INSTITUTO POLITÉCNICO

NACIONAL
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Materia: Métodos de Análisis

Práctica: Separación de una mezcla de azul de
metileno y fluoresceína usando cromatografía por
adsorción.

Profesor: González Acuña

Alumno: Ramírez Gutiérrez Edna Yamile
Grupo: 4IM2
Sección: 4
OBJETIVOS
 Separar dos colorantes aplicando una técnica cromatográfica por adsorción.
 Realizar un perfil de elución para poder comprobar la separación.
FUNDAMENTO
Es un método de separación que depende de los equilibrios de adsorción- desorción
de los componentes de la mezcla, entre la fase estacionaria sólida y la fase móvil
líquida o gaseosa. La fuerza con que es adorbido un componente depende de la
polaridad de este, de la actividad del adsorbente y de la polaridad de la fase móvil.
En general cuanto más polar es un compuesto más fácilmente es adsorbido.
RESULTADOS
Tabla 1.
Volumen de A493 A468 Volumen de A493 A468
elución elución
3 0.002 0.000 63 0.057 0.038
6 0.048 0.169 66 0.116 0.012
9 0.279 2.013 69 0.517 0.037
12 0.090 0.892 72 1.089 0.076
15 0.033 0.255 75 1.004 0.023
18 0.036 0.107 78 0.633 0.037
21 0.044 0.084 81 0.382 0.037
24 0.042 0.069 84 0.251 0.025
27 0.036 0.047 87 0.212 0.049
30 0.057 0.054 90 0.117 0.005
33 0.040 0.036 93 0.100 0.004
36 0.047 0.046 96 0.096 0.039
39 0.050 0.053 99 0.105 0.038
42 0.049 0.052 102 0.059 0.033
45 0.026 0.032 105 0.014 0.033
48 0.020 0.042 108 0.020 0.011
51 0.020 0.019 111 0.045 0.013
54 0.036 0.022 114 0.044 0.040
57 0.022 0.025 117 0.064 0.037
60 0.030 0.031 120 0.035 0.033
 Perfil de elución
2.500

2.000
Absorbancia

1.500

1.000

0.500

0.000
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 54 57 60 63 66 69 72 75 78 81 84 87 90 93 96 99102105108111114117120
Volúmen de elución [mL]

A493 A668

PREGUNTAS EXTRAS
1. Especifique y defina los elementos del sistema cromatográfico para
esta separación.
Fase estacionaria: Alúmina ácida (pH 5) actúa como el adsorbente.
Fase móvil: Agua y NaOH (0.1) permite la elución de los solutos a través de la
columna de acuerdo con su afinidad por éstos.
Soporte: Columna, lugar donde se lleva a cabo la separación de los compuestos.
Mezcla: Fluoresceína y azul de metileno, actúan como adsorbato.

2. Defina el término adsorción y empleando fórmulas, esquematice qué

fuerzas intermoleculares participan en el proceso de separación de
solutos.
La adsorción es un fenómeno por el cual átomos, iones o moléculas de gases,
líquidos o sólidos disueltos son atrapados o retenidos en una superficie a través de
interacciones covalentes (adsorción química) o interacciones débiles: puentes de
hidrógeno y fuerzas de Van Der Waals.
Puentes de hidrógeno: La fuerza por puente de hidrógeno o enlace de hidrógeno
es la fuerza eminentemente electrostática atractiva entre un átomo electronegativo
y un átomo de hidrógeno unido covalentemente a otro átomo electronegativo.

Ión- dipolo: los iones de una sustancia pueden interactuar con los polos de las
moléculas covalentes polares.

Dipolo- dipolo: La interacción dipolo-dipolo consiste en la atracción electrostática

entre el extremo positivo de una molécula polar y el negativo de otra.

Dipolo- dipolo inducido: Tienen lugar entre un ión y una molécula apolar. La
proximidad del ión provoca una distorsión en la nube electrónica de la molécula
apolar que convierte (de modo transitorio) en una molécula polarizada. En este
momento se produce una atracción entre el ión y la molécula polarizada.
 3. Considerando las propiedades de solubilidad de los colorantes, indique
qué modificaciones haría para invertir el orden de elución.
Se utilizaría alúmina básica y un regulador ácido, de manera que el compuesto
retenido sería el azul de metileno por su carga positiva, mientras que la fluoresceína
sería el primer compuesto en eluír.
DISCUSIÓN
Para poder llevar a cabo la separación fue necesario cuidar de varios factores, como
mantener la altura de la fase móvil para que de esta manera la presión se mantenga
y la velocidad sea constante, así como cuidar el aforo en los tubos donde se recogía
la muestra. De esta manera se puede construir un perfil de elución más confiable
De acuerdo con el perfil de elución podemos apreciar que la separación de la mezcla
de colorantes se llevo a cabo porque existen fracciones con valores de 0 de
absorbancia entre los dos picos máximos. Esto quiere decir que una vez terminada
la separación de uno de los colorantes, no se obtuvo ninguna señal instrumental
hasta después de cierto volumen, que lo da el otro colorante.
También de acuerdo con el perfil de elución hay dos picos máximos de absorbancia.
El primero corresponde al azul de metileno y se pudo apreciar visualmente mientras
se recogían en los tubos. Este compuesto al presentar una carga positiva no
interactúa con la fase estacionaria por presentar la misma carga de manera que
eluye junto con el agua por la formación de puentes de hidrógeno entre ellos. La
fluoresceína por presentar carga negativa queda retenida en la fase estacionara
hasta que cambiamos la fase móvil, al agregar el hidróxido comienza una
competencia por la fase estacionaria entre la fluoresceína y el hidróxido. Al existir
mayor interacción con el NaOH la fluoresceína sale del sistema, representando el
segundo pico máximo del perfil de elución.
El perfil de elución también nos indica que el azul de metileno muestra señal
instrumental en dos longitudes de onda, una máxima en 468 y una en 493, que si
bien no es grande, existe señal de absorbancia. Mientras la fluoresceína solo
muestra señal a una longitud de 493 nm. Además hay diferencia en lo ancho de las
bandas para ambas muestras. La banda del azul de metileno es más estrecha que
la de la fluoresceína debido a que eluyó con mayor velocidad.
CONCLUSIÓN
  Se llevo a cabo la separación de los dos colorantes por cromatografía de
adsorción.
 Se comprobó la separación debido a las fracciones con valores de
absorbancia iguales a cero.
 El azul de metileno muestra señal instrumental en más de una longitud de
onda.
 El ancho de banda, es decir la resolución, depende de la velocidad de
elución.
BIBLIOGRAFÍA
 Skoog, D. A., Holler, J. H., Nieman, T. A. “Principios de Análisis Instrumental”,
5a Edición. McGraw Hill. Madrid, España. 2001. (p.p 662-663).
 Harris, D. (1992) Análisis químico cuantitativo. España: Reverte (p. 105-107).