REVISTA INTERNA DEL DEPARTAMENTO DE

INGENIERÍA QUÍMICA Y BIOQUÍMICA

EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE SUBSTRATO SOBRE LOS

PARÁMETROS CINÉTICOS DE LA ENZIMA INVERTASA.

Cinthia A. Lugo, Leslie V. Santana.

Departamento de Ingeniería Química y Bioquímica; Instituto Tecnológico de Zacatepec.

Recibido 11 de Mayo 2018; Aceptado 12 de Mayo 2018.

RESUMEN

La actividad enzimática está relacionada con muchos factores como el pH, la temperatura y la concentración de
substrato, los cuales modifican sus capacidades como catalizadores alterando la respuesta que tiene ésta ante
estos factores; ya sea inhibiéndola o potenciando su actividad. La velocidad de una reacción es el número de
moléculas de substrato convertidas en producto por unidad de tiempo, ésta aumenta conforme se incrementa la
concentración de substrato hasta que se llega a una velocidad máxima (Vmax), a partir de la cual la velocidad de
la reacción es independiente de la cantidad de substrato; la presencia de los productos finales puede hacer que la
reacción sea más lenta, o incluso invertir su sentido. En el presente trabajo se emplea el uso de la enzima
invertasa, que hidroliza la sacarosa por escisión en sus constituyentes glucosa y fructosa, y se evalúa su actividad
y sus parámetros cinéticos partiendo de la absorbancia que presenta tras un determinado tiempo de reacción.

Palabras clave: Cinética, enzimas, actividad enzimática, concentración.

ABSTRACT

The enzymatic activity is related to many factors such as pH, temperature and substrate concentration, which
alter their capacities as catalysts altering the response to them, either inhibiting or enhancing their activity. The
rate of a reaction is the number of molecules of substrate converted into product per unit of time, this increases
as the substrate concentration increases until a maximum speed (Vmax) is reached, from which the speed of the
Reaction is independent of the amount of substrate, the presence of the final products may cause the reaction to
slow down or even reverse its direction. The present work uses the enzyme invertase, which hydrolyzes sucrose
by excision in its constituents glucose and fructose, and its activity and its kinetic parameters were evaluated
starting from the absorbance that presented after a certain reaction time.

Key words: Kinetics, enzymes, enzymatic activity, concentration.

 1. INTRODUCCIÓN
Las enzimas están en el centro de todos los
procesos bioquímicos. Actuando en secuencias
organizadas catalizan cientos de reacciones
consecutivas en las que se degradan moléculas
de nutrientes, se conserva y transforma la
energía química y se fabrican las
macromoléculas biológicas a partir de
precursores sencillos. Son consideradas
catalizadores biológicos de naturaleza proteica.
Por regla general, todas las reacciones
bioquímicas están mediadas por enzimas. En
una célula ocurren de 2000 a 3000 reacciones
químicas distintas, por lo que teóricamente
podría haber una cantidad similar de enzimas.
Para el uso de la Invertasa en alimentos se
requiere de una proteína altamente purificada, a
fin de no alterar el sabor y preservar la salud de
las personas. La Invertasa es producida por una
gran variedad de organismos que pueden
utilizar la sacarosa como fuente de carbono y
uno de estos organismos son los hongos
filamentosos, como lo es el Aspergillus Níger,
los cuales son inducidos para secretar enzimas
de interés industrial, dentro de ellas. La cinética
de las reacciones químicas es aplicable a las
reacciones catalizadas por las enzimas, en los
seres vivos. La cinética enzimática estudia la
velocidad de las reacciones catalizadas por
enzimas. Estos estudios proporcionan
información directa acerca del mecanismo de la
reacción catalítica y de la especificidad de la
enzima. La velocidad de una reacción
catalizada por una enzima puede medirse con
relativa facilidad, ya que en muchos casos no es
necesario purificar o aislar la enzima. Se evalúa
la influencia de estos factores en la reacción
catalizada por enzimas con la finalidad de
determinar los intermediarios en una reacción y
el papel que juegan en la reacción enzimática,
es decir, para predecir mecanismos de reacción.
La velocidad de reacción es generalmente
sensible a la temperatura. En el caso de las
reacciones biomoleculares, un aumento de 10º
C incrementa su velocidad entre 1,5 y 5 veces.
Esto es, la velocidad de una reacción
enzimática se incrementa al aumentar la
temperatura dentro de un determinado rango,
alcanzando un valor máximo a la denominada
temperatura óptima. A valores superiores la
actividad disminuye debido a que la enzima,
como cualquier otra proteína, sufre procesos de
desnaturalización y, por lo tanto, de
inactivación. La velocidad de reacción de una
reacción química depende, principalmente, de
los siguientes factores:
-La naturaleza de las sustancias que reaccionan
-La concentración de dichas sustancias -La
temperatura
-La acción de catalizadores
Efecto de la concentración del substrato
sobre la catálisis enzimática
La actividad de una enzima se puede estudiar in
vitro, bajo condiciones controladas añadiéndole
una enzima a un substrato. Sí se trabaja con la
condición de que la concentración del substrato
seasaturante,avariandoaentoncesalaaconcentra
ción de enzima, se observa que aumenta el
producto de la reacción, a pH y temperatura
constantes. Si se mantiene la concentración de
laaenzimaaconstanteayavariandoalaaconcentra
ción de substrato se obtiene una curva
hiperbólica.1 Al principio un aumento de la
concentración de substrato produce un aumento
rápido de la velocidad de reacción, pero si se
sigue aumentando la concentración de
substrato, la velocidad de reacción comienza a
disminuir y a muy altas concentraciones de sus-
trato se observa que no cambia la velocidad de
reacción, se dice que los centros activos de la
enzima se encuentran saturados.3 a
La velocidad de reacción que se obtiene a esa
alta concentración de substrato se define como
la velocidad máxima de la reacción enzimática
bajoalasacondicionesaespecificadas.Laaconcen
traciónadeasubstratoa(S), aalaasemivelocidad
máxima de reacción (Vmax/2) se puede
determinar de la figura y representa la constante
de Michaelis o Km, la cual es una característica
para cada enzima. La inversa de Km, o 1/Km,
mide aproximadamente la afinidad de la enzima
por el substrato. Mientras más pequeño sea el
valor de Km, mayor será la afinidad de la
enzima por el substrato. Si varias enzimas
compiten en el metabolismo por el mismo
substrato, substrato éste será transformado
preferentemente por la enzima con mayor
afinidad.2
2. METODOLOGÍA
Curva estándar
Se preparó una solución de glucosa a una
concentración de 25 g/L. En tubos de ensaye,
fueron colocados (0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 y 3)
mL de la solución de glucosa, posteriormente se
adicionó el volumen restante de agua destilada
a cada tubo hasta a completar un volumen total
de 3 mL para cada tubo, cada tubo fue agitado
con ayuda de un vortex para homogeneizar la
mezcla. Una vez listas las muestras se añadió 3
mL de DNS a cada tubo, nuevamente fueron
sometidos a una agitación para después llevar a
baño substrato maría a 80 °C por 5 minutos,
posteriormente se realizó la lectura de la
absorbanciaaaa650anmaconaunaespectrofotó-
metro.
Soluciones de Sacarosa
Se prepararon dos soluciones de sacarosa a
concentraciones de 50 g/L y 200 g/L. En 7
tubos de ensaye, se colocaron (0.0, 0.5, 1.0,
1.5, 2.0, 2.5 y 3) mL de la solución de sacarosa
a 50 g/L enseguida se adicionó el volumen
restante de agua destilada a cada tubo hasta a
completar un volumen total de 3 mL para cada
tubo, cada tubo fue agitado con ayuda de un
vortex para homogeneizar la mezcla y se agregó
3 mL de la enzima y se agitó nuevamente.
Posterior a esto se tuvo que dejar la mezcla
reposar por 5 minutos y pasando exactamente
el tiempo se añadieron 6 ml de DNS a cada tubo
y se volvió a agitar por unos segundos. Después
los tubos se pasaron al baño María que se
encontrabaaaa90y°Cayssevdejaronaaproxima-
damente ahí por unos 5 minutos o hasta notar
cambios. Siguiente a esto las muestras se
analizaron mediante un espectrofotómetro a
650 nm para que nos diera las lecturas
correspondientes. El mismo procedimiento
descrito anteriormente se llevó a cabo para la
solución de sacarosa a 200 g/L.
Figura 1: Concentración de la solución de
glucosa de 25 g/L.
3. RESULTADOS
Losaresultadosadealaaabsorbanciaadealaasolu-
ción de glucosa con una concentración dea25
g/L dadas por el espectrofotómetro se muestran
en la tabla 1. Para realizar la curva de
calibración de la glucosa se tuvo que graficar
las diferentes concentraciones de glucosa de
cada uno de los tubos contra la absorbancias
obtenidas a partir de la lectura con el
espectrofotómetro (Figura 1). De igual manera
se obtuvieron los datos de las absorbancias de
la solución de sacarosa con una concentración
de 50 g/L las cuales se muestran en la tabla 2.
Mientras que en la tabla 3 se encuentran los
datos de absorbancia de la solución de sacarosa
con una concentración de 200g/L recalcando
que los datos tomados del espectrofotómetro no
fueron los idóneos, por lo que no se pudo
observar de manera clara la inhibición que
presentaba la enzima a dicha concentración de
sacarosa. A partir de la curva estándar obtenida
de la glucosa se obtuvieron las concentraciones
de producto producido por la enzima.
Para observar el comportamiento de la enzima 𝑦 = 1.9905𝑥 − 0.053
invertasa en las soluciones de sacarosa de las
𝐶𝑝 = 𝑦 = 1.9905(𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑎𝑑𝑎)
concentraciones de 50g/L y 200g/L se procedió
− 0.053
a realizar la linealización Eadie- Hostie el cual
los datos usados fueron los de la tabla 4. Ejemplo: 𝐶𝑝 = 1.9905 (2.114) − 0.053
𝑔
Tenido en cuenta que Cp se calcula de la 𝐶𝑝 = 4.1554
𝐿
siguiente manera:
Y “r” es el Cp entre el tiempo trascurrido al
agregar la enzima que en este caso fueron 5
minutos. Para mostrar el comportamiento de la
concentración con respecto a la rapidez de la
enzima se graficó Cs contra R (fig.2). Con estos
datos de la tabla 4 se procedió a graficar cabe
mencionar que la concentración 50g/L solo se
tomaron los ultimos seis datos ya que el primer
era erroneo para poder realizar la linerizacion de
dicha concentracion (Fig.3). Mientras que la
concentración de 200g/L se tomaron los últimos
tres datos ya que si se tomaban todos
presentaban una curva inusual (Fig.4). En la
figura 3 se puede observar que la enzima
invertasa trabaja de manera normal degradando
la sacarosa en glucosa y fructuosa ya que la
velocidad de degradación va en aumento así
teniendo que en esas concentraciones no se
inhibe esta enzima mientras que en la figura 4
se puede observar una inhibición ya que va
bajando la velocidad en la que la enzima va
degradando a la sacarosa.
Al tener la linerización se pueden sacar datos 4. DISCUSIONES
de estos los cuales son: Durante el desarrollo de la práctica se
Con inhibición Sin inhibición presentaron algunos factores que provocaron
Km= -39.7 g/L Km= 25.016 g/L que los resultados no fueran totalmente los
Rmax= 0.0727 Rmax= 0.2341 esperados. Uno de estos factores fue que al
g/L*min g/L*min momento de la medición de la absorbancia en
la solución de glucosa, se observaron en las
Al observar que cambian Rmáx se deduce dos primeras muestras, la misma medición,
que es una inhibición no competitiva. asimismo, se presentó cierto grado de error en
las lecturas, ya que el espectrofotómetro
Y se deduce KI por medio de la ecuación:
digital no servía, y por lo tanto se tuvo que
𝐶𝐼 realizar dichas mediciones en el
𝐾𝐼 =
𝑟𝑚á𝑥 espectrofotómetro análogo. También, fue
𝑟𝑚á𝑥A − 1 necesario que se tuviera de diluir estas
133.33 muestras de glucosa, debido a que los colores
𝐾𝐼 = que se presentaron no fueron los esperados,
0.2341
−0.0727 − 1 esto ocasionado a que la solución preparada
de DNS estuvo muy concentrada.
𝐾𝐼 = −31.5941 𝑔/𝐿
5. CONCLUSIÓN
En base a las curvas de calibración realizadas
de la sacarosa (obtención de glucosa y
fructuosa por parte de la adición de la
enzima), en concentraciones de 50g/L y
200g/L respectivamente, se obtuvieron los
valores de Km y rmax; los valores de rmax
presentes en los gráficos tenían una similitud,
pero los valores de Km eran muy distintos uno
de otro, por lo tanto se determinó que la
enzima invertasa presentaba una inhibición
competitiva ante la degradación y obtención
de glucosa. Se observó que al ir aumentando
de concentración de sacarosa, el sustrato
actuaba como inhibidor de la enzima y no
realizaba su función, por lo tanto, se concluye
quedladenzimadinvertasadrealizadladdegra-
daciónddedladsacarosadefectivamentedadbaj
asdconcentraciones. Cabe destacar que las
variaciones en el sistema y en las lecturas
fueron causadas por errores ligados al manejo
de muestras, al material y a los errores
humanos de medición y lectura.
6. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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2. Vazques Contreras, E. (2003). Factores que
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