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UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA

LA MOLINA
FACULTAD DE INGENIERÍA PESQUERA
DEPARTAMENTO DE MANEJO PESQUERO Y MEDIO
AMBIENTE

“APLICACIÓN TÉCNICA DE COLORACIÓN, PARA LA


IDENTIFICACION DE LOS COMPONENTES SANGUÍNEOS”
CURSO:
SANIDAD ACUICOLA
ALUMNOS:
ALVAREZ GARAY, Dora Elena
LEON PRAILE, Katherine
RUIZ SALAZAR, Luis Jeanpierre
PROFESOR:
CRUZ CASTELLÓN, César
FECHA DE ENTREGA DE PRÁCTICA:
06 de noviembre de 2018
LA MOLINA – PERÚ
I. INTRODUCCION

La tinción de Giemsa, ideada por el alemán Gustav Giemsa, es un método


habitual para el examen de frotis sanguíneos, cortes histológicos y otro tipo de
muestras biológicas. Este método tiene utilidad sobre todo para poner de
manifiesto las rickettsias localizadas dentro de las células huéspedes. La
coloración de Giemsa se emplea también para teñir frotis de sangre en el
examen para protozoos. Se pueden emplear, como variaciones, otras
coloraciones como es la técnica de citoconcentración para parásitos sanguíneos,
la cual tiene un bajo coste y ofrece la posibilidad de aislar e identificar en el
mismo sedimento el parásito principal, con excepción de los trofozoitos jóvenes
y el Plasmodium falciparum; también se emplea la tinción de Wright. Este
método de tinción permite también la tinción diferencial de zonas con un alto
contenido de ADN, y concretamente de uniones A-T. Esto permite distinguir
perfectamente en microscopio óptico el núcleo celular, los cromosomas durante
la mitosis, y en algunos casos, incluso el ADN mitocondrial (kinetoplasto de
algunos protozoos, como Trypanosoma). Los cromosomas pueden ser tratados
con varios compuestos químicos que producen la alternancia de bandas claras
y oscuras a lo largo de los cromosomas. Cada cromosoma tiene un patrón de
bandas característico, permitiendo que aberraciones estructurales como
borrados, duplicaciones o sutiles translocaciones sean detectadas, al igual que
permite la identificación de cromosomas marcadores.
En la práctica realizada en el laboratorio de microbiología de la UNALM, se
aplicaron las técnicas de coloración Giemnsa y Wrigh, mediante estas, se logró
identificar los distintos componentes sanguíneos.

II. OBJETIVOS
 Conocer la morfología de las diferentes células sanguíneas
 Saber que función cumple cada una de estas células sanguíneas
 Reconocer y diferenciar los órganos inmuno competentes, así como sus
respectivos tejidos.
III. MARCO TEORICO

Técnicas de tinción

El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles


de ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste
entre la célula y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el
contraste es la utilización de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir
entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia de determinados
constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes
celulares, centros de actividad respiratoria, etc.

La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna


afinidad específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con
frecuencia son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con
intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como
los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes
catiónicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros
colorantes son moléculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con
los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas
proteínas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo.
Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este
grupo se combinan con los materiales lipídicos de la célula, usándose a menudo
para revelar la localización de las gotículas o depósitos de grasa. Un ejemplo de
colorante liposoluble es el negro Sudán.

Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de


teñirlas, proceso llamado fijación. Para bacterias, la fijación por el calor es lo más
corriente, aunque también puede fijarse con sustancias químicas como
formaldehido, ácidos y alcoholes. Después de la fijación, si se añade el colorante,
no se producen ulteriores cambios estructurales en el protoplasma. La fijación
se realiza habitualmente en células que han sido fijadas sobre un portaobjetos,
tratando después éste con el agente fijador, y siguiendo inmediatamente el
proceso de tinción. La fijación produce habitualmente el encogimiento de las
células; la tinción, por el contrario, hace que las células aparezcan mayores que
los que son realmente, de manera que las medidas de las células que han sido
fijadas o teñidas no pueden realizarse con mucha precisión.
Lámina portaobjetos

Es una lámina de cristal sobre el cual se disponen objetos para su examen


microscópico. Sus dimensiones típicas son de (75 x 25) mm. El objeto a observar
suele disponerse sobre este artefacto para después situarse en el microscopio y
ser observado. En ocasiones puede cubrirse la muestra con un cubreobjetos,
una hoja de cristal más fina y pequeña.

Figura N°1 secuencia de inserto del frotis sanguineo.

Coloración simple
Las tinciones se basan en la utilización de colorantes que pueden clasificarse
como naturales o sintéticos. Los naturales se utilizan principalmente con fines
histológicos. La mayor parte de los colorantes que se utilizan para teñir bacterias
son sintéticos, muchos de ellos son las anilinas y los derivados del benceno.
Se habla de coloración simple cuando una muestra extendida se tiñe con un solo
colorante. Si la preparación se tiñe con safranina, las bacterias adquirirán un
color rojo, si se utiliza azul de metileno, se teñirán de azul, si por el contrario se
tiñen con cristal violeta, las bacterias aparecerán teñidas de color violeta, es decir
adquirirán el color del único colorante que se utilizó. Este procedimiento permite
distinguir la morfoloía y estructuras internas de la célula bacteriana, como por
ejemplo, la presencia de endospora bacteriana. Existen coloraciones especiales
que permiten poner de manifiesto estructuras bacterianas como por ejemplo:
Flagelo, cápsula, endospora, etc.
Principio de coloración
Como su nombre lo indica, la técnica combina las técnicas de coloración
desarrolladas por May-Grünwald y Giemsa. Estas técnicas a su vez se basan en
el empleo de dos soluciones colorantes:

 La solución de May-Grünwald, que contiene el colorante ániónico eosina y el


colorante catiónico azul de metileno ambos disueltos en metanol

 La solución de Giemsa, que contiene eosina, azul de metileno y una serie de


productos de la oxidación de este último tales como el azur A, el azur B,
el violeta de metilo y el azul de metilo.
Todos estos colorantes se encuentran en estado no ionizado mientras se
mantienen en solución de alcohol metílico, pero al añadir agua se ionizan y se
unen selectivamente a los constituyentes celulares precipitando como sales
insolubles.
Los componentes celulares de naturaleza aniónica (ácida) se unen
selectivamente a los tintes catiónicos tiñéndose en variados tonos de azul. Estos
componentes son llamados basófilos:
(ADN, mitocondrias, ribosomas y citoplasma de células ricas enARN).
Los componentes celulares de naturaleza catiónica (básicos) se unen
selectivamente al tinte ácido eosina, tiñendose en variados tonos de naranja y
rojo. A estos elementos se los denomina acidófilos o eosinófilos. Este es el caso
de la hemoglobina, y de las proteínas contenidas en las granulaciones de
los granulocitos eosinófilos.
Los componentes celulares que tienen afinidad por ambos tipos de colorantes
se denominan neutrófilos y se tiñen en variados tonos de violeta.
IV. MATERIALES Y METODOS

Materiales
 Microscopio compuesto
 Estereoscopio
 Laminas coloreadas de frotis sanguíneo
 Laminas y laminillas
 Heparina
 Placa Petri
 Colocación Wright
 Coloración Giemsa
 Jeringas de 1ml
 Agujas de 5ml
Métodos
 Extraer sangre fresca (uso de jeringa de 1ml y aguja de 5ml)
 Colocar anticoagulante (heparina) en la hipodérmica (jeringa)
antes de ser extraída la sangre.

a. Coloración Giemsa
 Cubrir con alcohol metílico toda la lámina (5 min.)
 Inclinar lamina para eliminar alcohol
 Teñir con colorante Giemsa (15-20) min
 Luego lavar con agua y dejar secar
 Observar al microscopio (incluir laminilla)

b. Coloración Wright
 Una vez realizado el frotis sanguíneo
 Verter colorante Wright (1-2) min
 Lavar con agua des ionizada y dejar secar
 Observar al microscopio(incluir laminilla)

V. RESULTADOS

Fig. N°2 inserccion de aguja en la zona del pedunculo Carpa Koi (Cyprinus Carpio)
Fig. N°3 Extracción de sangre en Carpa Koi (Cyprinus Carpio) en pedúnculo.

Fig. N°4 Frotis de sangre de Carpa Koi (Cyprinus Carpio) siendo colocada en
una lámina porta objeto.
Monocitos

Hematíes

Linfocitos

plaquetas

Fig. N°5 Frotis de sangre de Carpa Koi (Cyprinus Carpio) bajo el microscopio
a 40X.

Se observan las distintas fracciones de la sangre, tales como glóbulos


rojos, plaquetas y glóbulos blancos, pero no se pueden distinguir u
observar leucocitos ni granulaciones eosinofilas.

VI. DISCUSIONES
La coloración Giemsa es la segunda tinción más utilizada, después de la de
Wright en frotis sanguíneos. El colorante empleado se compone de la mezcla
en tampón fosfato o en agua de azul de metileno, que tiñe componentes
ácidos, eosina, que tiñe los componentes básicos, y distintos azures, que en
función del pH del medio y del grado de basofilia de las estructuras pueden
producir coloraciones metacromáticas.
Los núcleos celulares se tornan violeta intenso.

 Las granulaciones neutrófilas(lila) y los hematíes (rojo pálido) se tiñen mal;


sin embargo, esta coloración permite diferenciar algunas formas de
metamielocitos que pueden ser confundidos con los monocitos, pues el
protoplasma de los monocitos queda de color azulado y el de los
metamielocitos de color rosa.
 El citoplasma de los linfocitos presenta una tonalidad azul definida y sus
núcleos violeta de intensidad variable.
 Los gránulos basófilos y las plaquetas se tiñen de color azul, no obstante,
éstas últimas presentan corpúsculos violeta internos.
VII. RECOMENDACIONES

Una extensión de sangre bien teñida debe caracterizarse por una buena
diferenciación de las estructuras sub-celulares de los leucocitos, definición
completa de los hematíes y de la ausencia de precipitados que den lugar
a artefactos no deseados.

Una coloración excesivamente azul que puede ser debida a:


 Frotis excesivamente gruesos
 Tiempo prolongado, dando lugar a sobre tinción
 Lavado insuficiente
 Empleo de solución diluyente o el colorante demasiado alcalino
VIII. CUESTIONARIO

1. Esquematice las diferentes estructuras celulares

Estructura Descripción Función


Núcleo celular
Núcleo Gran estructura rodeada por una Control de la célula
doble membrana; contiene
nucleolo y cromosomas.
Nucleolo Cuerpo granular dentro del Lugar de síntesis ribosómica;
núcleo; consta de ARN y ensamble de subunidades
proteínas. ribosómicas.
Cromosomas Compuestos de un complejo de Contiene genes (unidades de
ADN y proteínas, llamado información hereditaria que
cromatina; se observa en forma gobiernan la estructura y
de estructuras en cilindro durante actividad celular).
la división celular.
Sistema de membranas de la célula.
Membrana Membrana limitante de la célula Contiene al citoplasma; regula
celular viva el paso de materiales hacia
(membrana dentro y fuera de la célula;
plasmática) ayuda a mantener la forma
celular; comunica a la célula
con otras.
Retículo Red de membranas internas que Sitio de síntesis de lípidos y de
endoplasmático se extienden a través del proteínas de membrana;
(ER) citoplasma. origen de vesículas
intracelulares de transporte,
que acarrean proteínas en
proceso de secreción.
Liso Carece de ribosomas en su Biosíntesis de lípidos;
superficie externa. Destoxicación de
medicamentos.
Rugoso Los ribosomas tapizan su Fabricación de muchas
superficie externa. proteínas destinadas a
secreción o incorporación en
membranas.
Ribosomas Gránulos compuestos de ARN y Síntesis de polipéptidos.
proteínas; algunos unidos al ER,
otros libres en el citoplasma.
Aparato de Compuesto de saculaciones Modifica, empaca (para
Golgi membranosas planas. secreción) y distribuye
proteínas a vacuolas y a otros
organelos.
Lisosomas Sacos membranosos (en Contienen enzimas que
animales). degradan material ingerido, las
secreciones y desperdicios
celulares.
Vacuolas Sacos membranosos (sobre todo Transporta y almacena
en plantas, hongos y algas ) material ingerido, desperdicios
y agua.
Microcuerpos Sacos membranosos que Sitio de muchas reacciones
(ej. peroximas) contienen una gran diversidad de metabólicas del organismo.
enzimas.
Organismos transductores de energía
Mitocondrias Sacos que constan de dos Lugar de la mayor parte de las
membranas; la mambrana interna reacciones de la respiración
está plegada en crestas. celular; transformación en
ATP, de la energía proveniente
de la glucosa o lípidos.
Plástidos Sistema de tres membranas: los La clorofila captura energía
cloroplastos contienen clorofila en luminosa; se producen ATP y
las membranas tilacoideas otros compuestos energéticos,
internas. que después se utilizan en la
conversión de CO2 en glucosa.
Citoesqueleto
Microtúbulos Tubos huecos formados por Proporcionan soporte
subunidades de tubulina. estructural; intervienen en el
movimiento y división
celulares; forman parte de los
cilios, flagelos y centriolos.
Microfilamentos Estructuras sólidas, cilíndricas Proporcionan soporte
formadas por actina. estructural; participan en el
movimiento de las células y
organelos, así como en la
división celular.

Centriolos Par de cilindros huecos cerca del Durante la división celular en


centro de la célula; cada centriolo animales se forma un uso
consta de 9 grupos de 3 mitótico entre ambos
microtúbulos. centriolos; en animales puede
iniciar y organizar la formación
de microtúbulos; no existen en
las plantas superiores.
Cilios Proyecciones más o menos Locomoción de algunos
cortas que se extienden de la organismos unicelulares;
superficie celular; cubiertos por la desplazamiento de materiales
membrana plasmática; en la superficie celular de
compuestos de 2 microtúbulos algunos tejidos.
centrales y 9 pares periféricos
Flagelos Proyecciones largas formadas Locomoción de las células
por 2 microtúbulos centrales y 9 espermáticas y de algunos
periféricos; se extienden desde la organismos unicelulares.
superficie celular; recubiertos por
mambrana plasmática.

Fuente: LEUKEMIA LYMPHOMA SOCIETY


2. ¿Qué función cumplen los monocitos?

Los monocitos son un tipo de glóbulos blancos agranulocitos. Es el leucocito de


mayor tamaño, su tamaño es de 18 μm, y representa del 4 al 8% de
los leucocitos en la sangre. Presenta un núcleo arriñonado (forma de riñón).
Están desprovistos de nucléolos. Su citoplasma es amplio con ocasionales
mamelones periféricos, de color azul plomizo y contienen un número variable de
gránulos azurófilos.
Su principal función es fagocitar partículas extrañas o microorganismos
foráneos, como bacterias o virus.
Se originan en la médula ósea a partir de células madres precursoras
llamados monoblastos. Luego de circular libremente por la sangre alrededor de
tres días, migran a los tejidos del cuerpo donde se transforman
en macrófagos y células dendríticas, para luego emigrar a diferentes tejidos
como hígado, bazo, pulmones, ganglios linfáticos, huesos, cavidades serosas,
etc. Después de alrededor de 24 horas de permanecer en el torrente sanguíneo,
los monocitos lo abandonan y atraviesan el endotelio de los capilareso las
vénulas poscapilares hacia el tejido conectivo, donde se diferencian rápidamente
a macrófagos.
Los macrófagos fagocitan microorganismos foráneos, y las células dentríticas
presentadoras de antígenos, presentándolos a los linfocitos T para que éstos
aprendan a reconocer los antígenos peligrosos.
De esta manera, se puede decir que los monocitos desempeñas dos funciones
en el sistema inmunológico:
 Fagocitosis, a través de la producción de macrófagos.
 Presentación de antígeno, en la superficie de los linfocitos T.
Los niveles de monocitos en la sangre tienden a elevarse cuando alguien tiene
una infección.

3. ¿De qué manera se ven afectadas las células sanguíneas, cuando


se presenta un estresamiento en los organismos acuáticos?

La respuesta inmune de los peces en general está bien desarrollada e integrada,


y en los Teleósteos es donde se encuentran muchas similitudes funcionales con
la respuesta observada en los vertebrados superiores; normalmente funciona
con eficiencia, aunque como cualquier otro sistema fisiológico, el sistema inmune
de un individuo se ve afectado cuando el estado de salud es deficiente. En
términos de una población, cuando las condiciones del medio son adversas,
aumentan los riesgos de una infección y se pone en peligro la salud de todo el
conjunto de ejemplares. Existen una serie de factores que influyen el desarrollo
de una buena respuesta, y en algunas ocasiones la deprimen significativamente.
Estos se clasifican en: factores intrínsecos o aquellos inherentes al pez como la
edad y el estado sanitario, y los factores extrínsecos, como la temperatura, los
cambios de estación y los parámetros abióticos del agua. Dentro de los factores
extrínsecos existen una serie de estímulos que actúan sobre un sistema
biológico en forma negativa, y que originan luego una reacción subsecuente del
mismo y que se conoce con el nombre de stress, el pez posee la capacidad de
responder al mismo, e involucra reacciones fisiológicas y de comportamiento,
que lo ayudan a adaptarse a una nueva situación. En algunos casos, cuando el
stress se prolonga o se hace más severo, puede exceder su capacidad de ajuste,
y se produce un colapso del sistema inmune y también de otros sistemas (Ellis
1981a). El efecto supresivo del stress está mediado por hormonas,
principalmente corticosteroides (Jeney et al. 1992). El cortisol es el principal
glucocorticoide que es producido (en la corteza adrenal) en las células
interrenales del Pronefros en los peces. Su secreción es aumentada por la
hormona adrenocorticotrófica (ACTH) que es secretada a su vez por la glándula
pituitaria y está bajo un control positivo del factor de liberación de corticotrofina
(CRF) del hipotálamo. La inhibición del sistema clásico de retroalimentación
sobre la secreción de la CRF ocurre cuando aumenta la concentración de cortisol
en la sangre. El cortisol es el más común y biológicamente activo de los
corticosteroides en peces.

4. Que indican la presencia de macrófagos o CMM en los tejidos

Pueden indicar cambios en las condiciones del medio ambiente, evidenciadas


en la diferencia en el número, tamaño y distribución del pigmento. Ha llevado a
proponerlos como indicadores para monitorear el estado sanitario de los peces
y las condiciones del medio ambiente. Uno de estos cambios, además de actuar
como una respuesta a ataque de cuerpos extraños, es que el individuo tenga un
cambio en sus hábitos alimenticios Entre las funciones de los centros de
melanomacrófagos se encuentra almacenamiento de hierro en forma de
hemosiderina, catabolismos de los tejidos y almacenamiento de productos de
desecho como lipofucsina y ceroide, donde la melanina actuaría como protector
contra los radicales libres.
I. BIBLIOGRAFIA

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 Atlas de Biologia. Los mecanismos de la vida, ed. Cultural S.A, Madrid,
España, 2010.

 LLS. Sociedad de leucemia y lymphoma, luchando por el cáncer de


sangre. Celulas sanguíneas. Revisado 10 de diciembre del 2017.
Disponible en:
https://www.lls.org/sites/default/files/file_assets/sp_bloodcellschart.pdf

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 Robbins and Cotran Pathologic Basis of Disease, 8th edición, Saunders


(Elsevier) «Ch.2 Acute and chronic inflammation», (2009)
 Sistema inmune en peces. S. Olabuenaga. Concepción 2000.
http://inmunologiaenlinea.es/index.php/articulos-2
 Susana E. Olabuenaga, 2011.Sistema inmune en peces. Concepción

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http://biblioteca.duoc.cl/bdigital/Documentos_Digitales/600/610/39584.p
df. Revisado el 03 de Diciembre del 2013.
 UAB. Universidad Autonoma de Barcelona. Los eritrocitos nucleados
podrían jugar un papel en la respuesta inmunitara. España. 2012.
Revisado 10 de diciembre del 2017. Disponible en:
http://www.uab.cat/PDF/PDF_1326439980461_es.pdf