón que se desvía del patrón de tipo salvaje indica una resistencia de la cepa
probada. El patrón de bandas obtenido con las sondas rpoB permite sacar una conclusión
acerca de una resistencia RMP de la tensión probada, el katG y el patrón de bandas inhA
sobre una resistencia INH.

Tenga en cuenta:
Solo se deben considerar aquellas bandas cuyas intensidades son tan fuertes o más fuertes
que las de la Zona de Control de Amplificación (AC). No todas las bandas de una tira
tienen que mostrar la misma intensidad de señal.

Si todas las bandas de tipo salvaje muestran una señal, esto se clasifica como positivo y
se marca en la columna WT del gen respectivo como "+". Si al menos una de las bandas
de tipo salvaje está ausente, esto se clasifica como negativo y se marca en la columna WT
como "-". Las entradas negativas solo se realizan en las columnas de mutación cuando
ninguna de las bandas de mutación muestra una coloración. Si al menos una de las bandas
de mutación muestra una coloración, esto se clasifica como positivo y la columna MUT
del gen respectivo se marca con un "+".

A continuación, se explican dos de los ejemplos mostrados arriba:

El ejemplo 1 muestra el patrón de bandas de tipo salvaje. Todas las sondas de tipo salvaje,
pero ninguna de las sondas de mutación muestran una señal; por lo tanto, el cuadro de

26
evaluación muestra "+" en las tres columnas de tipo salvaje y "-" en las tres columnas de
mutación. En consecuencia, las casillas "RMP sensible" y "INH sensible" están marcadas
con un "+".
En el ejemplo 5, falta una de las sondas de tipo salvaje rpoB y katG; por lo tanto, las
casillas para "rpoB WT" y "katG WT" están marcadas con un "-". Como ninguna de las
sondas de mutación está desarrollada, estas casillas también están marcadas con un "-".
La región promotora inhA no se desvía del patrón de tipo salvaje. La cepa se evalúa como
resistente a RMP e INH.

Ventajas

La prueba GenoType MTBDRplus® puede determinar la resistencia del bacilo a las

drogas antituberculosas en un máximo de 72 horas, y favorece el inicio temprano y
específico del tratamiento contra la tuberculosis.

La prueba está basada en un PCR multiplex que genera múltiples productos de

amplificación, los cuales mediante hibridación reversa reconocen las mutaciones génicas.

Se pueden procesar entre 12 y 48 muestras simultáneamente.

Puede aplicarse tanto en cultivo o directamente en esputo.

En cuanto a validez de la prueba ofrece una sensibilidad para detectar resistencia a

Rifampicina de 98,1% y para Isoniacida de 90,2%, con una especificidad de 97,8% y
100% para cada droga respectivamente.

La aplicación de la prueba GenoType MTBDRplus® es útil para detectar mutaciones

específicas asociadas con la tuberculosis multirresistente y, según la población de que se
trate, permitiría establecer de una manera rápida la resistencia cruzada entre Isoniacida y
Etionamida, lo cual es útil para decidir sobre la inclusión o exclusión de la Etionamida en
los esquemas de tratamiento de segunda línea.

Desventajas

La ausencia de mutaciones en el promotor inhA no garantiza la eficacia del tratamiento

con Etionamida, porque existen otros genes relacionados con la resistencia a este
medicamento.

27
Se debe señalar que la prueba de GenoType MTBDRplus® requiere que la muestra de
esputo sea frotis positivo para poder utilizarlo.

Una limitación del método molecular es que requiere de equipamiento y personal

entrenado para la ejecución de la prueba, por lo que este tipo de metodologías deben ser
realizadas en laboratorios con infraestructura adecuada, equipamiento y personal
entrenado.

Las condiciones económicas y el escaso conocimiento sobre la frecuencia de las

mutaciones en los genes asociados a la DR de varios de los países afectados por la nueva
dinámica de la TB-DR, proyectan un futuro incierto para las técnicas genotípicas.

Sensibilidad y Especificidad

La prueba Genotype MTBDRplus está recomendada por la O.M.S. como una herramienta
diagnóstica rápida y sensible para detectar el complejo MTB y su resistencia a drogas
antituberculosas de primera línea.

Se han realizado varios estudios evaluando el rendimiento de esta prueba para la detección
de resistencia a rifampicina e isoniacida en muestras con baciloscopia positiva. Rango de
sensibilidad de la prueba: 75-100 %. Rango de especificidad de la prueba: 63-100%

La elevada sensibilidad de la prueba molecular para detectar resistencia a rifampicina

puede explicarse por: La rifampicina actúa como bactericida interfiriendo con la síntesis
de ARN mensajero al unirse a la ARN polimerasa, que está compuesta por cuatro
subunidades diferentes codificadas por los genes rpoA, rpoB, rpoC y rpoD. Las
micobacterias desarrollan resistencia a rifampicina mediante mutaciones en la subunidad
β de la ARN polimerasa, que es codificada por el gen rpoB. Las principales mutaciones
de resistencia se encuentran en la región Core de 81 pb del gen rpoB.

En cuanto a isoniacida, La isoniazida, es una prodroga que, al ser captada por la bacteria,
es activada por el sistema catalasa-peroxidasa a la forma activa, el ácido nicotínico, de
manera que la ausencia de actividad catalasa, debido a mutaciones en el gen katG,
codificante de esta enzima, es uno de los mecanismos de resistencia a la isoniazida.

El mecanismo de acción es la inhibición específica de la síntesis de ácidos micólicos, sin

afectar la de otros ácidos grasos. Se determinó que se debe a la mutación del gen katG
donde mutación katG Mut 1 es las más frecuente, pero, existen otras mutaciones más

28
prevalentes: inhA Mut y rpoB3. La enzima enoil ACP reductasa codificada por gen inhA,
está involucrada en los pasos de elongación de ácidos grasos del M. tuberculosis y se ha
identificado como blanco de acción de la isoniazida. La isoniazida activada interfiere con
la síntesis de ácido micólico por inhibición de la NADH dependiente de la enoil ACP
reductasa. La mutación del gen inhA, que la codifica explica aproximadamente el 25%
de los casos de resistencia a isoniazida. Las mutaciones en el gen inhA, no solo causa
resistencia a la isoniazida sino también a la ethionamida.

FALSOS POSITIVOS

La prueba Genotype MTBDRplus determinó en el 5,3 % de las muestras un resultado

positivo que el cultivo estableció como negativo. Dado que el cultivo es la prueba de
referencia, este porcentaje corresponde a resultados falsos positivos de la PCR. Barnes y
Neonakis, entre otros, han planteado la posibilidad de contaminación cruzada de la PCR
y generación de dichos falsos positivos. A pesar de que en este estudio se incluyó un
control negativo en cada montaje para validar la positividad de las PCR, cada una de las
muestras debe analizarse a la luz del resultado del cultivo y en este caso, dada la
proveniencia de las muestras pensar en posible contaminación cruzada.

FALSOS NEGATIVOS

En contraste a los resultados falsos positivos, se encontró que el 2,1 % de las muestras
fueron determinadas negativas por la prueba Genotype MTBDRplus, pero establecidas
positivas por cultivo, indicando resultados falsos negativos de la PCR. Hofmann-Thiel
evaluaron la utilidad de una PCR con hibridación reversa para la detección de MTB,
donde encontraron una proporción similar de resultados falsos negativos con 2,7 % de las
muestras determinadas como tal.

Otros autores han sugerido que resultados falsos negativos se deben a presencia de
inhibidores de la PCR o a errores técnicos de laboratorio. Sin embargo, la prueba
Genotype MTBDRplus trae una sonda control de amplificación que siempre dio positiva,
indicando que la PCR se preparó con todos los reactivos necesarios para un resultado
válido y que no existieron sustancias inhibidoras de la reacción.

29
Discusión

30
Conclusiones
Conclusión
Es muy importante realizar una toma muestra de esputo ya que nos ayudara a tener
resultados verdeaderos y confidenciales, y es clave para poder hacer seguimiento de las
personas con TB
Conclusión:

Llegamos a concluir que es de suma importancia la reacción en las líneas de control, ya

que eso hace que la prueba tenga validez. De no suceder se tendría que volver a realizar
la prueba.

Conclusión:

 Los diferentes tipos moleculares de genotype, presentan un perfil diagnóstico

adecuado para detectar la tuberculosis multiresistente (causada por un organismo
resistente, por lo menos, a los dos medicamentos más utilizados en el tratamiento
de esa enfermedad (isoniacida y rifampicina) y la extremadamente resistente (con
resistencia a isoniacida y rifampicina, a una fluoroquinolona)

Conclusión:

La sensibilidad y especificidad de la prueba difiere en el ámbito de cual droga antituberculosa se

quiera evaluar resistencia, pero, algunos estudios realizados señalan que mutaciones específicas
hacen que varíe este porcentaje de sensibilidad establecido y se infiera que otros factores podrían
modificar este porcentaje.

CONCLUSION :

 La prueba de PCR Genotype MTBDRplus es una buena opción para la detección

rápida de M. tuberculosis en muestras respiratorias con baciloscopia positiva.

31
ANEXOS:

Casos de tuberculosis
TB-MDR y TB-XDR,
Instituto Nacional de
Salud, Perú, 2000–
2014. (*) Genotype
MTBDRplus solo
para detección de
casos de TB-MDR

Total de pacientes
con diagnóstico de
TB en Perú y número
total de pruebas
Genotype
MTBDRplus
realizadas entre
2011–2015

Total de pacientes con TB con

baciloscopía positiva en Perú y total de
pruebas Genotype MTBDRplus
realizadas a partir de muestras de esputo
en el Instituto Nacional de Salud, Perú,
2011–2015. (*) Datos tomados del año
2014, ya que no se cuenta con
información de 2015.

32
Bibliografía

Microbiología Medica 8va Edición de Patrick R. Murray, Ken S. Rosenthal y

Michael Pfaller (2017), (pag. 170-182)
Detección por GenoType MTBDR sl Prueba de mecanismos complejos de
resistencia a fármacos de segunda línea y etambutol en aislados de complejos de
Mycobacterium tuberculosis resistentes a múltiples fármacos. Florence Brossier ,
Nicolas Veziris , Alexandra Aubry , Vincent Jarlier , Wladimir Sougakoff. 16 de
Marzo del 2014.
file:///D:/por%20eliminar/UTILIDAD_DE_LA_TECNICA_GENOTYPE_MTB
DRPLU.pdf
Prueba de sonda lineal Genotype MTBDrplus para el diagnóstico de tuberculosis
multidrogorresistente en Perú (2016) Recuperado:
https://repositorio.ins.gob.pe/bitstream/handle/INS/906/2016%281-
3%2916-21.pdf?sequence=1&isAllowed=y

Genes del Mycobacterium tuberculosis involucrados en la patogenicidad y

resistencia a antibióticos durante la tuberculosis pulmonar y extrapulmonar (2015)
Recuperado: http://www.scielo.org.co/pdf/muis/v28n1/v28n1a04.pdf
GenoType Mycobacterium CM VER 2.0 Instructions for (2016) Use IFU-299A-
01. Recuperado: https://immunodiagnostic.fi/wp-content/uploads/GenoType-
CM-V2_kit-insert.pdf

33