STUDIUL

CROMOZOMILOR
UMANI
 Cromozomul
u Definiţie:
este un corpuscul colorat (“chroma”= culoare, “soma”= corp)
vizibil în timpul diviziunii nucleare.
u Structură:
corpuscul filamentos alcătuit din cromatina nucleară.
u Funcţii:
•  este purtător de informaţie genetică;
asigură continuitatea genetică între generaţii (transportă
informaţia genetică de la părinţi la descendenţi);
•  participă la procesul de recombinare genetică asigurând
variabilitatea genetică.
 Elementele morfologice ale unui
cromozom
Cromozomul metafazic:
- cromatide
- centromer
- telomere
Cromatidele -cele două
subunităţi ale cromozomului,
identice între ele numite cromatide
surori;
- sunt ataşate una de cealaltă la nivelul
centromerului prin intermediul unui complex proteic- coezine;
-fiecare cromatidă are un braţ scurt (p) şi un
braţ lung (q).
 Centromerul
• este punctul de ataşare al cromatidelor surori
una de cealaltă; se găseşte la nivelul
constricţiei primare.
• contine secvente de ADN satelit ce formeaza
un bloc de heterocromatina constitutiva (220
nucleotide) la care se fixeaza proteine
specifice CENP (Centromer Proteins) si CLIP
(Cytoplasmic Linker Proteins) formand in
mitoza KINETOCORUL ;
• are rol in procesul de segregare normala a
cromatidelor / cromozomilor in timpul
diviziunii celulare;

•  adeziunea cromatidelor surori (coezina se asociaza heterocromatinei

centromerice dupa replicarea cromozomilor).
 Telomerele
• Sunt segmente terminale situate la
capetele braţelor cromozomilor;
• Formate din ADN repetitiv (secventa
TTAGGG) si proteine
• Au rolul de la le menţine integritatea si
stabilitatea structurala a cromozomulu;
• Stabilesc arhitecturia tridimensionale a
nucleului;
• Asigura replicarea completa a capetelor
cromozomilor sub actiunea telomerazei.

•  Implicate in
imbatranire si moatre
celulara (apoptoza)-
prin scurtarea
Bucla T

secventei cu fiecare Bucla D

diviziune celulara 5’
3’
 Eucromatina/ Heterocromatina
Eucromatina:
•  Segmentul activ al genomului
•  Secvente unice AND (predomina G-C si proteine nehistonice
•  Se replica precoce (inceputul fazei S)
•  Benzi G (-)
Heterocromatina:
•  Segmente inactive genetic
•  ADN repetitiv (A-T; histone)
•  Foarte compacta, replicare tarzie
•  Benzi G (+)
•  Stabilizeza centromerul si telomerele, rol in desfasurarea meiozei
(formarea bivalentilor)
•  Poate fi:
-constitutiva (constanta in toate celulele,formata din ADN
inalt repetitiv, se gasste in zona centromerica, brat lung Y,
constrictii secundare 1,9,16
-facultativa (difera functie de celula, rol in reglajul genic
prin mecanisme epigenetice)
Eucromatina/ Heterocromatina
 Elemente specifice fiecarui cromozom

Regiuni; benzi si sub-benzi

cromozomiale
Identificarea cromozomilor: criterii
1.marimea; 2.modelul de benzi;
3.pozitia centromerului.
marimea

modelul de
benzi

pozitia
centromerului
Identificarea cromozomilor umani în
funcţie de poziţia centromerului
Grupa A
Include perechile 1-3
Sunt cromozomi de talie mare
Sunt metacentrici 1, 3
Cromozomul 2 este submetacentric
Grupa B
Include perechile 4 si 5
Sunt cromozomi de talie mare
Sunt submetacentrici
Greu de diferentiat intre ei
Pe bratul q al cromozomului 4 se evidentiaza o banda
intens colorata imediat sub centromer
Grupa C
Include perechile 6-12 si X
Sunt cromozomi de talie medie,
submetacentrici
Grupa D
Include perechile 13-15
Sunt cromozomi de talie medie
Perechea 13 este cea mai mare din grupa
Sunt acrocentrici cu sateliti
Grupa E
Include perechile 16-18
Sunt cromozomi de talie medie
Perechea 16 este metacentrica
Perechile 17-18 sunt submetacentrici
Grupa F
Include perechile 19-29
Sunt cromozomi de talie mica
Sunt metacentrici
Grupa G
Include perechile 21, 22 si Y
Sunt cromozomi de talie mica
Cromozomii 21, 21 sunt acrocenrici cu sateliti
Cromozomul Y este acrocentric fara sateliti
CLASIFICAREA CROMOZOMILOR UMANI DUPA
LUNGIME SI POZITIA CENTROMERULUI

LUNGIMEA CROMOZOMULUI

POZITIA mari mijlocii mici

CENTROMERULUI
metacentrici A 1-3 E 16 F 19-20

submetacentrici B 4-5 C 6-12, X

-
E 17,18
acrocentrici - D 13-15 G 21-22, Y
 Studiul cromozomilor

CITOGENETICA CLASICA (CARIOTIPARE SI MARCAJ CROMOSOMIAL)

CITOGENETICA MOLECULARA (FISH; array CGH)

Simboluri folosite în nomenclatura
citogenetică
SIMBOLUL SEMNIFICATIE
p Bratul scurt al cromozomului
q Bratul lung al cromozomului
cen centromer
ter terminal
A - G Grupe cromozomiale
1 - 22 Numarul perechilor de autozomi
umani
X, Y Cromozomii sexului (gonozomi sau
heterozomi)
 Studiul cromozomilor prin
citogenetica clasica
Cromozomii sunt vizualizaţi
microscopic:

a. Prin tehnici speciale de

colorare;

b. In perioada în care
nucleul se divide, dupa ce ADN-
ul a fost deja replicat,
cromozomii fiind formati din 2
cromatide surori (de regulă,
sunt analizaţi în metafaza
mitotică pentru că în acel
moment ating gradul maxim de
condensare).
 Citogenetica Clasica
Efectuarea cariotipului uman

Materiale pentru analiza cromozomiala:

limfocitele sangelui periferic
vilii corionici – pt. Diagnostic prenatal precoce – 10-12 sapt. de
gestatie.
Lichid amniotic – colectat la 14-20 sapt de gestatie
Biopsie cutanata – pentru anomalii cromozomiale care nu sunt
prezente in sange
 Citogenetica Clasica
Efectuarea cariotipului uman

Cultura celulara pentru obtinerea metafazelor

0,5 ml sange in 5 ml mediu de cultura
se adauga fitohemaglutinina (stimuleaza limfocitele sa se divida)
se cultiva 48-72 h
se adauga colcemid (opreste celulele in metafaza)
Prelucrarea culturilor (hipotonizare si fixare)
se adauga solutie hipotona de KCl pentru a baloniza celulele;
se fixeaza cu solutie 3:1 metanol:acid acetic
Etalarea pe lame de microscopice
Marcajul cromosomial/ bandare (G, R, Q etc.)
Cariotipare
 Citogenetica Clasica
Efectuarea cariotipului uman

Cariotipare
Analizarea metafazei etalate

0.5 ml sange venos

periferic

Digestie cu tripsina
+colorare cu Giemsa
+hemaglutinin
+mediu de cultura

Etalare prin
Cultivare la 37°C picurare pe lama
2- 3 zile

+colchicina
+solutie hipotona salina Fixare
 Benzile Q
( se foloseşte un colorant fluorescent, Quinacrina
Utila pentru evidentierea cromozomului Y))
 Benzile C
(se obţin prin denaturare cu hidroxid de bariu şi colorare cu Giemsa;
evidenţiază heterocromatina constitutivă-centromerii)
 Benzile NOR
(evidenţiază organizatorii nucleolari; se tratează preparatele
cromozomiale cu soluţie de nitrat de argint)
 Benzile G
(se obţin prin digestia controlată cu tripsină şi colorare cu
Giemsa)
 Cariotiparea
Definiţie:
aranjarea sistematizată a cromozomilor unei celule
somatice, tinand cont de mărimea, poziţia
centromerului, prezenţa sateliţilor, prezenţa
constricţiilor secundare, modelul de benzi.
Caracteristici:
§ Numărul total de cromozomi este 46
§ Aranjaţi în şapte grupe de cromozomi notate
convenţional de la A la G
§ Autozomii sunt numerotaţi de la 1 la 22 în ordinea
descrescătoare a mărimii
§ Gonozomii sunt aşezaţi separat, la sfârşitul
cariotipului.
Idiograma modelului specific al dispoziţiei
benzilor G în fiecare cromozom
 CARIOTIP
46,XX

A B

D E

F G
Cariotip normal de bărbat: 46,xy
Cariotip normal de femeie: 46,xx
Indicaţii pentru analiza cariotipului
Analiza cromozomilor este utilă în următoarele situaţii:
Prenatal
- Sarcină în cazul unei femei cu o vârstă care depăşeşte 40 de ani;
- Sexul fătului în cazul unor boli genetice legate de cromozomul X.
Neonatal
- Moarte neonatală;
- Malformaţii congenitale;
- Organe genitale ambigue;
- Suspiciune de sindrom cromozomial.
Adolescenţă
- Amenoree primară;
- Retard al creşterii, statură mică.
Adult
- infertilitate, avorturi spontane repetate;
- Dizabilitate intelectuala;
- Anumite tulburări maligne (leucemie);
- Screening în cazul persoanelor care au rude cu tulburări cromozomiale
cunoscute.
 CITOGENETICA MOLECULARA
Hibridizarea in situ - Tehnica FISH (Fluorescence in Situ
Hibridization)- vizualizarea localizarii cromozomiale a unei secvente
specifice de ADN sau ARN;
.
 FISH
(Fluorescence In Situ Hybridization)

ADN tinta DENATURARE

SONDA SONDA locus
centromerica specifica

SONDA SONDA wpc M-FISH

HETERODUPLEX
ADN tinta-SONDA





HIBRIDIZARE

eduard.kocarek@lfmotol.cuni.cz
 FISH
(Fluorescence In Situ Hybridization

SONDA:

Este un fragment de ADN monocatenar, circa 50-300 nucleotide,

complementar unei regiuni din cromozom.

Tipuri de SONDE ( criteriu de clasificare: secventa de ADN):

•  1. Pan-CENTROMERICE sau Pan-TELOMERICE
•  2. CENTROMERICE-specifice unui cromozom (sonde alfoide)
•  3. Specifice unui LOCUS dat ( specifice unei gene)
•  4. Specifice unui CROMOZOM intreg (wpc) sau unui brat
cromozomial (pcp).
 SONDA si tipul de secventa
ADN
SONDA centromerica SONDA specifica unui locus dat

SONDA specifica unui cromozom SONDA telomerica

 Tehnica FISH

 FISH pe cromozomi metafazici

•  secvenţă de ADN clonat (sondă), marcata cu o
molecula fluorescenta (fluorocromi) se
hibridizează pe cromosomii prometafazici sau
metafazici etalaţi pe o lamă microscopică şi
denaturaţi în prealabil (pentru ca ADN lor să
devină monocatenar).
•  Se pot folosi1-3 fluorocromi
•  Permite detectia deletiilor, duplicatiilor,
translocatiilor
•  Limitarea metodei: Necesita efectuarea
prealabila a unui diagnostic clinic riguros: fiind o
tehnica ”tinta” identifica doar anomaliile
“cautate”
 Tehnica FISH

Normal Deletie
 Tehnica FISH

 FISH pe nuclei interfazici

•  Folosita in diagnosticul prenatal
•  Hibridizarea unor sonde (centromerice sau de locus)
specifice anumitor cromozomi (21, 18, 13, X, Y) cu nucleii
interfazici ai amniocitelor
•  Nu necesita cultura celulara
•  Detecteaza aneuploidiile cromozomiale fara a efectua
cariotipul
Tehnica FISH pe nuclei interfazici
Harta nucleara a cromozomilor umani