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S.E.P.

TECNOLÓGICO NACIONAL DE MEXICO

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE TUXTEPEC

CARRERA:
INGENIERIA BIOQUÍMICA

MATERIA
ING. DE BIORREACTORES

NOMBRE DE LA PRÁCTICA:

OBTENCIÓN DE ÁCIDO CÍTRICO POR MEDIO DE


ASPERGILLUS

ALUMNOS
Alonso Vásquez Carolina
Alta Moreno Carolina
Aragón Gutiérrez Fernando
Domínguez Rojas Karla L.
Terrones Juárez Luis Ángel
Rascón Rodríguez Ismeraí

DOCENTE
M.C. Martha Patricia Valencia Pérez
INTRODUCCIÓN:

La producción de ácido cítrico por fermentación a escala comercial. Ha constituido


un gran progreso dentro del campo de la microbiología industrial. El ácidocítrico se
encuentra como constituyente natural de los frutos cítricos. El ácido cítrico
obtenido de limones, piña, peras, etc., se denomina natural en contraste con el
ácidocítrico obtenido por fermentación. Wehner en 1893 fue el primero en
descubrir elácidocítrico como un producto de la fermentación por hongos. Los
mohos descritos inicialmente como Citromyces Pfefferianus y C. glaber son
hongos que producen ácidocítrico: posteriormente han sido identificados como
Penicillium sp. Lo mismo que otros numerosos deuteromicetos, como, por
ejemplo, Penicillium Luteum, Paccilomyces divaricatum y Mucor pyriformis, forman
ácido cítrico a partir de azúcar, aunque no alcanzaron importancia industrial
alguna. En 1917, Currie encontró que una variedad de A. niger producida ácido
cítrico, y en 1934. Doelger-Prescott corroboraron estos resultados contribuyendo
con sus aportaciones al conocimiento de esta fermentación. La sacarosa es la
sustancia clave para la obtención del ácido cítrico. Se cree que existen diversas
rutas metabólicas para la formación de ácido cítrico a partir de las hexosas.
Resultados experimentales han demostrado que Aspergillus niger acumula el
ácido cítrico en forma de Piruvico, que luego se descarboxila y uniéndose a la
coenzima A en presencia de la coenzima difosfopiridina nucleótido (DPN) da
acetil-coenzima A. el ácido oxalacetico como el acetil-coenzima A origina
fácilmente ácido cítrico. El rendimiento depende mucho del contenido de
oligoelementos. Cuando los metales pesados y en especial los iones de
manganeso y hierro, así como los de molibdeno y cobre no se encuentran en
condiciones óptimas, se perjudica la síntesis del ácido cítrico. El ácido cítrico es el
acidulante más empleado en la industria alimentaria para la fabricación de bebidas
refrescantes, caramelos, mermeladas y gelatinas. También se usa en polvos
efervescentes y en la industria farmacéutica.

OBJETIVO GENERAL:
Aislar y seleccionar microorganismos productores de ácido cítrico, además,
identificar el producto obtenido por el método apropiado.
AISLAMIENTO DEL A. NIGER:

PROCEDIMIENTO:

1. Preparar una muestra proveniente del suelo o bien de una fruta o verdura
con signos de podredumbre negra o tizón. La cual es una alteración
causada por el A. niger, en base al procedimiento 3.1 (“técnica de dilución
de muestra”)
2. Preparar los siguientes medios de cultivo: medios para el aislamiento de
sepas de A. niger:

MEDIO DE MARTIN:
Glucosa 10gr/l
Peptona 5gr/l
Agar 20gr/l
KH2PO4 1.0gr/l
MgSO47H2O 0.5gr/l
Rosa de véngala 3 mg/l
Sulfato de Dihidroestreptomicina 30 mg/l

El medio deberá tener un pH de 6.9-7.2


La estreptomicina se adiciona en condiciones asépticas al medio.

MEDIO DE FOSTER:
Glucosa 50gr/l
Peptona 5gr/l
Agar 20gr/l
MgSO47H2O 0.5gr/l
KH2PO4 1.0gr/l
Indicador 5.7ml por 100ml de medio.
El medio deberá tener un pH de 6.9-7.2

- Preparación del indicador: 1 gr de verde de bromocresol se disuelve en


14ml de NaOH 1N y se afora a 250ml con agua destilada. Dando un color
inicial azul al medio de cultivo.

3. Esterilizar ambos medios de cultivo a 121ºC (15Lb) durante 15min.


4. Inocular 2 placas con medio Martin y 2 con medio de Foster, cada una con
1ml de la dilución seleccionada (se recomienda que se encuentre en el
rango 10-2 -10-3).
5. Incubar las placas a 28 ± 1ºC durante 3-5 días.
6. Transcurrido este tiempo, buscar colonias que se encuentren rodeadas de
un halo de color amarillo alrededor de ellas lo cual nos indica que los
microorganismos de dicha colonia son productores de ácidosorgánicos.
7. Para tener la certeza de que el microorganismo aislado es A. niger, realizar
un micro cultivo (procedimiento 9.3) a partir de una colonia con un halo
amarillo, verificando su morfología y su forma de reproducción.
8. Inocular la sepa de A. niger en los tubos de agar dextrosa Sabouraud
acidificado a pH 3.8.
9. Incubar el cultivo a 28ºC durante 3-5 días.
10. Después de este lapso, Re suspender las esporas en 5ml de solución
estéril Twenn 20 en agua destilada.
11. La sepa de A. niger puede ser conservada en agar dextrosa Sabouraud.

CINETICA DE PRODUCCION DE ACIDO CITRICO


PROCEDIMIENTO
1. Preparar 5 matraces Erlenmeyer con 250ml del medio de cultivo para la
producción de ácidocítrico.
1.1 el medio se prepara en base a la siguiente composición:

MEDIO PARA LA PRODUCCION DE ACIDO CITRICO


Sacarosa 14.00gr/l
MgSO47H2O 0.25gr/l
SUSO45H2O O.50 gr/l
KH2PO4 2.50gr/l
NH4NO3 2.50 gr/l
FESO47H2O 0.10 gr/l

El medio deberá tener un pH de 3.8.

1.2 esterilizar el medio de cultivo a 121ºC (Lb) durante 15min.


2. Inocular los matraces con 2ml de una suspensión de esporas.
3. Incubarlos en agitación a 28ºC y tomar muestras a las 48, 72, 96, 120 y 144
horas o cada 12 horas durante 5 días.
4. Separar el micelio por filtración y en el filtrado determinar los siguientes
parámetros.

MONITOREO DEL PH
PROCEDIMIENTO

A cada nuestra tomada se le determinará el pH (de la manera señalada en el


anexo 3 determinación del pH) con ayuda de un potenciómetro o pHmetro el cual
será calibrado con una solución búfer de pH 4.01.

DETERMINACION DE AZUCARES TOTALES (método de fenol sulfúrico)


PROCEDIMIENTO
1. Tomar alícuotas de 0.1 a 2.0 ml de solución filtrada.
2. Adicionar 0.1ml de fenol al 80% y 5ml de ácidosulfúrico lentamente.
3. Agitar vigorosamente y dejar reposar durante 30min.
4. Leer en el fotocolorímetro Klett Summerson equipado con filtro azul a
490nm. En caso de no contar con este, leer en un espectrofotómetro a la
misma longitud de onda llevando el aparato a cero con un blanco de
reactivos (testigo).
5. Interpolar los resultados en una curva de calibración de glucosa o sacarosa
linealizada.
6. Elaborar una curva de calibración.
6.1 preparar 5ml de una solución patrón de glucosa o sacarosa (con
concentración de 100mg/ml).
6.2 Proseguir de la manera indicada en la tabla siguiente:
TUBO No. SOLUCION H2ODESTILADA FENOL AL H2SO4 (ml)
PATRON (ml) (ml) 80% (ml)
1 0.1 1.9 0.1 5.0
2 0.2 1.8 0.1 5.0
3 0.4 1.6 0.1 5.0
4 0.6 1.4 0.1 5.0
5 0.8 1.2 0.1 5.0
6 1.0 1.0 0.1 5.0
TESTIGO 0.0 2.0 0.1 5.0

6.3 Al final de la adición de los reactivos agitar vigorosamente.


6.4 Dejar los tubos reposar durante 30min.
6.5 Leer los tubos de manera indicada en el punto 4.

DETERMINACION DE NITROGENO TOTAL (METODO DE NESSLER)


PROCEDIMIENTO

1. Tomar 2 ml de solución filtrada y adicionar 5ml del reactivode Nessler.


2. Leer inmediatamente a 200nm en el fotocolorímetro Klett Summerson
equipado con filtro azul. En caso de no contar con este leer en un
espectrofotómetro a la misma longitud de onda llevando el aparato a cero
con un blanco del reactivo (testigo).
3. Interpolar los resultados en una curva de calibración de (NH4)2 SO4
linealizada.
4. Elaborar una curva de calibración.
4.1 Preparar 5ml de una solución patrón de sulfato de amonio (NH4)2 SO4 (con
concentración de 100mg/ml).
4.2 Proseguir de la manera indicada en la siguiente tabla:

TUBO No. SOLUCION DE H2O (ml) REACTIVO DE


(NH4)2 SO4 (ml) NESSLER (ml)
1 0.2 1.8 5.0
2 0.4 1.6 5.0
3 0.6 1.4 5.0
4 0.8 1.2 5.0
5 1.0 1.0 5.0
TESTIGO 0.0 2.0 5.0

4.3 Leer os tubos de la manera indicada en el punto 2.


DETERMINACION DE ACIDO CITRICO (METODO DE SAFRAN-DENSTED)
PROCEDIMIENTO

1. En un tubo de ensayo se coloca la solución de ácidocítrico con una


concentración de 400mg/ml, llevar a 1 ml con agua destilada.
2. Adicionar 8ml de anhídridoacético y colocar en un baño de agua a 60ºC
durante 10min. En estas condiciones se desarrolla un color amarillo.
3. Leer en un fotocolorímetro Klett Summerson equipado con filtro azul, a una
longitud de onda de 400 a 420nm. En caso de no contar con este, leer en
un espectrofotómetro a la misma longitud de onda llevando el aparato a
cero con un blanco del reactivo (testigo).
4. Preparar una curva de calibración de ácidocítrico siguiendo las indicaciones
de la siguiente tabla.

TUBO No. SOLUCION AGUA ANHIDRIDO PIRIDINA (ml)


DE ACIDO DESTILADA ACETICO (ml)
CITRICO (ml) (ml)
1 0.1 0.9 8.0 1.0
2 0.2 0.8 8.0 1.0
3 0.4 0.6 8.0 1.0
4 0.6 0.4 8.0 1.0
5 0.8 0.2 8.0 1.0
6 1.0 0.0 8.0 1.0
TESTIGO 0.0 0.1 8.0 1.0

DETERMINACION DE ACIDO CITRICO (POR CROMATOGRAFIA EN PAPEL)


PROCEDIMIENTO

1. Se apartan 4ml de la solución filtrada y adicionar 1 ml de alcohol


isopropílico y 5ml de agua destilada.
2. Preparar una solución patrón de ácidocítrico. Pesar 30mg del ácido y
disolver en 10ml de alcohol isopropílico al 10%.
3. Recortar una tira de papel Whatmen No. 1 de 20cm por lado
aproximadamente, y se marca con un lápiz una línea de aplicación de
muestras a 2 cm de uno de los extremos del papel (tener la precaución de
utilizar guantes para no tocar el papel con las manos).
4. Dividir la línea anterior en dos partes (con 5cm de distancia entre cada
una).
5. Activar el papel colocándolo en una estufa a 80ºC durante 15min.
6. Aplicar 3 microlitros de la solución patrón de ácidocítrico en un punto
marcado. En otra marca se aplican 5 microlitros de la muestra tomada para
examinar.
7. Secar las gotas con aire caliente (secadora) y colocar el papel dentro de la
cámara de desarrollo. Al principio el papel deberá dejarse suspendido por
encima del líquido de desarrollo (que debe ocupar una altura de 1 cm
dentro de la cámara).
8. Se tapa el frasco durante 5-8 minutos, para que el papel se equilibre con el
vapor del solvente de desarrollo (formiato de n-butilo-acido fórmico-agua en
una concentración de 10:5:1 respectivamente); en seguida se baja el papel
de tal manera que el extremo inferior penetre 0.5cm en el solvente y se deja
desarrollar durante 3-4 horas.
9. Entonces se saca el cromatograma y se mide la altura alcanzada por el
solvente.
10. Se deja secar durante 30min. A 100ºC o secar con ayuda de una secadora.
11. Revelar el cromatograma agregando el reactivo revelador (el cual consta de
0.05gr de formiato de sodio y 0.02gr de azul de bromofenol por cada 100ml
de solvente de desarrollo) con ayuda de un atomizador.
12. Se deja secar durante 30 minutos a 80ºC y secar totalmente con una
secadora.
13. El ácido orgánico aparecerá amarillo sobre un fondo azul.
14. Se debe medir el Rf que presento cada acido patrón, y observar las
separaciones obtenidas en la solución patrón y en la muestra filtrada. El Rf
se medirá en base a la siguiente formula:
𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎𝑝𝑜𝑟𝑙𝑎𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
Rf=
𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎𝑝𝑜𝑟𝑒𝑙𝑠𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡𝑒

15. Comparar el corrimiento de la solución patrón y de la muestra, para


determinar si existe ácido cítrico presente.
RESULTADOS:

1-. BIOMASA DIA LUNES

TIEMPO BIOMASA(PESO)
1 0.003
2 0.01
3 0.008
4 0.007
5 0.009
6 0.017
7 0.026
8 0.026
9 0.046
10 0.018
11 0.021

BIOMASA LUNES
0.05
0.045
0.04
0.035
BIOMASA (PESO

0.03
0.025
0.02
0.015
0.01
0.005
0
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO( HRS)
TIEMPO BIOMASA
(PESO)
1 0.032
2 0.036
3 0.043
4 0.04
5 0.043
6 0.037
7 0.042
8 0.035

BIOMASA
0.05
0.045
0.04
0.035
BIOMASA(PESO)

0.03
0.025
0.02
0.015
0.01
0.005
0
0 2 4 6 8 10 12 14
TIEMPO(HRS
DIA MIERCOLES BIOMASA
NUMERO BIOMASA
(PESO)
1 0.01
2 0.017
3 0.01
4 0.026
5 0.013
6 0.009
7 0.015
8 0.01
9 0.011

BIOMASA MIERCOLES
0.03

0.025

0.02

0.015

0.01

0.005

0
0 2 4 6 8 10
BIOMASA DIA JUEVES

NUMERO BIOMASA
(PESO)
1 0.047
2 0.058
3 0.055
4 0.014
5 0.059
6 0.057
7 0.062
8 0.065

BIOMASA JUEVES
1.82

1.81

1.8

1.79

1.78

1.77

1.76

1.75
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Podemos observar que hubo variaciones ya que el día lunes estaba en la etapa de adaptación y no
hubo mucha producción de la biomasa observando que los siguientes días presentamos una
estabilización de las gráficas también interfiriendo la homogenización del medio como factor
principal a estas inestabilidades de las ultimas lecturas.

2.-TURBIDEZ DIA LUNES


TIEMPO TURBIDEZ
1 0.67
2 1.272
3 1.015
4 0.435
5 0.6
6 0.92
7 1.56
8 0.964
9 1.894
10 1.45
11 1.36

TURBIDEZ LUNES
2
1.8
1.6
1.4
ABSORBANCIA

1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO (HRS)
TURBIDEZ DIA MARTES
TIEMPO TURBIDEZ
1 1.576
2 1.6
3 1.868
4 1.685
5 1.912
6 1.616
7 1.63
8 1.878
9 1.628
10 1.722
11 1.69
12 1.72
TURBIDEZ MARTES
2.5

2
ABSORBANCIA

1.5

0.5

0
0 2 4 6 8 10 12 14
TIEMPO(HRS)

TURBIDEZ DIA MIERCOLES

TURBIDEZ
NUMERO MIÉRCOLES
1 0,629
2 1,064
3 0,73
4 1,295
5 1,218
6 0,919
7 0,912
8 0,938
9 1,018
TURBIDEZ MIERCOLES
1.4

1.2

0.8

0.6

0.4

0.2

0
0 2 4 6 8 10

TURBIDEZ DIA JUEVES

NUMERO TURBIDEZ JUEVES


1 1,228
2 1,466
3 1,794
4 1,557
5 1,534
6 1,732
7 1,989
8 1,924

TURBIDEZ JUEVES
2.5

2
La turbidez observamos que igual el día lunes se presentó una variación con respecto a los
siguientes días pudiendo intervenir su adaptación, pero tomando en cuenta esto vemos que en las
demás graficas se presenta una estabilidad de la turbidez teniendo una variación la cual pueden
ser la homogenización al tomar la muestra o la lectura.

3.-PH DIA LUNES


TIEMPO PH
1 2.89
2 3.2
3 3.03
4 2.83
5 3.18
6 2.94
7 3.13
8 2.96
9 3.09
10 3.04
11 3.19
PH LUNES
3.25
3.2
3.15
3.1
3.05
PH

3
2.95
2.9
2.85
2.8
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO(HRS)

DIA PH MARTES
TIEMPO PH
1 2.97
2 3.26
3 3.05
4 3.18
5 3.1
6 3.13
7 3.04
8 2.97
9 3.63
10 3.43
11 3.34
12 3.4

PH martes
4
3.5
3
2.5
PH

2
1.5
1
0.5
0
0 2 4 6 8 10 12 14
TIEMPO(HRS)

pH miércoles

PH
NUMERO MIERCOLES
1 3,9
2 4
3 4,29
4 3,59
5 3,74
6 3,25
7 3,99
8 4,11
9 3,77

PH MIERCOLES
5
4.5
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
0 2 4 6 8 10

pH jueves

PH
NUMERO JUEVES
1 3,69
2 3,89
3 3,13
4 4,39
5 3,89
6 4,46
7 3,77
8 3,95

PH JUEVES
5
4.5
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

En el pH se mantuvo ya que queríamos obtener el ácido cítrico el


medio estaba en un rango de entre 3 y 5 de pH observando que se
encontraba entre los rangos del ácido cítrico dándonos cuenta que
obtuvimos lo deseado

4.-AZUCARES TOTALES.
TIEMPO ABSORBANCIA
1 2.421
2 2.33
3 2.682
4 2.349
5 2.824
6 2.966
7 2.736
8 2.932
9 2.963
10 2.95
11 2.867

Azucares totales lunes


3.5

2.5
ABSORBANCIA

1.5

0.5

0
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO(HRS)

AZUCARES TOTALES DIA MARTES


TIEMPO ABSORBANCIA
1 2.888
2 1.796
3 1.884
4 2.05
5 1.492
6 1.85
7 1.95
8 1.8
9 1.888
10 1.505
11 2.453
12 1.878

Azucares Totales martes


3.5

2.5
ABSORBANCIA

1.5

0.5

0
0 2 4 6 8 10 12 14
TIEMPO (HRS)

Azucares totales miércoles


AZUCARES
TOTALES
NUMERO MIECOLES
1 2,11
2 2,971
3 2,958
4 2,409
5 2,938
6 2,552
7 2,007
8 0,421
9 0,508

AZUCARES TOTALES MIERCOLES


3.5

2.5

1.5

0.5

0
0 2 4 6 8 10

Azucares totales jueves


AZUCARES
NUMERO TOTALES JUEVES
1 0,395
2 0,498
3 0,45
4 0,35
5 0,46
6 0,45
7 0,448
8 0,507

AZUCARES TOTALES JUEVES


0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Podemos ver que el microorganismo mantuvo su alimentación de los


azucares suministrados para su crecimiento y producción del acido
manteniéndose en su constante producción en los días esperados.

5.-ACIDO CITRICO DIA LUNES


TIEMPO ABSORBANCIA
1 0.224
2 0.163
3 0.187
4 0.184
5 0.186
6 0.171
7 0.158
8 0.158
9 0.155
10 0.154
11 0.161

Acido Citrico LUNES


0.25

0.2
ABSORBANCIA

0.15

0.1

0.05

0
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO(HRS)

ACIDO CITRICO DIA MARTES


TIEMPO ABSORBANCIA
1 0.123
2 0.176
3 0.183
4 0.165
5 0.233
6 0.221
7 0.194
8 0.181

ACIDO CITRICO MARTES


0.25

0.2
ABSORBANCIA

0.15

0.1

0.05

0
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO (HRS)

Ácido cítrico miércoles


ÁCIDO CÍTRICO
NUMERO MIÉRCOLES
1 0,215
2 0,231
3 0,272
4 0,233
5 0,222
6 0,195
7 0,161
8 0,275
9 0,207

ACIDO CITRICO MIERCOLES


0.3

0.25

0.2

0.15

0.1

0.05

0
0 2 4 6 8 10

ACIDO CÍTRICO JUEVES


ÁCIDO CÍTRICO
NUMERO JUEVES
1 0,265
2 0,286
3 0,256
4 0,242
5 0,255
6 0,261
7 0,35
8 0,259

ACIDO CITRICO JUEVES


0.4

0.35

0.3

0.25

0.2

0.15

0.1

0.05

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Al observar las gráficas encontramos que el ácido cítrico si se logró


obtener mediante el aspergillus niger teniendo en cuenta los datos
anteriores de pH y las observancias que se tuvieron fueron constantes
para determinar el ácido cítrico.
6.-NITROGENO TOTAL.

TIEMPO ABSORBANCIA
1 0.294
5 2.33
11 1.454

nitrogeno total
2.5

2
ABSORBANCIA

1.5

0.5

0
0 2 4 6 8 10 12
TEMPERATURA (HRS)

Aquí podemos observar que la producción de nitrógeno en el medio


fue favorable ya que obtuvimos una elevación en la gráfica
presentada.
CONCLUSION

En los datos y graficas antes vistos nos podemos dar cuenta que, si se obtuvo el
ácido cítrico ya que el medio que utilizamos y el tipo de sustrato que se utilizo fue
favorable para el aspergillus niger,así como la temperatura como también la
agitación y la oxigenación llegandoasí al resultado esperado.

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