Partea întâi

INTRODUCERE

Toate organismele, de la cele mai simple la cele mai complexe sunt alcătuite din celule. Unele
organisme precum bacteriile sau amoeba sunt alcătuite dintr-o singură celulă. Un organism complex
precum cel al unui om adult este alcătuit din mai mult de 1014 celule. Forma, structura, funcţia tuturor
organismelor, reprezintă suma proprietăţilor totale ale celulei sau celulelor din care sunt ele alcătuite.
De aceea, studiul celulei este indispensabil pentru a înţelege viaţa în toate formele sale.
Începuturile biologiei celulare merg cu aproximativ 300 ani în urmă. Inventarea microscopului
optic a permis observarea de către Robert Hooke (1665), care analizând o secţiune prin plută, a unor
cavităţi dispuse ca într-un fagure de miere, le-a dat numele de celule (cella, în latină, înseamnă cameră
mică); erau de fapt pereţii de celuloză ai fostelor celule vegetale. Câţiva ani mai târziu, olandezul
Anton van Leeuwenhoek (1683) descoperă fascinanta lume a celulelor vii, protozoarele din apă,
globulele roşii din sângele vertebratelor, bacteriile.
H. Grew (sec. XVII) menţionează pentru prima dată structura celulară a plantelor. La începutul
secolului XIX, Oken (1805) afirma că toate organismele se nasc din celule şi formulează ideea unităţii
de structură a plantelor şi animalelor.
Robert Brown (1831) descoperă nucleul celular la plante, afirmând că nucleul este o
componentă constantă şi fundamentală a celulei, iar Valentin Leeuwenhoek (1836) descoperă
nucleolul în interiorul nucleului. J. E. Purkinje introduce noţiunea de protoplasmă, iar M. Schultze
defineşte celula ca „o mică masă de protoplasmă limitată în spaţiu de o membrană şi care conţine în
interior un nucleu”.
Formularea clară a teoriei celulare aparţine botanistului Mathias Jacob Schleiden (1838) care
arată că celula este un mic organism şi fiecare plantă este un agregat de celule individualizate, cu
existenţă proprie. Împreună cu T. Schwann a fundamentat o teorie unitară celulară, recunoscând celula
ca unitate structurală a materiei vii. R. Virchow (1958) în lucrarea sa „Die cellular patologie”1
formulează afirmaţia „omnis cellula e cellula”2; de asemenea, susţine că ţesuturile patologice sunt
formate, ca şi cele normale tot din celule, la baza bolilor aflându-se de fapt îmbolnăvirea celulelor.
E. Strasburger (1875) descoperă şi descrie diviziunea celulară la plante, iar W. Fleming (1879)
diviziunea celulară la animale.
Prin perfecţionarea tehnicilor de microscopie, a metodelor de fixare, secţionare şi colorare,
precum şi prin folosirea coloranţilor vitali s-au adus noi contribuţii la dezvoltarea cunoştinţelor de
Biologie celulară. Se evidenţiază corpusculii Altman (condriomul), aparatul reticular Golgi, ş.a. În 1912
Carrel realizează primele culturi de ţesuturi.
În ciuda cunoştinţelor acumulate, între anii 1665 si 1900, care au demonstrat că celula este
piatra de temelie a unui organism multicelular se punea problema dacă şi microorganismele, precum
bacteriile şi protozoarele, sunt organisme monocelulare sau dimpotrivă non-celulare sau acelulare?
Odată cu înţelegerea proprietăţilor genetice, fiziologice şi biochimice ale celulei, a devenit clar că
microorganismele sunt celule de sine stătătoare. Toate studiile moderne recunosc că atât în
organismele unicelulare cât şi în cele pluricelulare celula este unitatea structurală fundamentală care
găzduieşte materialul genetic şi prezintă organizarea biochimică care susţine existenţa vieţii.
Studiul contemporan al celulei este o activitate complexă care combină mai multe discipline şi
metode ştiinţifice incluzând microscopia, genetica, biochimia, biofizica şi fiziologia – volumul imens de
cunoştinţe acumulate în ultimii 50 de ani a dus la definirea Biologiei celulare şi moleculare ca domeniu
individual, cu rol din ce în ce mai important în practica medicală.

1
Patologia celulară (germ.)
2
Orice celulă derivă din altă celulă (lat.)

5
 Arhetipurile1 celulare
Organismele vii sunt alcătuite din celule care au trăsături comune, existând şi funcţionând
împreună, aceasta fiind unul dintre aspectele unităţii lumii vii. Procesele intracelulare care definesc
viaţa (metabolismul, reproducerea, schimbul de informaţie cu mediul) se desfăşoară după mecanisme
comune, indiferent de tipul organismului studiat.
Universul biologic este alcătuit din două tipuri de celule – celulele procariote şi cele eucariote
între care există deosebirii esenţiale de organizare.
Celulele procariote2 – sunt cele mai simple şi primitive forme de organizare a vieţii, preced
eucariotele în evoluţia formelor de viaţă şi sunt organisme unicelulare (figura 1.1a). Din aceasta clasă
fac parte bacteriile şi algele albastre–verzi.
Celulele eucariote3 – sunt celule cu organizare complexă în alcătuirea cărora se disting trei
parţi principale: nucleul (organit al coordonării proceselor celulare), citoplasma, ce conţine numeroase
organite şi suprafaţa celulară, dispozitiv ce controlează schimburile cu mediul înconjurător (figura 1.1b).
Eucariotele cuprind protozoarele cu nucleu, şi toate metazoarele – plantele şi animalele, inclusiv omul.

Figura 1.1 Comparaţie între celulele procariote şi cele eucariote: imagini de microscopie electronică şi
scheme. a) Celula procariotă – se remarcă alcătuirea simplă fără prezenţa de compartimente în
citoplasmă. b) Celula eucariotă – alcătuire complexă, cu citoplasma compartimentată (trăsătura cea
mai evidentă este prezenţa nucleului). [15]

1
archetipos = model primitiv (gr.)
2
prokarion = prenucleat (pro – înainte, karion – nucă, gr.)
3
eukarion = cu nucleu (eu – sufix pentru adevărat, există, karion – nucă, gr.)

6
 Principalele deosebiri dintre celulele procariote şi cele eucariote sunt următoarele:
1. Celulele eucariote au nucleu bine individualizat, cu o morfologie caracteristică, înconjurat de o
membrană proprie. Dimpotrivă, la celulele procariote materialul nuclear se găseşte în citoplasmă,
formând aşa numitul nucleoid sau echivalent nuclear care, de fapt, este o singură moleculă circulară de
acid dezoxiribonucleic ce constituie cromozomul unic al procariotelor.
2. Procariotele se înmulţesc prin simplă scindare a celulei după ce s-au dublat componentele
acesteia. Dimpotrivă, la eucariote diviziunea este un proces complex, care poate fi de două tipuri:
mitoza şi meioza. În cursul diviziunii celulare la eucariote, se formează structuri caracteristice
temporare – materialul nuclear se condensează sub forma mai multor cromozomi, al căror număr şi
structură sunt caracteristice fiecărei specii, şi apare fusul de diviziune.
3. Eucariotele au în citoplasmă organite celulare (mitocondrii, lizozomi, peroxizomi, aparatul Golgi,
reticulul endoplasmatic), delimitate prin membrane de restul citoplasmei care formează matricea
citoplasmatică sau citoscheletul. Celula eucariotă are o compartimentare structurală şi funcţională a
citoplasmei. Procariotele nu au organite celulare delimitate de membrane şi deci nu prezintă
compartimentarea citoplasmei.
4. Eucariotele au în citosol un citoschelet ce determină forma şi mişcările celulei din care face
parte. La procariote locomoţia este asigurată de un flagel cu structura mult mai simplă decât a celor
întâlniţi la celulele eucariote.

Mărimea celulelor şi a componentelor lor

Dimensiunile celulelor sunt prezentate, comparativ cu cele ale organismelor pluricelulare şi ale
moleculelor, în figura 1.2. Celulele şi o parte din componentele lor au dimensiuni de ordinul
micrometrilor (μm)1, în vreme ce pentru alte structuri mai mici dimensiunile sunt exprimate în
nanometri (nm). Deşi nu este cuprins în sistemul metric se mai foloseşte unitatea de măsură numită
angstrom2 (Å) care reprezintă a zecea parte dintr-un nanometru.

Figura 1.2 Dimensiunile relative ale moleculelor, celulelor şi organismelor superioare. [3]

Proteinele globulare mici au dimensiuni de câţiva nanometri, complexele moleculare mari cum
sunt ribozomii pot atinge 30 de nm. Dimensiunile organitelor mai mari, ca nucleul sau cloroplastele,
sunt exprimate în micrometri. Bacteriile au dimensiuni cuprinse între 1 şi 5 μm, iar celulele animale

1
1 μm = 10–6 m; 1 nm = 10–9 m; 1 Å = 10–10 m
2
1 Å este aproximativ egal cu diametrul unui atom de hidrogen

7
tipice între 10 şi 30 de μm. Se observă deci că, datorită dimensiunilor lor, celulele şi componentele lor
nu sunt vizibile cu ochiul liber şi sunt necesare dispozitive şi metode speciale pentru a le putea studia.

Metode utilizate în studiul celulelor

Datorită dimensiunilor foarte mici ale structurilor care constituie obiectul său de studiu (celulele
şi componentele lor), Biologia celulară şi moleculară este dependentă de dezvoltarea unor variate
instrumente şi tehnologii (figura 1.3).

Figura 1.3 Metode implicate în studiul celulelor şi a structurilor subcelulare.

Microscopia optică a stat la baza primelor date obţinute despre celule. În prezent, departe de a-
şi fi epuizat potenţialul, stă la baza unei largi arii de aplicaţii in studiul celulei, în parte prin dezvoltarea
de noi dispozitive (exemplu: microscopia cu fluorescenţă, a se vedea partea a doua) şi, de asemenea,
prin descoperirea de noi metode studiu a componentelor celulare (exemplu: utilizarea anticorpilor
marcaţi în identificarea şi localizarea diferitelor structuri intracelulare – imunocitochimia). Diferite
componente celulare pot fi identificate datorită legării preferenţiale a anumitor coloranţi – citochimia;
sau prin detectarea activităţii enzimelor marker specifice – citoenzimologia (exemplu: localizarea
mitocondriilor în celule este indicată de prezenţa succinat-dehidrogenazei, aşa cum se poate observa
în fibrele musculare striate din figura 1.4).

Figura 1.4 Secţiune prin muşchi striat în care

este pusă în evidenţă activitatea succinat-
dehidrogenazei. Fibrele bogate în mitocondrii
(fibre aerobe) apar închise la culoare, iar cele
cu sărace în mitocondrii (fibre anaerobe) apar
palide. [13]

Apariţia microscopiei electronice şi dezvoltarea tehnicii de fracţionare celulară au realizat un

important salt calitativ în descifrarea ultrastructurii celulei şi a funcţiei diferitelor compartimente celulare.

8
 Microscopia electronică, datorită puterii de rezoluţie mult mărită faţă de cea a microscopului
optic face posibilă observarea unor detalii fine ale structurilor celulare. În figura 1.5 sunt prezentate
comparativ imagini de microscopie optică, microscopie electronică de transmisie şi de baleiaj.

a) b) c)

Figura 1.5 Spermatozoizi umani observaţi la microscopul fotonic (a), microscopul electronic de
transmisie (b) şi microscopul electronic de baleiaj (c). [3]

Fracţionarea celulară permite studierea organitelor celulare, izolarea lor şi caracterizarea lor
din punct de vedere al structurii şi compoziţiei chimice. Pentru a efectua fracţionarea, celulele trebuie
întâi fragmentate mecanic cu formarea unei suspensii numite omogenat celular. Omogenatul este apoi
supus unei serii de centrifugări în urma cărora se separă „fracţiunile celulare” care conţin organitele
izolate. Aceste organite păstrează o bună parte din activitatea lor fiziologică, ceea ce face posibilă
studierea funcţiilor lor. Compoziţia chimică poate fi analizată prin efectuarea în continuare a unor tehnici
de separare a componentelor dintr-un amestec cum sunt cromatografia şi electroforeza.
Atunci când se urmăreşte studierea anumitor procese, separat de contextul interacţiunilor
complexe din organism, este utilă creşterea celulelor in vitro1 prin tehnica culturilor de celule. Primul
pas constă în izolarea celulelor din proba recoltată, de regulă cu o enzimă proteolitică de tipul tripsinei.
Celulele izolate sunt apoi introduse în flacoane care conţin mediu de cultură - o soluţie izotonă, cu pH
neutru, suplimentată cu substanţe necesare creşterii celulelor. Culturile de celule furnizează un număr
mare de celule de acelaşi tip care pot fi studiate din punct de vedere al funcţiei lor prin metode variate;
de asemenea, poate fi studiată structura lor şi compoziţia chimică prin tehnici de microscopie şi
fracţionare celulară.

1
in vitro = creşterea celulelor în afara organismului, într-un mediu artificial.

9
 Partea a doua
TIPURI DE MICROSCOAPE UTILIZATE ÎN BIOLOGIA CELULARĂ

Dispozitivele optice de mărit sunt folosite pentru a observa imaginea mărită a obiectelor.
Lupa, este o lentilă simplă, convergentă, cu o distanţă focală mai scurtă decât distanţa vederii
clare. Ea se aşează cât mai aproape posibil de ochi pentru a vedea sub un diametru evident mai mare,
obiecte mici, ale căror detalii sunt invizibile. Lupele cele mai puternice nu măresc decât maxim de 50 de
ori.
Microscopul, este un instrument optic care utilizează sisteme de lentile pentru a studia
structurile cu dimensiuni sub limita vizibilităţii cu ochiul liber. Microscopul trebuie să îndeplinească trei
obiective: să producă o imagine mărită a obiectelor, să separe detaliile imaginii şi să facă aceste detalii
vizibile pentru ochiul uman sau camera fotografică.
Dimensiunea obiectelor care pot fi studiate cu un microscop depinde de tipul de radiaţie pe
care îl utilizează pentru a ilumina proba – cu cât lungimea de undă (λ) a radiaţiei este mai mică cu atât
pot fi observate obiecte mai mici, altfel spus puterea de rezoluţie1 a microscopului depinde de lungimea
de undă a radiaţiei. Cu microscopul optic pot fi observare obiecte cu dimensiuni până la 0.2  m
diametru, în timp ce cu microscopul electronic, care foloseşte în loc de lumină un fascicul de electroni,
se pot observa structuri cu dimensiuni de ordinul nanometrilor (tabelul 2.1).

Microscoape fotonice
A. Microscoape fotonice care
folosesc radiaţiile spectrului vizibil
(radiaţii luminoase cu λ=400-800
nm)
Microscopul optic (fotonic), care după adaptarea
unor dispozitive speciale poate deveni:
Microscop cu câmp întunecat
Ultramicroscop
Microscop cu lumină polarizată
Microscop cu contrast de fază

B. Microscoape fotonice care Microscoape cu lumină ultravioletă

utilizează alte tipuri de radiaţii
Microscoape cu lumină ultravioletă pentru
(ultraviolete, cu λ<400 nm)
fluorescenţă

Microscoape electronice Folosesc un fascicul de electroni, cu Microscopul electronic de baleiaj

lungimea de undă invers
Microscopul electronic de transmisie
proporţională cu viteza electronilor

Tabelul 2.1 Clasificarea microscoapelor folosite în studiul celulelor în funcţie de tipul radiaţiei utilizate.

2.1 MICROSCOPUL OPTIC (FOTONIC)

Este un aparat optic de mărit, folosit în studiul explorator al structurilor cu dimensiuni de ordinul
micronilor şi care foloseşte ca sursă de radiaţii lumina naturală sau artificială, (figura 2.1).
Are în alcătuire:
A. Elemente mecanice
B. Elemente optice

1
Rezoluţia este cea mai mică distanţă între două puncte ale probei care pot fi încă distinse ca două obiecte separate.

10
 a) b)

Figura 2.1 a) Reprezentare schematică a microscopului fotonic şi a elementelor sale: 1 – piciorul, 2 –

coloana, 3 – angrenaj cu şină dinţată, 4 – platina, 5 – vizele laterale ale platinei, 6 – tubul, 7 – revolverul,
8 – dispozitivul de punere la punct a imaginii, 9 – sursa de lumină, 10 – condensatorul, 11 – obiectivele,
12 – ocularele. b) Imagine a microscopului fotonic.

A. Elementele mecanice

Reprezintă un sistem de piese mecanice ce conţine sistemul optic de mărit, pe cel de iluminat
şi pe cel de captat şi transmis lumina. Aspectul şi forma dispozitivului mecanic pot să varieze uşor de la
un tip de microscop la altul.
Rolul elementelor mecanice este de a susţine părţile sistemului optic şi de a crea posibilitatea
de manevrare a componentelor sistemului optic.
Sunt reprezentate de:
A.1. Piciorul sau talpa microscopului
A.2. Coloana microscopului
A.3. Dispozitive de punere la punct a imaginii
A.4. Tubul microscopului
A.5. Platina sau măsuţa microscopului cu cavalerii

1. Piciorul, sau talpa microscopului  este un dispozitiv metalic de formă aproximativ

dreptunghiulară ce asigură stabilitatea aparatului. În el sunt montate: sursa de lumină, oglinda
proiectoare şi un diafragm.
2. Coloana microscopului  de formă dreaptă sau curbă se articulează în partea sa inferioară cu
piciorul microscopului. În partea sa superioară şi anterioară, coloana prezintă un sistem de angrenaj
prin şina dinţată pentru deplasarea tubului microscopului. La coloana sunt montate: platina, tubul,
dispozitivul de punere la punct a imaginii.
3. Dispozitivele de punere la punct a imaginii sunt fixate la coloana microscopului. Ele sunt
reprezentate de două perechi de şuruburi numite vize, dispuse simetric de o parte şi de alta a coloanei:
a) Vizele macrometrice  sunt reprezentate de o pereche de şuruburi ce imprimă tubului
microscopic mişcări în plan vertical faţă de preparatul de studiat. Deplasarea tubului cu macroviza este

11
rapidă, şi realizează o punere la punct a imaginii aproximativ clară. Această pereche de vize se
angrenează pe o şină dinţată la nivelul coloanei.
b) Vizele micrometrice, constituie cealaltă pereche de vize, ce imprimă tubului microscopului
mişcări foarte fine, lente, pe aceeaşi direcţie ca şi viza macrometrică. Se folosesc pentru a completa
claritatea şi precizia imaginii obţinută cu viza macrometrică.
4. Tubul microscopului  este fixat pe coloană la partea superioară a microscopului şi poartă la
cele două extremităţi partea optică propriu-zisă a microscopului: sistemul obiectiv şi sistemul ocular.
a) La extremitatea superioară prezintă partea mecanică a sistemului ocular alcătuită la
microscoapele binoculare din două tuburi cilindrice, telescoape, înnegrite în interior pentru a evita
reflectarea luminii, numite tuburi de observare. Tuburile de observare, în care se montează cele două
oculare sunt mobile unul în raport cu celălalt.
b) În partea inferioară a tubului se găseşte partea mecanică a sistemului obiectiv, numită
revolver. Revolverul este format din două discuri unite printr-o axă de rotaţie:
 discul superior, fix este ataşat excentric la capătul inferior al tubului şi prezintă un orificiu circular în
dreptul tubului;
 discul inferior, mobil este angrenat pe discul fix, prezintă unu până la cinci orificii filetate pentru
montarea obiectivelor şi se poate roti aducând obiectivele în axul optic al microscopului. Un dinte
metalic montat între cele două calote blochează fiecare obiectiv în parte când acesta a fost adus în axa
optică a microscopului prin rotirea revolverului.
Tubul purtător al sistemului optic în totalitatea
sa, se apropie sau se depărtează de platină, care
sprijină preparatul de studiat, prin rotirea celor două
perechi de vize, macrometrică şi micrometrică.
5. Platina microscopului (măsuţa)  este o placă
metalică rotundă sau pătrată, fixată orizontal la coloana
microscopului, deasupra articulaţiei acesteia cu piciorul.
Pe platină se aşează preparatul microscopic. Central,
platina tuturor microscoapelor prezintă un orificiu
circular, larg de 2.5 cm care permite trecerea
fasciculului luminos dinspre condensator înspre tubul
microscopului (figura 2.2). Pe faţa superioară a platinei
se găsesc două lame metalice numite cavaleri sau
valeţi, care fixează pe platină preparatul de studiat. Figura 2.2 Platina şi cavalerii

B. Elementele optice

Sunt împărţite în două sisteme cu roluri şi localizare diferite:

B.1. Sistemul de iluminare
B.2. Sistemul optic propriu –zis

1. Sistemul de iluminare
Conţine acele părţi ale microscopului care furnizează lumina cu care se studiază preparatul.
Elementele sale componente sunt montate pe microscop sub nivelul platinei şi sunt reprezentate de
sursa de lumină şi o serie de alte elemente care modifică fasciculul luminos şi traiectul acestuia în
microscop – diafragmul, oglinda şi condensatorul (figura 2.3).
a. Sursa de lumină este inclusă în talpa microscopului în partea posterioară şi este reprezentată
de un bec de putere mică (15 W/6 V), alimentat de un transformator. Transformatorul este plasat în
afara microscopului şi are rolul de a transforma curentul de la 220 V la 6 V.
Microscoapele mai vechi utilizau sursa de lumină artificială externă sau lumina obişnuită.

12
 Figura 2.3 Elementele optice şi
parcursul fasciculului luminos în
microscopul fotonic.

b. Oglinda plană, este montată în talpa microscopului în partea anterioară şi are rolul de a
orienta razele luminoase în axul optic al microscopului cu ajutorul a două vize;
c. Diafragmul (iris) – este situat în picior între sursa de lumină şi oglindă; este un sistem de lame
metalice montate într-un inel metalic constituind un diafragm a cărui deschidere se reglează printr-o tijă
laterală, putând micşora sau mări conul luminos ce iese prin deschiderea circulară din talpa
microscopului.
d. Condensatorul – este format dintr-un sistem de lentile convergente, montate într-un dispozitiv
mobil aflat sub platină şi are rolul de a focaliza lumina pe preparatul microscopic. În funcţie de obiectivul
folosit se stabileşte şi poziţia condensatorului: când se utilizează obiective cu putere mare de mărire, se
ridică condensatorul, iar când se foloseşte obiectiv cu putere de mărire mică, se coboară (având poziţie
inferioară pentru obiectivul de 10×, iar pe măsură ce creşte puterea de mărire a obiectivului se ridică
condensatorul, având poziţie maximă pentru obiectivul de 90×).

2. Sistemul optic propriu-zis

Este reprezentat de sistemele de lentile care produc imaginea mărită a obiectelor din
preparatul microscopic: obiectivele şi ocularele (figura 2.4). Ele sunt montate pe microscop deasupra
platinei, la cele două extremităţi ale tubului.
a. Obiectivele
Microscopul poate avea până la 5 obiective, care se înşurubează în orificiile filetate ale discului
mobil al revolverului. Fiecare obiectiv este format dintr-un sistem de lentile convergente dispuse într-o
anumită ordine într-un tub metalic (figura 2.4a); puterea de mărire a obiectivelor (P ob.) este înscrisă pe
acestea prin gravare (exemplu: 10× = putere de mărire de 10 ori).
Lentila inferioară plasată spre preparatul microscopic se numeşte lentilă frontală, iar distanţa
dintre lentila frontală şi preparat se numeşte distanţă frontală.
Distanţa focală (f) a unui obiectiv este invers proporţională cu puterea lui de mărire, iar
obiectele trebuie plasate la o distanţă frontală mai mare ca f dar mai mică decât 2f pentru obţinerea
unei imagini clare – distanţa frontală la care se obţine imaginea clară (Di) este fixă pentru fiecare
obiectiv şi este, de asemenea, invers proporţională cu puterea lui mărire (exemplu: pentru obiectivul de
10×, Di este de aproximativ 10mm, iar pentru obiectivul de 20× este de 2-3 mm).
Obiectivele diferă între ele atât după puterea de mărire cât şi după modul de întrebuinţare.

13
 Microscopul fotonic este dotat cu:
– obiective uscate sunt cele cu putere de mărire de 6×, 10×, 20× si 40× (spaţiul dintre lentila frontală şi
preparat este ocupat de aer); ele sunt aşezate în funcţie de mărime şi se pot roti în direcţia acelor de
ceasornic.
– obiectivul umed (cu imersie) este cel cu putere de mărire de 90×, care necesită interpunerea între
lentila frontală şi preparat a unui lichid cu indice de refracţie aproximativ egal cu al sticlei (ulei de cedru).

Figura 2.4 Reprezentare schematică a sistemelor de lentile şi aspectul obiectivelor (a) şi ocularelor (b).

b. Ocularele
Microscopul fotonic prezintă două oculare, fiecare fiind format din două lentile convergente
montate într-un tub metalic scurt, înnegrit in interior pentru a evita reflexia luminii (figura 2.4b), care se
introduc la extremitatea superioară a tubului microscopului în tuburile de observare.
Fiecare ocular se caracterizează printr-o putere de mărire, iar microscopul ML4 este prevăzut
cu oculare care măresc de 5×, 7×, 10× si 15×. Puterea de mărire a ocularelor (P oc.) este gravată pe
acestea.
Puterea de mărire a microscopului este egală cu: P ob. × P oc.
Exemplu: la observarea obiectivul de 10× şi cu oculare de 7×, P microscopului = 10 × 7 = 70×.

Tehnica de lucru la microscopul fotonic

1. Transformatorul se conectează la reţeaua de 220 V şi apoi se conectează sursa de lumină

(becul) a microscopului la priza proprie a transformatorului.
2. Prin rotirea revolverului se aduce obiectivul de 10× în axul optic al microscopului.
3. Se stabileşte distanţa între oculare în funcţie de distanţa interpupilară a examinatorului.
4. Privind prin oculare, se controlează iluminarea câmpului microscopic. Intensitatea luminii se
corectează prin ridicarea sau coborârea condensatorului, în funcţie de puterea de mărire a obiectivului.
5. Se aşează lama portobiect cu lamela în sus pe faţa superioară a platinei, fixând-o cu ajutorul
valeţilor. Se centrează apoi preparatul în axul optic al microscopului.

14
 6. Privind lateral, se coboară tubul cu ajutorul vizei macrometrice până la o distanţă mai mică
decât Di pentru obiectivul cu care examinăm preparatul (Di pentru obiectivul de 10× este de 10mm).
7. Punerea la punct a imaginii: privind prin oculare se ridică încet tubul cu ajutorul vizei
macrometrice până apare imaginea clară în câmpul microscopic. Apoi se corectează claritatea imaginii
cu ajutorul vizei micrometrice.
Dacă nu apare nici o imagine înseamnă că:
– obiectivul nu se afla în axul optic
– preparatul nu se află în câmpul microscopic
– s-a ridicat prea repede tubul microscopului.
8. Cu ajutorul celor două vize laterale ale platinei se va mişca lama cu preparatul în direcţie
antero-posterioară şi de lateralitate, în vederea examinării lui în totalitate. Tot timpul studiului la
microscop se ţine mâna în permanenţă pe viza micrometrică, cu care se fac scurte mişcări de rotire
înainte şi înapoi pentru a adapta claritatea imaginii, deoarece preparatul nu are aceeaşi grosime pe
toata suprafaţa sa.
9. Trecerea la obiective cu putere de mărire crescută – se face pentru examinarea de detaliu
a preparatului. Etapele sunt următoarele:
– se ridică tubul microscopului cu 2-3 cm cu ajutorul macrovizei;
– se roteşte revolverul până se aduce în axul optic obiectivul imediat superior ca putere de
mărire (20×);
– se coboară noul obiectiv cu ajutorul macrovizei până la o distanţă mai mică decât noua Di
(1-2 mm deasupra preparatului);
– privind prin oculare, se ridică condensatorul până se iluminează corespunzător câmpul
microscopic;
– se corectează claritatea imaginii, folosind vizele micrometrice
10. Folosirea obiectivelor cu imersie (90×):
– când este necesară trecerea la obiectivul cu imersie, se face o centrare riguroasă, precisă
a zonei de studiat folosind obiectivul 40×;
– se scoate din ax obiectivul respectiv;
– se pune o picătura de ulei de cedru pe lamă în dreptul axului optic;
– se ridică condensatorul în poziţia sa superioară maximă;
– apoi se aduce obiectivul cu imersie în ax, astfel încât lentila frontală a obiectivului intră în
contact cu uleiul de cedru, dispărând spaţiul de aer dintre obiectiv şi portobiect;
– se fixează claritatea imaginii privind prin ocular şi folosind viza micrometrică.
Obiectivele cu imersie necesită o manipulare foarte atentă, de aceea se evită coborârea tubului
cu ajutorul macrovizei, deoarece există riscul spargerii lamei portobiect şi deteriorarea lentilei frontale.
11. Întreţinerea şi păstrarea microscopului – pentru bună funcţionare a microscopului este
necesară păstrarea lui în husa de plastic, iar părţile metalice se curăţă periodic cu o bucată de pânză
moale şi obiectivele cu tifon înmuiat în solvenţi organici.
După terminarea folosirii microscopului se fac următoarele operaţiuni:
– se ridică tubul microscopului;
– se scoate lama de pe platină;
– se aduce obiectivul de 10x în axul optic;
– se coboară condensatorul;
– se decuplează sursa de lumină a microscopului de la transformator, iar acesta de la
reţeaua de 220 V;
– microscopul se acoperă cu husa.
Se recomandă să nu se atingă cu mâna nici una dintre părţile optice ale aparatului.

15
 2.2 MICROSCOPUL CU CÂMP ÎNTUNECAT

Microscopul cu câmp întunecat permite observarea unor obiecte de dimensiuni foarte mici,
necolorate. Metoda se bazează pe fenomenul de dispersie a luminii de către particulele aflate în
suspensie (similar particulelor de praf vizibile într-un fascicul de lumină), care astfel devin vizibile ca
obiecte strălucitoare pe un fond întunecat.
Pentru obţinerea acestui efect, preparatul nu trebuie iluminat direct, ci din lateral. În acest scop,
sub condensator se plasează un disc opac, care va lăsa să treacă lumina doar la periferia
condensatorului – fascicul de raze oblice. Nedeviate de preparat aceste raze nu intră în obiectiv şi, deci,
câmpul microscopic apare întunecat. Dacă fasciculul întâlneşte în calea sa obiecte mici, razele vor fi
dispersate şi o parte vor avea direcţia corespunzătoare pentru a străbate sistemul optic şi a forma
imaginea (figura 2.5a).
Datorită fenomenului de dispersie a luminii, prin această metodă se pot observa particule foarte
mici, de până la 0.003 m (rezoluţie de aproximativ 100 de ori mai mare ca a microscopului fotonic
obişnuit) – aşa cum se poate observa în figura 2.5b.

b)

c)

a)

Figura 2.5 a) Reprezentare schematică a elementelor unui microscop cu câmp întunecat şi parcursul
razelor într-un astfel de microscop – lumina care ajunge în obiectiv şi formează imaginea este doar cea
dispersată de preparat; Imagini de microscopie cu câmp întunecat: b) a unui preparat din sânge – se
observă hematiile precum şi numeroase puncte strălucitoare care reprezintă colonii de nanobacterii1
(săgeata) şi c) a spirochetelor Treponema pallidum responsabile pentru apariţia sifilisului.

Particularităţile microscopului cu câmp întunecat

Pe un microscop fotonic obişnuit, câmpul întunecat se poate obţine prin plasarea unui disc
opac pe traiectul fasciculului luminos sub condensator. Microscoapele destinate acestei tehnici prezintă
discul opac încorporat în condensator, foarte aproape de sistemul de lentile. Cu cât discul opac este

1
Nanobacterii = ultamicroorganisme implicate în formarea plăcii dentare; în sânge se pare ca au rol în coagulare şi cresc în
colonii. Dimensiunile lor extrem de mici le fac imposibil de evidenţiat la microscopul fotonic obişnuit.

16
mai aproape de lentilele condensatorului, cu atât mai bună este ocluzia fasciculului direct şi contrastul
obiectelor de observat este mai bun.
Aplicaţiile practice ale microscopiei cu câmp întunecat:
– observarea rapidă a suspensiilor de celule – de exemplu în examinarea eritrocitelor în
diferite tipuri de anemii;
– examinarea preparatelor din sânge pentru depistarea rapidă a agenţilor patogeni – de
exemplu examinarea sângelui pentru diagnosticarea bacteriemiei în sifilis (figura 2.5c);
– examinarea probelor de apă pentru detectarea contaminării bacteriene;
– observarea motilităţii la diferite tipuri de celule.

2.3 MICROSCOPUL CU FLUORESCENŢĂ

Microscopul cu fluorescenţă permite observarea în celule a compuşilor numiţi fluorocromi sau

fluorofori. Aceştia prezintă proprietatea de a absorbi o radiaţie invizibilă, ultravioletă şi de a elibera o
parte din energie sub forma emiterii unei radiaţii cu lungime de undă (λ) mai lungă, în spectrul vizibil,
proprietate numită fluorescenţă.
Fluorescenţa unui preparat microscopic poate fi clasificată în două categorii:
– fluorescenţă primară, naturală sau autofluorescenţa – produsă de substanţe care se
găsesc în mod natural în celule sau ţesuturi (lipofuscină, cromolipidele, fenilalanina,
tirozina, adrenalina, noradrenalina etc.);
– fluorescenţa secundară sau provocată – indusă prin tratarea secţiunilor de ţesut cu
fluorocromi, prin această metodă putându-se detecta acizii nucleici, fibrele de colagen, de
reticulină şi elastice, mucinele, etc.
Fluorocromii folosiţi pentru colorarea diferitelor substraturi celulare sunt substanţe din marea
clasă a coloranţilor citologici. Prezintă structură asemănătoare coloranţilor (vezi capitolul 3.3), cu
deosebirea că grupările cromofore din structura lor nu absorb radiaţii în spectrul vizibil, ci în spectrul
ultraviolet şi emit în scurt timp o parte din energie sub forma unei radiaţii vizibile cu λ mai mare, radiaţia
emisă fiind în spectrul vizibil(figura 2.6), cu o lungime de undă specifică în funcţie de fluorocrom (deci
cu culoare specifică).

Figura 2.6 Principiul fluorescenţei:

1) energia radiaţiei ultraviolete este absorbită de atom care intră
în stare de excitaţie;
2) electronii trec pe un nivel superior de energie;
3) în scurt timp electronii revin la starea de bază, emiţând un
foton (radiaţie luminoasă).

Fluoresceina, folosită în prezent pe scară largă în aplicaţiile microscopiei cu fluorescenţă este o

xantină, înrudită îndeaproape cu eozina, un colorant frecvent utilizat în coloraţiile de rutină (figura 2.7).
Alţi fluorocromi utilizaţi sunt acridin-orange, quinacrina, rodamina şi derivaţii lor.

Fluoresceina Eozina Y

Figura 2.7 Fluoresceina şi eozina Y, două

substanţe din familia xantinelor cu aplicaţii
practice diferite datorită particularităţilor
grupărilor chimice.

17
 Particularităţile microscopului cu fluorescenţă
Microscopul cu fluorescenţă prezintă următoarele dispozitive montate în plus faţă de un
microscop fotonic obişnuit (figura 2.8a):
a. sursa de lumină - este reprezentată de o lampă cu vapori de mercur (HBO – 200 W) care emite
radiaţii U.V.; se montează în partea postero-superioară a microscopului şi comunică cu tubul
microscopului;
b. două tipuri de filtre de lumină:
– filtrul de excitaţie care are rolul de a opri toate radiaţiile în afara celor U.V.; se montează la
ieşirea din sursa de lumină;
– filtre de protecţie care protejează retina şi se montează între obiectiv şi ocular; aceste filtre
nu lasă să treacă radiaţiile ultraviolete care pot produce leziuni ale retinei.

a) b)

Figura 2.8 a) Dispunerea filtrelor şi traiectul radiaţiilor în microscopul cu fluorescenţă. b) Imagine de

imunofluorescenţă a filamentelor gliale din astrocite (verde); nucleii apar coloraţi în albastru. [1]

Sursa de lumină produce radiaţii ultraviolete, iar acestea străbat filtrul de excitaţie care lasă să
treacă numai pe aceea care este capabilă să excite fluorocromul. Aceasta este focalizată pe preparat
care va emite o radiaţie în spectrul vizibil captată şi focalizată de obiectiv pentru a forma imaginea.
Deoarece sursa de lumină produce numai lumină ultravioletă – „neagră”, obiectele colorate cu
fluorocrom apar strălucitoare pe un fond negru (figura 2.8b).

Aplicaţiile practice ale microscopiei cu fluorescenţă:

Cu ajutorul fluorescenţei primare pot fi identificaţi:
– pigmenţii: porfirinele (fluorescenţă roşie), lipocromii sau pigmenţii carotenoizi (fluorescenţă
verde), cromolipidele (fluorescenţă galben-verde), lipofuscina (fluorescenţă roşu-brun);
– acizii aminaţi: fenilalanina, tirozina, triptofanul (fluorescenţă albastră);
– unele virusuri şi bacilul Koch emit o fluorescenţă verde strălucitor;
– dintele natural este autofluorescent, proprietate prin care se deosebeşte de cel artificial;
– aminele biogene: adrenalina, noradrenalina, serotonina (fluorescenţă verde).
Cu ajutorul fluorescenţei secundare prin colorare cu acridin-orange se pot identifica:
– acizii nucleici: ARN-ul (fluorescenţă roşie), AND-ul (fluorescenţă verde-galben);
– fibrele de colagen, elastice şi reticulină – fluorescenţă verde;
– nucleii leucocitelor au o fluorescenţă verde, iar citoplasma lor şi eritrocitele rămân opace;
– mucinele – fluorescenţă verde.

18
 Coloraţia cu acridin-orange se mai utilizează în citodiagnosticul precoce al cancerului (studiul
acizilor nucleici în condiţiile unui proces tumoral).
Cea mai importantă aplicaţie este imunofluorescenţa, care se bazează pe cuplarea unui
anticorp cu un fluorocrom; prin fluorescenţa indusă poate fi identificată localizarea antigenelor în celule.

2.4 MICROSCOPUL CU CONTRAST DE FAZĂ

Microscopia cu contrast de fază utilizează un tip special de microscop fotonic ce realizează

contrastul unor obiecte de examinat, permiţând astfel studiul celulelor în stare vie, nefixate şi necolorate.
În general, distingem diferitele părţi ale unui obiect deoarece acestea afectează lumina în mod
diferit. Una din caracteristicile care stă la baza acestei diferenţe este indicele de refracţie; celulele şi
organitele sunt alcătuite, în proporţii variabile, din molecule diferite, iar regiunile cu compoziţie diferită
au şi indicele de refracţie diferit. În mod normal aceste diferenţe nu pot fi detectate de ochi, dar
microscopul cu contrast de fază converteşte diferenţele între indicii de refracţie în diferenţe de
intensitate a luminii care sunt vizibile pentru ochi sub formă de regiuni întunecate şi regiuni luminoase
(figura 2.9).

Figura 2.9 Imaginea unui fibroblast în cultură, necolorat (A) în microscopie optică şi (B) cu contrast de
fază. [1]

Particularităţile microscopului cu contrast de fază

Microscopul cu contrast de fază separă lumina directă de lumina difractată care trece prin
probă şi face ca aceste două radiaţii să interfere (figura 2.10). Prezintă următoarele adaptări faţă de un
microscop fotonic obişnuit:
– condensatorul are un diafragm inelar (un inel transparent într-un disc opac);
– în obiectiv se găseşte o placă sau inel de fază care are rolul de a modifica transmisia unei
părţi din razele luminoase care formează imaginea câmpului microscopic (are loc
interferenţa razelor luminoase care sunt transmise direct şi a celor care sunt difractate de
preparat).
Defazarea este proporţională cu indicele de refracţie al regiunii străbătute de radiaţia
respectivă.

Aplicaţiile practice ale microscopiei cu contrast de fază:

– studiul celulelor în stare vie (celule nefixate şi necolorate) – important mai ales în urmărirea
culturilor de celule, care sunt verificate prin transparenţa flaconului de cultură pentru
observarea proliferării şi a aderării de substrat (vezi figura 5.13)
– permite urmărirea mişcărilor celulare care nu se pot observa la microscopul fotonic obişnuit
ca endocitoza, mişcarea cililor şi flagelilor, diviziunea celulară etc.
– studiul reacţiile celulare la diferiţi agenţi fizici sau chimici.

19
 a) b)

Figura 2.10. a) Diferenţa între modul cum afectează

lumina un preparat colorat şi unul necolorat şi efectul
interferenţei a două unde cu aceeaşi fază şi cu faze
opuse; b) Parcursul fasciculului luminos în microscopul
cu contrast de fază. [1, 14]

2.5 MICROSCOPUL CU LUMINĂ POLARIZATĂ

Lumina, la fel ca şi alte radiaţii electromagnetice, este alcătuită din unde care vibrează în mai
multe planuri. Microscopul cu lumină polarizată, foloseşte filtre speciale capabile să selecteze lumina
care vibrează într-un singur plan (lumină polarizată). Cu ajutorul acestor filtre, microscopul cu lumină
polarizată furnizează imagini ale unor constituenţi celulari în care structurile examinate sunt anizotrope1,
acestea făcând ca planul şi viteza de propagare a luminii polarizate să varieze cu direcţia de propagare.
Astfel de structuri se numesc birefringente – deşi nu sunt vizibile în mod normal la microscopul fotonic
obişnuit, pot fi evidenţiate la microscopul cu lumină polarizată ca structuri luminoase pe un fond
întunecat.

Particularităţile microscopului cu lumină polarizată

Microscopul cu lumină polarizată prezintă în plus faţă de microscopul fotonic obişnuit:
– un polarizor situat între sursa de lumină şi condensator – acesta este un filtru care lasă să
treacă din fasciculul incident doar lumina care vibrează într-un plan – lumină polarizată;
– un analizor – acesta este un al doilea polarizor situat deasupra obiectivului; când analizorul
şi polarizorul sunt aşezate cu planurile de polarizare perpendiculare unul pe celălalt, lumina
incidentă nu străbate sistemul optic şi câmpul microscopic apare negru;
– o platină rotativă, care permite modificarea orientării preparatului în raport cu planul luminii
polarizate.

1
structuri anizotrope = structuri compuse din elemente cu o anumită orientare, care prezintă diferenţe în indicele de refracţie
în funcţie de orientare.

20
 Când pe platină se găseşte un preparat cu structuri birefringente, planul luminii polarizate este
rotit astfel încât o parte din lumină va străbate analizorul chiar dacă acesta este orientat perpendicular
pe polarizor (figura 2.11a).
a) b)

Figura 2.11 a) Traiectul fasciculului luminos, modificările luminii polarizate induse de proba
birefringentă şi alcătuirea microscopului cu lumină polarizată. b) Imagine a fibrelor musculare striat la
microscopul cu lumină polarizată. [17]

Aplicaţiile microscopiei cu lumină polarizată constau în studierea constituenţilor celulari

care prezintă proprietatea de birefringenţă, cum ar fi:
– structurile fibrilare (colagen, mielină, fibrele musculare striate, vezi figura 2.11b) prezintă o
birefrigenţă pozitivă când indicele de refracţie este mai ridicat în lungime decât în plan
perpendicular şi negativă în caz contrar (fibrele nucleoproteice).
– birefrigenţa cristalină sau intrinsecă observată în sistemele sau moleculele în care ionii
prezintă un aranjament asimetric regulat, se observă în structuri constituite din proteine
sau lipide;
– birefrigenţa de tensiune se observă la structurile izotope care sunt supuse unei
constrângeri mecanice şi se întâlneşte la nivelul muşchilor şi în ţesuturile embrionare;
– dicroismul apare în momentul în care absorbţia unei lungimi de undă dată de lumina
polarizată variază în funcţie de orientarea obiectului examinat. Unii coloranţi organici ca
roşul de Congo, pot induce dicroismul în unele structuri biologice datorită unei orientări
preferenţiale a moleculelor.

2.6 MICROSCOPUL ELECTRONIC

Microscoapele electronice sunt aparate optice de mărit cu o mare putere de rezoluţie, care în
locul luminii vizibile folosesc un fascicul de electroni.
Funcţionarea microscoapelor electronice presupune existenţa unui fascicol de electroni care
suferă, sub influenţa unui câmp electrostatic sau electromagnetic, fenomene de deviaţie asemănătoare
celor obţinute prin intermediul lentilelor de sticlă în cazul radiaţiilor vizibile.
Puterea lor mare de rezoluţie este în funcţie de aceeaşi parametri ca şi cei ai microscopului
fotonic, adică micşorarea lungimii de undă.

21
 Lungimea de undă a unui flux de electroni este în funcţie de tensiunea de accelerare la care
aceştia sunt supuşi şi se poate calcula după formula lui de Broglie:
λ = h/mv
unde:
λ= lungimea de undă; h = constanta lui Planck; v = viteza electronului; m = masa electronului.
Prezentăm in continuare două tipuri de microscoape electronice utilizate în Biologia celulară şi
moleculară: microscopul electronic de transmisie (TEM) şi microscopul electronic de baleiaj (SEM1).
TEM formează imaginea cu ajutorul unui fascicul de electroni care străbat preparatul, în vreme ce SEM
foloseşte electronii reflectaţi de suprafaţa preparatului.

Microscopul electronic de transmisie (T.E.M)

Utilizează un fascicul de electroni cu λ de ordinul angstromilor (Å). De aceea rezoluţia
imaginilor obţinută cu aceste microscoape este mult mai mare decât a unui microscop fotonic (figura
2.12 b). Microscoapele electronice au o putere de rezoluţie maximă de 1,2 Å şi o mărire de 800.000×.
Preparatele microscopice care sunt examinate la microscopul electronic de transmisie trebuie
să aibă o grosime maximă de 50 nm, pentru a putea fi străbătute de fasciculul de electroni. Tehnica de
obţinere a preparatelor microscopice pentru TEM este discutată în capitolul 3.5.
Un microscop de electronic de transmisie este alcătuit din (figura 2.12a):
1. Tubul sau coloana microscopului în care se face un vid înalt cu ajutorul a două pompe:
pompa de rotaţie şi pompa de difuzie.
Fluxul de electroni este produs de un filament încălzit  catod, care se află în partea superioară
a coloanei; anodul - situat imediat sub catod, este reprezentat de un disc metalic prevăzut cu un orificiu
central prin care electronii sunt dirijaţi în axul optic al coloanei microscopului.
În timpul funcţionării, între catod şi anod se aplică o tensiune înaltă pentru accelerarea
electronilor (50 - 100 kV).
2. Lentilele condensor de tip electromagnetic în număr de două, reprezintă o componentă
esenţială a sistemului de iluminare, şi au rolul de a concentra fluxul de electroni pe preparatul de
examinat.
3. Camera pentru preparat se află sub lentilele condensoare şi este prevăzută cu măsuţa pentru
preparat, de formă circulară prezentând în partea centrală un orificiu circular în care se introduce
portobiectul cu preparatul de examinat. Printr-un sistem de microvize, portobiectul se poate mişca,
oferind posibilitatea examinării unui câmp cât mai mare. Camera pentru preparat este prevăzută cu un
sistem ecluză prin care portobiectul este introdus în coloana microscopului fără a scădea valoarea
vidului de lucru.
4. Sistemul de formare a imaginii la microscopul obişnuit este alcătuit din trei lentile
electromagnetice: obiectiv, intermediară şi o lentilă proiector. Ultimele două au rolul de a mări imaginea
formată de lentila obiectiv, proiectând-o pe ecranul aflat în partea bazală a coloanei.
5. Camera de observare prezintă trei ferestre şi un ecran circular fluorescent care, sub influenţa
bombardamentului de electroni permite vizualizarea imaginii preparatului. Imaginea poate fi examinată
direct sau prin intermediul unei lupe binoculare.
6. Camera fotografică se află în partea cea mai inferioară a coloanei, imediat sub camera de
observare; în ea se introduce o casetă cu 12 sau 24 de plăci fotografice sau film cu dimensiuni variabile.
7. Panoul de comandă are forma unui birou cu două corpuri fiind prevăzut cu comutatoare şi
potenţiometre de control şi operare; în interiorul blocurilor se află blocul de fumizare a tensiunii înalte
stabilizate şi blocul care alimentează circuitele lentilelor şi sistemul de vidare.

1
TEM = transmission electron microscope (engl.); SEM = scanning electron microscope (engl.)

22
 a) b)

Figura 2.12 a) Alcătuirea microscopului electronic de transmisie – schemă. b) Două secţiuni adiacente,
una de 1 μm şi a doua de 0.025 μm, examinate la microscopul optic, respectiv la TEM cu aceeaşi
putere de mărire – se observă rezoluţia mult superioară a TEM. [b) după 12]

Microscopul electronic de baleiaj (S.E.M)

Spre deosebire de TEM care se utilizează în examinarea structurii interne a celulelor, SEM
este utilizat pentru examinarea suprafeţelor obiectelor cu dimensiuni cuprinse între câţiva namometri şi
câţiva milimetri. În plus, datorită focalizării în adâncime a fasciculului de electroni, imaginile obţinute cu
SEM prezintă aspect tridimensional (figura 2.13).

Figura 2.13 Imagine de microscopie

electronică de baleiaj a unui neutrofil
care emite pseudopode pentru a
fagocita bacterii din mediu. [8]

Construcţia şi operarea SEM este diferită de cea a TEM având un principiu de funcţionare
asemănător unui sistem TV în circuit închis (figura 2.14).
Microscopul electronic de baleiaj este format din:
1. Sistemul electrono-optic, care cuprinde:
– coloana microscopului, în care se găsesc:
– tunul electronic, la care se aplică o tensiune de accelerare de la 1.000 V la 60.000 V, în
funcţie de preparatul de examinat.
– două lentile condensor de tip electromagnetic cu rol de a micşora diametrul fasciculului de
electroni.

23
 – bombardarea preparatului cu fasciculul primar de electroni face ca acesta să emită
electroni secundari care sunt captaţi de un detector; curentul astfel format este amplificat şi
dirijat într-un tub catodic unde se formează imaginea.
– sistemul de vid este format ca şi în cazul microscoapelor electronice de transmisie din
două pompe: de vid preliminar şi de vid înalt.

Figura 2.14 Schema de funcţionare a microscopului electronic de transmisie comparativ cu

microscopul electronic de baleiaj. [3]

2. Sistemul de operare şi de afişaj cuprinde blocul de comandă al aparatului:

– sistemul de operare include alimentarea la reţea (220 V) stabilizatori de tensiune, operarea
pompei de vid.
– sistemul de afişaj reprezintă partea de prelucrare a semnalelor primite de la preparat şi de
redare a acestora sub formă de imagine (monitor TV) precum şi de înregistrare a acestora
cu aparate fotografice obişnuite.
În Biologia celulară, acest tip de microscoape se utilizează în studiul suprafeţelor celulare 
studiază elementele figurate ale sângelui (în special al leucocitelor, vezi figura 2.13), microvilozităţi, cili
flageli, fenomenele de suprafaţă ale diviziunii celulare, ale fecundării, ale primelor stadii ale segmentării
şi formarea blastulei etc.

24
 Partea a treia
TEHNICA OBŢINERII PREPARATELOR MICROSCOPICE

3.1 GENERALITĂŢI

Pentru a putea observa celulele la microscop, fragmentele de ţesut trebuie prelucrate în

vederea obţinerii preparatelor microscopice.
Un preparat microscopic este alcătuit din proba de studiat, aşezată pe o lamă de sticlă şi
acoperită, de regulă, cu o lamelă.
– lama se mai numeşte şi „lamă port-obiect” cu laturi paralele şi dimensiuni de 76/26 mm şi 1.5-2 mm
grosime;
– lamela este din sticlă, are formă pătrată sau dreptunghiulară, foarte subţire, cu dimensiuni variabile;
– proba de studiat este reprezentată de un fragment de ţesut sau o cantitate mică dintr-un lichid
corporal, aduse prin secţionare, respectiv etalare la o grosime de câţiva microni; la aceasta
grosime, lumina străbate proba (transiluminare) permiţând studierea celulelor la microscopul optic.
În funcţie de starea celulelor de studiat, preparatele microscopice se clasifică în:
1. Preparate proaspete, temporare sau extemporanee
2. Preparate permanente sau durabile, care permit un studiu amănunţit al celulelor pe
piese fixate şi colorate

1. Preparatele proaspete, temporare sau extemporanee, se realizează atunci când se

urmăreşte studierea celulelor în stare vie.
În acest scop se recoltează din organismul animal în timpul vieţii (biopsie) un fragment foarte
subţire de organ sau ţesut pe care-l disociem pe lamă într-un lichid natural sau artificial, favorabil
menţinerii vieţii celulelor în timpul examinării (plasmă, limfă, lichid amniotic, ser fiziologic). Acoperim
apoi preparatul cu o lamelă ale cărei margini le lipim cu parafină topită, pentru a evita uscarea ţesutului.
Acest tip de preparat se mai foloseşte şi în studiul culturilor de ţesuturi. Pe astfel de preparate
proaspete putem examina celulele sau elementele ţesutului respectiv necolorate sau colorate printr-o
metodă numită coloraţie vitală. În metoda coloraţiei vitale se întrebuinţează diferite substanţe colorante
puţin toxice, care nu alterează viaţa celulelor (exemple: albastru de tripan, verde Janus). Coloraţiile
vitale pot fi: intravitale, când substanţa colorantă se introduce în organism în timpul vieţii, apoi se
recoltează ţesutul şi se studiază, sau pot fi supravitale, când colorantul vital se aplică pe un preparat cu
celule in stare vie.
Examenul în stare vie sau proaspată are marele avantaj de a permite studiul celulelor în viaţă,
de a urmări diferite aspecte funcţionale ale acestora în desfaşurarea lor, de a studia unele aspecte ale
dinamicii celulare. Putem observa :
– mişcarea cililor, miscarea ameboidă, contractilitatea;
– fagocitoza, exocitoza;
– diviziunea celulară, fecundaţia, segmentarea ovulului.
Cu toata simplitatea acestui procedeu, examenul în stare proaspătă are aplicaţii restrânse.
Marele dezavantaj al acestei metode este alterarea relativ rapidă a ţesutului de examinat.

2. Preparate permanente sau durabile, rezistă în timp deoarece în timpul prelucrării ţesuturilor
celulele sunt conservate prin fixare. Preparatele permanente se pot obţine prin două procedee:
– metoda efectuării secţiunilor fine
– metoda etalării materialului biologic în monostrat (frotiu – din fluide, amprente de organ –
din ţesuturi solide).

25
 3.2 METODA EFECTUĂRII SECŢIUNILOR FINE

Secţiunea este un preparat permanent prin care se studiază ţesuturile solide. Datorită detaliilor
structurale tisulare şi celulare pe care le evidenţiază, secţiunile fine sunt preparatele cel mai frecvent
utilizate în studiul ţesuturilor solide.
Efectuarea preparatelor microscopice din secţiuni fine este o metoda laborioasă, care se
desfăşoară în laboratoare specializate. Etapele obţinerii preparatelor din secţiuni fine sunt următoarele
(figura 3.1):
o recoltarea
o fixarea şi spălarea
o deshidratarea
o includerea
o secţionarea şi aplicarea secţiunilor pe port-obiect
o colorarea şi montarea lamelei

Figura 3.1 Reprezentare schematică a principalelor etape în obţinerea preparatelor microscopice prin
secţiuni fine

26
 Recoltarea şi fasonarea pieselor
Fragmentele de organe sau ţesuturi pot fi recoltate în timpul vieţii, (printr-o intervenţie
chirurgicală, când se obţine o piesă operatorie, fie printr-un act operator mai redus, biopsie, când se
obţine un mic fragment de ţesut, fragment bioptic) sau imediat după moartea animalului, pentru a evita
liza ţesuturilor.
Fasonarea pieselor: fără a le deforma sau strivi, fragmentele mari sunt tăiate la o grosime de 2-
3 mm şi orientate astfel încât să permită un studiu cât mai complet – în acest scop peretele organelor
cavitare va fi secţionat şi acestea se întind şi se prind pe un suport plan prin fixare cu bolduri sau spini
de copac şi aşa se introduc în fixator.
Piesa de material biologic trebuie să aibă feţe plane şi paralele, să nu aibă grosime mai mare
de 1-4 mm, pentru a facilita pătrunderea rapidă a fixatorului şi a evita apariţia alterărilor autolitice.

Fixarea şi spălarea
Fixarea reprezintă un timp obligatoriu în realizarea preparatelor permanente. Are ca scop
oprirea proceselor celulare şi conservarea constituenţilor celulari într-o stare cât mai apropiată de cea
din timpul vieţii, cu păstrarea formei, structurii şi compoziţiei chimice precum şi a raporturilor reciproce
existente în stare vie, şi pregătirea ţesuturilor în vederea manevrelor ulterioare (includere, colorare).
Fixarea omoară şi imobilizează celulele într-un anume moment al activităţii lor.
La nivel molecular, fixarea realizează denaturarea şi/sau polimerizarea constituenţilor celulari şi
în special a proteinelor. În consecinţă (1) se realizează blocajul reacţiilor enzimatice, împiedicând astfel
digestia autolitică a ţesuturilor şi (2) se imobilizează constituenţii celulari, păstrându-se raporturile
existente în timpul vieţii.
Fixarea se poate face folosind agenţi fizici sau chimici:
Agenţii fizici utilizaţi sunt: căldura, desicarea (uscarea) sau congelarea. Sunt utilizaţi numai în
aplicaţii speciale, având ca principal dezavantaj un grad redus de păstrare a raporturilor celulare.
Agenţii chimici sunt cel mai frecvent utilizaţi, fie ca fixatori simpli, fie sub formă de amestecuri
fixatoare. Fixatorii chimici au ca mecanism general de acţiune combinarea cu grupările funcţionale ale
moleculelor proteice, pe care le fac insolubile în lichidele utilizate în tehnică şi blochează reacţiile
enzimatice (digestia autolitică). Un fixator simplu este greu să îndeplinească toate calităţile necesare
unei bune fixări (să aibă putere mare de pătrundere, să producă o cât mai mică retracţie a pieselor, să
nu determine apariţia de artefacte, să confere o anumită consistenţă piesei), motiv pentru care se
recurge uneori la amestecuri fixatoare în care diverşii constituenţi îşi completează reciproc acţiunea.
Exemple de fixatori utilizaţi în practică:
1. Aldehidele – sunt reprezentate de formaldehida (formolul) şi glutaraldehida. Ţesuturile sunt fixate
prin polimerizarea proteinelor. Acest tip de fixare nu modifică mult structura proteinelor acestea
păstrându-şi antigenicitatea, deci piesele fixate astfel pot fi studiate prin tehnici imunologice.
Formaldehida: - are putere de penetrare bună, dar acţiune lentă;
- soluţia standard este 10% formalină tamponată (tamponarea previne aciditatea care
favorizează autoliza); această soluţie se mai numeşte formol şi reprezintă fixatorul cel
mai frecvent utilizat în efectuarea preparatelor pentru microscopia optică.
- conservă proteinele fără a le precipita, fixează bine lipidele complexe dar nu are efect
pe lipidele neutre şi deşi nu este fixatorul de elecţie pentru glucide, acestea sunt
imobilizate în matricea proteică.
Glutaraldehida - are penetrare slabă, dar acţiune rapidă, piesele trebuie tăiate la cel mult 1 mm
grosime pentru a asigura pătrunderea fixatorului;
- dă cele mai bune detalii citoplasmatice globale şi nucleare;
- este folosită, de aceea, în microscopia electronică.
2. Fixatorii mercuriali - reprezentaţi, în principal, de clorura de mercur al cărei mecanism de acţiune
este necunoscut; intră în compoziţia amestecului fixator Zenker. Dau detalii nucleare excelente, şi
acţionează rapid, dar au penetrare slabă şi produc rigiditate.

27
3. Alcoolii – reprezentaţi de metanol şi etanol, sunt printre primii fixatori folosiţi. Etanolul conservă
glicogenul. Acţionează prin denaturarea proteinelor şi produc rigiditate şi fragilitate. De aceea folosirea
lor este recomandată mai mult pentru frotiuri. Acţionează rapid şi dau detalii nucleare bune. Sunt folosiţi
şi în amestecuri: alcool-formol, amestecul Carnoy etc.
4. Agenţii oxidanţi – sunt pemanganaţi (permanganatul de potasiu), dicromaţi (dicromatul de potasiu) şi
tetraoxidul de osmiu. Au ca mecanism polimerizarea proteinelor, dar produc denaturare severă. Au
aplicaţii specializate şi se folosesc mai rar. Există numeroase amestecuri (Fleming, Benda, Benoit etc).
Tetraoxidul de osmiu (acidul osmic) reacţionează cu lipidele nesaturate pe care le face vizibile datorită
formării unui precipitat negru de osmiu hexavalent.
5. Picraţii – sunt fixatori ce conţin acidul picric; cel mai cunoscut, frecvent utilizat este soluţia Bouin.
Mecanismul de acţiune este necunoscut. Dau detalii nucleare aproape la fel de bune ca fixatorii
mercuriali, fără să producă rigiditate marcată.
Exemple de amestecuri fixatoare folosite în practică:
Fixatorul Carnoy Alcool-formol
Etanol absolut 60 ml Etanol 96% 90 ml
Cloroform 30 ml Formalină 10 ml
Acid acetic galcial 10 ml Acetat de calciu 0.5 g

Fixatorul Zenker Soluţia Bouin

Apă distilată 95 ml Soluţie saturată apoasă de
Bicromat de potasiu 2.5 g acid picric 75 ml
Clorură de mercur 5g Formalină 25 ml
Acid acetic glacial 5 ml Acid acetic glacial 5 ml

Alegerea fixatorului se face ţinând cont de următoarele aspecte:

– gradul conservării morfologice pe care dorim să-l obţinem: fixarea se realizează în mod diferit
pentru microscopia electronică faţă de cea fotonică; în primul caz trebuiesc păstrate relaţiile între
constituenţii celulei la scară moleculară.
– natura constituenţilor chimici ce trebuie conservaţi: anumite structuri macromoleculare sunt mai
uşor de conservat (de exemplu proteinele), în timp ce alţii sunt foarte labili şi dificil de fixat,
(oligozaharidele).
– volumul fragmentelor tisulare ce trebuiesc conservate: fixarea unui frotiu celular este diferită de cea
a unui organ (de exemplu encefalul) unde pătrunderea fixatorului devine elementul esenţial al fixării.
– tipul reacţiilor histochimice sau de culoare pe care dorim să le efectuăm: fixarea este diferită când
folosim o coloraţie simplă, topografică sau când încercăm decelarea lipidelor sau enzimelor.
Pentru a facilita difuziunea cât mai rapidă a fixatorului în piesă, volumul de fixator trebuie sa fie
cel puţin de 10 ori mai mare decât volumul piesei. Rata de difuziune, care depinde atât de natura
fixatorului cât şi de tipul de ţesut, este factorul limitant în obţinerea conservării optime. De asemenea,
durata fixării depinde de natura fixatorului, precum şi de structura şi dimensiunile piesei şi poate fi de
câteva ore (fixatorul Carnoy) până la câteva zile (soluţia Bouin). Formolul dă rezultate bune după cel
puţin 24 de ore.
Spălarea este operaţiunea prin care se opreşte fixarea şi se îndepărtează excesul de fixator şi
a unor eventuale structuri false ce pot apare în preparat datorită unor defecte de fixare. În funcţie de
fixatorul folosit se poate face cu diferite substanţe: apa curgătoare pentru formaldehidă, alcool pentru
fixatori cu dicromat de potasiu sau alcool absolut pentru fixatorii pe bază de alcool (amestecul Carnoy).

28
 Deshidratarea
Este operaţiunea prin care se îndepărtează apa care există în piesă la sfârşitul fixării/spălării.
Acest pas este necesar deoarece majoritatea mediilor de includere nu sunt solubile în apă. Se
desfăşoară în două etape: deshidratarea propriu-zisă şi clarificarea.
Deshidratarea propriu-zisă se face cu etanol în băi de concentraţii succesiv crescute (70%,
95% şi 100%). Prin difuziune alcoolul înlocuieşte treptat apa din ţesuturi. Durata depinde mărimea
fragmentelor, în medie de 2-3 ore pentru fiecare baie de alcool.
Clarificarea, este operaţiunea prin care alcoolul din piesă este înlocuit cu o substanţă care este
miscibilă atât cu alcoolul cât şi cu parafina (solvenţi organici, de exemplu: xilenul, benzenul, toluenul,
cloroformul). Clarificarea constă , de asemenea în băi succesive de solvent organic, de obicei 3 băi de
xilen cu durată de 3-6 ore în funcţie de mărimea fragmentului. La sfârşitul operaţiunii de clarificare,
piesa devine translucidă (de aici şi denumirea acestei etape).

Includerea
Este etapa în care piesa este procesată într-o formă care să permită efectuarea de secţiuni
subţiri. Majoritatea ţesuturilor au o consistenţă moale, chiar şi după fixare, care nu permite tăierea unor
secţiuni destul de subţiri. De aceea este necesară includerea care constă în impregnarea şi înglobarea
piesei într-o substanţă solidificabilă, rezultând un bloc cu consistenţă solidă, omogenă.
Cel mai frecvent utilizat mediu de includere este parafina, cu o densitate asemănătoare
ţesuturilor, ce permite obţinerea de secţiuni cu grosimi de 3-10  m. Alte substanţe folosite sunt
celoidina, gelatina, iar pentru microscopia electronică răşinile sintetice.
Impregnarea la parafină: se utilizează parafina topită la, care e menţinută la aceasta
temperatură într-un termostat. Se trec piesele prin cel puţin 3 băi de parafină pentru a se îndepărta
orice urmă de solvent din piese.
Includerea propriu-zisă, sau turnarea blocului, constă în înglobarea pieselor în parafină
neutilizată, amestecată cu ceară 6-10 %, topită la 56°C. Amestecul este turnat într-o formă realizată
prin unirea a două bare metalice în formă de „L” (bare Leuckardt) care se asamblează realizând
„matriţe” de diferite mărimi in funcţie de dimensiunea pieselor ce urmează a fi incluse.
Piesa se introduce în parafină cu faţa care va fi secţionată spre fundul formei. Prin răcire la
temperatura camerei blocul se solidifică şi va putea fi secţionat.

Secţionarea şi aplicarea secţiunilor pe lamă

Blocul de parafină care conţine piesa este montat, în vederea secţionării, într-un aparat numit
microtom. Acesta este prevăzut cu un cuţit foarte ascuţit dispus orizontal şi cu un braţ mobil în care se
prinde blocul şi care se deplasează vertical pe cuţit, tăind secţiunile. La fiecare cursă verticală, braţul
mobil avansează orizontal cu o distanţă standard – grosimea secţiunii (câţiva microni, de regula 4 – 6
m). Prin mişcarea repetată a blocului în lungul cuţitului se obţin secţiuni seriate, care aderă una de
alta, formând o panglică.
Uneori includerea la parafină împiedică evidenţierea anumitor compuşi celulari. De exemplu,
lipidele sunt „spălate” din piese în timpul etapei de clarificare care precede includerea. Pentru
evidenţierea acestor compuşi, piesele se congelează după fixare (fără a fi incluse). Congelarea conferă
o consistenţă solidă ce permite secţionarea în secţiuni subţiri; se face rapid, de obicei prin introducerea
pieselor într-un gaz lichefiat (bioxid de carbon, azot lichid), şi apoi piesele se secţionează la un
microtom special numit criotom.
Secţiunile sunt apoi aplicate pe lama port-obiect. Pe lama de sticlă bine degresată se aplică o
picătură de albumină Mayer sau soluţie apoasă de gelatină care se întinde bine în lungul lamei.
Din panglica de secţiuni se taie fragmente de 3-4 secţiuni care aşează pe suprafaţa unei băi de
apă încălzită la aproximativ 56°C. Secţiunile se lasă să plutească până se descreţesc şi se întind
complet, apoi sunt preluate cu lama port-obiect. În continuare, lamele se ţin 24 de ore la termostat la
37°C, pentru ca secţiunile să se usuce şi să se lipească.

29
 Astfel procesate, preparatele permanente pot fi păstrate necolorate, ferite de praf şi lumina
timp îndelungat. Ele vor putea fi însă observate la microscop numai după efectuarea colorării.

Colorarea şi montarea lamelei

Este operaţiunea prin care diferitele componente tisulare şi celulare sunt evidenţiate pentru a
putea fi observate la microscop. Colorarea se face cu ajutorul unor soluţii de coloranţi care sunt în
marea lor majoritate soluţii apoase, mai rar alcoolice. Montarea lamelei se face cu ajutorul unor răşini
de tipul balsamului de Canada.
Datorită utilizării în tehnica secţiunilor fine atât a substanţelor anhidre, nemiscibile cu apa, cât si
a soluţiilor apoase, sunt necesare secvenţe intermediare de deshidratare şi rehidratare care să permită
accesul acestor agenţi la structurile tisulare (figura 3.2).
De aceea, înainte de colorarea propriu-zisă a secţiunilor la parafină, este necesară efectuarea
unei etape de rehidratare. Rehidratarea implică folosirea alcoolilor şi solvenţilor organici într-o secvenţă
inversă deshidratării prezentată anterior; se desfăşoară în doi timpi:
– Deparafinarea – se face prin trecerea lamelor cu secţiuni în bai de solvent organic;
– Hidratarea – se face prin trecerea secţiunilor în bai de alcool de concentraţii descrescătoare, ultima
baie fiind de apă.
Deoarece secţiunile au grosime mult mai mică decât piesele de ţesut, durata acestor băi este
de câteva minute pentru fiecare baie.
Se face apoi colorarea propriu-zisă cu coloranţii specifici pentru evidenţierea structurilor dorite.
Alegerea coloranţilor se face în funcţie de componentele celulare pe care dorim să le evidenţiem şi de
proprietăţile lor, prezentate în secţiunea următoare.
După colorare, lamele se spală, se usucă şi se acoperă cu o lamelă.
Montarea lamelei – are ca scop (1) protecţia mecanică a secţiunilor, (2) conservarea cât mai
mult timp posibil a coloranţilor şi (3) obţinerea unui indice de refracţie şi grad de transparenţă avantajos
din punct de vedere optic.
Pentru lipirea lamelei se foloseşte un mediu de montare cu indice de refracţie asemănător cu al
sticlei, cel mai utilizat fiind balsamul de Canada. Acesta este o răşină anhidră care nu este miscibilă cu
apa şi deci nu poate fi aplicată direct pe secţiunile colorate, ci numai după efectuarea unei etape de
deshidratare (băi de alcool de concentraţii crescătoare şi băi de solvent organic).
Montarea se realizează punând 1-2 picături din mediul de montare pe lama cu secţiunea
colorată, pe care se aplică o lamelă de sticlă. Preparatele astfel montate se pun la termostat la 37°C,
10-12 ore sau la temperatura camerei, dar ferite de praf, 1-2 zile, pentru uscarea şi uniformizarea
mediului de montare.

Figura 3.2 Colorarea şi montarea lamelei necesită secvenţe de hidratare şi deshidratare cu solvenţi
organici (S1, S2) şi bai de alcool etilic de concentraţii crescătoare (70 – 100) pentru deshidratare şi
descrescătoare (100 – 70 – apă distilată) pentru hidratare.

30
 3.3 COLORAREA ÎN MICROSCOPIA OPTICĂ

3.3.1 NOŢIUNI GENERALE

Colorarea are rolul de a face vizibile diferitele structuri celulare la microscopul fotonic.
Prelucrate la grosimea necesară observării la microscopul fotonic, celulele apar translucide; pentru a le
putea observa se utilizează coloranţi citologici. Aceştia sunt substanţe de natură organică, capabile
să coloreze selectiv şi durabil diferitele structuri celulare, conferindu-le culori specifice.
Pentru aceasta, un colorant are nevoie de:
- grupări atomice specifice ce conferă culoarea – grupări cromofore;
- grupări care permit o fixare permanentă a substanţei de colorat – grupări auxocrome (figura 1).
Grupările cromofore, din punct de vedere chimic, sunt grupări aromatice, sau alte grupări ce
conţin legături duble, nesaturate, conjugate. Aceste grupări au proprietatea de a modifica fasciculul de
lumină, absorbind radiaţii cu o anumită lungime de undă; fasciculul reflectat va apărea colorat în
culoarea complementară celei absorbite.
Un compus organic ce conţine grupări cromofore se numeşte şi “cromogen”. Un compus
cromogen nu este obligatoriu şi colorant, proprietatea de colorant fiind conferită şi de prezenţa simultană
a grupărilor auxocrome.
Grupările auxocrome sunt, din punct de vedere chimic, grupări simple fără duble legături,
polare sau semipolare. Principalii auxocromi sunt grupările hidroxil, amino, carboxil, cian, sulfonil. Ele
permit ataşarea coloranţilor de substratul celular prin stabilirea de legături chimice cu grupările acestuia.

Figura 3.3 Reprezentare schematică a alcătuirii coloranţilor şi a modului cum influenţează proprietăţile
fasciculului luminos.

Clasificarea coloranţilor
Coloranţii se împart:
După origine:  naturali  de origine animală (carminul) sau de origine vegetală (hematoxilina)
 sintetici  majoritatea coloranţilor;
După natura auxocromilor, ce determină şi comportamentul lor în soluţie, coloranţii se împart în:

31
– Coloranţi acizi sau citoplasmatici – acei coloranţi care colorează componentele celulare încărcate
pozitiv. Exemple de coloranţi acizi: eozina, albastru de anilină, orange G (tabelul 1).
– Coloranţi bazici sau nucleari – care colorează componentele celulare încărcate negativ, cei mai
utilizaţi fiind hemalaunul, albastrul de metil, albastrul de toluidină;
– Coloranţi „neutri” – se obţin din soluţii apoase de coloranţi acizi şi bazici amestecaţi în anumite
proporţii (de exemplu eozinat de albastru de metilen şi eozinat de azur de metilen).

Coloranţi acizi culoarea Coloranţi bazici culoarea

Eozina roşu Hematoxilina Mayer violet
Fucsina acidă roşu Albastru de metilen albastru
Orange G portocaliu Albastru de toluidină albastru
Verde de lumină verde Verde de metil verde
Albastru de anilină albastru Pironina G roşu

Tabelul 1 Caracterul şi culoarea unor coloranţi.

Interacţiunea colorant – substrat celular

Mecanismele fixării coloranţilor pe structurile celulare sau tisulare sunt complexe, realizându-se
prin intermediul unor factori fizici şi a unor mecanisme chimice în proporţii variabile.
Mecanismele fizice sunt implicate în mică măsură în colorare şi sunt reprezentate în principal
de absorbţia coloranţilor în interiorul substratului. Un exemplu de colorare prin acest mecanism este
colorarea lipidelor cu coloranţi nepolari numiţi si lizocromi1 (Sudan III, Sudan black sau Oil red O) –
aceştia sunt substanţe hidrofobe solubile la limită în solvenţi polari. Când aceste soluţii de colorare vin
în contact cu structurile celulare, are loc transferul coloranţilor în lipidele tisulare ca urmare a solubilităţii
preferenţiale a acestor coloranţi în lipide.
Majoritatea reacţiilor de colorare sunt de natură chimică, proteinele reprezentând substratul
molecular la nivelul căruia se ataşează coloranţii. Proteinele sunt substanţe amfotere, având atât
grupări acide cât şi bazice. La pH-ul fiziologic, proteinele tisulare specifice pot prezenta încărcătură
netă pozitivă sau negativă – ceea ce determină afinitatea pentru coloranţi. Coloranţii formează legături
ionice cu grupările încărcate ale proteinelor astfel:
 proteinele încărcate negativ la pH fiziologic vor fixa coloranţi bazici; structurile astfel colorate se
numesc bazofile. Exemple de structuri bazofile: acizii nucleici (conţin numeroase grupări fosfat) din
nucleu, nucleol, ribozomi; mucopolizaharidele din substanţa fundamentală a matricei extracelulare
(conţin grupări carboxil şi sulfat).
 proteinele încărcate pozitiv vor fixa coloranţi acizi; structurile astfel colorate se numesc acidofile (sau
eozinofile când colorantul acid folosit este eozina). Exemple de structuri acidofile: citoplasma, colagenul,
keratina, hemoglobina şi proteinele din celulele musculare. Acestea conţin în număr mare grupări
amino şi derivaţi ai acestora.
Odată legaţi de substrat, coloranţii conferă structurilor colorate propria culoare – fenomen
numit colorare ortocromatică. Există însă anumiţi coloranţi care, în contact cu anumite structuri celulare,
îşi pot altera uşor structura chimică. Acest fapt duce la modificarea spectrului radiaţiilor absorbite şi, în
consecinţă, a culorii care se observă. Fenomenul prin care un colorant conferă unei anumite structuri
celulare o culoare diferită de culoarea sa se numeşte colorare metacromatică sau metacromazie. Cel
mai frecvent exemplu de folosire în practică a metacromaziei este colorarea în violet a granulaţiilor
mastocitelor cu albastru de toluidină.; alţi coloranţi care prezintă proprietatea de a colora metacromatic
structurile celulare sunt albastrul şi azurul de metilen folosiţi la colorarea frotiurilor.
Clasificarea metodelor de colorare

1
Lizo = soluţie, solubil (gr.); croma = culoare (gr.) – lizocromi = coloranţi solubili (în grăsimi)

32
 Metodele de colorare se clasifică după următoarele criterii:
După numărul coloranţilor utilizaţi:
– simple când se foloseşte un singur colorant, de exemplu colorarea cu albastru de toluidină;
– combinate, când secţiunile se colorează succesiv cu doi sau mai mulţi coloranţi (dublă:
hematoxilină  eozină, triplă: hematoxilină  fuxină acidă  albastru de anilină, sau coloraţia
Masson) sunt folosite pentru colorarea în mod diferenţiat a diferitelor elemente ale unui ţesut.
După folosirea sau nu a adjuvanţilor:
– directe, atunci când colorantul se fixează prin simplul contact cu secţiunea (colorarea cu eozină);
– indirecte sau prin mordansare când este necesară prezenţa unui mediator sau mordant (alaunuri,
iodul, sărurile de fier etc) care fixează colorantul de componentele celulare; combinaţia dintre
colorant şi mordant se numeşte lac.
După intensitatea colorării:
– progresive – se fac încercări succesive sub control microscopic până se ajunge la tenta de culoare
optimă a structurii celulare, după care se opreşte colorarea prin spălare;
– regresive – se face o supracolorare care prinde şi alte structuri celulare decât cele dorite, după
care excesul de colorant este îndepărtat prin substanţe decolorante sau diferenţiatori (de exemplu
la colorarea cu hematoxilină ferică Heindenhain, este necesară diferenţierea cu alaun de fier
amoniacal pentru a rămâne colorată numai cromatina nucleară).
După starea materialului:
– coloraţii vitale care se fac pe celule în stare vie prin utilizarea unor coloranţi vitali şi care persistă
numai atât timp cât supravieţuieşte celula; se utilizează pentru evidenţierea unor organite celulare
(de exemplu mitocondriile se colorează cu verde Janus B, iar aparatul Golgi cu roşu neutru).
– coloraţii perrmanente care se execută la colorarea unor preparate permanente.
Dupa structurile pe care le colorează:
– uzuale (de rutină) – evidenţiază structura generală a celulei, făcând posibilă observare formei,
numărului celulelor, morfologiei nucleilor, caracterul acidofil sau bazofil al citoplasmei. Exemple:
coloraţia hematoxilină – eozină, coloraţiile tricromice.
– specifice – evidenţiază specific anumiţi constituenţi sau structuri celulare, datorită legării anumitor
coloranţi numai la nivelul acestor structuri. Exemple: glicogenul este evidenţiat cu coloraţia PAS,
ADN-ul cu coloraţia Feulgen, lipidele cu Sudan, fibrele de reticulină cu impregnare argentică, fibrele
de reticulină cu orceină, etc.

3.3.2 COLORAŢII FRECVENT UTILIZATE ÎN EVIDENŢIEREA STRUCTURILOR CELULARE

Coloraţii de rutină – vom prezenta trei coloraţii frecvent utilizate în demonstrarea de rutină a
structurii generale a celulelor:
Coloraţia hematoxilină – eozină;
Coloraţia tricromică Masson;
Coloraţia May-Grünwald – Giemsa pentru colorarea frotiurilor.

Coloraţia hematoxilină – eozină (HE)

Hematoxilina este un colorant natural extras din lemnul unor arbori1 din America de Sud şi
India. În stare naturală nu are proprietăţi colorante, ci numai după oxidarea la hemateină, ea însăşi un

1
haimato = sange; xylon = lemn (gr.); hematoxilina a fost denumită astfel datorită culorii roşu închis în stare naturală şi
metodei de obţinere din lemn.

33
colorant destul de slab. Cuplată cu diferite săruri metalice (mordanţi) care asigură legarea de ţesuturi,
este unul din cei mai buni coloranţi nucleari.
Hematoxilina folosită în această coloraţie este de fapt un hemalaun (foloseşte ca mordant o
sare de aluminiu), numit şi hematoxilină Mayer de culoare violet.
Eozina este un colorant sintetic din clasa xantinelor. Cea mai frecvent utilizată în combinaţie cu
hematoxilina este eozina Y (yellowish = gălbuie), de culoare roşu-portocaliu. Prezintă şi fluorescenţă,
dar aplicaţiile sale ca şi colorant acid sunt mult mai extinse decât cele ca fluorocrom.
Tehnica de colorare: coloraţia hematoxilină – eozină este o coloraţie combinată, dublă care
foloseşte succesiv un colorant bazic şi unul acid. Etape:
1. Secţiunile la parafină se rehidratează (vezi capitolul 3.1);
2. Lamele se introduc într-o baie de hemalaun, timp de 5-10 min.;
3. Spălarea în apă curgătoare 5-10 min.;
4. Diferenţierea în ‚alcool clorhidric’ (alcool 96% - 100 ml, soluţie de acid clorhidric – 0.5 ml),
când nucleii sunt supracoloraţi, câteva secunde;
5. Virare în soluţie saturată de carbonat de litiu (culoarea virează în albastru), timp de 5
minute.
6. Secţiunile se introduc într-o soluţie apoasă de eozină 1%, timp de 1-2 min.;
7. Spălarea cu apă distilată câteva secunde pentru îndepărtarea excesului de colorant;
8. Deshidratarea şi montarea lamelei.
Rezultatele colorării cu HE: (figura 3.4)
Nucleii albastru-violet
Nucleolii albastru
Citoplasma roz
Ergastoplasma albastru
Colagen roz intens

Coloraţia tricromică Masson

Denumirea de coloraţie tricromică vine de la utilizarea a trei coloranţi pentru evidenţierea
diferitelor structuri tisulare (regulă nu totdeauna respectată de unele coloraţii „tricromice”). În general
este folosit un colorant bazic şi doi coloranţi acizi (sau mai mulţi) care colorează diferenţiat structurile
tisulare datorită fenomenului de competiţie1.
Colorantul nuclear (bazic) este primul folosit – în coloraţia Masson este, de regulă,
hematoxilina ferică Weigert, de culoare neagră. Se aplică apoi colorantul citoplasmatic – fuxina acidă,
care se fixează pe structurile acidofile. Prin folosirea unui poliacid (acidul fosfomolibdenic) se desprinde
fuxina de pe anumite structuri (fibre). Se aplică apoi al doilea colorant acid – albastru de anilină, care va
colora structurile decolorate de acid. In acest fel se creează un contrast între structuri cu aceeaşi
încărcare, care astfel pot fi diferenţiate.
Tehnica de colorare: este o coloraţie combinată, triplă, regresivă în care se folosesc succesiv
un colorant bazic şi doi coloranţi acizi. Etape:
1. Secţiunile la parafină se rehidratează;
2. Lamele se introduc într-o baie de hematoxilină ferică Weigert, 10 minute, se spală în apă
de la robinet;
3. Diferenţiere în alcool clorhidric, spălare în apă de la robinet;
4. Virare în carbonat de litiu, soluţie saturată, spălare în apă de la robinet;
5. Colorare cu fuxină acidă Masson, 10 minute, spălare cu apă distilată;

1
fenomenul de competiţie apare atunci când, la folosirea succesivă a doi coloranţi cu aceeaşi afinitate tisulară, primul este
dislocuit de pe anumite structuri dar rămâne fixat pe altele.

34
 6. Diferenţiere cu acid fosfomolibdenic, 5 minute, spălare cu apă distilată;
7. Colorare cu albastru de anilină, 5-10 minute, spălare cu apă distilată;
8. Diferenţiere în apă acidifiată, 4-5 minute;
9. Deshidratarea cu secvenţe de alcooli şi xilen şi montarea lamelei.
Rezultatele colorării cu Masson: (figurile 3.5, 3.14)
Nucleii negru
Citoplasma mov
Fibrele musculare, hematiile roşu
Colagen albastru

Coloraţia May-Grünwald – Giemsa (MGG)

Este o coloraţie folosită în studiul de rutină al elementelor figurate pe frotiul de sânge. Este o
coloraţie panoptică deoarece evidenţiază, pe lângă nucleii şi citoplasma acestor celule, şi elemente
specifice cum sunt granulaţiile leucocitelor granulare.
Există numeroase variante ale acestei coloraţii, cunoscute sub numele de coloraţii Romanovski
modificate. Cea utilizată in prezent foloseşte două soluţii de colorare neutre:
– soluţia May-Grünwald;
– soluţia Giemsa.
Soluţia May-Grünwald este un amestec de eozină şi albastru de metilen, care precipită în
soluţie apoasă sub formă de eozinat de albastru de metilen. Precipitatul se dizolvă apoi în alcool metilic
pur, la care se adaugă glicerină neutră pentru o mai bună stabilitate a soluţiei.
Soluţia Giemsa se prepară în mod similar din eozină şi azur de metilen, cu exces de colorant
bazic (azur de metilen).
Diluate în apă chiar înainte de folosire soluţiile devin ionizare şi coloranţii se vor fixa pe
structurile celulare pentru care au afinitate – eozina pe structurile încărcate pozitiv şi albastrul şi azurul
de metilen pe cele încărcate negativ.
Albastrul de metilen şi azurul de metilen sunt coloranţi bazici din clasa tiazinelor. Ca şi albastrul
de toluidină, un alt colorant din această clasă, ei prezintă proprietatea de metacromazie când vin în
contact cu anumite structuri celulare (de exemplu granulaţiile bazofilelor).
Tehnica de colorare: este o coloraţie combinată dublă, în care se folosesc succesiv două soluţii
de colorare neutre:
1. Pe lamele aşezate cu frotiul în sus se picură 10-15 picături din soluţia May-Grümwald,
pentru a se acoperi toată suprafaţa frotiului.
Se lasă 2-3 min., timp în care se produce o fixare a frotiului, alcoolul metilic din colorantul May-
Grümwald acţionând ca un fixator.
2. Se toarnă apoi peste soluţia May-Grümwald un număr egal de picături de apă distilată
neutră. Soluţia May-Grümwald diluată acţionează ca un colorant, colorând granulaţiile acidofile
şi neutrofile. Se lasă 1-2 min.
3. Se îndepărtează soluţia May-Grümwald diluată fără spălare, prin înclinarea lamelor,
după care se acoperă frotiurile cu soluţia Giemsa diluată 1/1 cu apă distilată neutră. Se lasă
15-20 min.
4. Se spală lama sub jet de apă.
5. Se sugativează uşor, se usucă.
6. Se examinează la microscop – cu obiectivul cu imersie pentru a observa morfologia
eritrocitelor, frecvenţa şi morfologia leucocitelor (se poate întocmi formula leucocitară) şi,
eventual, frecvenţa şi morfologia trombocitelor (pentru a putea observa trombocitele se
colorează 45 min. cu soluţia Giemsa şi nu se spală sub jet deoarece jetul de apă antrenează
trombocitele).

35
 Rezultatele colorării cu MGG: (vezi figurile 3.27 şi 28)

Nucleii violet – de diferite intensităţi în funcţie de

tipul de cromatină
Citoplasma eritrocitelor roz
Citoplasma bazofilă albastru deschis
Trombocitele albastru-violet
Granulaţiile neutrofile brun-violet
Granulaţiile bazofile albastru-violet închis
Granulaţiile acidofile roz intens

Coloraţii specifice
Coloraţiile specifice permit evidenţierea anumitor substanţe sau a unor structuri celulare şi a
localizării lor intracelulare, diferenţiat faţă de restul componentelor celulare. Colorarea diferenţiată a
elementelor celulare pe baza proprietăţilor chimice specifice poartă numele de citochimie. În
continuare vom prezenta:
I. Evidenţierea unor compuşi chimici intracelulari: acizii nucleici, glucidele, lipidele;
II. Evidenţierea elementelor matricei extracelulare: substanţa fundamentală, fibrele de colagen,
reticulină, elastină;
III. Evidenţierea organitelor celulare: ergastopasma, aparatul Golgi, lizozomii, mitocondriile,
neurofibrilele.

I. Evidenţierea compuşilor chimici intracelulari

I.1. Evidenţierea acizilor nucleici
Acizii nucleici (ADN şi ARN) sunt macromolecule încărcate negativ cu afinitate pentru coloranţii
bazici din coloraţiile de rutină. Există două metode mai frecvent utilizate pentru evidenţierea specifică a
acizilor nucleici: reacţia Feulgen care pune în evidenţă ADN-ul şi coloraţia verde de metil – pironină
care evidenţiază atât ADN-ul cât şi ARN-ul. Se folosesc preparate prin secţiuni fine fixate cu fixatori
alcoolici (de exemplu fixatorul Carnoy) pentru obţinerea unor rezultate optime.
Reacţia Feulgen
Se bazează pe hidroliza acidă a ADN-ului cu acid clorhidric diluat, cu formarea de grupări
aldehidice, urmată de colorarea cu reactivul Schiff pentru punerea în evidenţă a acestor grupări. Pentru
evidenţierea structurii generale a celulei se poate folosi o colorare de fond cu verde luminos.
Tehnica este specifică pentru ADN (nu colorează şi ARN-ul); în plus, întrucât după tratarea cu
acid clorhidric singurele grupări aldehidice sunt cele provenite din ADN, reacţia Feulgen este şi o
reacţie cantitativă pentru ADN, cu ajutorul densitometriei putându-se măsura cantitatea de ADN din
celulă1.
Rezultatele coloraţiei: nucleii apar coloraţi în violet; celelalte componente celulare apar
necolorate (figura 3.6), sau verde deschis dacă s-a folosit colorarea de fond cu verde luminos.
Coloraţia verde de metil – pironină
Diferenţiază structurile care conţin ADN (nucleul) de cele care conţin ARN (ribozomii şi
nucleolul). Verdele de metil se fixează pe structura dublu-catenară a ADN-ului, pe care îl colorează in
verde albăstrui. Pironina se fixează pe ARN, datorită prezenţei regiunilor monocatenare cu baze
purinice şi pirimidinice libere. ARN-ul se colorează în roşu cu pironina. Coloraţia dă rezultate mai bune
pe celulele cu ribozomi abundenţi în citoplasmă (de exemplu hepatocitele, celulele secretorii).
1
Reacţia Feulgen a stat la baza analizei cantitative a ADN corelată cu faza ciclului celular, găsindu-se celule care aveau o
cantitate dublă de ADN în interfază, deşi nucleii lor aveau acelaşi aspect. Acest fapt a dus la împărţirea interfazei celulei în
perioadele G1, S şi G2 şi au putut fi identificate celulele în care a avut loc sinteza de ADN în perioada S a interfazei, ca
având cantitate dublă de ADN.

36
 Rezultatele coloraţiei: nucleii – verde albăstrui, citoplasma – roz palid până la roşu, nucleolul –
roşu (figura 3.7).
I.2. Evidenţierea glicogenului şi a glucidelor complexe
Glicogenul este forma de depozit a glucozei în celulele animale. Este abundent în celulele
hepatice şi în fibrele musculare striate. Pentru rezultate bune, piesele trebuie fixate în fixatori alcoolici
(fixatorii apoşi, cum este formolul, nu sunt indicaţi). Poate fi pus in evidenţă prin două tehnici mai
cunoscute:
Coloraţia cu carmin Best
Mecanismul prin care carminul se ataşează specific de glicogen nu este cunoscut. Se foloseşte
o soluţie apoasă de carmin şi, de regulă, o colorare de fond cu hematoxilină.
Rezultatele coloraţiei: depozitele de glicogen apar colorate in roşu (figura 3.8).
Coloraţia cu acid periodic – Schiff (PAS)
Coloraţia PAS pune în evidenţă grupările glicol învecinate în glucide.
Acidul periodic transformă aceste grupări în grupări aldehidice, care apoi sunt puse în evidenţă
cu reactivul Schiff. Se face o coloraţie de fond cu hematoxilină sau HE.
Rezultatele coloraţiei: granulele de glicogen apar colorate în roşu-violet (figura 3.9).
Mucopolizaharidele sunt glucide complexe legate de proteine. Acestea, împreună cu alte
glicoproteine, se găsesc ataşate la suprafaţa celulei şi intră în alcătuirea substanţei fundamentale a
matricei extracelulare şi a membranelor bazale. De asemenea, unele celule secretoare de mucus
prezintă depozite citoplasmatice de mucopolizaharide care sunt secretate în lumenul unor organe
(intestin, plămân).
Se pot evidenţia prin:
Colorate cu albastru alcian mucopolizaharidele şi glicoproteinele acide apar colorate în
albastru deschis, iar cu coloraţia PAS apar colorate în roşu violet (figurile 3.10 şi 11) . Spre
deosebise de albastru alcian, care este un colorant bazic şi colorează glicoproteinele şi
mucopolizaharidele acide, colorantul Sfhiff din coloraţia PAS colorează şi structuri neutre cum sunt
glicogenul şi glicocalixul de la suprafaţa celulei.
I.3. Evidenţierea lipidelor
Lipidele neutre, de depozit, pot fi evidenţiate la microscopul optic deoarece formează în
citoplasmă depozite de dimensiuni relativ mari. În adipocite, lipidele formează picături mari care ocupă
toată citoplasmă împingând nucleul la periferie; în alte tipuri de celule, de exemplu în hepatocite, sunt
dispuse sub formă de picături mici răspândite în citoplasmă.
Pe preparatele de rutină, incluse la parafină şi colorate HE, lipidele nu se pot pune în evidenţă.
Pentru evidenţierea lipidelor, preparatele trebuie secţionate la gheaţă, cu criotomul – nu se includ la
parafină deoarece solvenţii organici utilizaţi în tehnică solubilizează şi înlătură lipidele din piesă; de
asemenea, datorită proprietăţilor coloranţilor folosiţi (lizocromi, extrem de solubili in solvenţii organici),
preparatele nu pot fi montate cu medii anhidre care necesită deshidratare şi clarificare, ci se va folosi
un mediu de montare apos cum e gelatina.
Colorarea lipidelor se face cu lizocromi (coloranţi solubili in grăsimi). Mecanismul prin care
aceşti coloranţi se fixează pe lipide a fost prezentat anterior. Cei mai utilizaţi lizocromi sunt coloranţii
Sudan (Sudan III colorează lipidele în roşu portocaliu – figura 3.12, Sudan IV în roşu violet şi Sudan B
în negru-albăstrui).
Un alt agent care colorează lipidele este tetraoxidul de osmiu, care este şi un bun fixator
al lipidelor, interacţionând cu acizii graşi (figura 3.13).

II. Evidenţierea componentelor matricei extracelulare

Matricea extracelulară este alcătuită din substanţă fundamentală şi proteine fibroase care
conferă ţesuturilor rezistenţă la solicitările mecanice. Substanţa fundamentală este compusă in principal
din mucopolizaharide, şi se colorează cu coloranţii specifici pentru acestea (albastru alcian, PAS).
Fibrele sunt colagenul (prezent în cantităţi mari în piele, oase, ligamente şi tendoane), reticulina (un tip

37
particular de colagen care formează stroma organelor parenchimatoase) şi elastina (prezentă în derm,
pereţii vaselor de sânge, plamân, ş.a.).
II.1. Evidenţierea fibrelor de colagen
Colagenul poate fi evidenţiat prin coloraţiile tricromice care colorează citoplasma celulelor şi
fibrele musculare diferit de fibrele de colagen. O astfel de coloraţie a fost prezentată anterior, la
coloraţiile de rutină – coloraţia Masson. Există numeroase coloraţii tricromice, majoritatea folosesc
albastrul de anilină sau verdele luminos pentru evidenţierea fibrelor de colagen.
Rezultatele unor coloraţii tricromice:
Coloraţia Masson  colagenul apare colorat în albastru intens cu albastru de anilină
(figurile 3.5 şi 14);
Coloraţia Goldner – Szekely – colagenul apare colorat în verde cu verde luminos
(figura 3.15);
Coloraţia van Gieson – colagenul apare colorat în roşu cu fucsina acidă (figura 3.16).
Mecanismul prin care colagenul apare colorat diferit de alte structuri acidofile este acelaşi
pentru majoritatea coloraţiilor tricromice, explicat prin fenomenul de competiţie între coloranţii acizi
folosiţi, facilitată de diferenţierea cu acid fosfotungstic (un polianion).
II.2. Evidenţierea fibrelor de reticulină
Ca şi alte structuri din ţesuturi, fibrele de reticulină prezintă afinitate pentru sărurile de argint,
putând fi observate după colorarea secţiunilor cu astfel de săruri. Coloraţiile cu argint (de regulă nitrat
de argint) sunt reunite sub denumirea generică de impregnare argentică.
Rezultatele coloraţiei: fibrele de reticulină apar colorate în negru; nucleii celulelor apar coloraţi
în gri palid, sau în violet dacă se foloseşte hematoxilina pentru colorarea de fond (figura 3.17).
II.3. Evidenţierea fibrelor de elastină.
Elastina se poate observa pe preparatele colorate HE sub formă de fascicule sinuoase colorate
în roz. Fibrele de elastină se pot evidenţia specific cu orceină când apar colorate în brun-roşcat sau
cu rezorcină când se colorează în negru-albăstrui(figura 3.18).

III. Evidenţierea organitelor celulare

III.1. Evidenţierea reticulului endoplasmic rugos (REr)
REr a fost identificat pe preparatele de microscopie optică sub formă de agregate bazofile în
citoplasma celulelor cu activitate metabolică intensă (hepatocite, celule secretorii, neuroni).
Aglomerările de REr au fost denumite diferit în funcţie de localizare (de exemplu în hepatocite se
numesc corpi Berg, în neuroni corpi Nissl sau corpi tigroizi) sau, în general, ergastoplasmă. Prezenţa
ribozomilor pe suprafaţa REr este motivul pentru bazofilia acestor structuri, care deci se vor colora cu
coloranţii bazici din coloraţiile de rutină.
O coloraţie specifică pentru evidenţierea REr este coloraţia cu violet de crezil prin care
se evidenţiază corpii Nissl în neuroni. Corpii Nissl apar coloraţi în violet ocupând toată citoplasma,
nucleul apare palid cu nucleol mare violet (figura 3.19).
III.2. Evidenţierea aparatului Golgi
Aparatul Golgi este bine reprezentat în celulele cu rol în secreţie. Este alcătuit din cisterne
membranoase care apar necolorate în coloraţiile de rutină, cum ar fi HE.
Poate fi evidenţiat pe preparate vitale cu coloraţia cu roşu neutru, unde apare ca regiuni
citoplasmatice cu dimensiuni variabile colorate în roşu (figura 3.20).
Pe preparatele permanente poate fi evidenţiat cu tetraoxid de osmiu, sau cu
impregnare argentică, apărând colorat în negru (figura 3.21).
III.3. Evidenţierea lizozomilor
Lizozomii sunt organite sub limita de rezoliţie a microscopului fotonic. Totuşi pot fi demonstraţi
pe preparatele de microscopie optică prin imunocitochimie – cu anticorpi marcaţi împotriva enzimelor
lizozomale (de exemplu fosfataza acidă, enzimă care se întâlneşte doar în lizozomi).

38
 O altă metodă este colorarea intravitală cu substanţe inerte care sunt fagocitate de
magrofagele din organe si înglobate în lizozomi. O astfel de metodă este injectarea animalelor de
experienţă cu tuş de India, şi apoi sacrificarea lor şi efectuarea de preparate microscopice din
ţesuturile bogate în celule ale sistemului reticulo-histiocitar (de exemplu din ficat). Macrofagele apar
colorate în negru datorită acumulării în citoplasmă de lizozomi care au înglobat tuş de India (figura
3.24).
III.4. Evidenţierea mitocondriilor
Mitocondriile pot fi observate pe preparate vitale colorate cu verde Janus unde apar sub
formă de bastonaşe sau granulaţii fine colorate în negru verzui. Pe preparatele permanente fixate cu
agenţi oxidanţi cum ar fi tetraoxidul de osmiu şi bicromatul de potasiu, şi colorate cu hematoxilină
Heidenhein (un lac feric de hematoxilină) se pot observa după diferenţiere, când majoritatea
structurilor bazofile se decolorează rămânând mitocondriile colorate în negru-brun (figurile 3.22, 23).
O altă metodă de evidenţiere, larg folosită în practică, este cea citoenzimologică când se
apreciază activitatea unor enzime specifice mitocondriale, cuplată cu o reacţie de culoare care pune în
evidenţă localizarea şi numărul mitocondriilor în celulă. Cel mai frecvent se foloseşte succinat-
dehidrogenaza, metodă care a fost amintită în capitolul introductiv.
III.5. Evidenţierea neurofibrilelor
Neurofibrilele sunt structuri din clasa filamentelor intermediare care intră în alcătuirea
neuronilor contribuind la menţinerea formei specifice a acestor celule.
Ele au fost puse în evidenţă pentru prima dată de Camillo Golgi prin metoda cu impregnare
argentică. Pe preparatele microscopice colorate cu nitrat de argint neurofibrilele apar ca o reţea de
filamente de culoare brună care se întretaie unind corpii neuronali (figura 3.25).

3.3.3 IMAGINI DE MICROSCOPIE OPTICĂ1 – EVIDENŢIEREA CITOCHIMICĂ A STRUCTURILOR

CELULARE ŞI EXTRACELULARE

Figura 3.4 Secţiune prin mucoasa colecistului Figura 3.5 Secţiune prin muşchi striat colorată
colorată cu hematoxilină – eozină. Se observă cu coloraţia Masson. Se observă nucleii negri,
celule cu nuclei violet de diferite intensităţi şi fibrele musculare roşii, fibrele de colagen
citoplasma roz. albastre.

1
Imaginile provin din histoteca proprie, precum şi din sursele bibliografice 4, 6, 9, 13, 16.

39
Figura 3.6 Hepatocite colorate prin reacţia Figura 3.7 Celule din acinii pancreatici colorate
Feulgen. Se observă nucleii coloraţi în violet şi cu verde de metil – pironină. Se observă nucleii
depozite pigmentare. Structura generală apare coloraţi verde albăstrui, nucleolul roşcat şi
necolorată. citoplasma colorată în roşu.

Figura 3.8 Hepatocite colorate cu carmin Best. Figura 3.9 Hepatocite colorate cu PAS -
Depozitele de glicogen din citoplasmă apar hematoxilină. Depozitele de glicogen din
colorate în roşu. citoplasmă apar colorate în roşu- violet. Nucleii
hepatocitelor apar coloraţi în violet.

40
Figura 3.10 Secţiune prin colon colorată cu
albastru alcian. Se observă numeroase celule
secretante de mucus (celule caliciforme) cu
depozite de mucus la polul apical. Structura
generală apare necolorată.
Figura 3.12 Adipocite colorate cu Sudan III; se
observă depozite de grăsimi care ocupă toată
citoplasma, colorate în roşu portocaliu.
41
Figura 3.11 Secţiune prin colon colorată cu
PAS – HE. Celulele caliciforme apar colorate în
roşu-violet datorită depozitelor de mucus. Se
observă cum mucusul se elimină in lumen la
polul apical. Structura generală este colorată cu
HE: nucleii în violet şi citoplasma în roz.
Figura 3.13 Ţesut adipos multilocular fixat şi
colorat cu tetraoxid de osmiu. Se observă
depozite de lipide de dimensiuni mai mici
răspândite în citoplasmă colorate în brun.
Figura 3.14 Secţiune prin piele colorată cu
coloraţia tricromică Masson. Se observă celulele
din epiderm cu nuclei negri si citoplasma violet,
fibrele de colagen colorate în albastru şi fibrele
musculare colorate în roşu.
Figura 3.16 Secţiune prin glanda sudoripară
colorată cu coloraţia van Gieson. Se observă
nucleii coloraţi în brun, citoplasma celulelor în
galben şi colagenul în roşu.
42
Figura 3.15 Secţiune prin nervul optic colorată
cu coloraţia tricromică Goldner-Szekely – nucleii
celulelor sunt coloraţi în negru, fibrele de colagen
apar colorate în verde, fibrele nervoase apar
colorate în roşu.
Figura 3.17 Secţiune prin splină colorată prin
impregnare argentică. Se observă fibrele de
reticulină colorate în negru. Prin colorare de fond
cu hematoxilină, nucleii celulelor apar coloraţi în
violet.
Figura 3.18 Secţiune prin lobul urechii colorată Figura 3.19 Neuroni coloraţi cu violet de crezil.
cu orceină. Se observă ţesutul conjunctiv bogat Se observă în citoplasmă granulaţiile
în fibre elastice colorate în brun-roşcat. caracteristice denumite corpi Nissl colorate în
violet. Nucleul este palid cu nucleol proeminent.

Figura 3.20 Neuroni coloraţi cu roşu neutru – Figura 3.21 Neuroni coloraţi cu tetraoxid de
coloraţie vitală pentru aparatul Golgi. Acesta osmiu în care se observă aparatul Golgi bine
apare sub forba unor zone colorate roşu intens reprezentat sub formă de structuri citoplasmatice
perinucleare; nucleul apare palid. perinucleare colorate în negru brun.

43
Figura 3.22 Preparat din rinichi, colorat Figura 3.23 Secţiune prin ficat, colorată cu
supravital cu verde Janus. Se observă hematoxilină ferică Heidenhein. Se observă
mitocondriile abundente în citoplasma mitocondriile în citoplasmă, aglomerate sub
nefrocitelor sub formă de granulaţii fine colorate formă de bastonaşe, colorate negru-brun. Nucleii
în negru-verzui. hepatocitelor s-au decolorat in urma diferenţierii.

Figura 3.24 Ficat colorat intravital cu tuş de
India, apoi prelucrat prin secţiuni fine şi colorare
de fond HE. Se observă numeroase macrofage
hepatice (celule Kupffer) care au ingerat tuşul de
India care marchează compartimentul lizozomal
al acestor celule.
Figura 3.25 Preparat din ţesut nervos colorat cu
impregnare argentică. Se observă neurofibrilele,
atât la nivelul corpului neuronal, cât şi la nivelul
prelungirilor neuronale, colorate în brun.

44
 3.4 METODA ETALĂRII MATERIALULUI BIOLOGIC ÎN MONOSTRAT

Etalarea materialelor biologice într-un singur strat este o tehnică rapidă prin care se pot studia
individual celule întregi. Este cea mai potrivită metodă când se doreşte studierea dinamicii celulare;
spre deosebire de metoda secţiunilor fine în care celulele sunt fixate şi apoi secţionate, prin metoda
etalării materialului biologic pot fi realizate şi preparate proaspete, cu celule în stare vie.
Atunci când pe lama port-obiect se etalează fluidele, preparatul se numeşte frotiu, iar când se
etalează ţesuturi solide, se numeşte amprentă de organ.

3.4.1 TEHNICA EFECTUĂRII FROTIURILOR

Frotiul este un preparat microscopic care se realizează prin etalarea în monostrat pe lame port-
obiect a probelor fluide. Aceste preparate se efectuează fie din sânge, fie din secreţii (mamare,
bronşice, vaginale), fie din celule provenite din descuamări epiteliale sau exfoliere, din sedimente
celulare (urină, suc gastric, bilă, LCR, lichid de ascită sau lichid pleural). Studierea celulelor din fluide
prin tehnica frotiului se numeşte citologie.

Tehnica efectuării frotiului de sânge

Studiului sângelui se efectuează prin tehnici cantitative (numărători), calitative şi biochimice. În
Biologia celulară se studiază caracterele morfologice ale elementelor figurate sangvine (tehnici
calitative).
Examenul morfologic al elementelor celulare se face pe preparate proaspete (necolorate sau
colorate supravital) sau pe preparate permanente, fixate şi colorate prin tehnici de colorare obişnuite
sau speciale.
Principiul – efectuarea frotiului constă în întinderea pe o lamă port-obiect curată a unei picături
de sânge, într-un strat subţire şi uniform. Etape:
1. Recoltarea sângelui la adult se face prin puncţionarea părţii laterale a pulpei mediusului sau
inelarului. Se dezinfectează pulpa degetului inelar cu un tampon de vată îmbibat în alcool; se
puncţionează locul dezinfectat cu un ac steril. Prima picătură se şterge cu o compresă uscată,
deoarece conţine prea mult lichid interstiţial şi impurităţi de pe piele.
2....Efectuarea frotiului propriu-zis – a doua picătură se recoltează cu marginea mică a unei lame
rodate şi se aplică pe una din extremităţile unei lame port-obiect aşezată orizontal pe o suprafaţă plană.
La contactul cu lama port-obiect, se imprimă lamei rodate câteva mişcări de lateralitate pentru ca
sângele să se întindă pe toată linia de contact. Se imprimă apoi lamei rodate o unică mişcare de
translaţie în lungul lamei port-obiect (figura 3.26).

a) b) c)

Figura 3.26 Efectuarea frotiului. a) recoltarea unei picături de sânge; b) aplicarea lamei rodate pe lama
port-obiect; c) etalarea picăturii de sânge în lungul lamei port-obiect.

45
 Un frotiu este bine executat dacă: (1) are marginile drepte, (2) se termină în franjuri, (3) are o
grosime potrivită (elementele figurate să nu fie suprapuse, dar să fie în număr suficient de mare pentru
a putea fi studiate).
Executarea unui frotiu corect depinde de:
– mărimea picăturii de sânge;
– unghiul dintre lama rodată şi lama port-obiect, care trebuie să fie de 30 – 35°;
– viteza de întindere – la viteză mai mare se obţine un frotiu mai gros.
3....Fixarea frotiului se realizează prin metode fizice – uscarea (desicarea) la temperatura camerei, prin
agitarea lamei pentru a obţine o uscare rapidă (uscarea lentă duce la ratatinarea celulelor); sau prin
metode chimice – cu alcool metilic timp de 2 minute sau alcool etilic şi eter în părţi egale, timp de 5 - 15
minute.
4....Colorarea frotiului – cu tehnici de colorare obişnuite (hematoxilină eozină, tricromic), sau folosind
tehnici speciale. În practica medicală se foloseşte coloraţia dublă panoptică May-Grünwald  Giemsa.

Celulele sângelui periferic evidenţiate prin coloraţia May-Grünwald 

Giemsa (MGG)

Eritrocitul – (hematia) are un diametru de aproximativ 7,2  m la celula uscată şi 8,6  m la

celula proaspătă, şi se găsesc în periferie în număr de 4,5 – 5,5 mil./mm3.
Eritrocitul adult este o celulă anucleată, discoidală, biconcavă; este alcătuit din citoplasmă şi
membrană celulară.
Eritrocitele au o culoare roşu-cărămiziu pe frotiul de sânge colorat cu May-Grümwald  Giemsa
şi au formă rotunjită văzute din faţă şi formă de disc biconcav văzute din profil (discocite). Datorită
formei particulare, apar mai palide în centru şi mai intens colorate la periferie, unde citoplasma este mai
abundentă (figura 3.27).
Trombocitele – (plachetele sangvine) au dimensiuni care variază între 2-5m şi se găsesc în
sângele periferic în număr de 150.000-400.000/mm3. Trombocitele se formează în măduva
hematogenă, din citoplasma unui precursor, megacariocitul.
Trombocitul adult este elipsoidal, cu formă de lentilă biconvexă. Este anucleat, fiind alcătuit din
membrană şi citoplasmă. Pe frotiu poate avea forme diferite: de stea, discoidală, poligonal etc.,
depinzând de gradul de uscare a frotiului, timpul scurs de la recoltare la fixare (figura 3.28a).
Leucocitele – (globulele albe) se împart în două mari clase:
– granulocitele;
– agranulocitele.
Granulocitele se caracterizează prin prezenţa în citoplasmă a granulaţiilor. După
tinctorialitatea granulelor specifice se împart în: neutrofile, eozinofile, bazofile. Se mai numesc şi
leucocite polimorfonucleare, deoarece nucleii lor au forme variate.
Neutrofilele – reprezintă 40-75% din leucocite. Au formă rotunjită care se poate modifica prin
emiterea de pseudopode când celulele trec din sânge în ţesuturi.
Nucleul este segmentat, prezentând 2-5 lobi nucleari legaţi prin filamente de cromatină; în
tehnica utilizată (MGG) apar coloraţi în roşu-violet (figura 3.28a şi e). Citoplasma este uşor acidofilă şi
apare colorată în roz palid. Granulele sunt de două tipuri: azurofile (primare) reprezintă lizozomii
neutrofilelor şi granule specifice (secundare) cu rol inhibitor asupra dezvoltării microorganismelor. Ele
sunt mici, abia vizibile şi se colorează în brun-violet cu tehnica MGG.
Eozinofilele – numite şi granulocitele acidofile, reprezintă 1-5% din globulele albe.
Nucleul este de obicei bilobat, are tentă roşu-violacee. Citoplasma este intens acidofilă colorată
în roz şi conţine granule colorate în portocaliu strălucitor (figura 3.28b) ce conţin hidrolaze cationice
(peroxidază, aril-sulfatază).
Bazofilele – se găsesc în sângele periferic în proporţie de 0.5% din leucocite.

46
 Nucleul apare incomplet segmentat (în formă de „S” sau de trifoi).Citoplasma este bazofilă şi
conţine granule de forme şi dimensiuni diferite ce apar colorate metacromatic în albastru-violet închis,
acoperind nucleul (figura 3.28c).

a) b)

Figura 3.27 Eritrocite. a) Imagine SEM care evidenţiază forma de disc biconcav a eritrocitelor. b)
Imagine MO a eritrocitelor pe frotiul de sânge colorat MGG – se observă centrul mai palid comparativ
cu periferia.

a) c)

b) d) e)
Figura 3.28 Elementele figurate ale sângelui pe frotiul de sânge colorat MGG. a) Trombocite şi neutrofil;
b) Eozinofil; c) Bazofil; d) Monocit şi limfocit; e) Neutrofil şi limfocit.

Leucocitele agranulare sunt reprezentate de limfocite şi monocite (figura 3.28d).

Limfocitele – se găsesc în sânge în proporţie de 25-45% din leucocite. Limfocitele circulante au
formă rotundă sau uşor ovală.
Nucleul limfocitului este mare şi ocupă o porţiune întinsă din citoplasmă. Este tahicromatic şi
apare intens colorat ca o pată de cerneală. Citoplasma este redusă la un inel perinuclear, este bazofilă
de culoare albastru foarte deschis; poate conţine câteva granulaţii azurofile.
Monocitele – se găsesc în sângele periferic în proporţie de 6-8% din leucocite, au formă
rotunjită şi sunt cele mai mari celule din sângele periferic (20-25 m).
Nucleul este nesegmentat (poate avea aspect de ‚rinichi’) cu cromatina dispusă particular ca o
‚tablă de şah’ (zone de heterocromatină alternând cu zone de eucromatină). Citoplasma este
abundentă, bazofilă colorată în albastru-cenuşiu; se pot observa granulaţii azurofile (lizozomi)
concentrate în scobitura nucleului.

47
 3.4.2 TEHNICA EFECTUĂRII AMPRENTEI DE ORGAN

Prin amprente de organ pot fi analizate fragmente de organele parenchimatoase (rinichi, ficat,
splină, ganglioni limfatici). Deşi aceste preparate nu oferă numeroasele detalii tisulare pe care le putem
observa pe secţiunile fine, prezintă un interes în diagnosticarea rapidă a formaţiunilor tumorale (tumori
renale, metastaze ganglionare), deoarece pun în evidenţă prezenţa anomaliilor nucleare.

Efectuarea amprentei de organ

Organul de examinat se secţionează prin zona care prezintă interes diagnostic.
1. Recoltarea – secţionarea se face cu un bisturiu sau cu o lamă bine ascuţită pentru a evita
deformarea sau strivirea ţesuturilor.
2. Etalarea  cu ajutorul unei pense se prinde fragmentul secţionat şi se apasă uşor cu faţa
secţionată pe lama port-obiect bine degresată.
3. Fxarea se face cu un amestec de alcool etilic şi eter în părţi egale timp de 15 minute după care
preparatul se colorează.
4. Colorarea se face cu albastru de toluidină (pentru examenul extemporaneu) sau cu o coloraţie
de rutină cum ar fi coloraţia hematoxilină – eozină.
Pentru demonstrarea acestei tehnici se poate utiliza ficat (de porc sau de vită). Amprentele de
organ din ficat se fixează ca mai sus şi se colorează HE. Deoarece la mamifere hepatocitele sunt
adesea poliploide şi chiar bi- sau polinucleate, aceste aspecte pot fi studiate pe amprenta de organ.
Rezultatele amprentei de organ din ficat colorată HE:
Hepatocite dispuse în grupuri de câteva celule, cu citoplasma roz şi nuclei violet; se pot
observa hepatocite binucleate. Se observă de asemenea, numeroase eritrocite, de culoare roşie,
(ficatul fiind un organ foarte bine vascularizat) – figura 3.29.

Figura 3.29. Imagine la

microscopul optic a amprentei de
organ din ficat, colorată cu
hematoxilină – eozină. Se
observă nucleii coloraţi in violet
şi citoplasma colorată în roz,
hematiile colorate în roşu şi
hepatocite binucleate (săgeata).

48
 3.5 EFECTUAREA PREPARATELOR PENTRU MICROSCOPIA
ELECTRONICĂ

Ca şi pentru observarea la microscopul optic, şi pentru observarea la microscopul electronic

ţesuturile trebuie fixate, incluse şi secţionate (figura 3.30). La microscopul electronic nu pot fi observate
celule întregi, deoarece grosimea unei celule este prea mare pentru a fi străbătută de fasciculul de
electroni; de aceea în microscopia electronică nu pot fi observate celule în stare vie.
Fixarea este o etapă critică, deoarece secţiunile sunt examinate mult mai detaliat – alterări
minore care nu se observă în microscopia optică (de exemplu fragmentarea reticulului endoplasmic)
devin evidente în microscopia electronică.
Pentru a obţine cea mai rapidă fixare, piesele prelucrate sunt tăiate in fragmente foarte mici
(sub 0.5 mm), şi se foloseşte ca fixator glutaraldehida, cu o etapă de post-fixare cu tetraoxid de osmiu
(OsO4). Grupările aldehidice ale glutaraldehidei reacţionează cu grupările amino ale proteinelor pe care
le imobilizează într-o reţea insolubilă. Osmiul este un metal greu care reacţionează în special cu acizii
graşi, producând conservarea membranelor celulare; în plus, atomii de osmiu au proprietatea de a
devia fasciculul de electroni, făcând membranele vizibile la microscopul electronic.

Figura 3.30 Reprezentare schematică a etapelor de obţinere a preparatelor microscopice pentru

microscopia de transmisie, comparativ pentru microscopul optic şi cel electronic.

49
 Odată fixate, ţesuturile sunt deshidratate în secvenţe de alcooli şi solvenţi organici, apoi sunt
incluse într-un material care să suporte secţionarea în secţiuni foarte subţiri (sub 0.1 m). Mediile de
includere folosite sunt răşini epoxi sintetice ( un material plastic dur).
Secţionarea se face cu ajutorul unui ultramicrotom. Acesta este prevăzut cu un cuţit de diamant
sau sticlă, care să poată secţiona blocuri dure, şi cu un braţ mobil în care se montează blocul. Braţul
mobil avansează pe distanţe de ordinul sutimilor de micrometru prin dilatarea controlată a unei bare
metalice din interior. Secţiunile se recoltează pe suprafaţa unei mici băi de apă ataşată la cuţit, apoi
sunt preluate sub control microscopic pe o grilă metalică şi uscate pe suprafaţa acesteia. Grila metalică
joacă rolul lamei port-obiect din microscopia optică (figura 3.31a).

a) b)

Figura 3.31 a) Reprezentare schematică a secţionării la ultramicrotom cu montarea secţiunilor pe o

grilă metalică (de regulă din cupru); b) Imagine de microscopie electronică a unei secţiuni longitudinale
printr-o fibră musculară striată – se observă alinierea sarcomerelor1 cu porţiuni electrono-dense ce
corespund benzilor A (întunecate, anizotrope) şi electrono-transparente ce corespund benzilor I
(luminoase, izotrope).
Colorarea se face cu soluţii de săruri ale metalelor grele (în special uraniu şi plumb), care au
proprietatea de a devia electronii. Regiunile colorate apar mai închise la culoare pe imaginea finală şi
se numesc electrono-dense. Regiunile care nu au fixat metale grele lasă să treacă fasciculul de
electroni, apărând luminoase pe imaginea finală – electrono-transparente (figura 3.31.b).

1
Sarcomerul reprezintă unitatea structurală şi funcţională a miofibrilelor. Miofibrilele sunt structuri specifice fibrei musculare
striate din muşchii scheletici – formate prin aşezarea cap la cap a zeci de mii de sarcomere. Sarcomerele se observă la
microscopul electronic ca fiind formate din unităţi ordonate numite miofilamente (de actină şi miozină).

50
 Partea a patra
CELULA: ASPECTE STRUCTURALE ŞI ULTRASTRUCTURALE
Conform teoriei celulare enunţate de Schleiden şi Schwann în 1858, celula este unitatea
structurală a materiei vii. Dezvoltarea Biologiei celulare nu a făcut decât să adauge noi dimensiuni
acestei teorii; celula fiind considerată în prezent unitatea morfofuncţională funfamentală a lumii vii,
produs al unei îndelungate evoluţii, având capacitatea de creştere, dezvoltare şi reproducere, precum şi
o organizare dinamică aflată în relaţii de echilibru cu mediul înconjurător.
În funcţie de caracterele lor morfologice celulele pot fi împărţite în două mari clase: procariote
şi eucariote. Dintre eucariote fac parte protozoarele cu nucleu, toate plantele, animalele, inclusiv omul.
De aceea în continuare vor fi prezentate caracteristicile celulelor eucariote.
Celulele eucariote sunt celule cu organizare complexă în alcătuirea cărora se disting trei părţi
principale: membrana celulară, citoplasma şi nucleul.
În organismele pluricelulare (inclusiv la om), deşi prezintă aceeaşi organizare structurală,
celulele îmbracă o varietate de forme şi mărimi, adaptate funcţiilor specifice pe care le îndeplinesc.

4.1 CARACTERELE GENERALE ALE CELULELOR

Forma celulelor
Celulele eucariote prezintă o mare diversitate de forme, în special în organismele animale.
Celulele din organismul uman, de exemplu, pot fi clasificate, pe baza formei şi a structurii aşa cum se
pot observa la microscop, în aproximativ 200 de tipuri celulare. Multitudinea de forme este determinată
atât de factori interni dintre care cel mai important este activitatea funcţională (dar şi vârsta,
vâscozitatea citoplasmatică, structura internă şi caracterele suprafeţei celulare) cât şi de factori externi
(ca presiunea sau vâscozitatea mediului). Celulele pot avea formă variabilă sau formă constantă.
Celulele cu formă variabilă
Din această categorie fac parte celulele care îşi desfăşoară activitatea într-un mediu lichid (de
exemplu celule sangvine), având în mod obişnuit o formă sferică sau ovalară. Dintre acestea, celulele
sistemului fagocitar părăsesc vasul şi trec în ţesuturi: granulocitele (în special cele neutrofilele) îşi
modifică forma capătând un contur neregulat prin emiterea de pseudopode. Există însă şi celule din
ţesuturi care îşi pot modifica forma – un exemplu îl constituie celulele epiteliului mucoasei vezicale
urinare, care se aplatizează atunci când aceasta se destinde prin acumulare de urină.
Celule cu formă fixă
Marea majoritate a celulelor din organism sunt organizate sub formă de ţesuturi solide. Acestea
îmbracă forme variate pentru a-şi îndeplini funcţiile specifice (figura 4.1).
Exemple:
1. Celule sferice. Forma sferică asigură cel mai
mare volum pentru o suprafaţă dată; celule în care
substanţele sunt depozitate prezintă forme sferice, de
exemplu adipocitul, ovocitul.
În imagine (a): adipocite în care depozitul de
grăsime a împins nucleul la periferie, aspect de „inel cu a)
pecete”.
2. Celule cubice – celulele epiteliului canaliculului
biliar, epiteliul tiroidian. Prezintă nucleu sferic situat central şi
echidistant.
În imagine (b): ţesut tiroidian cu celule cubice
secretoare de hormoni tiroidieni care mărginesc foliculii
tiroidieni plini cu o substanţă amorfă numită coloid. b)

51
 3. Celule pavimentoase (turtite) – celulele
mezoteliale, celulele endoteliale. Sunt celule aplatizate cu
suprafaţa mare si grosime mică ce tapetează lumenul
vaselor de sânge şi anumite cavităţi (pleura, peritoneul). Au
nucleul de formă lenticulară bombează în lumen şi
citoplasmă foarte puţină.
4. Celule poliedrice – celulele epiteliului spinos
c)
malpighian, hepatocitele. Sunt celule care aderă strâns
unele de celelalte.
În imagine (c): ţesut hepatic în care se observă un
vas de sânge cu celulele endoteliale, pavimentoase
(săgeata închisă) şi hepatocitele poliedrice (săgeata
deschisă).
5. Celule stelate – sunt celule care sunt conectate
intermediul unor prelungiri; exemple: celulele nervoase,
osteocitele.
În imagine (d): ţesut nervos în care se observă d)
neuroni multipolari – din corpul neuronal se desprind
prelungiri prin intermediul cărora neuronii sunt interconectaţi.
6. Celule flagelate – spermatozoidul este singura
celulă cu flagel din organismul uman; flagelul asigură
propulsia spermatozoidului în mediu lichid.
În imagine (e): frotiu pe care se observă celule mici
care prezintă fiecare câte un flagel, cu nucleu intens bazofil e)
şi citoplasmă extrem de redusă cantitativ.
7. Celule cilindrice – se întâlnesc în epiteliul
mucoasei tubului digestiv, a tractului genital feminin. Au
nucleu ovalar, situat central (poziţia se poate modifica în
funcţie de momentul funcţional al celulei. Sunt celule
puternic polarizate, având un pol apical către lumen şi un pol
bazal în relaţie cu membrana bazală.
8. Celule caliciforme – celulele secretante de mucus
din epiteliul intestinal, epiteliul respirator. Au formă de cupă, f)
cu nucleul plasat bazal şi depozite de mucus care ocupă
toată citoplasma la polul apical.
În imagine (f, g): vilozităţi intestinale din jejun, în
epiteliul intestinal se observă celulele cilindrice cu rol în
absorbţie (săgeata deschisă) şi celulele caliciforme,
secretante de mucus (săgeata închisă); acestea
acumulează mucus la polul apical de unde este eliminat în
lumenul intestinal. g)
Figura 4.1 a – g Forme celulare. Forma celulelor variază în funcţie de activitatea specifică. [6]

Mărimea celulelor
Mărimea celulelor este apreciată de regulă liniar prin diametrul celulelor, sau prin evaluarea
volumului şi prin calcularea masei celulare.
În mod obişnuit celulele din organismul uman au un diametru între 10-30 μm. Putem însă
întâlni celule cu diametrul în afara limitelor medii, ca de exemplu: ovocitul – cea mai mare celulă din

52
organism cu un diametru de 250 μm, sau celule mici  spermatozoizii (5-6 m) şi celulele granulare din
scoarţa cerebeloasă cu un diametru de 3-4 μm. Un alt exemplu sunt fibrele musculare striate din
muşchiul scheletic care sunt celule cilindrice foarte lungi; pot atinge lungimi de ordinul centimetrilor (de
la câţiva milimetri la câţiva centimetri).
Volumul celulelor este constant pentru un anumit tip de celulă şi independent de mărimea
organismului, volumul variind între 200-1500 μm3.
Dimensiunile celulare suferă modificări în raport cu starea funcţională, cu condiţiile de mediu în
care îşi desfăşoară activitatea şi cu vârsta; astfel celulele tinere (blaste) au diametrul mai mare decât
celulele adulte sau cele îmbătrânite.

4.2 ALCĂTUIREA CELULEI EUCARIOTE

Elementele din care sunt alcătuite celulele eucariote sunt întotdeauna aceleaşi, indiferent de
tipul celular (figura 4.2):
– membrana celulară – sau învelişul celular, ce controlează schimburile cu mediul
înconjurător;
– citoplasma – ce conţine numeroase organite;
– nucleul – organit al coordonării proceselor celulare.
Nucleul şi citoplasma împreună mai sunt cunoscute sub denumirea de protoplasmă.

53
 Figura 4.2 Reprezentare schematică a structurii celulei eucariote – se observă abundenţa de structuri
intracitoplasmatice şi împărţirea citoplasmei în numeroase compartimente funcţionale, datorită
prezenţei organitelor delimitate de membrane, inclusiv nucleul.
4.2.1 MEMBRANA CELULARĂ ŞI SPECIALIZĂRILE ÎNVELIŞULUI CELULAR

La microscopul fotonic celula apare mai mult sau mai puţin delimitată de o membrană celulară.
Membrana celulară este o peliculă foarte subţire şi foarte flexibilă, ce acoperă şi delimitează
compartimentul citoplasmatic, controlează schimburile cu mediul înconjurător, se comportă ca un
sistem de recepţie-transducţie şi constituie substratul adezivităţii celulare. În microscopia electronică,
membrana celulară apare ca o structură complexă, ce are la bază un dublu-strat lipidic care se
asociază cu proteine specifice şi glucide. Membranei celulare, numită şi înveliş celular, i se descriu trei
regiuni (dispuse dinspre exterior spre interiorul celulei – vezi figura 4.3):
– glicocalix;
– plasmalemă;
– citoscheletul membranar.
glicocalix
plasmalema
citoscheleul
membranar

Figura 4.3 Reprezentare schematică a alcătuirii învelişului celular; se observă cele trei regiuni ale
învelişului celular, structura lor şi relaţiile dintre ele. [4]

Plasmalema reprezintă pătura mijlocie a membranei celulare, cu structura caracteristică

membranelor biologice. Plasmalema nu este vizibilă la microscopul fotonic (are o grosime de 7 – 9 nm),
dar reprezintă structura de bază a învelişului celular care asigură rolul de barieră cu permeabilitate
selectivă între mediul intern şi cel extracelular.
Din punct de vedere molecular, plasmalema este alcătuită din lipide, în special fosfolipide,
(40%) şi proteine (60%). Conform modelului în mozaic fluid al lui Singer şi Nicolson, membrana celulară
este formată dintr-o pătură dublă lipidică traversată total sau parţial de proteine. În microscopia

54
electronică, plasmalema are o structură trilaminară cu două regiuni electrono-dense separate de o
regiune electrono-transparentă (figura 4.4a).
Glicocalixul sau glicolema este o pătură glucidică situată la exteriorul membranei celulare; de
integritatea sa depinde în mare măsură activitatea celulară. Este mai bine reprezentat la suprafaţa
celulelor sangvine şi la polul apical al celulelor epiteliale care delimitează cavităţi, şi mai redus pe
suprafeţele prin care celulele vin în contact unele cu altele.
La MO, glicocalixul nu poate fi pus în evidenţă decât prin detectare citochimică a componentei
glucidice. La ME, are o grosime pe suprafeţele libere de aproximativ 50nm, şi aspect fibrilar (figura 4.a).
Din punct de vedere biochimic este alcătuit din resturile glucidice ale proteinelor şi lipidelor din
plasmalemă, care proemină la exteriorul celulei şi vin în contact cu fluidul extracelular şi elementele
matricei extracelulare, având roluri în adezivitate şi recunoaşterea celulară.
Citoscheletul membranar este alcătuit dintr-o reţea de proteine fibroase ancorată pe faţa
internă a plasmalemei; are rol în stabilizarea infrastructurii membranei, constituind suportul formei
celulare, de asemenea participă în mişcările suprafeţei celulare şi conferă învelişului celular plasticitate
şi elasticitate. De exemplu: forma hematiilor, de disc biconcav, are ca suport asamblarea specifică a
proteinelor din citoscheletul membranar, care asigură deformabilitatea hematiilor la trecerea prin
capilarele mici (rol plastic), şi revenirea lor la forma normală când constângerea externă a încetat
(elasticitate).
Din punct de vedere biochimic este alcătuit din proteine de tipul actinei, spectrinei, ankirinei, etc
(figura 4.4b).

Ak A

S
a) b)
Figura 4.4 a) Imagine de microscopie electronică a unei secţiuni prin microvili; se observă la polul
apical glicocalixul (săgeata închisă) şi plasmalema care delimitează microvilii la exterior cu aspectul
tipic trilaminar cu două regiuni electrono-dense separate de o regiune electrono-transparentă. b)
Imagine de microscopie electronică a citoscheletului membranar de pe partea citoplasmatică a
membranei eritrocitare: este o reţea de spectrină, conectată prin diferite proteine globulare de tipul
ankirinei la plasmalemă si la elementele citoscheletului celular (actina). [1]

Specializările învelişului celular

Membrana celulară, prezintă şi diferenţieri speciale cum sunt dispozitivele joncţionale şi
prelungirile citoplasmatice. Aceste diferenţieri sunt permanente, dar există şi diferenţieri temporare ( de
ex. emiterea de pseudopode).
Joncţiunile sunt complexe proteice membranare care conectează celulele între ele sau cu
elementele matricei extracelulare. Există trei tipuri de joncţiuni: strânse, de ancorare şi de comunicare
(figura 4.5).
Joncţiunile strânse se găsesc la polul apical al celulelor epiteliale ce delimitează cavităţi şi au
rolul de a preveni trecerea substanţelor din lumen în spaţiul interstiţial printre celule (paracelular).
Transportul substanţelor va avea loc doar prin celulele epiteliale (transcelular). La acest nivel
plasmalemele celor două celule vin în contact strâns şi spaţiul intercelular dispare.

55
 Joncţiunile de ancorare sau desmozomii conectează plasmalemele celulelor învecinate între
ele şi cu elementele citoscheletului celular, conferind rezistenţă ţesuturilor. Există trei tipuri de joncţiuni
de ancorare: desmozomii în bandă – care conectează celulele la polul apical, imediat sub joncţiunile
strânse şi se leagă la reţeaua de actină de sub plasmalema apicală; desmozomii în pată – care
conectează suprafeţele laterale ale celulelor învecinate şi se leagă la reţeaua de filamente intermediare
(filamente de keratină in epitelii); şi hemidesmozomii – care ancorează plasmalema bazală a celulelor
la membrana bazală a epiteliului şi la matricea extracelulară, se leagă de asemenea de filamentele
intermediare intracelulare.
Joncţiunile de comunicare numite şi joncţiuni gap sunt alcătuite din proteine numite
conexoni care conectează plasmalemele celulelor învecinate, formând pori care permit deplasarea
moleculelor mici şi a ionilor între citoplasmele celulelor vecine, dar nu şi a macromoleculelor. Sunt bine
reprezentate în celulele muşchiului striat cardiac unde, prin schimbul de ioni între celule, participă la
transmiterea impulsului electric în grosimea miocardului.

Figura 4.5 Tipuri de joncţiuni. a) Schema joncţiunilor strânse; se observă că la nivelul joncţiunilor
strânse spaţiul intercelular este întrerupt. b) Schema joncţiunilor de ancorare – conectează
plasmalemele celulelor învecinate cu elementele citoscheletului. c) Schema joncţiunilor de

56
comunicare – conexonii formează pori în membranele celulelor adiacente. d) Imagine de microscopie
electronică a unui complex joncţional între celulele epiteliului intestinal. [22]
Prelungirile citoplasmatice sunt: cilii şi flagelii, stereocilii şi microvilii. Se găsesc la polul
apical al anumitor celule unde îndeplinesc roluri specifice. Se pot observa şi diferenţia pe imaginile de
microscopie optică, iar la microscopul electronic se evidenţiază detaliile structurale (figurile 4.6 şi 7).
1) Cilii şi flagelul  deşi au un structură asemănătoare, cilii şi flagelii se deosebesc în câteva
privinţe:
Cilii1 sunt expansiuni citoplasmatice mobile ale polului apical al celulei învelite de o lungă
extensie a membranei celulare, cu diametru de 0.2 m şi lumgime de 10-20 m. Se găsesc sub formă
de prelungiri multiple pe suprafaţa unor celule cum sunt cele de pe suprafaţa mucoasei aparatului
respirator sau din oviduct.
Cilii au mişcări ciclice în doi timpi (bătaie-revenire), şi se mişcă în mod coordonat astfel că
mişcarea se propagă în valuri succesive ca ,,într-un lan de grâu bătut de vânt’’. Prin această mişcare se
realizează eliminarea materialelor din căile respiratorii antrenate în stratul de mucus.
La microscopul optic cilii apar sub forma unor prelungiri fine, perpendiculare pe suprafaţa
apicală a epiteliului mucoasei trompei uterine sau a mucoasei traheale (figura 4.6a).
La microscopul electronic se observă în axul prelungirii, atât la cili cât şi la flageli, un mănunchi
de microtubuli cu o organizare specifică, numit axonemă2. Axonema conţine o pereche de microtubuli
situaţi central înconjuraţi de nouă perechi de microtubuli periferici. Axonema se ancorează în
ectoplasma apicală a celulei, unde se găseşte corpusculul bazal al cilului care a re o structură
asemănătoare cu cea a centriolului (figura 4.7a şi figura 4.14a)
Flagelul are structura asemănătoare cu a cilului, însă are o lungime mai mare şi conţine şi alte
structuri asociate (de exemplu placa mitocondrială dispusă în jurul filamentrului axial).
La mamifere, singura celulă flagelată este gametul masculin (spermatozoidul) care are un
flagel unic (figura 4.1e). Spre deosebire de cili, flagelul are o mişcare ondulatorie sinusoidală.
2) Stereocilii – (cilii ficşi din urechea internă şi epididim) au structură şi roluri diferite de ale
cililor mobili, aceştia fiind elemente imobile a căror structură se deosebeşte de cea a cililor prin numărul
mic al microfilamentelor de actină dispuse neregulat în axul prelungirii figura 4.7b). Stereocilii, numiţi şi
„cili giganţi” se unesc mai mulţi la un loc formând conglomerate cu rol în ghidarea produşilor de secreţie
(figura 4.6b).
3) Microvilii – sunt expansiuni permanente mici pe suprafaţa unor celule cu funcţie de
absorbţie cum sunt celulele intestinului subţire, ale tubului contort proximal din rinichi sau hepatocite.
Microvilii măresc suprafaţa de absorbţie dar pe lângă aceasta, intervin şi activ împingând substanţele
absorbite spre interiorul celulei. De ex. microvilii de pe suprafaţa unei celule intestinale ce alcătuiesc
aşa numita „margine în perie” cresc de aproximativ 25 ori suprafaţa de absorbţie (figura 4.6c). În
microscopia optică apar sub forma unor striaţii perpendiculare pe suprafaţa plasmalemei apicale, iar la
microscopul electronic se observă în axul lor mănunchiuri de actină bine organizate (figura 4.7b).

a) b) c)

1
cilium = geană (lat.)
2
axonema = filament axial (gr.)

57
Figura 4.6 Imagini de microscopie optică în care se observă: a) aspectul cililor în epiteliul respirator; b)
aspectul stereocililor în epididim şi c) microvilii din „marginea în perie” a epiteliului intestinal. [4]

a) b) c)

Figura 4.7 Imagini de microscopie electronică a prelungirilor citoplasmatice. a) Celule din epiteliul
traheei în care se observă la polul apical cili secţionaţi în diferite incidenţe şi prezenţa corpusculului
bazal în citoplasmă (săgeata); b) Stereocili în celulele epididimului; pe secţiunea transversală se
observă ca stereocilii sunt fuzionaţi formând streucturi asemănătoare unor canaliculi care ghidează
produşii de secreţie; c) Microvilii în epiteliul mucoasei intestinale – se observă mănunchiurile de actină
bine împachetate, dispuse ordonat în centrul prelungirii. [13]

4.2.1 CITOPLASMA

Citoplasma este teritoriul celular aflat între membrana celulară şi învelişul nuclear este formată
din hialoplasmă (matricea citoplasmatică sau citosolul) şi morfoplasma ce conţine structuri cu
organizare şi funcţii caracteristice numite organite celulare: ribozomii, REN, REG, complex Golgi,
mitocondrii, lizozomi, peroxizomi, centrioli, microtubi şi microfilamente. În afara organitelor celulare în
citoplasmă se mai găsesc incluziuni citoplasmatice care reprezintă substanţe de rezervă (picături de
grăsime, glicogen), produşi de secreţie (pigmenţi) sau acumulări de produşi exogeni fagocitaţi.
Citoplasma examinată la MO apare ca o masă relativ omogenă în care însă se pot distinge
două regiuni:
– ectoplasma – este porţiunea periferică a citoplasmei, ea este vâscoasă, opacă, lisită de
organite celulare;
– endoplasma – regiunea internă, numită şi granuloplasmă, ce conţine toate organitele şi
granulaţiile celulare şi este mai puţin vâscoasă. În endoplasmă se disting numeroase
particule şi granule datorită indicilor diferiţi de refracţie. Acestea corespund fie organitelor
celulare fie granulelor de secreţie.
Între cele două regiuni nu există o delimitare netă, dar ele sunt diferite şi din punct de vedere
funcţional: ectoplasma participă la fenomenele de suprafaţă ale celulei, pe când în endoplasmă se
desfăşoară procesele metabolice celulare.

ORGANITELE CELULARE

Organitele celulare sunt un grup heterogen de structuri intracitoplasmatice, de regulă delimitate

de o membrană, care separă mediul lor intern de cel citoplasmatic. Se creează astfel numeroase

58
compartimente citoplasmatice cu structură diferită, conţinând sisteme enzimatice specifice şi capabile
să îndeplinească funcţii specifice.
Clasificarea organitelor celulare după funcţia lor în celulă:

A. Organitele sintezei şi secreţiei celulare:

 Ribozomii
 Reticulul endoplasmic
 Aparatul Golgi

B. Organitele generatoare de energie:

 Mitocondriile

C. Organitele digestiei celulare:

 Lizozomii
 Peroxizomii

D. Organitele motilităţii celulare:

 Microfilamentele şi microtubulii
 Centrul celular

A. Organitele sintezei şi secreţiei

RIBOZOMII – sunt organite celulare submicroscopice, corpusculare, nedelimitate de

membrane, formate din ribonucleoproteine (ARNr şi proteine) cu rol în procesele de sinteză a
proteinelor.
Sunt prezenţi în citoplasma tuturor celulelor, cu excepţia eritrocitelor. Pot fi de două tipuri:
ribozomi liberi în citoplasmă (izolaţi sau grupaţi în poliribozomi) şi ataşaţi de membranele reticulului
endoplasmic şi de faţa citoplasmatică a învelişului nuclear.
Au diametrul este cuprins între 15 – 30 nm, deci nu pot fi observaţi la microscopul fotonic. În
celulele în care se desfăşoară procese intense de proteogeneză (neuroni, hepatocite), ribozomii
formează zone intens bazofile în citoplasmă. La microscopul electronic apar sub formă de granule
ovalare sau elipsoidale care prezintă două subunităţi: mare şi mică.

Poliribozomii sunt formaţiuni

constituite dintr-o moleculă de ARN-
mesager pe care se fixează mai
mulţi ribozomi implicaţi concomitent
în sinteza unui lanţ polipeptidic.
La nivelul poliribozomilor liberi
se sintetizează proteinele de
structură (pentru procesele de
creştere şi diviziune), iar la nivelul
ribozomilor ataşaţi membranelor RE
se sintetizează proteine de export
(enzime, hormoni, anticorpi).

Figura 4.8 Schema sintezei de proteine la nivel ribozomal – asamblarea subunităţilor ribozomale în
prezenţa moleculei de ARN mesager iniţiază sinteza unui lanţ polipeptidic; prin asamblarea mai multor
ribozomi pe molecula de ARNm se produc mai multe copii ale aceluiaşi lanţ polipeptidic. [14]

59
 RETICULUL ENDOPLASMIC (RE) – este un organit membranar, comun tuturor celulelor cu
excepţia hematiei adulte, reprezentat de un sistem de canalicule şi cisterne delimitate de membrane
trilaminare care străbat toată citoplasma şi comunică cu spaţiul perinuclear.
Este bine reprezentat în celulele angajate în sinteze de proteine, glucide şi lipide, fiind bine
dezvoltat în celulele secretorii exo- şi endocrine.
Reticulul endoplasmic este de două tipuri: RE rugos (granular) şi RE neted.

Reticul endoplasmic Reticul endoplasmic Reticulul endoplasmic neted

neted rugos (REn): nu este vizibil la microscopul
fotonic. La microscopul electronic,
apare ca un labirint de canalicule
care comunică cu sacii RE rugos şi
la nivelul cărora nu se ataşează
ribozomi.
Reticulul endoplasmic rugos
Ribozomi (REr): este vizibil la microscopul
fotonic datorită prezenţei ribozomilor,
fiind abundent în celulele
specializare în sinteză de proteine: în
celulele glandulare (pancreatice), în
hepatocite (corpii Berg), în celulele
nervoase (corpii lui Nissl).
La microscopul electronic apare
ca un ansamblu de vezicule sau saci
aplatizaţi, cu diametru de aproximativ
20 nm, pe suprafaţa cărora se
găsesc ataşaţi ribozomi prin
subunitatea mare şi care sintetizează
proteine de export.

Figura 4.9 Reticulul endoplasmic neted şi rugos – schemă şi imagine de microscopie electronică; se
observă că, deşi se deosebesc din punct de vedere morfologic, RE neted şi RE rugos prezintă
continuitate structurală. [1, 22]
REn este bine reprezentat în celulele care sintetizează hormoni steroizi glicogen (hepatocite) şi
pigmenţi. În celula musculară striată, REN are rol de rezervor de Ca 2+ şi ATP (reticul sarcoplasmic).
REr este abundent în celulele glandulare, hepatocite, neuroni, plasmocite, putând fi observat la
MO (ergastoplasmă) după colorarea cu coloranţi bazici (hematoxilină, violet de crezil, albastru de
toluidină).

COMPLEXUL GOLGI – este un sistem intracitoplasmatic de cavităţi limitate de citomembrane,

prezent atât în celulele vegetale cât şi în celulele animale, cu excepţia hematiei adulte. Are localizare
diferită în funcţie de tipul şi activitatea celulei – în neuroni este plasat perinuclear, în celulele secretorii
exocrine se află supranuclear, iar în celulele tiroidiene se deplasează între cei doi poli ai celulei.
La microscopul fotonic se evidenţiază prin colorare supravitală cu roşu neutru, sau cu
impregnare argentică pe preparatele pemanente.
Aparatul Golgi participă la formarea de membrane, la formarea proteoglicanilor şi a
glicoproteinelor, maturarea lipoproteinelor şi formarea lizozomilor primari; reprezintă ultima staţie în

60
secreţia celulară, realizând împachetarea produşilor de secreţie în vezicule care fuzionează cu
plasmalema şi îi elimină la exteriorul celulei.

Faţă cis şi microvezicule La microscopul electronic

aparatul Golgi apare ca o reţea de
Cisterne canalicule anastomozate şi vacuole
de diferite mărimi, dispuse sub forma
unor unităţi structurale numite
dictiozomi formate din
(1) pachete de cisterne
aplatizate,
Faţă trans şi vezicule de secreţie (2) microvezicule şi
(3) vezicule de secreţie
delimitate de membrane lipoproteice.
Aparatului Golgi i se descriu: o
faţă cis care primeşte vezicule de la
reticulul endoplasmic, orientată către
nucleu, şi o faţă trans, pe care se
formează veziculele de secreţie, de
regulă orientată către plasmalemă.

Figura 4.10 Aparatul Golgi – schemă şi imagine de microscopie electronică; se observă structurile din
care este alcătuită unitatea structurală şi funcţională – dictiozomul. [22]

B. Organitele generatoare de energie

MITOCONDRIILE – sunt organite membranare prezente în toate celulele cu metabolism aerob,

cu excepţia eritrocitului adult. Ele generează energia necesară derulării proceselor celulare.
Sunt răspândite în întreaga citoplasmă, cu predilecţie la polii celulei sau perinuclear în
momentele de intensă activitate de sinteză; au dimensiuni de aproximativ 7μm lungime şi de 0,5 μm
grosime şi formă variabilă (granulare, alungite). Forma variază în funcţie de tipul celular, dar şi în
funcţie de starea funcţională a celulei.
Numărul mitocondriilor variază în limite foarte largi în diferite ţesuturi, în funcţie de implicarea
celulelor ţesutului respectiv în producerea de energie (ATP). De exemplu, în fibra musculară striată din
muşchii scheletici mitocondriile ocupă 4-6% din volumul celulei, 15% în hepatocit, 27% în celula
parietală gastrică şi 35% în fibra musculară cardiacă, unde ATP-ul este obţinut aproape în exclusivitate
prin fosforilare oxidativă.
La microscopul fotonic apar ca granule izolate, sau grupate în şiruri sau filamente. Se
colorează vital cu verde Janus B pentru celulele nefixate şi hematoxilină ferică Heidenhein pentru
celulele fixate.
Mitocondriile conţin sistemele enzimatice necesare pentru oxidarea materialelor nutritive (prin
 -oxidarea acizilor graşi şi digestia produşilor rezultaţi în ciclul Krebs), pentru sinteza moleculelor de
ATP şi cuplarea acestor două procese (fosforilarea oxidativă). Fosforilarea oxidativă se soldează cu
producerea de ATP necesar pentru desfăşurarea proceselor celulare.

61
 Creste Matrice Membrana
La microscopul electronic
internă mitocondriile sunt delimitate de o
membrană dublă formată din două
membrane trilamelare: membrana
externă şi membrana internă care
trimite în interior prelungiri ce
Membrana formează crestele mitocondriale.
externă

Spaţiul dintre cele două

membrane se numeşte camera
externă, iar între membrana internă şi
crestele mitocondriale se află camera
internă sau matricea mitocondrială. În
matricea mitocondrială se găsesc
enzimele ciclului Krebs.

Membrana internă este

alcătuită dintr-un ansamblu de
particule elementare – unităţile
tripartite care sunt alcătuite dintr-un
cap sferic, o tijă cilindrică şi o bază
patrulateră. Fiecare astfel de element
conţine un set complet de enzime
implicate în fosforilarea oxidativă.

Figura 4.11 Mitocondria. Schemă şi imagine de microscopie electronică a unei mitocondrii; în imaginea
de jos se observă un detaliu al membranei interne cu prezenţa particulelor elementare (săgeata). [22]

C. Organitele digestiei celulare

LIZOZOMII – sunt organite membranare de formă sferică sau ovoidală, prezente în citoplasma
tuturor celulelor ce excepţia hematiilor.
Majoritatea sunt vizibili doar la microscopul electronic, dar există şi lizozomi de talie mare
(granulaţiile azurofile din granulocite) care sunt vizibili şi în microscopia fotonică.
După starea funcţională lizozomii se împart în (1) lizozomi primari care nu au fost încă angajaţi
în digestie, au talie mică şi matrice omogenă şi (2) lizozomi secundari funcţionali, cu activităţi
enzimatice digestive, cu talie mai mare şi matrice heterogenă – aceştia pot fi heterofagozomi sau
autofagozomi. În a doua categorie intră, de asemenea, corpii multiveziculari ce reprezentă lizozomi
secundari în care procesele de digestie s-au terminat şi corpii reziduali în care persistă reziduuri
nedigerate de enzimele lizozomale.
Lizozomii sunt organite celulare responsabile de digestia intracelulară prin prezenţa în matricea
lizozomală a unui mare număr de enzime hidrolitice acide care degradează macromoleculele în
unităţile din care sunt formate.
PEROXIZOMII – sunt organite ultramicroscopice care conţin enzime ce catalizează reacţia de
formare (oxidaza) şi de descompunere (catalaza) a peroxidului de hidrogen (apa oxigenată).
Sunt vacuole sferice sau ovoide cu diametrul este între 0,1 – 1,5 μm; pot fi peroxizomi propriu-
zişi (activi, 0.5-1.5 μm) sau microperoxizomi (inactivi, 0.2 – 0.4 μm).

62
 Peroxizomii conţin enzime implicate în metabolismul peroxidului de hidrogen (catalaza –
marker peroxizomal), în degradarea acidului uric (uratoxidaza) în  -oxidarea acizilor graşi şi în
producerea unei mici cantităţi de energie.

La microscopul electronic
lizozomii apar alcătuiţi dintr-o
membrană delimitantă şi o matrice
lizozomală cu aspect omogen (fin
granular) în cazul lizozomilor primari
sau heterogen în cazul lizozomilor
secundari.

a)
La microscopul electronic
peroxizomii sunt formaţi dintr-o
membrană trilaminară, o matrice
omogenă fin granulară; iar în
peroxizomii propriu-zişi mai sunt
prezente un material dens numit
nucleoid şi placa marginală.

b)

Figura 4.12 Imagini de microscopie electronică reprezentând a) lizozomi primari şi secundari aflaţi în
diferite stadii de digestie a materialelor înglobate şi b) peroxizom propriu-zis (cu diametru mare şi
structură neomogenă) şi microperoxizom. [13]

D. Organitele motilităţii celulare (elementele citoscheletului şi centrul celular)

Elementele citoscheletului sunt reprezentate de trei tipuri de filamente care străbat citoplasma
conferind rezistenţă celulelor şi fiind implicate în mişcările celulare:
MICROFILAMENTELE – sunt structuri fibrilare formate din actină şi miozină, prezente în
citoplasma tuturor celulelor, cu predilecţie în acele celule care prezintă accentuate mişcări de deplasare
în ţesuturi sau mişcări active intracitoplasmatice. Intră în structura citoscheletului membranar, a
desmozomilor în centură, a miofibrilelor şi a pseudopodelor.
În celulele nemusculare ale eucariotelor, cele mai multe microfilamente sunt formate din actină
şi numai un număr redus de microfilamente conţin miozină.
Actina apare fie sub formă polimerizată, filamentoasă (actina F) în microfilamente, fie
depolimerizată, monomerică (actina G) în citosol. Microfilamentele de actină au diametrul de
aproximativ 5-7 nm şi lungimi diferite. Miozina se găseşte în cantitate redusă în celulele nemusculare,
fiind de formă şi mărime diferită în aceeaşi celulă.
În celulele musculare, actina şi miozina alcătuiesc formaţiuni bine organizate şi stabile numite
miofilamente cu diametru de 8-12 nm, care prin aşezarea lor orientată, realizează miofibrilele.
FILAMENELE INTERMEDIARE – sunt structuri fibrilare alcătuite din subunităţi proteice
alungite care se unesc cap la cap şi se înfăşoară într-o structură asemănătoare unei frânghii. Au

63
dimensiune de 8 – 12 nm, intermediară între cea a microfilamentelor de actină şi microtubuli. Structura
lor este stabilă spre deosebire de a microtubulilor şi a microfilamentelor care se asamblează şi se
dezasamblează în funcţie de necesităţi. Sunt alcătuite din mai multe tipuri de proteine, caracteristice
diferitelor ţesuturi; de exemplu, în epitelii sunt formate din cheratină, în muşchi din desmină, în
fibroblaste din vimentină şi în celulele nervoase din proteine acide neuronale. Intră în alcătuirea
desmozomilor şi hemidesmozomilor, şi a neurofilamentelor. În toate tipurile de celule, formează o reţea
proteică pe faţa internă a membranei nucleare, numită lamina nucleară.
MICROTUBULII – sunt structuri tubulare sub formă de cilindri subţiri prezenţi în citoplasma
celulelor vegetale şi animale, având în secţiune transversală diametrul de 20-30 nm. Ca şi
microfilamentele, ei pot apărea grupaţi sau izolaţi.
În microscopia electronică se observă peretele este alcătuit din 12-13 protofilamente paralele,
formate din polimerizarea unor heterodimere de tubulină alfa şi beta.
Microtubulii sunt, în general structuri labile, datorită moleculelor de tubulină ce se agregă şi se
dezagregă continuu în citoplasmă; au rol în formarea citosheletului contribuind la menţinerea formei
celulei, a fusului de diviziune, participă la mişcările celulare, sunt prezenţi în structura cililor şi flagelilor
etc. Microtubulii sunt prezenţi şi sub formă de structuri stabile, cum ar fi centriolii.

Diametrul Subunităţi

7 nm Actină
Microfilamente

8 – 12 nm Diferite proteine în
funcţie de ţesut
Filamente intermediare

25 nm Tubulină (α şi )

Microtubuli

Figura 4.13 Reprezentare schematică comparativă a elementelor citoscheletului şi a caracteristicilor lor.

[1]

CENTRUL CELULAR – este un organit nemembranar, prezent în toate celulele care se divid,
situat in apropierea nucleului, conţinând doi centrioli, înconjuraţi de o zonă citoplasmatică mai clară.
Rolul său este de a controla creşterea şi organizarea microtubulilor.
Prezintă aspecte diferite în funcţie de fazele ciclului celular. În interfază este o structură
granulară numită centrozom, în interiorul căruia se află centriolii înconjuraţi de o masă citoplasmatică
numită centrosferă. Din centrosferă se detaşează elemente fibrilare radiare asterul. In timpul diviziunii
celulare, formează polii fusului de diviziune.
Centriolii apar la microscopul electronic ca doi cilindri perpendiculari unul pe celălalt – fiecare
cu peretele format din 9 triplete de tubuli ce înconjoară o zonă centrală, care apare de obicei de aspect
omogen. Centriolii realizează asamblarea microtubulilor în timpul interfazei, iniţiază şi declanşează
diviziunea celulară prin formarea fusului de diviziune, generează mişcarea cililor şi flagelilor (la baza
acestora se găseşte un centriol numit corpuscul bazal).

64
 a) b)

Figura 4.14 Imagini de microscopie electronică a) a unei secţiuni transversale printr-un centriol în care
se observă cele 9 triplete de microtubuli pe circumferinţa sa; şi b) a unui centrozom, situat în
proximitatea nucleului – se observă cei doi centrioli aşezaţi perpendicular unul pe celălalt (unul este
secţionat transversal şi celălalt longitudinal). [13]

INCLUZIUNILE CELULARE

Sunt produse ale activităţii celulare depozitate în celule sub forma substanţelor de rezervă sau
deşeuri de metabolism şi au un caracter temporar.
Pot fi formate din:
1. substanţe proteice – de exemplu hemoglobina;
2. lipide – sub formă de picături sferice în hepatocite, corticosuprarenală şi corpul galben din
ovar, evidenţiate cu coloraţia Sudan;
3. glicogenul – granule de diferite mărimi în hepatocite şi celulele muşchilor scheletici,
evidenţiate cu coloraţia PAS;
4. substanţele minerale – fier, siliciu, evidenţiate prin tehnici de citochimie;
5. pigmenţi – melanina, lipofuscina.
Se evidenţiază la microscopul optic prin tehnici speciale de citochimie, menţionate anterior. Mai
jos sunt prezentate evidenţierea depozitelor de fier şi a lipofuscinei (figura 4.15).

a) b)
Figura 4.15 Incluziuni intracitoplasmatice: a) depozite de fier în ficat, evidenţiate prin reacţia cu
ferocianură de potasiu care se transformă în contact cu fierul tisular în albastru de Prusia, colorare de
fond cu roşu nuclear; b) lipofuscina în neuroni apare ca depozite pigmentare maronii, colorare de fond
cu hematoxilină. [6,9]

65
 4.2.3 NUCLEUL

Este o structură intracitoplasmatică, caracteristică celulelor eucariote, care reprezintă sediul

genomului (cantonează informaţia genetică) şi coordonează întreaga activitate a celulei .
Aspectul nucleului diferă după faza ciclului celular. În interfaza ciclului celular, nucleul are o
structură morfologică bine definită îndeplinind funcţiile amintite, motiv pentru care se mai numeşte şi
nucleu metabolic.
În diviziune, a doua etapă a ciclului celular, nucleul pierde structura morfologică amintită,
singura sa componentă care se conservă este cromatina care se organizează sub formă de cromozomi.

Caracterele generale ale nucleilor:

1. Forma
În mod obişnuit, forma nucleului urmează forma
celulei din care face parte, deşi pot exista excepţii (vezi
figura 4.16):
– Nucleu rotund – în celulele sferice, celulele
cubice, celulele poliedrice;
– Nucleu turtit – în celulele pavimentoase;
– Nucleu alungit, ovalar – în celulele fusiforme,
celulele cilindrice;
– Nucleu – în celulele polipliode;
– Nucleu – în leucocitele granulare;
– Nucleu – în monocite.

Figura 4.16 Diferite forme ale nucleilor: rotund (1, 2, 3), turtit (4), alungit (5, 6) înmugurit (7), lobat (8),
reniform (9). [2]
2. Poziţia nucleului în celulă
În general poziţia sa este centrală, dar poate fi
modificată de anumiţi factori cum ar fi acumularea de
substanţe de rezervă sau de granule de secreţie (vezi
figura 4.17).
Figura 4.17 Diferite poziţii ocupate de nucleu în celule:
centrală (1), excentrică (2), medio-bazală (3), bazală (4, 5). [2]
3. Dimensiunile nucleului
Variază de la un tip de celulă la alta în funcţie de specie şi vârstă, iar la aceeaşi celulă în
funcţie de fazele ciclului celular. În celulele umane dimensiunile nucleilor sunt cuprinse între 3-25
microni.
4. Numărul nucleilor în celulă
Marea majoritate a celulelor din organism sunt mononucleate, dar mai pot exista:
– celule anucleate – singurele celule anucleate la om sunt hematiile adulte (în cursul
hematopoiezei, celula cap de serie pentru linia eritrocitară – proeritroblastul – este o celulă
nucleată care în timpul diferenţierii pierde nucleul şi se încarcă cu hemoglobină – figura 3.27);
– binucleate – celule cu activitate metabolică intensă, de exemplu hepatocitele (figura3.29), unii
neuroni din ganglionii simpatici;
– multinucleate – sinciţiul – provine prin fuzionarea mai multor celule mononucleate într-o
celulă unică, de exemplu osteoclastul (figura 4.18a);
– plasmodiul – ca exemplu: fibra musculară striată scheletică (figura 4.18b) provine dintr-o
celulă iniţial mononucleată (mioblast) care suferă multiple diviziuni ale nucleului fără diviziunea
citoplasmei.

66
Figura 4.18 a) Osteoclastul –
celulă cu formă neregulată şi
numeroşi nuclei în citoplasmă; b)
Fibra musculară striată
scheletică – celula alungită cu
citoplasma ocupată de miofibrile
şi numeroşi nuclei turtiţi situaţi la
periferie. [6, 13] a) b)

Structura nucleului
La MO, nucleul interfazic apare ca un organit vezicular, delimitat de o membrană bine vizibilă,
la interior are 1-2 nucleoli refringenţi, cromatina şi carioplasma sau sucul nuclear (figura 4.19).
1. Membrana nucleară apare ca o linie fină care separă conţinutul nucleului de cel
citoplasmatic (la MO). În microscopia electronică învelişul nuclear apare constituit din două membrane
trilaminare separate printr-un spaţiu clar – cisterna sau spaţiul perinuclear, cu o grosime de 10-15 nm.
Membrana externă se continuă cu membranele reticulului endoplasmic rugos, iar pe faţa citoplasmatică
are ataşaţi ribozomi.
Din loc în loc, anvelopa nucleară este străbătută de canale – porii nucleari – prin care se
realizează pasajul macromoleculelor între citoplasmă şi nucleu.
Membrana nucleară
Nucleolul
Pori nucleari
Cromatin

Figura 4.19 Structura nucleului interfazic – imagine de microscopie electronică, schemă. [22]
2.. Cromatina se prezintă sub forma unor granule; este dispusă sub două aspecte:
a. condensată în formaţiuni intens colorate, de formă şi dimensiuni variabile, numiţi
cromocentrii, a căror totalitate formează heterocromatina;
b. eucromatina, formată din granule de cromatină fin dispersată şi ca urmare slab colorate cu
coloranţi specifici.
Cromatina este alcătuită din punct de vedere chimic din ADN în cantitate mare cuplat cu
proteine; se va evidenţia cu coloranţi bazici in coloraţiile de rutină sau prin colorare specifică pentru
ADN cu colorant Feulgen (colorează ADN–ul în roşu violet).
3. Nucleolii sunt de formă sferică; conţin o cantitate mare de ARN şi au rol în sinteza
ribozomilor. Nucleolul se poate observa la microscopul optic, fiind intens bazofil in coloraţiile de rutină
sau cu verde de metil – pironină când se colorează în roşu (verdele are afinitate pentru ADN colorându-
l în verde, pironina are afinitate pentru ARN colorându-l în roşu).
4. Carioplasma are aspect omogen la microscopul optic. La microscopul electronic se observă
o reţea de proteine fibroase în ochiurile căreia se găsesc celelalte componente.

67
 4.3 DIVIZIUNEA CELULARĂ

Organismul uman adult constă din aproximativ 1014 celule rezultate toate dintr-o celulă unică -
zigotul. O parte din celule îmbătrânesc şi mor, altele sunt angajate în procese complexe de diferenţiere,
de aceea este necesară compensarea constantă a pierderilor de celule din sistemele celulare. Această
compensare se realizează prin diviziunea celulară.
Toate celulele organismului uman, în afara celulelor nervoase sunt capabile să se multiplice,
deci să formeze celule fiice cu aceleaşi caractere morfologice şi funcţionale ca şi celula mamă. Prin
diviziunea celulară se realizează un proces de diferenţiere şi creştere, de menţinere a structurii şi
funcţiilor organismelor şi reproducerea lor.
În timpul diviziunii materialul celular este împărţit în mod egal, astfel că fiecare celulă fiică
rezultată din diviziune să reprezinte un duplicat fidel al celulei mamă.
Acest lucru este posibil datorită dublării materialului celular care urmează a fi împărţit între
celulele fiice, în special a materialului genetic cromozomial, în timpul perioadei metabolice a vieţii
celulei, numită interfază, urmată de distribuţia acestui material în celulele fiice în timpul diviziunii
celulare. Interfaza şi diviziunea celulară alcătuiesc împreună ciclul celular.

În lumea vie există două tipuri de diviziuni celulare: diviziunea directă sau amitoza şi diviziunea
indirectă care la rândul său se împarte în: diviziunea indirectă a celulelor somatice  mitoza şi
diviziunea indirectă a celulelor sexuale  meioza .

Diviziunea directă (amitoza)

Reprezintă procesul de formare a două celule fiice ca urmare a divizării nucleului şi a
citoplasmei celulei mamă, fără apariţia cromozomilor, după fenomenul de autoreplicare a materialului
genetic. Acest tip de diviziune se caracterizează prin lipsa aparatului mitotic (cromozomii şi fusul de
diviziune).
Este considerată o formă inferioară de reproducere celulară, fiind întâlnită obişnuit la
organismele unicelulare. Poate fi întâlnită şi la organismele superioare, în hepatocite, osteocite,
condrocite, în ţesuturi de regenerare şi tumori.
În unele situaţii (de exemplu în cazul hepatocitelor), diviziunea nucleului nu este însoţită şi de
divizarea citoplasmei în două celule fiice (citodiereză), ducând la apariţia celulelor binucleate. În acelaşi
mod ia naştere şi plasmodiul.

4.3.1 MITOZA

Mitoza este o diviziune indirectă caracteristică celulelor somatice1, prin care dintr-o celulă
mamă diploidă2 rezultă două celule fiice diploide.
În mitoză se desfăşoară diferite procese care au ca rezultat împărţirea materialului celular al
celulei mamă între celulele fiice; dacă distribuţia membranei celulare şi a organitelor este aproximativ
egală, distribuţia materialului genetic se face riguros egal între cele două celule fiice, prin participarea
aparatului mitotic format din cromozomi şi fusul de diviziune (figura 4.20).
Mitozei i se descriu cinci etape:
– profaza,
– prometafaza,
– metafaza,
– anafaza şi
– telofaza.

1
celule somatice = toate celulele corpului cu exceptia celulelor sexuale, care se găsesc în gonade.
2
diploid = 2N – setul complet de cromozomi al celulelor somatice; la om 2N = 46 de cromozomi.

68
 Profaza: în această etapă au loc:
fenomene citoplasmatice: al doilea centru
celular devine vizibil, cei doi centrozomi se
îndepărtează unul de celălalt, spre polii celulei
şi între cei doi centrozomi se formează fusul de
diviziune (figura 4.21); şi
fenomene nucleare: nucleul îşi măreşte
dimensiunile, dispare nucleolul; cromatina
nucleară se condensează sub forma unui
ghem, iar membrana nucleară se fragmentează
şi dispare, urmată de amestecul conţinutului
nuclear cu citoplasma.
Prometafaza: în această etapă
cromatina se spiralizează la maxim şi se
individualizează cromozomii (figura 4.22), fiind
posibil studiul acestora din punct de vedere al
numărului, şi structurii lor. Cromozomii sunt
captaţi de filamentele fusului de diviziune de la
cei doi poli ai celulei, executând mişcări
oscilatorii în citoplasmă.
Metafaza: cromozomii bicromatidieni
se plasează în planul ecuatorial al fusului de
diviziune, cu axul lor lung perpendicular pe axul
fusului de diviziune formând placa metafazică.
Anafaza: în această etapă are loc
împărţirea materialului genetic între cele două
celule fiice în urma a 3 fenomene: 1) clivarea
longitudinală a centromerului prin ruperea
punţilor de heterocromatină dintre cei doi
kinetocori, 2) separarea celor două cromatide
surori ca urmare a apariţiei unor forţe de
respingere (rezultă astfel un număr dublu de
cromozomi formaţi dintr-o cromatidă 
monocromatidieni; la om, în această etapă sunt
92 de cromozomi monocromatidieni); şi 3)
migrarea simultană, cu aceeaşi viteză, a
cromozomilor monocromatidieni spre cei doi
poli ai celulei, jumătate la un pol, cealaltă
jumătate la celălalt pol.
Telofaza: în această etapă au loc
fenomene de refacere a nucleului:
despiralizarea comozomilor, apariţia
membranei nucleare în jurul cromatinei, nucleul
recăpătându-şi structura interfazică; şi
fenomene citoplasmatice: dispariţia fusului de
diviziune are loc şi diviziunea citoplasmei odată
cu apariţia peretelui despărţitor între cele două
celule fiice pe locul fostei plăci ecuatoriale
(fenomenul de citodiereză).
Figura 4.20 Etapele mitozei şi procesele celulare specifice fiecărei etape. [1]

69
 Aparatul mitotic
Fusul de diviziune se formează prin reasamblarea microtubulilor pornind de la cei doi
centrozomi care în mitoză sunt situaţi la polii celulei. Fibrele fusului se împart în trei categorii: fibrele
asterului care solidarizează centrozomii la polii celulei, fibrele kinetocoriene care se ataşează de
cromozomi şi scurtându-se realizează migrarea cromozomilor, şi fibrele polare care se unesc în planul
ecuatorial şi se alungesc, realizând alungirea celulei prin îndepărtarea polilor.

Figura 4.21 Reprezentare schematică după imaginea de microscopie electronică a fusului de diviziune
cu cromozomii ataşaţi – o parte din fibrele fusului au cromozomi ataşaţi (fibre kinetocoriene sau
cromozomiale) şi o parte din fibre se unesc în planul ecuatorial al celulei (fibre polare). [2, 14]

Cromozomii – fiecare cromozom este alcătuit

din câte două cromatide. Cromatida rezultă în urma
spiralizării intense a filamentului de cromatină şi
asocierea cu proteine. Cele două cromatide sunt
formaţiuni strict identice cantitativ şi calitativ rezultate în
urma replicării (sintezei) ADN-ului în interfază. Ele sunt
unite între ele printr-o formaţiune numită centromer care
are rolul de a fixa cromozomii pe fusul de diviziune.
Centromerul este alcătuit din doi kinetocori, câte
unul pentru fiecare cromatidă. Kinetocorii prezintă două
zone: internă şi externă. Prin zona internă se
solidarizează cele două cromatide, iar pe zona externă
se prind filamentele fusului de diviziune.
Extremităţile cromatidelor sunt bine delimitate şi
se numesc telomeri.
La om, în prometafaza mitozei există 46 de
cromozomi bicromatidieni (23 de perechi).
Figura 4.22 Structura cromozomului în prometafază. [1]

70
 Activitate practică  Studiul mitozei la Allium cepa:
Este o metodă rapidă pentru studiul cromozomilor în mitoză la Allium cepa; se face pe rădăcini
de Allium cepa, colorate cu orceină acetică (sau soluţie carmin acetică).
Principiu: orceina are proprietatea ca în soluţie acidă să fie încărcată pozitiv şi să se comporte
ca un colorant bazic, care se va fixa pe cromatină, evidenţiind modificările materialului genetic în timpul
diviziunii celulare.
Etape:
1. Recoltarea materialului biologic: un bulb de ceapă este lăsat să germineze într-un pahar cu
apă 3-4 zile. Când apar rădăcinile se vor recolta cu o lamă ascuţită numai vârfurile acestora
(10-15 mm).
2. Fixarea: se face cu alcool etilic absolut – acid acetic glacial 3:1, timp de 5 – 10 min.
3. Macerarea (hidroliza fibrelor): alcool etilic absolut acid clorhidric concentrat 1:1, 5 – 10 min.
4. Spălarea: în apă de la robinet 10 minute.
5. Colorarea: se face cu orceină acetică. Se pun radacinile în 1 ml colorant. Se încălzesc la 70°C,
timp de 15 – 20 min (de regulă colorarea se termină când rădăcinile sunt colorate roşu închis).
Se lasă să se răcească.
6. Efectuarea preparatelor microscopice: se face prin etalarea materialului biologic între lamă şi
lamelă. Pe o lamă curată se pune o picătură de colorant şi vârful unei rădăcini (~3 mm). Se
acoperă cu o lamelă. Materialul biologic se striveşte prin loviri repetate ale lamelei cu un băţ de
chibrit şi se absoarbe cu sugativa excesul de colorant.
7. Examinarea la microscopul fotonic – se observă următoarele aspecte (figura 4.23):
a) spiralizarea cromatinei în profază;
b) apariţia cromozomilor şi dispunerea lor
în placa metafazică în metafază;
c) migrarea cromozomilor către poli în
anafază;
d) refacerea structurii nucleare şi d c
citodiereza în telofază.
b
a
c

Figura 4.23 Preparat din meristemul rădăcinilor de

ceapă colorat cu orceină acetică pe care se
observă celule în diferite faze ale mitozei.

4.3.2 MEIOZA

Meioza este o diviziune indirectă caracteristică celulelor sexuale într-o anumită etapă a
dezvoltării lor, prin care dintr-o celulă mamă diploidă rezultă patru celule fiice haploide1, în urma a două
diviziuni celulare succesive denumite meioza I şi meioza II.
Celulele rezultate în urma meiozei se diferenţiază, fără a se mai divide, rezultând gameţii,
celule înalt diferenţiate cu rol în reproducerea organismului (ovulul la sexul feminin şi spermatozoizii la
sexul masculin). Meioza este deci, ultima diviziune pe care o suferă celulele liniei germinale în
diferenţierea lor către formarea gameţilor; se desfăşoară în organism numai în gonade.

1
haploid = N – setul de cromozomi al celulelor sexuale (gameţii); la om N = 23 de cromozomi.

71
 Meioza I
Se mai numeşte meioza reducţională, deoarece se finalizează cu obţinerea a două celule fiice
haploide, reducându-se astfel la jumătate numărul de cromozomi în celulele fiice.
Se desfăşoară în aceleaşi cinci etape ca şi în mitoză, denumite: profaza I, prometafaza I,
metafaza I, anafaza I, telofaza I.
Datorită fenomenelor care au loc în nucleu în timpul profazei I, se produce ulterior reducerea
numărului de cromozomi în celulele fiice (figura 4.24).
Profaza I: durează mai mult decât profaza mitozei; i se descriu cinci stadii: leptoten, zigoten,
pahiten, diploten şi diachineza.
În leptoten volumul nuclear este mult crescut, iar cromozomii prezintă zone de spiralizare –
cromomere – care alternează cu zone mai relaxate. În zigoten cromozomii omologi se alătură,
cromatidele fiecărei perechi împerechindu-se cromomer lângă cromomer. În pachiten toate perechile
de cromozomi omologi sunt unite şi ca urmare cromozomii rezultaţi sunt BIVALENŢI. Formaţi din 4
cromatide aparţinând celor doi cromozomi omologi, cromozomii bivalenţi alcătuiesc TETRADE
cromozomiale. În diploten perechile de omologi înfăşuraţi strâns pe anumite porţiuni denumite
„chiasme” încearcă sa se separe. Apar simultan rupturi la acelaşi nivel pe comatidele tetradelor
cromozomiale, iar segmentele celor două cromatide se schimbă între ele. Fenomenul care se referă la
schimbul de material genetic este cunoscut sub numele de „crossing-over”. În diakinesis cromozomii
bivalenţi care continuă să schimbe segmente cromozomiale între ei, se depărtează unii de alţii, se
spiralizează puternic devenind mai intens coloraţi şi se îndreaptă către periferia nucleului. La sfârşitul
profazei I cromozomii bivalenţi rămân uniţi la nivelul chiasmelor.

INTERFAZA PROFAZA I METAFAZA I ANAFAZA I TELOFAZA I

Figura 4.24 Meioza I – datorită fenomenelor care au loc în profaza I, are loc distribuţia materialului
genetic diferit faţă de mitoză, cu reducerea numărului de cromozomi în cele două celule fiice.

Prometafaza I: are loc dispariţia învelişului nuclear şi formarea fusului de diviziune; cromozomii
bivalenţi încep să se ataşeze pe filamentele fusului de diviziune.
Metafaza I: cromozomii bivalenţi (fiecare format din cei doi omologi), se dispun la ecuatorul
fusului de diviziune, fixându-se prin centromer în placa metafazică.
Anafaza I: are loc împărţirea materialului genetic în urma a două fenomene: 1) separarea
cromozomilor omologi, prin terminalizarea chiasmelor, cu separarea perechilor de cromozomi materni
şi paternidin fiecare pereche; şi migrarea simultană, cu aceeaşi viteză, a cromozomilor bicromatidieni
spre polii celulei, jumătate din cromozomi vor migra spre un pol cealată jumătate la celălalt pol.
Rezultatul: reducerea numărului de cromozomi (din set diploid în set haploid) şi recombinarea
cromozomilor (amestecarea în celulele fiice a cromozomilor materni şi paterni „dansul cromozomilor”)
Telofaza I: au loc fenomene de refacere a nucleului şi fenomenul de citodiereză rezultând două
celule fiice haploide.

72
 Meioza II
Este o diviziune ecvaţională, ca şi mitoza, în care se împart cromozomii bicromatidieni, celulele
fiice având acelaşi număr de cromozomi ca celula mamă. Urmează după meioza I, fără a fi precedată
de o interfază şi se desfăşoară în cinci etape, similare cu cele din mitoză, cu deosebirea că participă la
diviziune celule care au set haploid de cromozomi (figura 4.25).

TELOFAZA I PROFAZA II METAFAZA II ANAFAZA II TELOFAZA II

Figura 4.25 Meioza II – se desfăşoară similar mitozei, cu împărţirea cromozomilor bicromatidieni în

cromozomi monocromatidieni.

Profaza II: are loc spiralizarea cromonemelor, dispariţia membranei mucleare şi formarea
fusului de diviziune.
Prometafaza II: are loc individualizarea cromozomilor bicromatidieni şi recombinanţi în set
haploid, care încep să se ataşeze pe filamentele fusului de diviziune.
Metafaza II: cromozomii bicromatidieni, în set haploid, se plasează în placa metafazică.
Anafaza II: are loc împărţirea materialului genetic în celulele fiice prin scindarea cromozomilor
bicromatidieni (rezultând la om 46 de cromozomi monocromatidieni) şi migrarea cromatidelor jumătate
la un pol şi jumătate la celălalt.
Telofaza II au loc fenomene de refacere a nucleului şi fenomenul de citodiereză rezultând, in
final, patru celule fiice haploide, pentru fiecare celulă care intră în meioză. De fapt, acest lucru se
întâmplă în spermatogeneză, când rezultă 4 spermatide care se vor diferenţia formând spermatozoizii;
în ovogeneză, se pierde câte o celulă după fiecare diviziune (globulii polari), rezultând un final un singur
ovul/meioză.

73
 4.4 CELULELE ÎN CONTEXT TISULAR – MATRICEA EXTRACELULARĂ

O parte importantă a volumului tisular este reprezentată de spaţiul extracelular, care este
ocupat de matricea extracelulară. Aceasta este o reţea complexă de macromolecule – proteine şi
polizaharide – care sunt secretate şi asamblate local şi care sunt conectate cu celulele ţesutului prin
glicocalix. Matricea extracelulară prezintă două componente:
– o componentă fluidă – reprezentată de lichidul tisular alcătuit din apă, electroliţi,
mucopolizaharide, proteine solubile şi diferiţi metaboliţi – mai poartă denumirea de
substanţă fundamentală;
– o componentă solidă – reprezentată de molecule insolubile şi complexe macromoleculare
organizate în structuri care pot fi identificate la microscop ca: fibre de colagen, fibre de
reticulină, fibre de elastină, membrane bazale.
Matricea extracelulară realizează organizarea celulelor în ţesuturi şi coordonează funcţiilor
celulare prin activarea căilor de semnalizare intracelulară care controlează creşterea şi proliferarea
celulară.
Matricea extracelulară este cel mai bine reprezentată în ţesutul conjunctiv; macromoleculele
matricei sunt sintetizate local de celule numite fibroblaste.

Componentele matricei extracelulare

Există două clase principale de macromolecule care intră în compoziţia matricei: lanţuri
polizaharidice denumite glicozaminoglicani (GAG numiţi şi mucopolizaharide) şi proteine fibroase care
pot avea în principal roluri structurale (colagenul şi elastina) sau în adezivitate (fibronectina şi laminina).
Glicozaminoglicanii intră în alcătuirea substantei fundamentale; sunt lanţuri neramificate
polizaharidice formate din repetări de subunităţi dizaharidice în număr variabil. Există 4 tipuri de GAG:
(1) acidul hialuronic, (2) condroitin sulfatul şi dermatan sulfatul, (3) heparan sulfatul şi heparina, şi (4)
keratan sulfatul. GAG prezintă numeroase grupări sulfat şi carboxil, fiind deci puternic încărcate negativ.
Din acest motiv nu se împachetează strâns ocupând un volum mare pentru masa lor şi atrag apa
formând geluri chiar la concentraţii mici. În acest fel, creează un turgor al ţesturilor realizând o bună
rezistenţă la forţele de compresie.

Figura 4.26 Imagine de microscopie electronică şi schema unui agregat de proteoglicani – se observă
proteoglicanii formaţi din GAG ataşaţi unui miez proteic; proteoglicanii sunt ataşaţi prin proteine de
legătură la acidul hialuronic, formând un agregat de dimensiuni mari. [1]

74
 Cu excepţia acidului hialuronic, toţi GAG se ataşează încă din timpul sintezei de un miez
proteic formând proteoglicani , cu dimensiuni extrem de variabile (o proteină poate ataşa una sau până
la sute de molecule de GAG). Proteoglicanii, la rândul lor, se ataşează de o moleculă de acid hialuronic,
formând agregate de proteoglicani cu masă moleculară foarte mare (figura 4.26).
La microscopul optic se evidenţiază cu albastru alcian, PAS sau mucicarmin.

Colagenul este principala proteină din corpul mamiferelor (~ 25% din masa proteică). Este o
componentă majoră a pielii şi oaselor. Fibrele de colagen au la bază filamentele de colagen care sunt
heterotrimeri alcătuiţi din molecule diferite în funcţie de ţesut. Moleculele de colagen se pot combina şi
asambla, dând naştere la o familie de filamente numite colagen I, II.. până la XI.
Moleculele de colagen se sintetizează intracelular, unde formează structura de bază de triplu
helix, apoi sunt secretate şi se asamblează in spaţiul extracelular în fibrile şi fibre (figura 4.27). Fibrele
de colagen conţin aminoacizi bazici în cantitate mare, motiv pentru care se colorează cu coloranţi acizi
în coloraţiile de rutină (figurile 3.14-16).
FIBRELE DE COLAGEN sunt inextensibile, rezistente la tracţiune, găsindu-se peste tot în
ţesutul conjunctiv, dar cu predilecţie în structurile conjunctive ce îndeplinesc funcţii mecanice
(aponevroze, tendoane, capsule, ligamente) unde sunt alcătuite predominant din colagen de tip I.

a) b)
Figura 4.27 Imagine de microscopie electronică în care se observă: a) un fibroblast şi mănunchiuri de
fibre de colagen secţionate longitudinal şi transversal; b) aspectul tipic al moleculei de colagen tip I (cea
mai frecventă formă) – trăsătura sa specifică este prezenţa unor striaţii cu periodicitate de 640 Å. [4]

FIBRELE DE RETICULINĂ sunt, de fapt, alcătuite din colagen de tip III. S-a crezut iniţial că
sunt formate din proteine diferite, deoarece se comportă diferit faţă de coloranţii citologici – au o
afinitate crescută pentru sărurile de argint, fiind evidenţiate specific prin impregenare argentică (figura
3.17). Ele formează o reţea reticulară fină în ţesuturile cu celularitate crescută cum sunt ficatul şi
organele limfoide, în ochiurile căreia se găsesc celulele.

Elastina – în matricea extracelulară există o reţea de fibre elastice care conferă ţesuturilor
proprietatea de a reveni la dimensiunea iniţială după ce au fost supuse unor forţe de întindere.
FIBRELE ELASTICE sunt alcătuite în principal din elastină, o proteină puternic hidrofobă. Ea
se formează din tropoelastină (precursorul solubil al elastinei) care este secretată în spaţiul extracelular
şi asamblată pe faţa externă a plasmalemei într-un ansamblu de straturi şi fibre (figura 4.28a).
La microscopul optic se evidenţiază cu coloranţi specifici (de exemplu orceina – figura 3.18); la
microscopul electronic apare ca o structură amorfă dispusă în straturi de formă neregulată (figura
4.28b).

75
 Elastina se găseşte în cantitate mare în peretele vaselor, în special în artere, reprezentând
50% din greutatea uscată a aortei. De asemenea sunt bine reprezentate în piele şi în plămân.

a) b)

Figura 4.28 a) Reprezentare schematică a asamblării moleculelor de elastină în fascicule. Moleculele

sunt interconectate prin punţi scurte. În starea relaxată sunt împachetate, iar în starea întinsă sunt
alungite. b) Imagine de ME arată elastina E în ţesutul conjunctiv lax subiacent epiteliului traheal.
Câmpul conţine şi fibrile de colagen C (secţionate transversal) şi extensii citoplasmatice ale
fibroblastelor F. Elastina este alcătuită dintr-o masă amorfă de tropoelastină polimerizată. [1, 4]

Fibronectina. Matricea extracelulară conţine o serie de proteine cu domenii multiple, cu locuri

specifice de legare pentru alte macromolecule din matrice şi pentru receptorii de la suprafaţa celulelor,
numite proteine multiadezive.
Aceste proteine contribuie deci, atât la organizarea matricei extracelulare cât şi la aderenţa
celulelor la ea. Cea mai bine caracterizată proteină de adeziune este fibronectina (figura 4.29) o
glicoproteină cu masă moleculară mare abundentă în matricea extracelulară; ea conţine domenii de
legare pentru integrine (proteine de adeziune moleculară) şi pentru componente ale matricei
extracelulare (colagen, proteoglicani) si astfel ataşează celulele de matricea extracelulară.

Figura 4.29 Reprezentare schematică a fibronectinei,

proteină cu numeroase domenii pe care se leagă
elemente matriceale şi celulare. [15]

76
 Epiteliile şi alte grupuri celulare organizate sunt aşezate sau înconjurate de MEMBRANA
BAZALĂ, o reţea de elemente matriceale dispuse într-un strat subţire de 60 – 120 nm (figura 4.30).
Majoritatea componentelor membranelor bazale sunt sintetizate de celulele care sunt aşezate pe ea.
Laminina este principala proteină de adezivitate din membrana bazală. Este o proteină
heterotrimerică în formă de cruce care formează o reţea şi ajută la interconectarea componentelor
membranei bazale.
În afară de laminină, în compoziţia membranelor bazale mai intră colagenul tip IV – o moleculă
cu un domeniu globular şi unul filamentar, care formează o reţea bidimensională, şi perlecanul un
proteoglican cu mai multe domenii proteice prin care se leagă de componentele matricei extracelulare
şi de celule.

Figura 4.30 Reprezentare schematică a membranei bazale – se observă cum componentele sale se
întretaie şi sunt interconectate formând o reţea densă. [15]

Datorită glicoproteinelor (laminina) şi proteoglicanilor din compoziţia lor, membranele bazale

pot fi evidenţiate la microscopul optic cu coloraţiile specifice pentru glucidele complexe, de exemplu cu
coloraţia PAS (figura 4.31).

Figura 4.31 Cripte duodenale tapetate cu

celule secretoare de mucus – coloraţie PAS.
PAS are afinitate pentru glucidele complexe
ca proteoglicanii din membrana bazală (BM),
ca şi pentru mucusul (M) de la polul apical al
celulelor. [4]

77
 Partea a cincea
ALTE METODE UTILIZATE ÎN STUDIUL CELULELOR

5.1 FRACŢIONAREA CELULARĂ

Populaţii de celule pot fi analizate biochimic prin fragmentarea lor şi fracţionarea conţinutului
prin ultracentrifugare. Organitele celulare sunt astfel izolate şi purificate pentru a putea fi studiate:
– compoziţia şi funcţia lor,
– localizarea intracelulară a unor molecule specifice.
Prima etapă în obţinerea organitelor izolate, îl constituie fragmentarea membranelor celulare,
de regulă printr-un procedeu mecanic numit omogenizare, în urma căruia se obţine un omogenat
celular.
Omogenizarea presupune mai multe etape:
– recoltarea unui fragment de ţesut;
– tăierea fragmentului în bucăţele mici;
– suspendarea în soluţie de omogenizare rece,
izotonă, pentru a preveni ruperea
membranelor organitelor datorită osmozei
(de regulă o soluţie de zaharoză 0.25M);
– omogenizarea mecanică (figura 5.1).
Figura 5.1 Omogenizarea mecanică a ţesuturilor se face
într-un omogenizator cu lamă metalică sau de teflon.
Procedura se desfăşoară la rece, pentru a preveni
degradarea enzimatică a structurilor celulare. [12]

Suspensia rezultată – conţine numeroase organite, fiecare având mărime şi densitate diferită.
Acestea sunt separate prin centrifugare: centrifugarea diferenţială – care separă grupuri
(fracţiuni) de organite cu mărimi şi densităţi apropiate, urmată de centrifugarea în gradient de
densitate – în care se separă organitele din fracţiunile obţinute anterior.
Centrifugarea diferenţială constă în centrifugări repetate, la viteze progresiv crescute, pentru
separarea din omogenat a componentelor sale. În general, cu cât o structură celulară este mai mică, cu
atât mai mare este forţa centrifugă necesară pentru a o sedimenta. Valorile tipice ale diferitelor etape
ale centrifugării diferenţiale sunt:
– viteză mică – 1000 g1 timp de 10 minute;
– viteză medie – 20.000 g timp de 20 minute;
– viteză mare – 80.000 g timp de 60 minute;
– viteză foarte mare – 150.000 g timp de 180 minute.
Iniţial omogenatul este supus centrifugării cu viteza mică la care sedimentează doar organitele
mari cum sunt nucleii (şi celulele rămase eventual întregi). La forţă centrifugă mai mare, organitele mari
sunt sedimentate – mitocondriile, lizozomii şi peroxizomii. În paşii următori sunt îndepărtaţi din
suspensie microzomii (fragmente de membrane din citosol care formează vezicule închise, provenind
în principal din reticulul endoplasmic), şi în final ribozomii (figura 5.2). Acest ultim pas necesită o
ultracentrifugă, care să se rotească cu viteză foarte mare (75.000 rotaţii/min.), pentru a genera forţa
centrifugă cerută de această etapă. Odată ribozomii îndepărtaţi, supernatantul va conţine faza solubilă
a celulei (citosolul).
1
Forţa realizată de centrifugă prin mişcarea circulară a rotorului (forţa centrifugă) se exprimă în număr de g  de câte ori
este mai mare forţa centrifugă decât forţa de atracţie gravitaţională.

78
 Se poate observa că în urma centrifugării diferenţiale nu se obţin organite în stare pură, ci
fracţiuni celulare care conţin mai multe structuri cu mărime şi densitate asemănătoare.

Figura 5.2 Reprezentare schematică a etapelor centrifugării diferenţiale. La fiecare etapă se

sedimentează un grup de structuri – o fracţiune celulară – de regulă heterogen. Forţa de centrifugare
este progresiv crescută, particulele mari se sedimentează primele, cele mai mici ultimele. [14]

Centrifugarea în gradient de densitate este necesară pentru purificarea organitelor din

fracţiunile rezultate anterior. Aceasta separă componentele celulare în funcţie de densitatea lor.
Fracţiunea care se doreşte a fi
separată se resuspendă şi se toarnă la
suprafaţa unei eprubete ce conţine o soluţie
de zaharoză (sau alt compus neionic cu
densitate mare). Soluţia de zaharoză este
turnată astfel încât densitatea (şi concentraţia)
sa să fie mai mare la baza tubului şi mai mică
la suprafaţă – gradient de densitate (figura
5.3).
Eprubeta este centrifugată la viteză
mare timp de câteva ore, permiţând organitelor
să migreze la o poziţie de echilibru unde
densitatea lichidului înconjurător este egală cu
densitatea organitului.

Figura 5.3 Centrifugarea în gradient de zaharoză a fracţiunii ce conţine mitocondriile, lizozomii şi

peroxizomii. [14]

79
 Deoarece fiecare organit prezintă trăsături morfologice
unice, puritatea preparatelor de organite poate fi apreciată prin
examinarea la microscopul electronic (figura 5.4).

Figura 5.4 Imagine de microscopie electronică din fracţiunea

microzomală rugoasă. Reticulul endoplasmic se fracţionează şi
framentele formează mici vezicule numite microzomi care
sedimentează în a treia fracţiune la centrifugarea diferenţială.
Centrifugarea în gradient de densitate separă în continuare
microzomii netezi, mai puţin denşi, de cei rugoşi. [1]
De asemenea, puritatea lor mai poate fi apreciată prin măsurarea nivelului proteinelor specifice
pentru un organit (proteine marker). De exemplu, citocromul c se găseşte numai în mitocondrii, deci
prezenţa acestei proteine în preparatul de lizozomi indică o contaminare cu mitocondrii. Alte exemple
de proteine marker sunt:
– catalaza prezentă doar în peroxizomi;
– fosfataza acidă prezentă doar în lizozomi;
– glucozo-6-fosfat dehidrogenaza prezentă în reticulul endoplasmic.
Organitele celulare izolate prin această metodă păstrează o proporţie semnificativă a activităţii
lor funcţionale. Ele pot fi folosite în sisteme „cell-free” pentru a se studia diferite procese celulare. De
exemplu, mecanismul sintezei de proteine a fost descifrat în experimente plecând de la un omogenat
celular care avea capacitatea de a traduce ARN-ul în proteine. Prin fracţionarea componentelor acestui
omogenat s-au izolat ribozomii, ARN-ul de transport şi diferitele enzime care participă la sinteza de
proteine. Odată izolate componentele pure, fiecare dintre acestea poate fi adăugată sau scoasă din
sistem, pentru a i se defini rolul în procesul global.

5.2 IZOLAREA ŞI PURIFICAREA PROTEINELOR

Specificitatea structurală şi mai ales funcţională a organitelor este determinată de proteinele

care intră în alcătuirea lor, de aceea, analizarea proteinelor joacă un rol important în analiza biochimică
a organitelor.
Analiza structurală sau funcţională a unei anumite proteine presupune în primul rând izolarea
acelei proteine într-o stare relativ pură.
Purificarea proteinelor se realizează în general prin etape succesive de îndepărtare a
structurilor contaminante. Două proteine pot fi foarte similare în ce priveşte o anumită proprietate (de
exemplu încărcarea electrică) şi diferite în ce priveşte o alta (de exemplu masa moleculară). Ca urmare,
purificarea completă a unei anumite proteine necesită de obicei folosirea succesivă a mai multor tehnici
care se bazează pe diferitele proprietăţi ale proteinelor ce urmează a fi separate.

5.2.1 EXTRAGEREA PROTEINELOR DIN MEMBRANE

Celulele conţin mii de proteine diferite dintre care o parte sunt dizolvate în mediul intern, iar
altele sunt ataşate la diferite structuri celulare – proteinele membranare sau cele ataşate matricei unor
organite. Proteinele ataşate membranelor sunt de două tipuri:
– proteine periferice, sau extrinseci – care pot fi extrase cu soluţii ionice slabe, şi
– proteinele intrinseci sau integrale, de regulă transmembranare – care au un domeniu
hidrofob în grosimea stratului dublu lipidic şi necesită folosirea detergenţilor pentru
extragerea din membrane.
Detergenţii sunt molecule amfipatice care distrug membranele, intercalându-se în dublul strat
lipidic şi solubilizând lipidele şi proteinele. Partea hidrofobă a moleculei de detergent este atrasă de
cozile acizilor graşi din lipide şi domeniul hidrofob al proteinelor, în vreme ce partea hidrofilă este atrasă

80
de apă, formând complexe solubile în apă cu proteinele şi lipidele membranare (figura 5.5). Unii
detergenţi sunt ionici având o grupare încărcată, cum este dodecil-sulfatul de sodiu (SDS), alţii sunt
neionici, cum ar fi Triton X-100 (figura 5.6).

Figura 5.5 Extragerea proteinelor din membrana celulară folosind detergenţi – porţiunea hidrofobă a
detergenţilor se asociază cu cele ale proteinelor şi lipidelor, iar cele hidrofile vin în contact cu mediul
apos. [1]

Figura 5.6 Formula chimică a doi dintre cei mai utilizaţi detergenţi pentru solubilizarea proteinelor –
formaţi dintr-ul lanţ de acid gras sau altă structură hidrocarbonată şi o grupare polară. [1]

Odată izolate şi purificate anumite proteine din membrane, acestea pot fi încorporate în
vezicule fosfolipidice artificiale (lipozomi) pentru a li se studia funcţia. De exemplu, în acest mod a fost
demonstrată funcţia pompei de Na+-K+, care menţine concentraţia intracelulară a acestor ioni prin
pomparea a doi ioni de Na+ către exteriorul celulei şi a trei ioni de K+ de la exterior către interior.

5.2.2 CROMATOGRAFIA
Cromatografia reprezintă metoda prin care un componentele unui amestec (de regulă dizolvate
într-o „fază mobilă”) sunt separate prin deplasarea de-a lungul unei matrici poroase („faza staţionară”).
Faza mobilă poate fi lichidă sau gazoasă, în vreme ce faza staţionară poate fi solidă sau lichidă.
Majoritatea tehnicilor utilizate sunt de cromatografie lichidă în care componentele amestecului
se asociază preferenţial cu una din cele două faze – faza mobilă lichidă, un solvent şi faza staţionară
solidă, o matrice poroasă prin care solventul se mişcă. Matricea poroasă este dispusă, de regulă într-o
coloană subţire, faza mobilă încărcată la un capăt al coloanei iese pe la celălalt capăt – cromatografie
lichidă pe coloană.
Proteinele ce trebuie separate sunt dizolvate în solvent şi trecute prin coloană. Materialul care
alcătuieşte faza staţionară conţine situsuri de care se pot lega proteinele din soluţie. Dacă moleculele
unei proteine interacţionează cu materialul matricei, progresul lor prin coloană este încetinit. Cu cât

81
afinitatea unei proteine pentru matrice este mai mare, cu atât mai lentă este trecerea sa prin coloană.
Deoarece diferitele proteine din amestec au afinitate diferită pentru matrice, ele sunt încetinite în grade
diferite. Pe măsură ce solventul străbate coloană şi picură în partea inferioară a acesteia, este colectat
ca fracţiuni într-o serie de tuburi. Proteinele din amestec cu cea mai slabă afinitate pentru matrice apar
în primele fracţiuni care ies din coloană.
Cromatografia de filtrare în gel. Filtrarea în gel separă proteinele (sau acizii nucleici) în
principal pe baza masei lor moleculare. Matricea folosită pentru filtrarea în gel este alcătuită din
polizaharide interconectate (dextrani sau agaroză) de diferite porozităţi.
Să presupunem că proteina ce
trebuie purificată are o masă
moleculară de 125 kDa şi este
prezentă în soluţie cu două proteine
contaminante de 250 şi respectiv 75
kDa. Se trece amestecul printr-o
coloană care permite să treacă
moleculele cu masă mai mică de 200
kDa (figura 5.7). Pe măsură ce
solventul se mişca prin coloană,
proteinele se deplasează în lungul
său, dar cu viteze diferite, proteinele
cu masă moleculară mai mare fiind
întârziate. Prima iese proteina de 75
kDa, fiind îndepărtată; apoi se
colectează proteina de 125kDa, în Figura 5.7 Separarea a trei proteine, pe baza masei
stare purificată, în vreme ce proteina moleculare prin cromatografia de filtrare în gel. [12]
de 250 kDa rămâne în coloană.
Cromatografia prin schimb de ioni. Proteinele pot fi considerate electroliţi polivalenţi mari, şi
proteinele unui amestec cel mai adesea au sarcină globală diferită. Încărcarea ionică este folosită ca
bază pentru purificarea proteinelor în cromatografia prin schimb de ioni. Aceasta se realizează prin
legarea ionică a proteinelor de o matrice inertă cum ar fi celuloza de care sunt ataşate covalent grupări
încărcate. Una din cele mai utilizate matrici este răşina dietil-amino-etil (DEAE) celuloza care este
încărcată pozitiv şi deci leagă moleculele încărcate negativ, fiind considerată un „schimbător de anioni”.
Alte tipuri de matrici acţionează ca schimbători de cationi (carboxi-metil celuloza).
Răşina este încărcată într-o coloană şi
amestecul proteic este trecut prin
coloană într-o soluţie tampon cu pH
stabilit în aşa fel încât majoritatea
proteinelor să se lege în coloană (figura
5.8). Proteinele sunt legate reversibil de
răşină şi pot fi detaşate prin modificarea
concentraţiei sau pH-ului tamponului.
Detaşarea proteinelor se poate face în
etape, prin adăugarea de soluţii tampon
cu proprietăţi diferite, sau continuu prin
folosirea unei soluţii al cărei pH se
modifică continuu (în gradient).
Indiferent de soluţia folosită, proteinele Figura 5.8 Separarea a două specii de proteine pe
sunt eliberate din coloană în ordine de la DEAE-celuloză. În acest caz o răşină încărcată pozitiv
cea mai slab legată la cea mai puternic (schimbătoare de anioni) leagă proteinele încărcate
legată. negativ. [12]

82
 Cromatografia de afinitate. Metodele descrise până acum se folosesc de proprietăţile globale
ale proteinelor pentru a efectua purificarea sau fracţionarea. Cromatografia de afinitate valorifică
proprietăţile structurale unice ale unei proteine, permiţând ca moleculele acesteia să fie specific retrase
din soluţie, în timp ce toate celelalte rămân în faza mobilă.
Proteinele interacţionează cu substraturi specifice: enzimele cu substratul lor, receptorii cu
ligandul, antigenele cu anticorpul specific. Fiecare din aceste tipuri de proteine poate fi îndepărtată din
soluţie la trecerea amestecului care o conţine printr-o coloană în care de matricea inertă este legată
covalent molecula cu care proteina interacţionează specific (substrat, ligand, anticorp ş.a.).
De exemplu un preparat impur
de receptor pentru insulină este trecut
printr-o coloană de agaroză având
ataşată covalent insulină, receptorul se
va lega specific de aceasta, in anumite
condiţii care favorizează legarea (figura
5.9). Odată ce toate proteinele
contaminante au trecut prin coloană
ieşind la partea sa inferioară, moleculele
de receptor insulinic pot fi detaşate prin
modificarea compoziţiei şi/sau pH-ului
solventului din coloană.

Figura 5.9 a) Reprezentare schematică

a matricei de agaroză cu un ligand ataşat
covalet (insulina) cu care se poate cupla
specific doar o proteină (receptorul
pentru insulină). b) Cromatografia de
afinitate – etape. [12]
Astfel, prin cromatografia de afinitate se poate obţine purificarea completă a unei molecule într-
o singură etapă.

5.2.3 ELECTROFOREZA
Electroforeza se bazează pe capacitatea moleculelor încărcate electric, de a migra către unul
din electrozi când sunt plasate într-un câmp electric.
Astfel, electroforeza separă amestecuri de substanţe încărcate electric, cum sunt proteinele şi
acizii nucleici, pe baza sarcinii şi a mărimii lor. Acestea sunt migrate în lungul unei matrici poroase, iar
forţa care se exercită asupra acestor molecule este direct proporţională cu diferenţa de potenţial
aplicată şi sarcina moleculei, şi invers proporţională cu mărimea moleculei şi vâscozitatea mediului.
Pentru separarea electroforetică se pot utiliza: hârtia de filtru, felii de acetat de celuloză, sau
geluri de agar, agaroză sau poliacrilamidă.
Electroforeza proteinelor pe gel de poliacrilamidă (PAGE1) – este cel mai frecvent utilizată
pentru separarea electroforetică a proteinelor. Matricea este formată din polimerii unei molecule mici
(acrilamida) care sunt interconectaţi („cross-linked”2)în prezenţa bisacrilamidei şi a unor catalizatori ai
polimerizării, formând o ‚sită moleculară’ prin care trebuie să treacă proteinele ce migrează în câmpul
electric. Soluţia de acrilamidă-bisacrilamidă se toarnă între două plăci de sticlă sau într-un tub subţire
unde este lăsată sa polimerizeze formând un film sau un cilindru subţire.

1
PAGE – polyacrylamid gel electrophoresis = electroforeza pe gel de poliacrilamidă (engl.)
2
cross-link = legare încrucişată (engl.)

83
 Odată polimerizat, gelul este
introdus, la ambele capete, în două
compartimente cu soluţie tampon în
care se găsesc cei doi electrozi
(catodul în partea superioară şi
anodul în partea inferioară).
Proba ce conţine amestecul
de proteine este încărcată în
godeurile de la partea superioară a
filmului de poliacrilamidă ca în figura
5.10 (sau în partea superioară a
tubului în electroforeza capilară).
Proba se amestecă în prealabil cu o
soluţie de zaharoză sau glicerol, a
cărei densitate împiedică proba să se
amestece cu soluţia tampon din
compartimentul superior.
Între cele două
compartimente este aplicată o
diferenţă de potenţial şi curentul
electric rezultat străbate gelul de
poliacrilamidă, declanşând
deplasarea proteinelor către
electrodul cu sarcină opusă.
Proteinele fiind molecule amfotere,
sarcina lor electrică depinde de pH-ul
mediului; de aceea separarea se
efectuează de regulă folosind soluţii
tampon alcaline, care fac ca
proteinele să fie încărcate negativ şi
să migreze către anodul încărcat
pozitiv de la extremitatea inferioară a
gelului. După electroforeză, filmul de
poliacrilamidă este scos dintre plăcile
de sticlă şi este colorat.

Figura 5.10 Electroforeza pe gel de

poliacrilamidă. Amestecul proteic este
încărcat în godeurile din partea
superioară a gelului (etapa 1). În
etapa a doua se aplică o diferenţă de
potenţial între extremităţile gelului,
ceea ce produce deplasarea
proteinelor de-a lungul unor piste
paralele. Când în tamponul conţine şi
SDS, proteinele se deplasează cu o viteză invers proporţională cu masa lor moleculară. Odată
încheiată electroforeza, gelul se colorează pentru evidenţierea proteinelor. [12]

Deplasarea proteinelor prin gelul de poliacrilamidă depinde de: densitatea sarcinilor, mărimea
şi forma moleculei proteice. Proteinele cu densitatea sarcinilor mare sunt atrase mai puternic către

84
anod, deci migrează mai repede. Moleculele mai mari sunt întârziate comparativ cu cele mici care
străbat mai uşor porii matricei. De asemenea, proteinele cu formă globulară se vor deplasa mai rapid
decât proteinele fibroase, alungite, cu masă moleculară similară.
Progresul electroforezei este urmărit prin migrarea unui colorant cu masă moleculară mai mică
decât a celei mai mici proteine din amestec. Când colorantul de urmărire a migrării a ajuns în poziţia
dorită se întrerupe migrarea. Gelul este scos dintre plăcile de sticlă şi se introduce într-o tăviţă cu
soluţie colorantă, pentru a se evidenţia poziţia proteinelor; cel mai frecvent se foloseşte pentru colorare
soluţia de albastru Coomassie sau nitrat de argint.
De regulă electroforeza se efectuează în prezenţa SDS (SDS-PAGE). Acest detergent cu
sarcină negativă se leagă în cantitate mare de toate tipurile de proteine, făcând ca proteinele să se
destindă sub forma unor filamente, eliminând diferenţele de formă dintre acestea. De asemenea,
neutralizează sarcinile pozitive ale proteinelor, care vor apare încărcate negativ, eliminând astfel şi
diferenţele de sarcină electrică. În SDS-PAGE, deci, proteinele sunt separate practic numai pe baza
masei lor moleculare.
Un exemplu de separate a proteinelor prin SDS-PAGE îl reprezintă electroforeza proteinelor
din membrana eritrocitară. Membrana celulară eritrocitară poate fi relativ uşor izolată, deoarece
eritrocitele nu conţin alte organite membranare, iar proteinele sale au fost studiate pentru descifrarea
funcţiilor membranei celulare în general.
Proteinele membranare
dizolvate într-o soluţie tampon ce
conţine SDS, migrează către anod
în funcţie de greutatea moleculară,
cele cu greutate mai mică (cum ar fi
actina) mai mult, cele cu greutate
mai mare (ca spectrina şi ankirina)
mai puţin (figura 5.11).

Figura 5.11 Migrarea electroforetică

pe SDS-PAGE a proteinelor izolate
din membrana eritrocitară. a)
Imaginea unui gel de poliacrilamidă;
pista 1 – marker de greutate
moleculară; pistele 2 şi 3 – migrarea
proteinelor membranare, în pista 3 a
fost încărcată o cantitate dublă de
amestec proteic. b) Reprezentare
schematică a distribuţiei proteinelor
membranei eritrocitare la SDS- a) b)
PAGE. [b) după 1]

5.3 CULTURILE DE CELULE

Culturile de celule reprezintă totalitatea tehnicilor prin care celulele sunt menţinute în viaţă sau
multiplicate în afara organismului.
Obţinerea culturilor celulare este o metodă importantă în studiul celulei din mai multe
considerente:
– în culturi se obţine un număr mare de celule;
– majoritatea culturilor conţin un singur tip celular, ceea ce este util în analizele biochimice
ale diferitelor tipuri de celule;

85
 – pot fi studiate numeroase activităţi celulare: endocitoza, mişcările celulare, diviziunea
celulară, transportul prin membrane, sinteza proteinelor;
– se studiază răspunsul celular la diferite substanţe – medicamente, hormoni, factori de
creştere.

Clasificarea culturilor de celule

1. După felul substratului culturile pot fi: pe suport care poate fi: organic nutritiv sau nenutritiv,
sau suport anorganic; de regulă cresc pe suport acele celule care provin din ţesuturi şi trebuie să adere
de un substrat pentru a funcţiona optim; şi în suspensie în mediu lichid, cresc acele celule care se
găsesc de obicei in mediu lichid (de exemplu limfocitele, sau celulele măduvei hematogene) sau au
pierdut proprietatea de adezivitate (celulele tumorale).
2. După tipul de material biologic cultivat se disting două mari categorii de culturi:
a) Culturi de organe (organocultură) – reprezintă întreţinerea, de obicei fără multiplicare, in medii
nutritive adecvate a unor fragmente de organ (intestin, trahee, rinichi). În general, cultura de organe „in
vitro” este dificilă şi necesită medii nutritive complexe şi condiţii tehnice speciale.
b) Culturi de celule – reprezintă multiplicarea „in vitro” a celulelor din:
– fragmente de ţesut (explante); în jurul explantului se formează o coroană de celule care se
multiplică;
– suspensii de celule naturale sau obţinute prin dispersarea în laborator.
3. După provenienţa celulelor care urmează a fi cultivate, culturile sunt: culturi primare – când
se recoltează pentru cultură celule din organism, şi culturi secundare – când celulele provin din altă
cultură şi au fost conservate prin îngheţare la temperaturi foarte scăzute (în azot lichid).

Obţinerea celulelor izolate pentru cultură

Celulele extrase din organism pentru a fi cultivate pot proveni din două surse – fie din
organismul adult, din diferite ţesuturi, fie din embrioni – culturi de celule embrionare. Celulele
embrionare se utilizează frecvent deoarece sunt mai uşor de disociat sub formă de celule izolate decât
cele din ţesuturile adulte, şi se găsesc într-o stare mai nediferenţiată, putându-se apoi diferenţia în
cultură în diferite tipuri celulare, sub acţiunea unor factori specifici. Celulele din ţesuturile adulte
necesită de obicei medii complexe şi un timp mai mare pentru a intra în diviziune şi a prolifera; excepţie
fac celulele tumorale care au pierdut mecanismele normale de control ale ciclului celular, se divid rapid
şi cresc chiar şi pe medii sărace.
Obţinerea celulelor se desfăşoară în mai multe etape, în care se respectă riguros regulile de
asepsie.
1. Recoltarea – se face din cele mai varitate ţesuturi provenite de la om, animal sau plante.
Exemplu: – efectuarea unor culturi de fibroblaşti din ţesut de embrion de găină. Se recoltează
embrionii din ouă in condiţii de sterilitate; se decapitează pentru îndepărtarea celulelor nervoase şi a
celor cheratinice ale ciocului.
Ţesutul recolatat se spală cu soluţii saline şi antibiotice pentru înlăturarea cheagurilor de sânge
şi a porţiunilor inutilizabile; se spală de 2-3 ori, de fiecare dată cu soluţie nouă.
2. Dispersarea mecanică (mărunţirea embrionului) se realizează într-un mediu steril special
amenajat, cu ajutorul unui foarfece special (figura 5.12). De regulă, fragmentele rezultate sunt supuse
dispersării chimice cu tripsină la 37C, pe suprafaţa unui agitator magnetic. Tripsina digeră domeniile
extracelulare ale proteinelor care mediază adeziunea celulară (colagen, fibronectină, proteoglicani).
Acţiunea tripsinei se opreşte prin răcirea soluţiei şi apoi celulele se separă de soluţia de tripsină
prin centrifugare şi se înlătură supernatantul reprezentat de tripsină.
Separarea celulelor este favorizată de resuspendarea celulelor într-o soluţie salină care conţine
un chelator de calciu (EDTA) – ionii de calciu joacă un rol important în adeziunea celulară şi
îndepărtarea lor din soluţie favorizează izolarea celulelor. Apoi se prepară o diluţie 1:10 a suspensiei
celulare în mediu nutritiv pentru efectuarea numărării.

86
Figura 5.12 Obţinerea celulelor izolate dintr-un fragment de ţesut presupune atât fragmentarea
mecanică, cât şi o dispersare chimică cu ajutorul unei enzime proteiolitice (tripsina). [10]

3. Numărarea cu camera de numărare (hemocitometru).

Din diluţia preparată (9 ml de mediu nutritiv + 1 ml din suspensia de celule) se pune o picătură
pe suprafaţa unei camere de numărare, pentru a stabili densitatea celulelor din suspensie.
După determinarea densităţii suspensiei celulare, se adaugă un anumit volum de mediu nutritiv
astfel încât sa se ajungă la numărul optim de celule pe mililitru, şi anume 106 celule/ml.
4. Se determină viabilitatea celulelor din suspensie cu ajutorul soluţiei de albastru de triptan
0.5%; se adaugă 0.1 ml soluţie în 0.9 ml de suspensie celulară. O picătură din acest amestec se
examinează la microscopul fotonic – celulele vii rămân necolorate deoarece nu încorporează colorantul,
cele moarte apar albastru-violet. Pentru obţinerea unei culturi reuşite mortalitatea nu trebuie să
depăşească 10%.

Efectuarea culturii propriu-zise

În organism, celulele se găsesc sub influenţa mecanismelor de conservare şi control. Odată
scoasă din mediul natural de viaţă, celula are nevoie, pentru a supravieţui şi a se multiplica „in vitro”, de
o serie de condiţii de ordin fizic, chimic, bioenergetic care să mimeze cât mai mult situaţia „in vivo”.
Deosebirile esenţiale dintre aceste două modalităţi de viaţă şi de multiplicare celulară sunt:
– „in vivo” celulele sunt supuse controlului neuroendocrin şi influenţei ţesuturilor din vecinătate;
aportul de substanţe nutritive şi eliminarea produselor de metabolism se face continuu prin sânge şi
limfă;
– „in vitro” celulele nu sunt supuse acestui control; aportul şi eliminarea sunt periodice.
Reuşita culturilor de celule „in vitro”, depinde în mare măsură de:
– folosirea instrumentarului steril şi aplicarea unor tehnici aseptice;
– utilizarea unor medii de cultură care să asigure celulelor cultivate „in vitro” condiţii apropiate de
acelea pe care le oferă organismul viu.
Mediile de cultură celulară trebuie să asigure:
– echilibrul ionic obţinut cu soluţii izotone (pentru păstrarea continuă a presiunii osmotice);
– pH-ul optim (pH 7.2 – 7.4) menţinut cu substanţe tampon (tampon fosfat sau bicarbonat de
sodiu – CO2); în mediu există şi un indicator de pH;
– temperatura optimă, conţinutul de O2 şi de CO2 favorabil;
– elemente nutritive, indispensabile metabolismului: hidraţi de carbon (glucoză), proteine
animale (din lichide biologice – plasmă, ser, lichid amniotic) şi aminoacizi esenţiali, grăsimi,
vitamine, hormoni, substanţe stimulatoare ale creşterii;
– evitarea contaminării cu germeni patogeni prin adăugarea de antibiotice (penicilină,
streptomicină) şi antifungice (stamicin, micostatin);
– stimularea multiplicării şi creşterii celulelor prin adăugarea de extracte embrionare.
De asemenea, dacă celulele din care se face cultura sunt celule care cresc pe suport, aderarea
lor la pereţii vasului este favorizată dacă acesta a fost pretratat prin aplicarea unui film proteic care să
permită ataşarea celulelor (de exemplu tratarea flacoanelor pentru cultură cu fibronectină). Celulele
cultivate secretă şi ele colagen, fibronectină şi laminină care le ajută să se ataşeze de substrat.

87
 Cultura propziu-zisă se realizează prin repartizarea pe suprafaţa recipientului de cultură a
unei cantităţi din suspensia de celule pentru care s-a determinat viabilitatea şi densitatea optimă, cât
mai uniform, cu ajutorul unei pipete Pasteur. Flaconul se ţine la termostat la 37  C, timp de 30-60
minute pentru aderarea celulelor, apoi se introduce mediul de cultură, astfel ca el să nu antreneze
fragmentele fixate pe pereţii recipientului. Vasul se astupă şi se incubează la 37  C; proliferarea
celulelor se verifică după 3-4 zile.
Pe toată durata culturii, aceasta este verificată periodic pentru a se observa:
a. dacă există contaminare bacteriană sau fungică – culturile contaminate apar tulburi;
ele sunt compromise şi trebuie întrerupte;
b. dacă se menţin constantele fizicochimice – de exemplu pH-ul poate fi apreciat
deoarece în mediu există un indicator de pH; variaţiile sale trebuie corectate. Periodic,
mediul învechit poate fi extras şi înlocuit cu mediu proaspăt;
c. eficienţa culturii – se observă la microscopul în contrast de fază (figura 5.13).

Figura 5.13 Imagine de microscopie în contrast de fază a unei culturi de celule din stratul bazal al
epidermului însămânţate pe un flacon de plastic acoperit cu un film de colagen. A) în scurt timp după
însămânţare (18 – 24 de ore) celulele se ataşează de substrat; apoi încep să prolifereze, demonstrat
de prezenţa figurilor mitotice în ziua a doua (B) şi a treia (C). În ziua a şaptea (D) celulele sunt ferm
ataşate unele de altele formând un strat continuu al suprafaţa flaconului. [10]

În funcţie de numărul de celule însămânţate culturile pot fi culturi în masă (ca în figura 5.13)
când într-un flacon se însămânţează un număr relativ mare de celule; acestea se ataşează de flacon,
cresc şi se divid şi, după un număr de generaţii, vor acoperii suprafaţa flaconului cu un strat uniform de
celule.
În culturile clonale, este însămânţat un număr mic de
celule (câteva sute), astfel încât fiecare celulă este plasată la
distanţă de celulele învecinate – în aceste condiţii, celulele
care supravieţuiesc proliferează formând o colonie separată,
numită clonă. Celulele unei clone derivă toate dintr-o singură
celulă originală rezultând o linie celulară uniformă din punct
de vedere genetic (figura 5.14).

Figura 5.14 Imagine de microscopie optică a unei culturi

clonale în care fiecare colonie conţine descendenţii unei
singure celule. [12]

88
 BIBLIOGRAFIE

1. Alberts B et al., Molecular biology of the cell. Ed. a 4-a. Garland Science 2002.
2. Benga G, Biologie celulară şi moleculară. Ed. Dacia Cluj - Napoca 1985.
3. Benjamin LC et al., Human biology. McGraw-Hill Companies Inc. 1997.
4. Burkitt HG et al., Wheater’s functional histology: a text and color atlas. Ed. a 3-a Churchill
Livingstone Inc. 1993.
5. Cotrutz C, Manual de lucrări practice de biologie celulară. Editura tehnică Chişinău 1994.
6. Dee FR, Leaven T, Consoer D, Virtual slidebox of histology. University of Iowa Department of
Pathology  http://www.path.uiowa.edu/virtualslidebox/nlm_histology/content_index_db.html
7. Dimofte I, Cozaru GC, Popa A, Durbală I, Nedelcovici S, Lucrări practice de Biologie celulară şi
moleculară. Cartea universitară 2003.
8. Goldsby et al., Immunology. Ed. a 5-a. W H Freeman 2003.
9. Gustafson AW et al., Study of cells, tissues and organs. Tufts University School of Dental Medicine
2006  http://ocw.tufts.edu/Course/15/Imagegallery
10. Helgason CD, Miller CL – editors, Methods in molecular biology, vol 290: Basic cell culture
protocols. Ed. a 3-a, Humana Press Inc. 2004.
11. Hîncu M, Vameşu S, Histologie practică. Ovidius University Press, Constanţa 2003
12. Karp G, Cell and molecular biology – concepts and experiments. Ed. a 3-a. Wiley 2002.
13. Kuehnel W, Color atlas of cytology, histology, and microscopic anatomy. Thieme 2003.
14. Lodish H et al., Molecular cell biology. Ed. a 4-a, W H Freeman 1999.
15. Lodish H et al., Molecular cell biology. Ed. a 5-a, W H Freeman 2003.
16. Methods and techniques for histologists and immunohistochemists. IHC World 2005. Actualizat
februarie 2007  http://www.ihcworld.com/imagegallery
17. Microscopy resource center website  http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/index.html
18. Mixich F, Cruce M, Ardelean A, Berceanu D, Principii experimentale în Biologia celulară. Editura
Sitech, Craiova, 1997.
19. Mogoanţă L, Hîncu M, Ghid de tehnici de citologie, histologie şi imunohistochimie. Editura Medicală
Universitară, Craiova 2003.
20. Stansfield WD, Colome JS, Cano RJ, Cullen KE – editor, Schaum’s Molecular and cell biology.
McGraw-Hill Companies, Inc. 2003.
21. Theml H, Diem H, Haferlach T, Color atlas of hematology: practical microscopic and clinical
diagnosis. Thieme 2004.
22. Widmaier EP, Raff H, Strang KT, Human phisiology: the mechanisms of body function. McGraw-Hill
Companies, Inc. 2003.

89