Ac Grasos

Los ácidos grasos de origen vegetal, animal y microbiano generalmente contienen

números pares de átomos de carbono en cadenas lineales, con un grupo carboxilo
en un extremo y con dobles enlaces de configuración cis (o Z) en posiciones
específicas en relación con esto. En los tejidos animales, los ácidos grasos
comunes varían en la longitud de la cadena de 14 a 22, pero en ocasiones pueden
abarcar el rango de 2 a 36 o incluso más. Los grupos individuales de
microorganismos pueden contener ácidos grasos con 80 o más átomos de
carbono, pero las plantas superiores suelen exhibir una distribución de longitud de
cadena más limitada. Los ácidos grasos de los tejidos animales pueden tener de
uno a seis dobles enlaces cis, como los de las algas, mientras que los de las
plantas superiores rara vez tienen más de tres; los ácidos grasos microbianos solo
ocasionalmente tienen más de uno. Los ácidos grasos oxigenados se sintetizan en
tejidos animales, pero los ácidos grasos con otros grupos funcionales, cuando
están presentes, generalmente se han absorbido de la cadena alimentaria. Las
plantas (especialmente las semillas) y los ácidos grasos microbianos, por otro
lado, pueden contener una amplia variedad de grupos funcionales que incluyen
dobles enlaces trans, enlaces acetilénicos, grupos epoxilo, hidroxilo, ceto y éter y
anillos de ciclopropeno, ciclopropano y ciclopenteno.

A. Ácidos grasos saturados

Los ácidos grasos saturados más abundantes en tejidos animales y vegetales son
compuestos de cadena lineal con 14, 16 y 18 átomos de carbono, pero se han
encontrado en la naturaleza en forma esterificada todos los homólogos pares e
impares posibles con 2 a 36 átomos de carbono. Se nombran sistemáticamente
del hidrocarburo saturado con el mismo número de átomos de carbono, la 'o' final
se cambia a 'oico'. Por lo tanto, el ácido graso con 16 átomos de carbono y
fórmula estructural: CH3(CH2)14COOH. se llama sistemáticamente ácido
hexadecanoico, aunque es más habitual ver el nombre trivial ácido palmítico en la
literatura. También se le puede llamar ácido graso 'C16' o con mayor precisión
como '16: 0', el número antes del punto especifica el número de átomos de
carbono en la cadena recta, y después del punto, el número de dobles enlaces. En
la Tabla 1.1 se da una lista de ácidos grasos saturados comunes junto con sus
nombres triviales y designaciones taquigráficas. Los ácidos grasos saturados más
altos (> C8) son sólidos a temperatura ambiente y son químicamente
comparativamente inertes.
Los ácidos grasos C4 a C12 unidos a los lípidos son, en esencia, solo encontrados
en las grasas lácteas en los tejidos animales, mientras que los compuestos de
cadena media se encuentran en los aceites de las semillas, como los aceites de
coco o de almendra de palma. El ácido palmítico es uno de los ácidos grasos más
abundantes en la naturaleza y se encuentra en los lípidos de todos los
organismos. El ácido esteárico (18: 0) también es relativamente común.

Los ácidos grasos de cadena impar son sintetizados por muchos microorganismos
y se producen, aunque de forma muy limitada, en tejidos animales cuando la ácido
graso sintasa acepta propionil-coenzima A en lugar de acetil-coenzima A como
molécula cebadora o cuando alfa-oxidación de los ácidos grasos se produce.

B. Ácidos grasos monoenoicos

Los ácidos grasos de cadena recta de números pares con 10 a más de 30 átomos
de carbono y que contienen un doble enlace cis se han caracterizado a partir de
fuentes naturales. El doble enlace puede estar en una variedad de posiciones
diferentes, y esto se especifica en la nomenclatura sistemática en relación con el
grupo carboxilo. Por lo tanto, el ácido graso monoenoico más abundante en
organismos superiores es probablemente el ácido cis-9-octadecenoico, también
denominado 'ácido oleico', y tiene la estructura: CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH
En la nomenclatura abreviada, se designa '18: 1 '(o 9-18: 1 o 9c-18: 1). La posición
del doble enlace también se puede denotar en la forma (n-x), donde n es la
longitud de la cadena del ácido graso y x es el número de átomos de carbono del
doble enlace en la región terminal de la molécula, es decir, el ácido oleico es 18: 1
(n-9). Aunque esto contradice la convención de que la posición de los grupos
funcionales debería estar relacionada con el carbono carboxílico, es de gran
utilidad para los bioquímicos lipídicos. Los lípidos animales y vegetales
frecuentemente contienen familias de ácidos grasos insaturados con estructuras
terminales similares pero diferentes longitudes de cadena, que pueden surgir de
un precursor común por elongación de la cadena o por beta-oxidación. La
nomenclatura (n-x) ayuda a señalar tales relaciones. Algunos ejemplos obvios se
pueden ver en la Tabla 1.1.

Varios isómeros posicionales existen en la naturaleza y el ácido cis-6-

octadecenoico (ácido petroselínico o 6c-18: 1)) se encuentra en aceites de
semillas de las Umbelliferae, por ejemplo, mientras que el ácido cis-11-
octadecenoico (o 11c-18: 1 ) es el principal ácido graso insaturado en muchas
especies bacterianas y es un componente omnipresente, aunque menor, de los
lípidos de animales y plantas. Muchos isómeros diferentes pueden existir en una
muestra de lípidos a partir de una única fuente natural.

Los ácidos grasos monoenoicos con dobles enlaces de la configuración trans

también se encuentran en la naturaleza. Por ejemplo, el ácido trans-3-
hexadecenoico siempre está presente como un componente de los lípidos del
cloroplasto de la planta. El ácido trans-11-octadecenoico (vaccénico) se forma
como un subproducto de la biohidrogenación en el rumen, y de allí se abre paso
en los tejidos de los animales rumiantes y, a través de la carne y los productos
lácteos, en los tejidos humanos. Además, los trans-isómeros se forman durante la
hidrogenación industrial de grasas y aceites, como en la fabricación de margarina.
Su idoneidad como componentes de alimentos es controvertida. Los ácidos grasos
cis-monoenoicos con 18 carbonos o menos se funden por debajo de la
temperatura ambiente (los isómeros trans tienen puntos de fusión algo más altos).
Debido a la presencia del doble enlace, son más susceptibles a la oxidación que
los ácidos grasos saturados.

C. ácidos grasos poliinsaturados

Los ácidos grasos poliinsaturados (a menudo abreviados como PUFA) de origen
animal se pueden subdividir en familias según su derivación de precursores
biosintéticos específicos. Cada familia contiene desde dos hasta un máximo de
seis enlaces cis-dobles separados por grupos de metileno individuales
(insaturación interrumpida por metileno) y con la misma estructura terminal. Una
lista de algunos de los más importantes está contenida en la Tabla 1.1.
El ácido linoleico (ácido cis-9, cis-12-octadecadienoico) se encuentra en la
mayoría de los tejidos de animales y plantas. Se designa 18: 2 (n-6) (o 9c, 12c-18:
2), utilizando la misma nomenclatura abreviada que antes (se supone que se
producen dobles enlaces cis interrumpidos por metileno). Es un ácido graso
esencial en las dietas de los animales, ya que no se puede sintetizar en los tejidos
animales, pero es necesario para el crecimiento normal, la reproducción y el
desarrollo saludable. Las enzimas en animales solo pueden insertar nuevos
dobles enlaces entre un doble enlace existente y el grupo carboxilo. El ácido
linoleico, por lo tanto, sirve como el precursor de una familia de ácidos grasos que
se forma por desaturación y alargamiento de cadena, en el que se retiene la
estructura terminal (n-6) (Figura 1.1). De estos, el ácido araquidónico (20: 4 (n-6))
es particularmente importante como un componente de los fosfolípidos de
membrana y como un precursor de las prostaglandinas y otros eicosanoides.
Estos compuestos tienen profundos efectos farmacológicos y son objeto de un
estudio intensivo. El ácido cis-6, cis-9, cis-12-octadecatrienoico (18: 3 (n-6) o
ácido? -linoleico) es un intermedio en la biosíntesis del ácido araquidónico y es un
constituyente de ciertos aceites de semillas.

Las enzimas en los tejidos vegetales son capaces de insertar un doble enlace en
la región terminal de un ácido graso insaturado existente, y el ácido \ alpha -
linolénico (ácido cis - 9, cis - 12, cis - 15 - octadecatrienoico o 18: 3 (n - 3)) es el
punto final de la biosíntesis en la mayoría de las plantas superiores. Cuando se
absorbe en los tejidos animales a través de la dieta, forma el precursor de una
familia adicional de ácidos grasos poliinsaturados con una estructura terminal (n-
3). Estos ácidos grasos también son componentes dietéticos esenciales. Si bien el
requisito para la familia (n-3) en mamíferos es menor que para la serie (n-6), los
ácidos grasos 20: 5 (n-3) y 22: 6 (n-3) tienen funciones especiales en el
fosfolípidos del tejido nervioso y del ojo, y también son precursores de
prostanoides específicos.
Existen otras familias similares de ácidos grasos poliinsaturados en la naturaleza,
y la derivada del ácido oleico tiende a adquirir mayor importancia en los animales
que padecen deficiencia de ácidos grasos esenciales, cuando 20: 3 (n-9) puede
acumularse en los tejidos.

Los ácidos grasos poliinsaturados con más de un grupo metileno entre los dobles
enlaces, como los sistemas cis-5, cis-9 y cis-5, cis-13, ocurren en plantas
coníferas, invertebrados marinos y algunos otros organismos, pero rara vez se
encuentran en animales superiores Algunas especies de plantas sintetizan ácidos
grasos con uno o más enlaces dobles de la configuración trans (por ejemplo, ácido
trans-9, ácido trans-12-octadecenoico), con sistemas de doble enlace conjugados
(por ejemplo, cis-9, trans-11, trans-13- ácido octadecatrienoico o \ beta -
leteoesteárico), o con enlaces acetilénicos (por ejemplo, octadec - cis - 9 - en - 12
- inico o ácido crepenílico). En la actualidad existe un gran interés en los ácidos
grasos dienoicos conjugados ('ácido linoleico conjugado' o 'CLA') por sus
propiedades anticancerígenas y antiaterogénicas. En general, los ácidos grasos
poliinsaturados tienen puntos de fusión bajos, y son más susceptibles al deterioro
oxidativo o la autooxidación.

D. Ácidos grasos de cadena ramificada

Los ácidos grasos de cadena ramificada se encuentran ampliamente en la
naturaleza, pero tienden a estar presentes como componentes menores, excepto
en bacterias, donde parecen reemplazar funcionalmente a los ácidos grasos
insaturados. Usualmente, la rama consiste de un solo grupo metilo, ya sea en el
penúltimo (iso) o antepenúltimo (anteiso) átomos de carbono. Las ramificaciones
de metilo se pueden encontrar en otras posiciones de la cadena (en átomos de
carbono con número par), por ejemplo si se usa metilmalonil-coenzima A en lugar
de malonilcoenzima A para la extensión de la cadena; esto puede ocurrir en
bacterias y en tejidos animales, especialmente en animales rumiantes, donde los
ácidos grasos polimetil-ramificados pueden incluso sintetizarse a niveles bajos.

El ácido fitánico o el ácido 3,7,11,15-tetrametilhexadecanoico, que es un

metabolito de fitol y se puede encontrar en pequeñas cantidades en muchos
tejidos animales, es el ácido graso polimetil-ramificado más común. Es un
componente significativo de los lípidos plasmáticos en el síndrome de Refsum,
una rara condición humana. Los ácidos grasos similares están presentes en los
lípidos de la glándula prefena de las aves.

Las micobacterias y ciertas especies relacionadas contienen una gama muy

distintiva de ácidos grasos \ beta - hidroxi de cadena larga \ beta, conocidos como
ácidos micólicos, es decir, de la forma siguiente: RCH(OH)CH(R')COOH

donde tanto R como R 'son cadenas alifáticas largas. Diferentes especies

sintetizan ácidos micólicos con estructuras bastante características y las
micobacterias, por ejemplo, producen ácidos C60 a C90 con ramificaciones de
C20 a C24; los Nocardiae sintetizan ácidos grasos C38 a C60 con ramificaciones
C10 a C16. También pueden contener grupos carbonilo adicionales,
ramificaciones de metilo, anillos de ciclopropano y dobles enlaces aislados.

E. Ácidos grasos oxigenados y cíclicos

Los ácidos grasos 2-hidroxilados son componentes comunes de los esfingolípidos
y también están presentes en la piel y la cera de lana. Los ácidos grasos 4- y 5-
hidroxi, que forman lactonas en la hidrólisis, y los cetoácidos se encuentran en la
leche de vaca. Una gran cantidad de ácidos grasos hidroperoxi, hidroxi y epoxi
(eicosanoides) se forman enzimáticamente como parte de la "cascada de ácido
araquidónico" y también se deben considerar las prostaglandinas, los leucotrienos
y los lípidos relacionados en este contexto.

Una gran cantidad de ácidos grasos hidroxi se encuentran en los aceites de las
semillas, y el más conocido de ellos es el ácido ricinoleico o 12-hidroxi-cis-9-
octadecenoico, el principal constituyente del aceite de ricino. Los ácidos grasos
polihidroxilados están presentes en las cutinas de plantas. El ácido vernólico o
12,13-epoxi-cis-9-octadecenoico, con una evidente relación biosintética con el
ácido linoleico, es uno de los varios ácidos grasos epoxídicos que se han
detectado en los aceites de semillas.
Se han encontrado ácidos grasos que contienen un anillo furanoide en los tejidos
reproductivos de los peces, especialmente durante la inanición, pero se
desconoce su función. Pueden derivarse de fuentes de plantas (algas) a través de
la dieta, y se sabe que son componentes de algunos aceites de semillas y de látex
de caucho.

Los ácidos grasos con un anillo de ciclopropano en la cadena alifática, como ácido
lactobacílico o 11,12-metileno-octadecanoico, se encuentran en los lípidos de
muchas familias Gram-negativas y algunas familias de bacterias Gram-positivas
del orden Eubacteriales. Los ácidos grasos de ciclopropeno se encuentran en
aceites de semillas de Malvaceae y Bombacaceae, entre otros. Por ejemplo, el
ácido estérico (9,10-metileno-octadec-9-enoico) está presente en cantidades muy
pequeñas en el aceite de semilla de algodón y debe eliminarse durante el refinado.
Los ácidos grasos que contienen un anillo de ciclopenteno se encuentran en los
aceites de semillas de las Flacourtiaceae. Se ha encontrado un ácido graso con un
anillo de ciclohexano en las bacterias del rumen y en los tejidos de los rumiantes.
Algunos de estos grupos sustituyentes son químicamente relativamente
inestables.

1. Los principales lípidos simples y glicerolípidos complejos

de los animales y tejidos vegetales

El consorcio LIPIDMAPS (www.lipidmaps.org) ha presentado una serie de ideas

excelentes para la clasificación de los diversos tipos de lípidos, que en general
apoyamos y tratamos de seguir aquí [198,200]. Sin embargo, en el momento de
redactar este documento, aún deben ser asumidos por organismos internacionales
oficiales como la IUPAC.

A. Triacilgliceroles y compuestos relacionados

Los triacilgliceroles (anteriormente llamados 'triglicéridos') consisten en un resto
glicerol, cada grupo hidroxilo del cual está esterificado a un ácido graso. Casi
todas las grasas y aceites comercialmente importantes de origen animal y vegetal
consisten casi exclusivamente en esta clase simple de lípidos. En la naturaleza,
los triacilgliceroles se sintetizan mediante sistemas enzimáticos, que determinan
que se crea un centro de asimetría alrededor del carbono 2 de la cadena principal
del glicerol, y existen en diferentes formas enantioméricas, es decir, con diferentes
ácidos grasos en cada posición. Se ha recomendado un sistema de "numeración
estereoespecífica" para describir estos formularios [364,365]. En una proyección
de Fischer de un derivado natural de L-glicerol (Figura 1.2), el grupo hidroxilo
secundario se muestra a la izquierda de C-2; el átomo de carbono por encima de
esto se convierte en C-1 y el de abajo se convierte en C-3. El prefijo 'sn' se coloca
antes del nombre raíz del compuesto. Si se omite el prefijo, se desconoce la
estereoquímica o el compuesto es racémico. Este mismo sistema de numeración
se usa para todos los glicerolípidos.

Los diacilgliceroles (anteriormente denominados "diglicéridos") y los

monoacilgliceroles (monoglicéridos) contienen dos moles y una mol de ácidos
grasos por mol de glicerol, respectivamente, y raramente están presentes a
niveles mayores que los niveles en los tejidos de animales y plantas frescos. Los
1,2-diacil-sn-gliceroles, sin embargo, son importantes como intermedios en la
biosíntesis de triacilgliceroles y otros lípidos. Además, son importantes mensajeros
intracelulares, generados en la hidrólisis de fosfatidilinositol y compuestos
relacionados por fosfolipasas específicas.
Los 2-monoacilgliceroles se forman por hidrólisis enzimática de triacilgliceroles
durante la digestión. La migración de acilo se produce rápidamente con di y
monoacilgliceroles, especialmente al calentar o en disolventes alcohólicos o
protonados, por lo que se requieren procedimientos de aislamiento especiales
para retener la estereoquímica.

B. Otros lípidos simples

El colesterol es con mucho el miembro más común de un grupo de esteroles con
un sistema de anillo tetracíclico; tiene un doble enlace en uno de los anillos y un
grupo hidroxilo libre (Figura 1.3). Se encuentra tanto en el estado libre, donde
tiene un papel vital en el mantenimiento de la fluidez de la membrana, y
esterificado, es decir, como ésteres de colesterol, que puede ser una forma de
almacenamiento biológicamente inerte. El colesterol es el esterol principal en los
tejidos animales, pero está presente a niveles traza solo en las plantas, que tienen
diferentes componentes de esteroles (por ejemplo, estigmasterol, sitosterol,
ergosterol, brassicasteroles, etc.), una proporción de los cuales también puede
esterificarse.

Los ésteres de cera consisten en ácidos grasos esterificados a alcoholes de

cadena larga. Los alcoholes son generalmente saturados y monoenoicos
solamente, aunque los ácidos grasos pueden ser más altamente insaturados,
especialmente en ceras marinas. Estos compuestos se encuentran en tejidos
animales, vegetales y microbianos y tienen una variedad de funciones, como
actuar como almacenes de energía e impermeabilización. En algunos tejidos,
como la piel y las glándulas de las alas de las aves o las superficies de las hojas,
los componentes de la cera pueden ser mucho más complicados en cuanto a
estructura y composición. Por ejemplo, las ceras pueden contener dioles alifáticos,
alcoholes libres, hidrocarburos (especialmente escualeno), aldehídos y cetonas.
Extracción de lípidos, almacenamiento y manejo de
muestras

1. Introducción
Antes de que se pueda comenzar el análisis de las muestras de lípidos, es
necesario extraer los lípidos de sus matrices tisulares y liberarlos de cualquier
contaminante no lipídico. Idealmente, esto debe hacerse inmediatamente después
de la extracción del tejido del organismo vivo, pero si esto no es posible, el tejido
debe almacenarse de manera que no se deteriore. Durante la extracción, es
posible introducir contaminantes inadvertidamente o provocar cambios no
deseados en la composición de los lípidos. La autooxidación de dobles enlaces en
ácidos grasos, por ejemplo, es particularmente problemática y se debe tener
cuidado en todos los pasos analíticos para eliminar el problema. Con cuidado, se
pueden evitar muchas otras dificultades. Se debe tener en cuenta que existen
riesgos potenciales para el analista de todas las operaciones que involucran
solventes, ya sea debido a su inflamabilidad o toxicidad. Los procedimientos de
extracción en general se han revisado en otro lugar [123].

2. Algunas consideraciones prácticas

A. Almacenamiento de tejidos y tratamientos preliminares antes de la
extracción
Siempre que sea posible, todos los tejidos deben extraerse inmediatamente
después de su eliminación del organismo vivo, de modo que haya pocas
oportunidades de que se produzcan cambios en los lípidos. Por supuesto, es
esencial que las muestras de plasma o tejido se tomen con el mínimo de estrés o
trauma, de lo contrario la lipólisis ocurrirá in vivo. La discusión de procedimientos
quirúrgicos o de recolección apropiados para tejidos animales está fuera del
alcance de este libro, pero se ha tratado en relación con el plasma en otros
lugares [541]. Sin embargo, como la sensibilidad de los métodos de
espectrometría de masas mejora especialmente, es cada vez más importante
obtener muestras de tejido representativas para su análisis, y esto se discute en el
Capítulo 15. Con plantas y tejidos cardíacos o cerebrales donde las enzimas
tisulares son especialmente activas, la extracción rápida es esencial . Cuando esto
no sea factible, el tejido debe congelarse lo más rápidamente posible, por ejemplo
con hielo seco o nitrógeno líquido, y almacenarse en recipientes de vidrio sellados
a -20 ° C en una atmósfera de nitrógeno. De hecho, se ha recomendado una
temperatura de almacenamiento de tan solo -60 ° C para muestras de plasma de
origen clínico [541]. El proceso de congelación de los tejidos los dañará
irreversiblemente, porque el choque osmótico junto con la formación de cristales
de hielo interrumpe las membranas celulares. Los lípidos tisulares se encuentran
con enzimas de las que normalmente están protegidos. Las enzimas lipolíticas,
que pueden hidrolizar lípidos en una posición prolongada incluso a -20 ° C, son
especialmente problemáticas, y el contacto con solventes orgánicos puede facilitar
el proceso. Por lo tanto, los tejidos deben ser homogeneizados y extraídos con
solvente a la temperatura más baja posible y ciertamente sin permitir que se
descongelen.

La presencia de grandes cantidades de ácidos grasos no esterificados,

diacilgliceroles, ácido fosfatídico o lisofosfolípidos en los extractos de lípidos es
una indicación de que se ha producido algún daño permanente a los tejidos y, por
lo tanto, a los lípidos. Dichos lípidos son potentes tensioactivos e inhibidores de
enzimas, por lo que las altas concentraciones que a veces se informan en la
literatura son claramente incorrectas. En los tejidos vegetales en particular, la
enzima fosfolipasa D se libera y puede atacar a los fosfolípidos, de modo que
existe una acumulación apreciable de ácido fosfatídico y compuestos
relacionados. Por ejemplo, se descubrió que el fosfatidilmetanol se produjo
mediante fosfosipatidilación catalizada por fosfolipasa D durante la extracción de
semillas de soja en desarrollo con cloroformo-metanol [603]. Pueden ocurrir otras
alteraciones a los lípidos que son más sutiles y por lo tanto se disciernen con
menos facilidad. Por ejemplo, las pérdidas de galactolípidos pueden tener lugar sin
una acumulación obvia de productos intermedios parcialmente hidrolizados [616].
Además, las lipoxigenasas pueden causar la formación de artefactos de ácidos
grasos oxigenados, y la autooxidación puede ser problemática (ver la siguiente
sección).

A menudo estos cambios son marginales en su importancia general, ya que las

alteraciones en los principales componentes lipídicos pueden ser pequeñas. Por
otro lado, pueden marcar una diferencia crucial en las concentraciones de algunos
metabolitos lipídicos importantes. Las concentraciones precisas de ácidos grasos
libres y 1,2-diacilglicerol de los tejidos son parámetros metabólicos clave. En un
estudio especialmente exhaustivo, Kramer y Hulan [426] observaron
concentraciones muy bajas de ácidos grasos libres cuando el tejido cardíaco se
congelaba rápidamente y se pulverizaba a temperaturas de hielo seco antes de la
extracción. Los valores obtenidos fueron solo aproximadamente el 15% de
aquellos cuando se extrajeron tejidos similares mediante técnicas más
ampliamente utilizadas, es decir, extrayendo directamente con un homogeneizador
del tipo de cuchilla giratoria a 0ºC. Con este último, se presume que la autolisis
ocurre durante la extracción. Los niveles de diacilgliceroles también fueron tres
veces mayores cuando se utilizó la última técnica. De forma similar, se descubrió
que la lisofosfatidilcolina, que anteriormente se había informado que era un
componente principal de los gránulos de cromafina en la glándula suprarrenal,
estaba ausente cuando los tejidos se congelaron en nitrógeno líquido
inmediatamente después de la disección [33].

Si bien a veces se ha recomendado que los tejidos se almacenen en solución

salina, probablemente sea mejor mantenerlos secos en una atmósfera de
nitrógeno en recipientes de vidrio o en botellas con tapas revestidas de TeflonTM
a las bajas temperaturas discutidas anteriormente. Los antioxidantes tisulares
endógenos generalmente proporcionan suficiente protección contra la oxidación
en estas condiciones, aunque esto puede no ser siempre cierto.

Las bolsas, viales u otros recipientes hechos de materiales plásticos deben

evitarse escrupulosamente para fines de almacenamiento, ya que los plastificantes
se filtrarán y contaminarán los extractos.

B. Minimizar la autooxidación
Si no están protegidos, los ácidos grasos poliinsaturados se autooxidarán muy
rápidamente en el aire y es posible que no se pueda obtener un análisis preciso.
La autooxidación implica el ataque de radicales libres, y se ve agravada por la luz
fuerte y por los iones metálicos. Una vez iniciado, la reacción procede de forma
autocatalítica. El ácido linoleico se autoxide veinte veces más rápido que el ácido
oleico, y cada doble enlace adicional en un ácido graso puede aumentar la tasa de
destrucción de dos a tres veces. La reacción hace que los dobles enlaces migren,
formando sistemas conjugados que absorben fuertemente a longitudes de onda en
la región UV del espectro.

Los antioxidantes de tejidos naturales, como los tocoferoles, brindan cierta

protección a los extractos de lípidos, pero por lo general es aconsejable agregar
más antioxidantes sintéticos, como 2,6-di-tert-butil-p-cresol ('hidroxitolueno
butilado' o BHT). ) a solventes de almacenamiento a un nivel de 50 a 100 mg / L.
Este compuesto no necesita interferir con la detección cromatográfica, aunque sí
absorbe fuertemente en la región UV, ya que es relativamente volátil y puede
eliminarse, a veces inadvertidamente, junto con los solventes cuando se evaporan
en una corriente de nitrógeno. También es bastante no polar y de bajo peso
molecular, por lo que tiende a eluir en el frente del solvente, por delante de la
mayoría de los lípidos, en muchos sistemas de cromatografía líquida. Por el
contrario, debe tenerse en cuenta que cantidades excesivas de antioxidantes a
veces pueden actuar como pro-oxidantes.
Como se advirtió anteriormente, las lipoxigenasas pueden causar la formación de
artefactos de ácidos grasos oxigenados durante el almacenamiento inadecuado de
los tejidos, dando lugar a pérdidas de ácidos grasos insaturados y de lípidos
intactos. Los grupos hidroperóxido de lípidos oxidados pueden reaccionar para
formar enlaces covalentes con las proteínas de las membranas, de las cuales se
liberan solo en el tratamiento con proteasas bacterianas [567].

Siempre que sea posible, los lípidos deben manipularse en una atmósfera de
nitrógeno. Por otro lado, rara vez es necesario llegar a la longitud de la
construcción de una caja de nitrógeno especial para contener todo el equipo
utilizado en el manejo de los lípidos. Por lo general, es suficiente garantizar que
las líneas de nitrógeno estén disponibles libremente, de modo que el aire pueda
eliminarse de los recipientes de vidrio o de los recipientes de reacción.

Cuando es necesario concentrar los extractos de lípidos, los mejores volúmenes

de solventes se eliminan mejor por medio de un evaporador de película giratoria a
una temperatura que, en general, no debe superar los 40 ° C. El matraz que
contiene la muestra no debe ser demasiado grande, de lo contrario el lípido puede
extenderse sobre un área grande de vidrio y así ser más accesible al oxígeno. Al
comienzo de la evaporación, puede ser aconsejable purgar el equipo con
nitrógeno, pero los vapores del solvente eventualmente desplazarán cualquier
aire. Se pueden evaporar pequeños volúmenes de disolvente dirigiendo
cuidadosamente una corriente de nitrógeno sobre la superficie del disolvente. Esto
no debe hacerse con demasiada energía ni a una temperatura demasiado alta, ya
que los derivados de ácidos grasos más volátiles, incluidos los ésteres metílicos
de los ácidos grasos (16: 0 e inferiores), también pueden perderse por
evaporación o por transporte físico como un aerosol.

¡TENGA EN CUENTA!
Como la repetición constante es tediosa, se asumirá en toda la discusión posterior
de la metodología en este libro que se tomarán precauciones en todo momento
para minimizar la autooxidación. Por ejemplo, si las clases de lípidos se aíslan por
cromatografía preparativa, todos los antioxidantes originalmente presentes
probablemente habrán eluido con el volumen vacío, y será necesario agregar más.

C. Almacenamiento de extractos de lípidos

Los extractos de lípidos o lípidos purificados ya no estarán en contacto con las
enzimas, pero aún son susceptibles a la autooxidación. No deben dejarse en
estado seco, sino que deben disolverse en un pequeño volumen de un solvente
relativamente no polar (aprótico), como el isohexano, y almacenarse a -20 ° C en
un recipiente de vidrio (nunca de plástico), desde qué aire se excluye enjuagando
con una corriente de nitrógeno y en presencia de antioxidantes. Las temperaturas
de refrigeración pueden aceptarse a corto plazo. Para el almacenamiento a largo
plazo, los contenedores idealmente deben sellarse al vacío.

D. Contaminantes y artefactos en procedimientos de extracción

La producción de ácidos grasos libres, diacilgliceroles, ácido fosfatídico o
lisofosfolípidos durante el almacenamiento defectuoso de los tejidos antes de la
extracción se discutió anteriormente. Se pueden introducir sustancias extrañas en
extractos de lípidos de innumerables fuentes. Todos los disolventes, incluso de
vez en cuando aquellos grados que son nominalmente de alta pureza, pueden
contener contaminantes, y como pueden usarse grandes volúmenes de disolvente
para obtener pequeñas cantidades de lípidos, cualquiera de tales impurezas
puede ser problemática. Las calidades de solventes de mayor calidad deben
revisarse periódicamente para garantizar que cumplan con los estándares
requeridos, mientras que las de peor calidad se deben volver a destilar antes de
su uso. Esto incluye agua, ya que el crecimiento microbiano en agua de pureza
insuficiente puede introducir contaminantes. De forma similar, los tampones
preparados para su uso en fases móviles y almacenados durante largos períodos
en refrigeradores acumularán gradualmente una población microbiana sustancial.
Los fabricantes añaden deliberadamente algunas sustancias extrañas, por ejemplo
antioxidantes, para minimizar la formación de peróxido en los éteres; estos no
deben causar problemas si se reconoce su presencia.

Otros materiales extraños similares a los lípidos pueden introducirse

accidentalmente en muestras de lípidos de una variedad de fuentes. Los artículos
de plástico de todo tipo (que no sean los fabricados con TeflonTM) pueden ser
especialmente problemáticos y es mejor evitarlos, ya que los plastificantes
(diésteres de ácido ftálico en general) se filtran muy fácilmente con solventes
orgánicos. Tienden a cromatografiarse conjuntamente con lípidos, por lo que
pueden esparcir confusión y oscurecer los compuestos de interés en los
cromatogramas (absorben muy fuertemente en el rango de UV). Son
especialmente molestos en los análisis de GC de los ésteres metílicos de ácidos
grasos. Por el contrario, se ha demostrado que los lípidos pueden disolverse en
algunos plásticos, lo que conduce a pérdidas selectivas de componentes menos
polares [451].

Los fabricantes de productos químicos finos, como todo tipo de seres humanos,
son falibles, y todos los reactivos de laboratorio pueden en ocasiones contener
impurezas que pueden causar problemas en los procedimientos analíticos. Es
necesario ejercer vigilancia para detectar y eliminar estos en una etapa temprana.
Otros contaminantes lipídicos pueden surgir de fuentes tan oscuras como las
huellas dactilares, y de una gran cantidad de materiales de uso cotidiano en
laboratorios, incluidos cosméticos, preparaciones para el cabello, cremas de
manos, jabones, pulimentos, los escapes de las bombas de vacío, lubricantes y
grasas, si son usado descuidadamente.

En condiciones óptimas, los lípidos no deberían cambiar en composición y

estructura durante la extracción o el almacenamiento. Sin embargo, hay algunas
combinaciones de condiciones que pueden dar lugar a alteraciones no deseadas.
Por ejemplo, si algún extracto metanólico o solución de lípidos se deja en contacto
durante largos períodos con pequeñas cantidades de carbonato de sodio o
bicarbonato derivado de tejidos, puede producirse la transesterificación de lípidos
y luego se acumularán ésteres de metilo de los ácidos grasos. Esto se notó por
primera vez en la bilis, y se superó ajustando el pH del medio acuoso a
aproximadamente 4 a 5 [471]. El mismo problema puede surgir si el pH es
demasiado bajo, y la reacción puede incluso ser catalizada enzimáticamente por
transacilasas. De forma similar, la acetona puede causar cierta desfosforilación de
polifosfoinosítidos y puede reaccionar con fosfatidiletanolamina para formar un
derivado de imina. Se descubrió que algunas transposiciones de plasmalógenos
se producían cuando se almacenaban en metanol durante períodos prolongados,
especialmente si se empleaban condiciones ácidas durante la extracción, cuando
los lisofosfolípidos se acumulaban como artefactos (ver [123] para referencias).

La hidrólisis enzimática artefactual de lípidos, catalizada por enzimas tisulares,

puede ser promovida por los solventes utilizados para la extracción. Esto es
especialmente problemático con los tejidos vegetales, en los cuales la actividad de
la fosfolipasa D (tanto hidrolítica como transfosfatidilasa) es estimulada por
algunos solventes. El problema generalmente se elude mediante una extracción
previa con isopropanol, que desactiva la enzima (ver a continuación). También es
posible obtener una acilación enzimática catalizada por enzimas en algunos
lípidos, como glicosildiacilgliceroles, en ciertas circunstancias [302].

E. Los principios de los procedimientos de extracción por solvente

Los lípidos se producen en los tejidos en una variedad de formas físicas. Los
lípidos simples son a menudo parte de grandes agregados en los tejidos de
almacenamiento, de los cuales son relativamente fáciles de extraer. Por otro lado,
los lípidos complejos son generalmente constituyentes de las membranas, donde
se producen en una estrecha asociación con las proteínas y los polisacáridos con
los que interactúan, y no se extraen tan fácilmente. Los lípidos complejos en
general no forman enlaces covalentes con los otros constituyentes de la matriz
tisular, aunque las proteínas que contienen ácidos grasos unidos covalentemente
sí ocurren en la naturaleza. En general, los lípidos se unen a otros componentes
celulares mediante fuerzas débiles hidrófobas o de Van der Waals, mediante
enlaces de hidrógeno y por enlaces iónicos. Por ejemplo, los restos alifáticos
hidrofóbicos de lípidos interactúan con las regiones no polares de aminoácidos,
tales como valina, leucina e isoleucina, de proteínas para formar asociaciones
débiles. Los grupos hidroxilo, carboxilo y amino en las moléculas de lípidos, por
otro lado, pueden interactuar más fuertemente con los biopolímeros a través de
enlaces de hidrógeno. Finalmente, los enlaces más fuertes de todos son los
enlaces iónicos entre los grupos ácido fosfato o sulfato en los lípidos y los iones
metálicos, que a su vez pueden estar unidos de manera similar a las proteínas
celulares o polisacáridos.

Los lípidos puros se disolverán en una variedad de disolventes, dependiendo de

las resistencias relativas de las interacciones entre el disolvente y las regiones
hidrofóbicas o hidrofílicas de las moléculas. Los lípidos de baja polaridad, como
los triacilgliceroles o los ésteres de colesterol, son muy solubles en disolventes
hidrocarbonados como hexano, ciclohexano o tolueno, y en solventes de polaridad
algo mayor, como cloroformo o éteres. Tienden a ser bastante insolubles en
solventes polares tales como alcoholes, y metanol especialmente; la solubilidad
aumenta a medida que disminuyen las longitudes de cadena de las fracciones de
ácido graso en estos lípidos o aumenta la del alcohol disolvente. Los lípidos
insaturados tienden a disolverse en la mayoría de los solventes más fácilmente
que los análogos saturados y de mayor punto de fusión. Por el contrario, los
lípidos complejos polares son escasamente solubles en disolventes de
hidrocarburos, aunque la disolución puede verse favorecida por la presencia de
otros lípidos, pero se disuelven fácilmente en disolventes más polares tales como
cloroformo, metanol y etanol. La acetona es un buen disolvente para los
glucolípidos, pero no para los fosfolípidos, e incluso puede usarse para precipitar
esta última de la solución.

Para extraer los lípidos de los tejidos, es necesario encontrar solventes que no
solo disuelvan los lípidos fácilmente sino que superen las interacciones entre los
lípidos y la matriz tisular. Además, algunos lípidos se pueden atrapar físicamente
dentro de una matriz de tejido; La lisofosfatidilcolina, por ejemplo, está contenida
dentro de macromoléculas de almidón en granos de cereal como un complejo de
inclusión. Las paredes celulares en algunos organismos son menos permeables
que otros a los solventes; el agua luego ayuda a la extracción al causar la
hinchazón de los biopolímeros y es un componente esencial de cualquier
extractante. En algunas circunstancias, puede ser necesario efectuar una
desnaturalización de los otros constituyentes de las paredes celulares por algún
medio antes de que sea posible una extracción exhaustiva de los lípidos.

Otra consideración importante es la posible toxicidad de los disolventes para el

operador y existe una necesidad creciente de encontrar condiciones de extracción
más seguras. Por ejemplo, existe cierto interés en el isopropanol-hexano (3: 2 en
volumen), ya que su toxicidad es relativamente baja [288,584].
Desafortunadamente no extrae gangliósidos cuantitativamente

La mayoría de los analistas de lípidos usan cloroformo-metanol (2: 1 en volumen),

con el agua endógena en el tejido como un componente ternario del sistema, para
extraer los lípidos de los tejidos animales, vegetales y bacterianos. Usualmente, el
tejido se homogeniza en presencia de ambos solventes, pero se pueden obtener
mejores resultados si el tejido se extrae primero con metanol solo antes de que se
agregue el cloroformo a la mezcla. Con muestras difíciles, puede ser necesaria
más de una extracción, y con tejidos liofilizados, puede ser necesario rehidratar
antes de llevar a cabo la extracción. La homogeneización y la extracción se
realizan mejor en equipos en los que el accionamiento de las cuchillas es desde
arriba, de modo que el disolvente no entre en contacto con ningún cojinete
lubricado. La licuadora Ultra-TurraxTM (Janke & Kunkel, Alemania) ahora es
ampliamente favorecida por los analistas de lípidos. Generalmente, no hay
necesidad de calentar el solvente para facilitar la extracción, aunque puede haber
momentos en que esto sea necesario.

La extractabilidad de los tejidos y de los lípidos particulares es variable, y hay

muchos casos en los que se deben utilizar procedimientos alternativos o
modificados. El butanol saturado con agua pareció ser la mezcla de disolventes
más útil para alterar los complejos de inclusión de lípidos en el almidón y dio la
mejor recuperación de lípidos de los cereales [144,518]. Esta combinación de
solventes también se ha recomendado para la recuperación cuantitativa de
lisofosfolípidos y para acilcarnitinas. Las condiciones de extracción ácida pueden
ser necesarias para la recuperación cuantitativa de clases de lípidos particulares,
pero pueden causar la hidrólisis de plasmalógenos. En ocasiones, se recomiendan
mezclas de disolventes que contienen acetonitrilo para ésteres de coA y
acilcarnitinas. También como se discutió anteriormente (Sección B.1), algunos
tejidos vegetales deben preextraerse con isopropanol para minimizar la
degradación artefactual de los lípidos por enzimas tisulares.

Los extractos de lípidos obtenidos de los tejidos de esta manera tienden a

contener cantidades significativas de contaminantes no lípidos, como azúcares,
aminoácidos, urea y sales. Deben eliminarse antes de analizar los lípidos y la
mayoría de los trabajadores utilizan un procedimiento de lavado sencillo ideado
por Folch, Lees y Stanley [214], en el que un extracto de cloroformo-metanol (2: 1
en volumen) se agita y equilibra con un cuarto su volumen de solución salina (es
decir, 0,88% de cloruro de potasio en agua). La mezcla se divide en dos capas,
cuya fase inferior está compuesta de cloroformo-metanol-agua en las proporciones
86: 14: 1 (en volumen) y contiene prácticamente todos los lípidos, mientras que la
fase superior está compuesta por los mismos solventes en las proporciones de
3:48:47 (en volumen), respectivamente, y contienen gran parte de los
contaminantes no lípidos. Es importante que las proporciones de cloroformo,
metanol y agua en las fases combinadas estén lo más cerca posible de 8: 4: 3 (en
volumen), de lo contrario, pueden producirse pérdidas selectivas de lípidos. Si se
necesita un segundo lavado de la fase inferior para eliminar cualquier
contaminante restante, se debe usar una mezcla de composición similar a la de la
fase superior, es decir, solución de metanol y solución salina (1: 1 en volumen).

Cualquier gangliósido en la muestra se dividirá en la capa superior, junto con

cantidades variables de oligoglicesfingolípidos. Sin embargo, pueden recuperarse
de esta capa dializando la mayoría de las impurezas de bajo peso molecular y
luego liofilizando el residuo (Capítulo 6) [394]. Las columnas de extracción en fase
sólida empaquetadas con materiales de fase inversa de tipo octadecilsililo se usan
para la recuperación cuantitativa de gangliósidos [745], prostaglandinas [576] y
fosfolípidos marcados isotópicamente también [208].

En cualquier procedimiento de extracción, es importante registrar el peso del tejido

fresco extraído, junto con el peso del lípido obtenido a partir de él. Para muchos
propósitos, puede ser deseable determinar la cantidad de materia seca o de
proteína en el tejido, de modo que se pueda calcular el peso de los lípidos en
relación con estos parámetros (ver también el Capítulo 16).

Debe enfatizarse que es difícil lograr una recuperación completa de cada clase de
lípidos mediante cualquier método conocido de extracción. Cualquier recuperación
incompleta dará lugar a una medición inexacta del contenido de lípidos en una
muestra o una incoherencia en los resultados de diferentes laboratorios. Para
evitar este problema potencial, se pueden agregar estándares internos para la
cuantificación de una clase de lípidos durante el procedimiento de extracción. Por
lo tanto, los efectos de cualquier recuperación incompleta en el análisis se pueden
minimizar. La recuperación diferencial de especies moleculares individuales de
una clase de interés lipídica en relación con el estándar interno seleccionado es un
efecto secundario menor. Este punto es particularmente importante para el análisis
preciso de especies moleculares de lípidos individuales que emplean un enfoque
lipidómico, como se analizará más adelante.
2. Procedimientos recomendados
A. Método de Folch
Se han ideado muchas modificaciones del procedimiento básico de extracción
[214] para su uso en circunstancias particulares, y el analista debe decidir qué se
requiere de un método. Uno que extrae exhaustivamente todas las clases de
lípidos menores es evidentemente deseable para muchas aplicaciones, pero
puede ser demasiado tedioso y consumir tiempo para el uso rutinario de grandes
cantidades de muestras. Por otro lado, un método que es adecuado para la
extracción cuantitativa de las principales clases de lípidos en grandes cantidades
de muestras de forma rutinaria por personal relativamente inexperto, puede no
proporcionar recuperaciones completas de ciertos componentes traza de
importancia biológica. El procedimiento modificado 'Folch' [735] que sigue se
encuentra en algún lugar entre estos extremos.

El tejido (1 g) se homogeneiza con metanol (10 ml) durante 1 minuto en una

mezcladora, luego se agrega cloroformo (20 ml) y la homogeneización
continúa durante 2 minutos más. La mezcla se filtra, cuando el sólido
restante se vuelve a suspender en cloroformo-metanol (2: 1 en volumen, 30
ml) y se homogeneiza durante 3 minutos. La mezcla se filtra de nuevo y se
vuelve a lavar con disolvente nuevo. Los filtrados combinados se transfieren
a un cilindro de medición, se agrega una cuarta parte del volumen total de
cloruro de potasio al 0,88% en agua, y la mezcla se agita a fondo antes de
dejarse sedimentar. La capa acuosa (superior) se extrae mediante
aspiración, se agrega un cuarto del volumen de la capa inferior de solución
salina de metanol (1: 1 en volumen) y se repite el procedimiento de lavado.
La capa inferior, que contiene el lípido purificado, se filtra antes de eliminar
el disolvente en un evaporador de película giratoria. El lípido se almacena en
un pequeño volumen de cloroformo o hexano a -20 ° C hasta que pueda
analizarse.
 Análisis de clases simples de lípidos
Los extractos lipídicos de tejidos animales comúnmente contienen triacilgliceroles
como la clase de lípidos simples predominante, junto con ésteres de esteroles,
esteroles (por ejemplo, colesterol), glicéridos parciales y ácidos grasos libres
además de lípidos complejos, que se tratan como una sola clase en este capítulo.
Además, se pueden encontrar pequeñas cantidades de hidrocarburos, ésteres de
cera, éteres de glicerol y muchos más, y en ocasiones, algunos de ellos pueden
asumir proporciones mayores. La mayoría de estas clases de lípidos se pueden
separar entre sí mediante cromatografía de adsorción. Se deben tomar
precauciones en todo momento para minimizar los efectos de la autooxidación
(Capítulo 3).

1. Fraccionamiento preliminar de extractos de lípidos

Si bien a menudo es posible analizar muchas clases distintas de lípidos en un
único procedimiento analítico, es importante poder aislar distintas fracciones
sencillas de lípidos, fosfolípidos o glicolípidos para su análisis. Por ejemplo, con
frecuencia es más fácil técnicamente aislar pequeñas cantidades de clases de
lípidos puros después de que se ha llevado a cabo un fraccionamiento preliminar
de este tipo. Ningún procedimiento parece ser satisfactorio en todos los aspectos,
pero algunos métodos útiles están disponibles.

El protocolo más simple a pequeña escala para aislar grupos de clases de lípidos
es el siguiente.

Se prepara una columna corta de gel de sílice (aproximadamente 1 g) en una

pipeta Pasteur descartable de vidrio tapada con algodón lavado con
disolvente. La columna se acondiciona mediante elución con cloroformo (5
ml) y se pueden aplicar aproximadamente 30 mg de lípidos en el volumen
mínimo de cloroformo. La elución con cloroformo o éter dietílico (10 ml)
produce los lípidos simples, la acetona (10 ml) da una fracción de
glicolípidos y el metanol (10 ml) da los fosfolípidos. Se permite que los
solventes fluyan bajo la gravedad.

Las diferentes marcas o lotes de gel de sílice tienden a variar en sus propiedades
y se puede encontrar cierta contaminación cruzada de las fracciones. Por ejemplo,
la fracción de acetona puede contener algunos de los fosfolípidos ácidos,
especialmente ácido fosfatídico y difosfatidilglicerol pero ocasionalmente
fosfatidiletanolamina. Agregar algo de cloroformo a la acetona antes de la elución
puede minimizar esto si se observa que ocurre. De hecho, para muchos
propósitos, puede no ser necesario incluir una etapa de elución con acetona, ya
que muchos tejidos contienen cantidades insignificantes de glucolípidos. Además,
es posible insertar una etapa adicional de elución con formiato de metilo antes del
lavado con acetona para obtener una fracción que contiene la mayoría de las
prostaglandinas (junto con algunos de los glucolípidos) [619].

Ahora puede ser más conveniente usar pequeños cartuchos de extracción en fase
sólida patentados de gel de sílice para estas separaciones grupales a pequeña
escala y se han descrito muchas aplicaciones de este tipo [120]. Estas columnas
siempre deben estar condicionadas por elución con algo del solvente de partida
antes de agregar la muestra. Por ejemplo, las muestras de grasa láctea (100 mg),
altas proporciones de las cuales consisten en triacilgliceroles, se pueden separar
en cartuchos de extracción en fase sólida de gel de sílice (1 g de sorbente); los
lípidos no polares se recuperan mediante elución con hexano-éter dietílico (1: 1 en
volumen, 4 ml), mientras que los lípidos complejos se recuperan mediante elución
primero con metanol (2 ml), y luego con cloroformo-metanol-agua (3: 5 : 2 por
volumen, 2 ml) [35]. Es la proporción de lípidos complejos que rige la cantidad de
muestra que se puede aplicar a tales columnas, y de 2 a 5 mg de fosfolípidos es
probablemente la carga máxima para una columna de este tamaño.

Muchos analistas han tratado de refinar las separaciones que se pueden obtener
con columnas de extracción en fase sólida, pero a menudo esto parece exceder la
capacidad de la tecnología y la reproducibilidad de los resultados es dudosa. Sin
embargo, hay algunas extensiones útiles para el análisis de lípidos complejos, que
se analizan en capítulos posteriores.

2. Cromatografía de capa fina (TLC)

Las clases simples de lípidos se separan fácilmente mediante TLC en una única
dimensión con gel de sílice G como adsorbente. La fase móvil que contiene
hexano, éter dietílico y ácido acético (o fórmico) en diversas proporciones es
adecuada. Por ejemplo, con estos disolventes en la relación 80: 20: 2 (en
volumen), se consigue la separación ilustrada esquemáticamente en la figura 4.2
en la que la mayoría de los lípidos simples comunes se separan, dejando los
fosfolípidos en el origen. Se pueden aplicar tan solo 0.5 g de lípido como una
mancha a una placa de TLC si los componentes separados son detectados por los
procedimientos de carbonización más sensibles. Para fines preparativos, se
pueden aplicar 20 mg de lípidos como una banda en una placa de 20 × 20 cm
recubierta con una capa de 0,5 mm de espesor de gel de sílice.
Debe reconocerse que la isomerización rápida de diacilgliceroles se produce
durante la extracción y en las placas de TLC, y generalmente es aconsejable
combinar las dos bandas (isómeros 1,3 y 1,2) con fines de cuantificación. Se han
desarrollado otros sistemas útiles de CCF de alto rendimiento para la separación
simultánea de lípidos simples y complejos en una sola dirección (Capítulo 5).

Se disuelve cloruro férrico (FeCl3.6H2O, 50 mg) en agua (90 ml) con ácido
acético (5 ml) y ácido sulfúrico (5 ml). La placa de TLC desarrollada se
pulveriza con el reactivo y luego se calienta a 100 ° C durante 2-3 minutos,
cuando la presencia de colesterol y ésteres de colesterol se indica por la
aparición de un color rojo violeta.

Tres tipos básicos de métodos son de uso común para la estimación de lípidos
simples separados por TLC (discutidos en términos generales en el Capítulo 2).
En el primer enfoque, todos los lípidos son carbonizados por agentes oxidantes en
o después de la elución de las placas, y la cantidad de carbono formado se
determina mediante fotodensitometría; en el segundo, se pulveriza un tinte sobre
la placa y los lípidos se determinan por fluorometría; en el tercer enfoque, los
lípidos se detectan y recuperan del absorbente, y se estiman individualmente por
métodos que son apropiados para cada clase de lípidos. Los procedimientos del
primer tipo son rápidos, pero son destructivos para las muestras y algunas veces
son de precisión limitada, los del segundo tipo no son destructivos para la
muestra, pero requieren un instrumento dedicado costoso (como el primer tipo),
mientras que los del tercer tipo consume mucho tiempo, pero es capaz de una
mayor precisión y puede proporcionar más información.
 Preparación de derivados de ácidos grasos

1. Introducción
Con el fin de analizar los componentes de ácidos grasos de los lípidos, es
necesario preparar derivados no polares de diversos tipos, pero generalmente los
ésteres metílicos. Debido a la alta sensibilidad de los procedimientos de análisis
cromatográfico, pequeñas cantidades de lípidos (generalmente menos de 1 mg, y
ciertamente menos de 10 mg) pueden ser todo lo que se requiere, y la mayoría de
los procedimientos descritos a continuación están en esta escala. Se puede usar
cualquier cristalería Pyrex convencional con juntas de vidrio esmerilado para las
reacciones, pero es conveniente usar tubos de ensayo de aproximadamente 15 ml
de capacidad con una junta de vidrio esmerilado estándar y un tapón. Los
condensadores y otros equipos se pueden conectar a estos cuando sea necesario.
Las capas orgánicas y acuosas se pueden separar eficientemente en tales tubos
con la ayuda de pipetas Pasteur, quizás después de una breve centrifugación para
asegurar una separación limpia de las capas. Los solventes se pueden secar
antes de la evaporación, permitiéndoles estar sobre sulfato de sodio anhidro. Se
deben tomar precauciones para evitar la autooxidación de lípidos (Capítulo 3), y es
aconsejable almacenar derivados de ácidos grasos en hexano que contenga 50
ppm de BHT para el análisis cromatográfico de gases (GC). Una monografía sobre
la preparación de derivados está disponible [60].

2. Hidrólisis (saponificación) de lípidos

Los lípidos pueden hidrolizarse calentándolos a reflujo con un exceso de álcali
etanólico acuoso diluido y los ácidos grasos recuperados para un análisis posterior
como en el siguiente procedimiento.

La muestra de lípidos (10 mg) se somete a reflujo con una solución 1M de

hidróxido de potasio en etanol al 95% (2 ml) durante 1 hora;
alternativamente, la reacción a temperatura ambiente durante la noche es
igualmente efectiva con la condición de que el lípido esté completamente
solubilizado. Los lavados con agua se añaden a la capa acuosa, que se
acidifica con ácido clorhídrico 6 M y se extrae con éter dietílico-hexano (1: 1,
v / v; 3 x 5 ml). Los ácidos grasos libres se recuperan después de lavar el
extracto con agua, secarlo sobre sulfato de sodio anhidro y eliminar el
disolvente por evaporación.
La capa no saponificable contendrá hidrocarburos, alcoholes de cadena larga,
esteroles y los residuos desacilados de cualquier éter de glicerol o plasmalógenos
originalmente presentes en la muestra de lípidos en forma libre o esterificada. La
recuperación de hidrolizados solubles en agua está fuera del alcance de este libro.
Los materiales no saponificables se pueden recuperar si se requiere extrayendo el
medio alcalino con hexano-éter dietílico (1: 1, v / v) antes de la acidificación. Como
alternativa, los productos de hidrólisis ácida y neutra se pueden separar mediante
cromatografía de intercambio iónico utilizando extracción en fase sólida con
columnas de amina unida (capítulos 4 y 5). Cuando los ácidos grasos de cadena
corta (C12 o menos) están presentes en los lípidos, es necesario extraer la
solución acidificada de forma mucho más exhaustiva, e incluso entonces puede
ser casi imposible recuperar los ácidos grasos de cadena más corta, como el
butírico. cuantitativamente Los ácidos grasos poliinsaturados no se alteran por las
condiciones suaves descritas anteriormente, pero si el tiempo de reacción se
prolonga indebidamente o si se usa una solución alcalina demasiado fuerte, puede
producirse cierta isomerización de dobles enlaces.

La mayoría de los reactivos hidrolizan muy lentamente el colesterol y los ésteres

de cera, y se necesitan tiempos de reacción más largos. De manera similar, los
derivados de N-acilo de las bases de cadena larga en los esfingolípidos se
saponifican solo lentamente con álcali (ver Capítulo 6).

3. La preparación de metilo y otros ésteres de ácidos grasos

La preparación de derivados de ésteres metílicos de ácidos grasos debe ser, con
mucho, la reacción química más común realizada por los analistas de lípidos, sin
embargo, a menudo es poco conocida; el tema ha sido revisado [122]. No es
necesario hidrolizar los lípidos para obtener los ácidos libres antes de preparar
ésteres, ya que la mayoría de los lípidos se pueden transesterificar directamente,
aunque algunos métodos aprobados insisten en este paso. Ningún reactivo
individual será suficiente, y se debe elegir uno que mejor se adapte a la muestra.
Los ésteres preparados mediante los siguientes métodos pueden purificarse si es
necesario mediante cromatografía de adsorción (Sección C.6). Se debe tener
cuidado en la evaporación de los solventes ya que se pueden perder cantidades
apreciables de ésteres hasta C14 (o incluso C16) mediante un uso excesivo de
nitrógeno para evaporar los solventes. Si se requieren ésteres distintos al metilo,
los métodos que siguen se pueden modificar sustituyendo el alcohol apropiado
(aunque pueden necesitarse tiempos de reacción más largos).

A. esterificación catalizada por ácido y transesterificación

Los ácidos grasos libres se esterifican y los lípidos O-acilo se transesterifican
calentándolos con un gran exceso de metanol anhidro en presencia de un
catalizador ácido (Esquema 1). Si hay agua presente, puede evitar que la reacción
se complete. El reactivo ácido más suave es cloruro de hidrógeno anhidro al 5% (p
/ v) en metanol. Se puede preparar burbujeando gas de cloruro de hidrógeno en
metanol seco, pero un procedimiento más simple es añadir cloruro de acetilo (5
ml) lentamente a metanol seco enfriado (50 ml). El acetato de metilo se forma
como un subproducto, pero no interfiere con la reacción. La muestra de lípidos se
puede calentar en el reactivo a reflujo durante aproximadamente dos horas, o en
un tubo sellado a temperaturas más altas durante un período más corto, o
calentando en un tubo con tapón a 50 ° C durante la noche. El último enfoque
reduce los requisitos de cristalería

El trifluoruro de boro en metanol (12-14%, p / v) se ha usado mucho como

catalizador de transesterificación y en particular como un medio rápido de
esterificar ácidos grasos libres. El reactivo tiene una vida útil limitada, incluso
cuando está refrigerado, y el uso de soluciones viejas o demasiado concentradas
a menudo da como resultado la producción de artefactos y la pérdida de
cantidades apreciables de ácidos grasos poliinsaturados mediante la adición de
metanol a través de los dobles enlaces. En vista de la gran cantidad de catalizador
ácido utilizado en comparación con otros reactivos y las numerosas reacciones
secundarias conocidas, el trifluoruro de boro en metanol está sobrevalorado y es
mejor evitarlo. Sin embargo, si algún reactivo se usa descuidadamente, puede
producirse cierta descomposición de los ácidos grasos poliinsaturados.

Una solución de 1-2% (v / v) de ácido sulfúrico concentrado en metanol

transesterifica los lípidos de la misma manera y a una velocidad similar a la del
cloruro de hidrógeno metanólico. Es fácil de preparar cuando se requiere (la vida
útil es de 2-4 semanas), y es especialmente útil para la esterificación de ácidos
grasos libres. Es posiblemente el agente más conveniente para la esterificación y
la transesterificación. Los lípidos no polares, tales como los ésteres de colesterol o
triacilgliceroles, no son solubles en reactivos compuestos principalmente de
metanol, y no reaccionarán en un tiempo razonable a menos que se añada otro
disolvente, tal como tolueno, a la solución del efecto. El siguiente es un buen
método de propósito general.
La muestra lipídica (hasta 5 mg) se disuelve en tolueno (1 ml) en un tubo de
ensayo equipado con un condensador y se agrega ácido sulfúrico al 1% en
metanol (2 ml), antes de que la mezcla se refluya durante 2 horas (o
alternativamente, la mezcla puede dejarse durante la noche en un tubo
tapado a 50 ° C). Se agrega agua (5 ml) que contiene cloruro de sodio (5%) y
los ésteres requeridos se extraen con hexano (2 x 5 ml), usando pipetas
Pasteur para separar las capas. La capa de hexano se lava con agua (4 ml)
que contiene bicarbonato de potasio (2%) y se seca sobre sulfato de sodio
anhidro. La solución se filtra y el disolvente se elimina a presión reducida en
un evaporador de película giratoria o en una corriente de nitrógeno.

No es necesario otro disolvente que el metanol si los ácidos grasos libres solos
deben metilarse (también se requieren solo 20 minutos a reflujo, o una hora a 50 °
C), o si los lípidos polares solo deben transesterificarse. Los lípidos de N-acilo se
transesterifican muy lentamente (ver a continuación). Los restos alquenilo de
plasmalógenos se convierten en dimetilacetales junto con los ésteres metílicos,
pero estos se distinguen fácilmente en el análisis de GC.

B. Transesterificación catalizada por bases

Los lípidos de O-Acilo se transesterifican rápidamente en metanol anhidro en
presencia de un catalizador básico (Esquema 2).

Los ácidos grasos libres normalmente no están esterificados, y se debe tener

cuidado de excluir el agua del medio de reacción para evitar su formación por
hidrólisis irreversible. Metóxido sódico 0,5M en metanol anhidro, preparado
simplemente disolviendo sodio fresco limpio en metanol seco, es el mejor reactivo,
pero también se han usado metóxido o hidróxido de potasio como catalizadores.
El reactivo es estable durante un mes o más a temperatura ambiente. Los
glicerolípidos se transesterifican completamente en unos pocos minutos a
temperatura ambiente de la siguiente manera.

La muestra de lípidos (hasta 10 mg) se disuelve en tolueno seco (1 ml) en un

tubo de ensayo, se agrega metóxido de sodio 0,5 M en metanol anhidro (2
ml) y la solución se mantiene a 50 ° C durante 10 minutos . Luego se agrega
ácido acético glacial (0,1 ml), seguido de agua (5 ml). Los ésteres requeridos
se extraen en hexano (2 x 5 ml), usando una pipeta Pasteur para separar las
capas. La capa de hexano se seca sobre sulfato de sodio anhidro y se filtra,
antes de eliminar el disolvente a presión reducida en un evaporador de
película giratoria.

Al igual que con los procedimientos de transesterificación catalizados por ácido, es

necesario un disolvente adicional, como tolueno o tetrahidrofurano, para solubilizar
lípidos no polares como triacilgliceroles o ésteres de colesterol. El cloroformo no
debe usarse de esta manera, ya que puede contener etanol como estabilizador y
porque puede generarse diclorocarbono, que puede reaccionar con dobles
enlaces. De nuevo, los ésteres de colesterol se transesterifican muy lentamente y
pueden requerir el doble de tiempo de reacción que el citado. No debe producirse
isomerización de dobles enlaces. En un procedimiento conveniente a escala
micro, se agrega acetato de metilo para suprimir la reacción de hidrólisis
competitiva [109].

Los ácidos grasos unidos a la amida de los esfingolípidos no se ven afectados por
los reactivos de transesterificación alcalina en tales condiciones, y los aldehídos
no se liberan de los plasmalógenos.

Aunque los ácidos grasos libres no están esterificados en las condiciones básicas
descritas anteriormente, los ésteres metílicos pueden prepararse por intercambio
con dimetilacetal de N, N-dimetilformamida en presencia de piridina [695]. Del
mismo modo, el yoduro de metilo reacciona con las sales de sodio o potasio de los
ácidos grasos en presencia de un disolvente aprótico polar como la
dimetilacetamida para formar ésteres metílicos [19]. Los métodos relacionados
han sido revisados en otra parte [122].

C. Diazometano
El diazometano reacciona rápidamente con ácidos grasos libres en presencia de
un poco de metanol, que cataliza la reacción, para formar ésteres metílicos. Sin
embargo, tanto el diazometano como los compuestos intermedios requeridos son
altamente tóxicos y cancerígenos. El trimetilsilil-diazometano [295] es una posible
alternativa, pero puede dar artefactos (probablemente ésteres de trimetilsililo) si
hay metanol insuficiente y hay un tiempo de reacción demasiado corto.