UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ CLUJ-

NAPOCA

Micropropagare
Notite de curs

Cluj-Napoca

2010
 INTRODUCERE
Cursul de Microprpropagare şi îşi propune să asigure concepte şi elemente de practică
pentru studenţii acestui curs.

Obiectivele propuse:
 să discute importanţa şi potenţialul culturilor de celule şi ţesuturi ca metodologie de
multiplicare şi producere a materialului vegetal;
 să identifice şi să aplice teoriile fundamentale ale tehnicilor şi sistemelor de cultură in
vitro în funcţie de diferite specii vegetale sau condiţii de producţie;
 dobândirea capacităţilor teoretice şi practice pentru realizarea unor culturi de celule şi
ţesuturi vegetale simple dar eficiente, în condiţii de laborator;
 însuşirea unui limbaj de specialitate care să permită comunicarea în cazul unor
discuţii cu caracter experimental sau ştiinţific, în cazul necesităţii achiziţionării unor
echipamente şi consumabile specifice, care presupun identificarea, studierea şi
cumpărarea din surse specializate (firme producătoare de chimicale/ echipamente,
căutarea surselor de informare pe internet sau cărţi şi reviste de specialitate)
NOTĂ: La activităţile de laborator este necesară purtarea unui halat de protecţie.
Fumatul şi consumul de alimente în laborator sunt STRICT interzise.

1. Noţiuni introductive în cultura in vitro

Cultura de ţesuturi vegetale este ştiinţa (sau arta) cultivării celulelor, ţesuturilor sau a
organelor vegetale izolate din planta mamă, pe un mediu artificial. Noţiunea de “cultură de
ţesuturi vegetale” este sinonimă cu “cultura in vitro “ (în sticlă) şi se referă la:

Cultura in vitro (în sticlă) se referă la:

1. Cultura în condiţii aseptice a unor:
 Organisme
  Organe
 Ţesuturi
 Celule, suspensii celulare
 Protoplaste
 Organite celulare, etc.
2. Cultura în condiţii controlate:
 Cultura aseptică (axenică)
- Lipsă de contaminare (bacterii, ciuperci, virusuri, drojdii)
- Mediu sterilizat
- Lipsit de microorganisme
 Condiţii controlate de cultură
- Suport nutritiv artificial (mediu lichid, semilichid solid, etc.)
- Fizice (temperatură, lumină, umiditate)
3. Cultura care se practică în recipiente de sticlă sau plastic special

Cultura in vivo (în viaţă) se referă la:

1. Evoluţia în condiţii naturale, septice.

Cultura ex vitro (afară din sticlă) se referă la:

1. Reluarea activităţii în condiţii naturale (prin aclimatizare) în urma culturii in
vitro.
Alţi termeni utilizaţi în culturile de ţesuturi:

Calus in vivo – ţesut cicatrizant, cu rol de apărare

in vitro ţesut nediferenţiat, neorganizat, cu creştere nelimitată,

format în urma diviziunii dezorganizate a celulelor sub influenţa
unei auxine

Calusogeneză formarea calusului.

Caulogeneză formarea de lăstari (stimulată de citochinine).

Citogeneză diferenţiere de structuri celulare noi.

Clona copie perfectă din punct de vedere genetic a plantei din care
provine explantul iniţial.
Clonarea înmulţirea asexuată, fără fecundare, prin mitoze succesive în
care, pe baza totipotenţei celulare, se obţin indivizi identici cu
planta mamă.

Creşterea mărirea cantitativă şi ireversibilă a numărului de elemente

constitutive care alcătuiesc planta, organul, ţesutul.

Dediferenţiere reversia progresivă a celulelor specializate spre celule

celulară nespecializate de tip calus

Dediferenţierea începe de la un ţesut specializat care îndeplineşte o anumită

tisulară funcţie şi care îşi opreşte creşterea.fiind transformat în ţesut
meristematic, care se înmulţeşte.

Dezvoltarea totalitatea schimbărilor cantitative (creşterea) şi calitative,

reprezentate de diferenţierea celulară pe care le suferă planta de
la faza de embrion până la maturitate.

Diferenţiere celulară pierderea progresivă a caracterelor morfologice şi citologice a

celulei embrionare şi dobândirea de caractere adulte urmate de
încetarea diviziunii celulare.

Dom meristematic meristem tipic, 0,1mm, în formă de cupolă.

Embrioni adventivi embrioni somatici formaţi direct din alţi embrioni sau organe

Embrioni formaţi de gametofilul mascul (microspori, grăunciori de polen)

androgenetici

Embrioni formaţi din celule ou nefertilizate

partenogenetici

Embrioni somatici Formaţi din alte celule decât cele zigotice

Embrioni somatici formaţi de celulele sporofitice, cu excepţia zigotului

Embrioni zigotici Formaţi prin fertilizarea celulelor ou sau a zigotului

Explant fragment de organ sau ţesut iniţial, utilizat în cultura in vitro.

Explantarea detaşarea din planta mamă a unui fragment mare de ţesut foliar,
radicular, internod, nod, boboc, mugure.

Implantare inserarea in vitro a unui fragment de plantă pe un alt ţesut.

Implantul fragmentul de ţesut (recalcitrant) cultivat in vitro pe un alt ţesut.

Linia celulară reprezintă o clonare perfectă, fiind descendenţa unei singure

celule.

Meristem formaţiune tisulară formată din celule în diviziune mitotică, care

poate forma toate categoriile de ţesuturi şi organe, inclusiv planta
întreagă.

Meristeme caulinare terminale, axilare (la baza frunzei sau bracteelor), adventive (se
pot forma în zone internodale, pe explante din frunză sau
rădăcină, etc.)

Meristeme meristemele (radiculare sau caulinare) formate in vitro pe un

neoformate calus şi sunt forme particulare de meristeme adventive

Meristeme primare (sau apicale)- definesc axa plantei

Meristeme terminale, laterale, adventive (induc formarea rădăcinilor pe alte

radiculare organe decât rădăcina- explante caulinare, foliare, etc.)

Morfogeneză (1) dezvoltarea ontologică a ţesuturilor diferenţiate. (2)

dezvoltarea unei structuri organizate, dintr-un ţesut neorganizat

Meristemoizi termenul a fost introdus în anul 1966 de către Torrey şi defineşte

o structură morfogenică plastică, sferică, formată din 6-24 celule
nespecializate mici, izodiametrice, cu perete celular subţire, fără
vacuole, cu nuclei mari şi citoplasmă foarte densă, capabile să se
dezvolte în diferite tipuri de celule primordiale. Sunt localizaţi în
alte părţi decât în meristeme.

Meristemul zona localizată a diviziunii celulare continue

Micropropagare (microînmulţire,micromultiplicare)
tehnică de înmulţire vegetativă in vitro, în mediu artificial,
aseptic, prin care se obţin plante identice cu planta mamă.

Morfogeneză dezvoltarea formei prin diferenţiere histologică şi

individualizarea plantei ca formă şi structură pe baza informaţiei
ereditare, se formează ţesut nou, care dă formă şi structură.

Nedeterminat Celule care încă nu au fixată o anumită cale a dezvoltării sau

specializării funcţionaleunei anumite căi
Neoplantule plantule nou regenerate (de novo) prin organogeneză directă sau
indirectă.

Organogeneză formarea de organe.

Pasare trecerea în condiţiile in vitro de pe un mediu de cultură pe alt

mediu de cultură cu conţinut identic sau diferit.

Plantule plante obţinute în cultură in vitro care nu au fost aclimatizate.

Prelevare detaşarea la microscop a unui fragment mic, sub 3 mm:

meristem, vârf de creştere.

Primordii foliare formaţiune existentă la baza domului cu scop de protecţie. Pot fi

primare, secundare, terţiare.

Promeristem celule care structurează viitorul meristem.

Propangule formaţiuni tipice, lăstari fără rădăcini.

Protocormi formaţiuni asemănătoare seminţelor.

Rediferenţierea procesul de refacere a procesului de diferenţiere (specializare).

Regenerarea refacerea unor structuri celulare care duc la formarea unei noi
plante.

Rizogeneză formarea de rădăcini (stimulată de auxine).

Subcultivare repetarea culturii in vitro pe parcursul mai multor cicluri

(primară, secundară, terţiară).

Ţesut nediferenţiat ţesut fără caracteristici de diferenţiere sau de dediferenţiere, dar

(calus) cu o continuă diviziune celulară.

Ţesut recalcitrant ţesut care răspunde cu greu procedurilor de regenerare in vitro.

Totipotenţa celulară capacitatea celulei de a regenera, pe baza informaţiei genetice

(omnipotenţă) ereditare, toate tipurile de ţesuturi, organe, inclusiv planta
întreagă, identice cu ale plantei mamă.

Transplantare trecerea de pe un mediu aseptic pe un alt mediu septic.

Variant O cultură de celule sau o plantă care prezintă o schimbare

fenotipică stabilă, de natură genetică sau epigenetică
 Principiile de bază ale micropropagării sunt :
1. Totipotenţa celulară 1902 Haberland
2. Asepsia 1922 Robbins
3. Mediul de cultură 1934 White
4. Reglarea hormonală 1957 Skoog şi
Miller
5. Etapizarea culturii 1964 Murashige.

Clasificarea culturilor in vitro:

1. după tipul de cultură:
 culturi de plante
 culturi de organe
 culturi de ţesuturi
 culturi de celule
 suspensie celulară
2. după tipul de ţesut:
 culturi de meristem
 culturi de calus
 culturi de antere
 culturi de ovule
 culturi de rădăcini

Scurt istoric al evoluţiei culturii in vitro

Perioada de pionerat a culturilor in vitro: numai ipoteze

1838 – Schwann – celula poate evolua independent

1853 – Trecul – experienţe cu ţesut izolat

1878 – diferenţiere calus

1893 – Rechinger – teoria minimului necesar, ţesut de 1,5mm poate regenera o plantă

1898 – Haberlandit – cultură pe mediu artificial in vitro

1902 – Haberlandit – creatorul teoriei totipotenţei celulare

1904 – Hanning – prima soluţie minerală cu zaharoză

Perioada primelor regenerări de culturi aseptice

1924 – culturi de rădăcini in vitro

1934 – White – vitamine din complexul B, primul mediu sintetic

1939 – Gautheret, Nobecourt, White – părinţii culturilor in vitro

1957 – Scoog şi Heller – teoria balanţei hormonale

Perioada industrializării:

Mitsui Petrochemical Ind. Ltd. fondată în 1983 cu obiectul în producţia industrială de

metaboliţi secundari (shikonim din Lithospermum)

Grupul EBI – grup de cercetare în domeniul biotehnologiei.

Chrysalis – fondată în 1984. Chrysalis este deţinătoarea patentului pentru tehnologia

microinjecţiei pronucleară, realizare a grupului EBI.

Sensus –companie fondată în 1993, cu activitatea de cercetare direcţionată în domeniul

tehnologiei compuşilor antagonici hormonilor de creştere (GHA- Growth
Hormone Antagonist technology).

Copernicus – companie fondată în 1997 pe baza semnării unei licenţe de utilizare a

tehnologiilor dezvoltate în programele de cercetare bilaterală ale companiilor
EBI şi Case Western Reserve University (din Cleveland, Ohio)

Cultura heterotrofă, mixotrofă şi fotoautotrofă

Noţiunea de organism fotoautotrof (foto= lumină + auto=propriu + trof=nutriţie)
redă capacitatea acelui organism de a produce carbon organic (sursa sa energetică) prin
transformarea CO2 atmosferic cu ajutorul luminii. Cultură autotrofă este o cultură alcătuită
din celule capabile să utilizeze CO2 ca sursă de carbon.
Noţiunea de organism heterotrof (hetero=altul, diferit + trof=nutriţie) redă
capacitatea acelui organism de a consuma molecule organice produse de alte organisme vii.
Cultură heterotrofă este o cultură alcătuită din celule care se hrănesc cu elementele nutritive
din mediu deoarece nu işi pot produce singure necesarul de substanţe nutritive.
 Noţiunea de organism mixotrof (mix=amestec+ trof=nutriţie) redă capacitatea acelui
organism de a asimila compuşi organici
Prin natura lor, sistemele de cultură in vitro nu asigură condiţii optime pentru
realizarea proceselor de fotosinteză. Este un fapt cunoscut că prezenţa hidraţilor de carbon,
asiguraţi exogen, prin mediul de cultură, reduc procesul de fotosinteză, probabil printr-un
efect de inhibiţie de tip feedback.
Factorii interni care afectează fixarea CO2 in vitro, sunt: anatomia frunzei, stomatele,
conţinutul de pigmenţi, stadiul de creştere şi dezvoltare, predeterminarea genetică a speciei,
metabolismul vegetal, activităţile de tip PEPC (fosfoenolpiruvat carboxilaza) şi rubisco
(Desjardins, 1995).
Factorii externi, din camerele de vegetaţie, care joacă un rol hotărâtor în procesele de
fixare a CO2, sunt reprezentaţi de:
 intensitatea luminoasă (150-250 µmol/m 2/s pentru cultura autotrofă, 20-65
µmol/m2/s pentru creşterea mixotrofă)
 compoziţia gazelor in vitro (cu referire specială la cantitatea de CO 2 din:
 atmosfera camerei (suplimentată la 5000 v.p.m. pentru autotrofe şi 500 v.p.m-
pentru mixotrofe- nefiind necesară adăugarea în plus faţă deceea ce este normal
într-o astfel de cameră)
 atmosfera din interiorul vasului de cultură (350 v.p.m. pentru autotrofe şi de la 30
la 5000 v.p.m. pentru mixotrofe)*
 prezenţa zaharurilor exogene (fără zaharuri pentru autotrofe şi 20-30 g/l pentru
mixotrofe).

* aceste diferenţe foarte mari pentru cultura mixotrofă sunt rezultatul efectului combinat al
cantităţii de lumină asociat suplimentării cu CO 2: în condiţii de iluminat inadecvat - cazul
unor heterotrofe crescute la întuneric – se poate acumula o cantitate mare de CO 2 în interiorul
vasului de cultură.

Fig. 1 Relaţia de reversabilitate în culturile hetero, mixo şi fotoautotrofe (adaptat după Barz,
1988
 În condiţii de cultură in vitro majoritatea speciilor vegetale cresc şi proliferează în
condiţii mixotrofe. Chiar dacă cultura este destinată unui sistem autotrof, în primele faze
până la acomodarea explantului cu condiţiile in vitro şi mai ales în cazul utilizării pentru
iniţiere a unor explante de dimensiuni mici, este obligatoriu să se practice un sistem mixotrof.
O intensitate luminoasă foarte mare (condiţie necesară în sistemul autotrof) are ca efect o
fotoinhibiţie a celulelor, în etapa de iniţiere.
Procesele de aclimatizare ale plantelor obţinute prin micropropagare in vitro pun
serioase probleme datorită dificultăţii trecerii de la sistemul heterotrof la cel autotrof, în
momentul transferului ex vitro.
Rezultatele experimentale au demonstrat că sistemul autotrof poate fi folosit în
sistemul de micropropagare comercială, la anumite specii înregistrâdu-se îmbunătăţirea ratei
de micromultiplicare şi calitatea plantelor. Procentul de supravieţuire după transferul ex vitro
este mai bun în comparaţie cu sistemul hetero/mixotrof deoarece şi nivelul optim de
temperatură cerut în sistemul autotrof este mai redus faţă de cel utilizat în sistemul mixotrof,
fiind mai apropiat de condiţiile naturale (Grout şi Price, 1987). Unele rezultate experimentale
(Zobayed, 1999) demonstrează că la plantulele crescute în sistem autotrof stomatele sunt în
stare de funcţionare, fiind închise în întuneric şi deschise pe intervalul de lumină. Totodată,
plantele crescute autotrof prezintă un număr dublu de stomate în comparaţie cu cele
mixotrofe, frunze mai groase, o concentraţie de până la 7 ori mai mare ceară epicuticulară, un
strat palisadic mai bine dezvoltat, compact cu spaţii intercelulare reduse; rata de transpiraţie
este mai scăzută şi creşte proporţional cu creşterea intensităţii luminoase. În ceea ce priveşte
rata de transpiraţie, în cazul plantulelor crescute în sistem mixotrof, valoarea acesteia rămâne
constantă în raport cu variaţia fluxului fotonic, fapt care demonstrează clar că stomatele
mixotrofelor sunt nefuncţionale pe durata menţinerii in vitro, ele începând să funcţioneze
după transferul ex vitro. Alte experimente (la Nicotiana tabacum) demonstrează că plantulele
crescute în sistem mixotrof asigură îmbunătăţirea ratei de creştere şi a acumulării substanţei
uscate în ţesuturile foliare (Ticha şi Schäfer,1998). Chiar mai mult, absenţa zaharului din
mediu şi intensitatea luminoasă prea mare au inhibat procesul de creştere în timp ce prezenţa
zaharurilor în mediu (sistemul mixotrof) a avut un efect protector pentru plantule.
Aceste rezultate contradictorii le interpretăm ca fiind expresia diferenţiată a plantelor faţă

de sistemul de micromultiplicare răspunsul fiind determinat în funcţie de specie.

2: Înfiinţarea unei unităţi de micropropagare

Un laborator-unitate de culturi de ţesuturi vegetale, destinat doar scopurilor de
multiplicare, nu trebuie să fie scump. Unitatea de micropropagare trebuie să deţină însă
obligatoriu un număr de încăperi separate, cu destinaţie precisă, elemente esenţiale pentru
reuşita operaţiunilor. Amenajarea corectă, într-o ordine logică şi eficientă, asigură nu numai
menţinerea asepsiei dar şi un nivel de standard ridicat al muncii.
Amplasarea unei unităţi de producţie trebuie să ţină cond de găsirea unei locaţii potrivite,
de aproximativ 150 mp. Această locaţie trebuie să fie amplasată într-o zonă, luminoasă,
izolată de trafic, să împiedice transmiterea contaminărilor de la o încăpere la alta, să deţină
un sistem de control al temperaturii, să fie legată la o sursă de apă permanentă şi de calitate,
precum şi la o structură de alimentare cu curent electric (minimum 100 amp). Instalaţiile
electrice trebuie realizate de electricieni de profesie, (majoritatea firelor cerute fiind de 110
volţi). De asemenea, pentru asigurarea securităţii este indicată instalarea unor sisteme de
detectare a incendiilor şi a controlului temperaturii, conectate la o linie telefonică pentru
intervenţie urgentă. Pentru situaţii incidentale se recomandă şi instalarea unui generator de
curent independent.
Este recomandat ca unitatea de micropropagare să fie construită ca spaţiu independent.
Chiar dacă aceasta implică cheltuieli suplimentare, izolarea este o garanţie a menţinerii
condiţiilor de curăţenie şi asepsie. În prezent există posibilitatea utilizării prefabricatelor,
disponibile în mărimile dorite, materiale care pot reduce costurile de înfiinţare ale unităţii. La
instalarea unuei unităţi de producţie trebuie luat în vedere obţinerea autorizaţiei, amplasarea
separată şi la distanţă faţă de zonele care reprezintă surse de contaminare (zona de transfer
postaclimatizare, zona de pregătire a amestecurilor de pămînt, zona de depozitare a
pesticidelor, îngrăşămintelor sau a altor substanţe chimice). În interior este obligatoriu
utilizarea gresiei şi a faianţei pentru realizarea unor suprafeţe uşor de curăţat. Asigurarea
curăţeniei permanente este un principiu de bază. Contaminarea datorată murdăriei poate duce
la pierderi de la 1% pînă la 50%. Având în vedere valoarea plantelor multiplicate in vitro nu
pot fi acceptabile pierderi datorate murdăriei mai mari de 1%. Sistemul de încălzire trebuie să
permită realizarea unor temperaturi constante mai ales pe timpul iernii (min. 25°C), iar pe
timpul verii este necesar utilizarea unui sistem de ventilaţie pentru controlul temperaturilor
prea ridicate.
Suprafaţa totală a unităţii de micropropagare este compartimentată într-o cameră
destinată spălării vaselor, o încăpere pentru pregătirea şi păstrarea mediilor de cultură şi a
soluţiilor stoc prevăzută cu o incintă, separată exclusiv pentru autoclav, o cameră sterilă
pentru inoculări, camere de vegetaţie şi unităţi pentru aclimatizare. Camera pentru pregătirea
şi păstrarea mediilor de cultură şi a soluţiilor stoc, precum şi zona de spălare a sticlăriei
trebuie amplasate separat de camera de inoculare şi de cea de vegetaţie. Zonele cele mai
curate trebuie să fie camera de vegetaţie şi camera de inoculat. Aceste două sectoare trebuie
să fie amplasate astfel încât intrarea să nu se facă direct din afara cădirii. Mai mult, ele
trebuiesc separate şi între ele prin instalarea unor uşi, cu rolul de reducere a traficului.

Camera destinată spălării vaselor

Camera pentru spălarea sticlăriei trebuie să fie dotată cu sursă permanentă de apă rece
şi caldă, de calitate, cel puţin un bazin-chiuvetă mare cu ţevi din materiale rezistente la soluţii
acide şi alcaline, rafturi şi dulapuri pentru uscarea şi păstrarea sticlăriei, aparatele pentru
producerea apei distilate şi deionizate.

Camera pentru pregătirea şi păstrarea mediilor de cultură şi a soluţiilor stoc

Camera pentru preparat mediile de cultură şi a altor soluţii trebuie să fie lângă camera
de spălat, având astfel acces direct la sursa de apă distilată şi la vase. Această încăpere este
prevăzută cu console sau mese de lucru foarte stabile. Suprafaţa lor trebuie să fie din
materiale rezistente şi uşor de curăţat. Camera trebuie să fie încăpătoare deoarece în această
zonă se găseşte majoritatea echipamentelor cerute în unitatea de micropropagare.
Necesarul de echipamente se stabileşte în funcţie de mărimea unităţii de producţie şi
se completează adecvat dacă în această unitate se realizează şi activităţi de cercetare.
Din tot necesarul de înfiinţare, cele mai costisitoare sunt aparatele, pentru un
laborator de culturi fiind necesară achiziţionarea a minimum următoarelor echipamente:

Descriere produs Utilizare produs

Cantitate
sticlărie
100 buc. Vase de cultură din sticlă, Veselă pentru
autoclavabile, cu posibilitate menţinerea
de inchidere ermetică materialului vegetal
prin subculturi
100 buc. Capace pentru vasele de Închiderea ermetică a
cultură, autoclavabile, cel mai vaselor de cultură
indicat din polipropilenă
15 buc Cutii Petri sau plăci de faianţă Suprafaţă sterilă
autoclavabile pentru fasonarea
explantelor în timpul
transferului pe mediu
proaspăt
10 buc. Sticle cu capac pentru apă, Apă sterilă pentru
autoclavabile (500 mL) clătire
1 buc. Vas Erlenmeyer, 1000 mL Pregătirea
mediului/soluţii
1 buc. Vas Erlenmeyer, 2000 mL Pregătirea
mediului/soluţii
1 buc. Vas Erlenmeyer, 4000 mL Pregătirea
mediului/soluţii
1 buc. Vas Erlenmeyer, 6000 mL Pregătirea
mediului/soluţii
1 cutie Sistem de filtrare cu pompă de Sterilizarea soluţiilor
vacuum, pentru lichide, din stoc fierbinţi
polistiren; 200 mL; 47 mm în
diametru/ membrane filtrante
de nailon cu pori de 0,22 µm
1 buc. Cilindru de sticlă/plastic Preparare soluţii stoc
gradat; 10 mL
1 buc. Cilindru de sticlă/plastic Preparare soluţii stoc
gradat; 100 mL
1 buc. Cilindru de sticlă/plastic Preparare soluţii stoc
gradat; 1000 mL
100 buc. Pipete gradate, 1 mL, sterile Măsurare soluţii stoc
sau autoclavabile
100 buc. Pipete gradate, 5 mL, sterile Măsurare soluţii stoc
sau autoclavabile
100 buc. Pipete gradate, 10 mL, sterile Măsurare soluţii stoc
sau autoclavabile
10 buc. Pipete gradate, 25 mL, sterile Măsurare soluţii stoc
sau autoclavabile
500 buc. eprubete Iniţierea culturii
(Etapa 1)
echipamente
1 buc. Sistem de purificare a apei; Purificarea apei pentru
apa trebuie să aibă o rezistenţă mediul de cultură
de cel puţin 200.000 ohms/cm
1 buc. Balanţă electronică (cu trei Cântărirea substanţelor
zecimale, max.200 g chimice
capacitate)
1 buc. pH-metru (scara 0-14±0,01; Măsurarea şi
conversie automată în funcţie corectarea valorii pH a
de temperatură (0-60ºC), cu 1- soluţiilor
2 valori de calibrare
1 buc. Plită electrică cu agitator Amestecarea şi
magnetic; valoarea de încălzirea mediului de
încălzire până la 400 ºC; cultură /soluţii stoc
viteză variabilă de agitare (50-
150 rpm); rezistentă chimic
1 buc. Combină frigorifică pentru Păstrarea soluţiilor
temperaturi de 2-6ºC în stoc, mediilor,
frigider şi respectiv, -20ºC în
hormonilor,
congelator substanţelor chimice
1 buc. Autoclav cu operare la 121ºC,Sterilizarea mediilor,
cu control presiune şi duratăsoluţiilor, sticlăriei,
instrumentarului
1 buc. Oală sub presiune cu operare Sterilizarea volumelor
între 116-126 ºC; 10-20 psi mici de mediu, soluţii,
obiecte mici
1 buc. Etuvă 120V (S636) sau 240V Presterilizare,
 (S637) sterilizare uscată
1 buc. Cronometru electronic, cu Alarmă şi
alarmă cronometrare
1 buc. Stereo-lupă prevăzută cu sursă Observare material
de luminare biologic
1 buc. Aparat fotografiat Observare material
biologic
chimicale
1L Detergent Spălarea vaselor de
sticlă
1L Dezinfectant (hipoclorit) Sterilizarea suprafeţei
explantului
4L Alcool 70 % Pentru sterilizarea
suprafeţelor de lucru şi
a instrumentarului
solutii standard de calibrare Calibrarea pH-
pentru valorile 4,0 si 7,0 metrului
Vată, tifon Uz general

instrumentar
3 buc. Foarfece din inox, Fasonat explante
autoclavabilă
2 buc. Bisturiu din inox, Fasonare explante
autoclavabil,
100 buc. Lame bisturiu Nr. 11 Fasonare explante
2 buc. Spatulă mare Măsurare volume mari de
substanţe chimice
2 buc. Spatulă mijlocie, 30 Măsurare volume mari de
cm lungime substanţe chimice
1 buc. Micropipetă şi vărfuri Măsurare volume mici
0-20 µl
1 buc. Micropipetă şi vărfuri Măsurare volume mici
20-1000 µl
2-3 buc. Marker colorat, 2-3 Etichetarea culturilor
culori
1 rolă Parafilm(4``x250 ft) Sigilare vase de cultură
1 pereche Mănuşi de protecţie Pentru manevrarea în
pentru autoclav siguranţă a autoclavului şi a
vaselor fierbinţi
1 rolă Folie aluminiu Pentru împachetarea
instrumentarului în vederea
autoclavării
2-3 buc. Magneţi de agitare Amestecarea soluţiilor pe
( pentru volume de agitator magnetic
250 mL, 1000 mL,
2000 mL)
2-3 buc. Perie de sticlă Spălare eprubete şi vase de
 sticlă
25 buc. Suport eprubete Suport eprubete în camera de
vegetaţie
1000 buc. şerveţele Pot fi sterilizate , sau pentru
uz general în laborator
100 coli Hârtie Pentru împachetat, la
sterilizare
1 rolă Bandă adezivă pentru Marcare autoclavare,
autoclav, se etichetare
diferenţiază după 15
min. de expunere la
121 ºC
1 buc. Termometru -20 /+150 Măsurare temperatura
ºC lichidelor sau în camera de
vegetaţie
25 buc. Tăviţe pentru Cântărirea substanţelor
cântărire, volume chimice
diferite

În categoria echipamentelor opţionale, în funcţie de bugetul alocat dotării, se pot

achiziţiona şi altele, cum este cazul unui cuptor cu microunde- necesar pentru dezgheţarea rapidă
sau pentru topirea rapidă a mediilor de cultură ce trebuie suplimentate postautoclavare cu diferite
componente termosensibile; laboratorul poate fi dotat şi cu o maşină de spălat vasele de cultură,
un sistem automat de dispersie a mediului de cultură, etc.
Camera sterilă pentru inoculări
Alături de camera de preparat mediul de cultură, există camera sterilă, destinată
inoculărilor, care trebuie să fie cea mai curată şi izolată încăpere. Izolarea eficientă a acestei
încăperi asigură condiţii de transfer aseptic şi împiedică circulaţia sporilor
microorganismelor. În această incintă este obligatorie purtarea unui echipament de laborator
corespunzător (halat, pantofi, bonetă, etc.). În această cameră sunt montate hotele de suflat
aer steril astfel încît toate operaţiunile să se execute obligatoriu în condiţii de asepsie. Pentru
menţinerea gradului de steril camera este prevăzută cu un sistem de ultraviolete, lumina UV
fiind însă utilizată, înainte sau între perioadele de inoculare şi doar când personalul şi
materialul biologic nu se află în încăpere. Pentru o protecţie sporită a personalului, este
indicat să fie avertizată prezenţa şi funcţionarea UV-ului iar închiderea/deschiderea lămpilor
UV să fie practicabile din exteriorul camerei, Suprafaţa interioară a hotelor trebuie să fie din
materiale perfect netede (sticlă) pentru a reduce depunerile de praf şi eventualele surse de
depozitare a microrganismelor, uşor de curăţat şi rezistente. Camera trebuie să fie dotată cu
surse de curent electric pentru hote, lupe, microscop şi aparatele bacto-incineratoare
(aparatele de sterilizat instrumentarul).

Camera de vegetaţie
Camera de vegetaţie este locul unde se păstreză materialul vegetal (plante, calus,
suspensii, protoplaşti) în vasele de cultură în intervalul dintre două subculturi. Elementele
caracteristice pentru această încăpere sunt definite de temperatură, umiditatea relativă,
sistemul de iluminare şi tipul de rafturi pentru culturi. Toate aceste elemente se stabilesc în
funcţie de mărimea camerei, locaţie şi tipul de cultură pentru care este destinată.
Elementul esenţial în camera de vegetaţie îl reprezintă temperatura. În funcţie de
aceasta se stabilesc şi alţi parametrii cum sunt lumina, umiditatea relativă şi tipurile de rafturi
(simple, cu oglindă sau cu system de răcire) pentru vasele de cultură.Valoarea medie a
temperaturii în camera de vegetaţie este cuprinsă între 22 şi 25 ºC. Încălzirea camerelor de
vegetaţie nu prezintă o problemă în sine; mult mai dificil este însă răcirea şi menţinerea unei
temperature constante – aceasta se realizează prin instalarea sistemelor de aer condiţionat sau
a unor ventilatoare. Nu este indicat apelarea la geamuri pentru camerele de vegetaţie
deoarece aceasta ar spori riscul contaminării culturilor în timpul verii şi ar crea variaţii de
umiditate în timpul iernii.
Unele camere de vegetaţie pot fi menţinute în întuneric dar majoritatea culturilor au
nevoie de lumină. Camerele de vegetaţie sunt prevăzute cu sisteme de iluminat
neincandescent, asigurându-se o intensitate medie de 1- 5 klux, această valoare fiind stabilită
în funcţie de specia cultivată şi de sistemul de cultură practicat. Calitatea luminii este şi ea o
componentă esenţială în procesele de culturi de celule şi ţesuturi vegetale : majoritatea
culturilor se practică sub lumină florescentă albă. Stadiul de dezvoltare a culturii poate
necesita însă utilizarea unui spectru variat de lumină. Culturile pot manifesta cerinţe specifice
şi faţă de fotoperioadă astfel încât orice cameră de vegetaţie va fi dotată cu un sistem automat
pentru programarea fotoperioadei. Utilizarea unor surse de lumină de tipul reflectoarelor este
limitată deoarece căldura generată de acestea poate determina condensarea sau concentrarea
mediilor de cultură. Dacă prezenţa reflectoarelor direct pe vasele de cultură este absolut
necesară atunci trebuie să se asigure o circulaţie corespunzătoare a aerului cu ajutorul
ventilatoarelor.
 Umiditatea relativă este foarte greu de controlat în interiorul vaselor de cultură.
Valoarea umidităţii relative în camera de vegetaţie nu trebuie să scadă sub 50 % ; dacă
valoarea creşte peste limitele acceptabile se vor folosi metode de uscare iar pentru situaţia
inversă vor fi folosite cantităţi mai reduse de agar la prepararea mediului.

Unitatea pentru aclimatizare

Aclimatizarea plantelor înrădăcinate in vitro se realizează în boxe speciale în care toţi
factorii de stress post transferului ex vitro să poată fi controlaţi şi adaptaţi în funcţie de
necesarul şi starea plantulelor

Aspecte economice şi comerciale

ale unităţii de micromultiplicare
Etichetare si păstrarea evidenţei
Laboratorul de culturi de celule şi ţesuturi vegetale, organizat pe principii comerciale
necesită utilizarea unui sistem eficient de înregistrare a informaţiilor care trebuie să asigure
toate informaţiile simplu şi exact prezentate din toate etapele procesului operaţional.Aceasta
se realizează îin scopul eficientizării planificării producţiei şi pentru reducerea la minimum,
mentinându-se costuri scăzute de producţie. Multe dintre informaţii pot fi păstrate în registru,
dar ideal este utilizarea unei baze de date pe calculator.Utilizarea calculatorului permite
organizarea, accesarea, sortarea şi clasificarea pe categorii.
Exemple de înregistrări:
 Metode de cultură
1. Protocoale, proceduri, formule de medii
2. Reţete de medii şi soluţii stoc
 Activitatea experimentală
1. Specii recalcitrante, problematica de rezolvat
2. Evoluţia experimentelor (detalii pe faze)
 Comenzi
1. Lista de furnizori (persoana contact, adrese,etc.)
2. Formulare tipizate
3. Informaţii legislative pentru produse cu regim special
 Contabilitatea
1. Conturi
2. Facturi
3. Alte documente
  Control periodic
1. Data verificării hotelor
2. Filtre schimbate
3. Control biohazard
4. Control instalaţie electrică
5. Verificare aparate în regim special (autoclav, distilator, pH-metru)
6. Control protecţia muncii
7. Control dotări prim-ajutor (acid acetic 2%, acid boric 4%, spirt medicinal,
apă oxigenată 3%, bicarbonat de sodiu 2%, comprese sterile, leucoplast,
pahar special pentru spălat ochii, tinctură de iod, vată hidrofilă, faşă de
tifon)

Micropropagarea
Material: celule organizate, ţesuturi, fragmente de
ţesuturi, plantă întreagă
Obiectiv: multiplicarea nelimitată a aceluiaşi tip de
material biologic valoros
Procese biologice implicate: creşterea şi
dezvoltarea
Stabilitate genetică: obligatorie
Metode şi tehnici : simple şi ieftine
Aplicaţii imediate: comerciale
Biotehnologia
Material: celule neorganizate: calus, suspensii
celulare, celule imobilizate, celule individuale
Obiectiv: obţinere de material genetic modificat,
obţinere de metaboliţi secundari
Procese biologioce implicate: metabolismul celular
Stabilitate genetică: variabilitate genetică şi
somaclonală
Metode şi tehnici: complexe şi sofisticate, destul de
costisitoare
Aplicaţii imediate: ştiinţifice, comerciale şi
industriale

3. Prepararea mediului de cultură.

Soluţii stoc
Cuvinte cheie:
pregătirea soluţiilor stoc;. prepararea mediului de cultură MSO; fişa de mediu;

Necesar echipamente:
 Balanţă analitică
 Plită cu agitator magnetic
 pH-metru
 Autoclav
Necesar consumabile:
 Substanţe chimice
 Filtre Millipore®
 Apă distilată

Noţiuni teoretice
Raportul între macroelemente şi microelemente este definit de cerinţele concentraţiei
celulare pentru un anumit element şi este funcţie de capacitatea fiecărui tip de cellule de
asimilare a elementului respective. Majoritatea macroelementelor se dau în concentraţii de
ordinul milimolilor iar cmicroelementele de ordinul micromolilor. Concentraţiile foarte
reduse de microelemente nu reprezintă indicaţia că acest tip de compuşi sunt lipsiţi de
importanţă; absenţa unui singur microelement poate determina apariţia unor probleme de
creştere extrem de severe. În practică, apa necorespunzătoare (contaminată) utilizată la
prepararea soluţiilor stoc, pot adăuga cantităţi semnificative a acestor elemente în mediul de
cultură.. Practica cea mai sigură este utilizarea unor medii condiţionate, în amestecuri gata
preparate cumpărate din surse comerciale autorizate şi verificate.

Alternativ, pot fi preparate şi soluţii stoc complexe, în concentraţii mari pentru a fi

utilizate în amestecurile finale. Un exemplu de astfel de soluţie complexă poate fi o
combinaţie de mai multe vitamine. Această metodă este practicabilă doar în cazul în care
combinaţia respectiă este frecvent utilizat în aceeaşi formulă.

Cea mai folosită formulă de mediu de cultură este cea descrisă de Murashigie şi
Skoog care a fost utilizată iniţial pentru cultura ţesutului foliar de tutun. Este o formulă
bazată pe compoziţia minerală a frunzelor de tutun.
Mediul de bază Murashige- Skoog (1962), cod: MSO:

Exerciţii practice
Component Cantitate Component Cantitate Exerciţiul 1.:
CaCl2-2H2O 440 mg/l CuSO4-5H2O 0,025 mg/l
NH4NO3 1650 mg/l ZnSO4-7H2O 8,6 mg/l
KNO3 1900 mg/l FeSO4-7H2O+ 27,85 mg/l
KI 0,83 mg/l Na2EDTA 37,25 mg/l
CoCl2-6H2O 0,025 mg/l Glicină 2,0 mg/l
KH2PO4 170 mg/l Inozitol 100 mg/l
H3BO3 6,2 mg/l Acid nicotinic 0,5 mg/l
Na2MoO4 0,25 mg/l Piridoxină HCl 0,5 mg/l
MgSO4-7H2O 370 mg/l Tiamină HCl 0,1 mg/l
MnSO4-4H2O 22,3 mg/l Zaharoză 30000 mg/l
pH 5.7

Prepararea soluţiilor stoc pentru mediul MS (1962)

a) Macroelemente MS, concentraţie 10x, pentru 1L mediu se adaugã 100 ml.

- se toarnã 250 ml apã bidistilatã într-un vas de 1L.
- se cântãresc pe rând si se adaugã în apa din vas urmãtoarele substanţe:
Azotat de K (KNO3).............................19,0 g
Azotat de amoniu (NH4NO3)................16,5 g
Clorurã de Ca (CaCl2.2H2O) .................4,4 g
Sulfat de Mg (Mg SO4.7H2O).............. 3,7 g
Fosfat monopotasic (KH2PO................ 1,7 g
TOTAL..............45,3 g
- se complecteazã cu apã bidistilatã sterilã pânã la un litru,
- se eticheteazã, se dateazã şi se pãstreazã la frigider.
 b) Microelemente MS, concentraţie 100x, pentru 1L mediu se adaugă 10 ml
- se toarnă 250 ml apă bidistilată sterilă într-un vas de 1L
- se cântăresc pe rând şi se adaugă în apa din vas următoarele substanţe:
Sulfat de Mn (MnSO4.H2O) ............1180 mg
Sulfat de Zn (ZnSO4.7H2O) ..............860 mg
Acid boric (H3BO..............................620 mg
Iodură de potasiu (KI) .........................83 mg
Molibdat de Na (NaMoO4.2H2O) ........25 mg
Clorură de Co (CoCl2.6H2O)........ 2,5mg
Sulfat de Cu (CuSO4.5H2O) ...............2,5 mg
TOTAL.........2773.0 mg
- se complectează cu apă distilată sterilă până la 1L
- se etichetează, se datează şi se păstrează la frigider.

c) Fierul pentru microelemente MS, concentraţie 100x, pentru 1L de mediu se

adaugă 5 ml
- se toarnă 400 apã bidistilată sterilă într-un vas de 500 ml
. - se cântăresc pe rând şi se adaugă următoarele substanţe:
Sulfat feros (Fe2SO4.7H2O) ......2,78 g

NaEDTA ..................................3,72 g
TOTAL.................6,50 g
- se amestecă la cald până la completa dizolvare
- se completează cu apă bidistilată sterilă până la 1L
- se etichetează, se datează şi se păstrează la frigider.

d) Vitamine MS, concentraţie 100x, pentru 1L mediu se adaugă 10 ml

- se toarnă 250 apă distilată sterilă într-un vas de 1L
- se cântăresc pe rând şi se adaugă următoarele substanţe :

Piridoxină HCl (Vitamina B........50 mg

 Tiamina HCl (Vitamina B1) .......10 mg
Acid nicotinic (Vitamina PP) ......50 mg

Glicina (aminoacid) ..................200 mg

Mezoinozitol (alcool) ............10000 mg

.............TOTAL..................10310 mg

Mediile de cultură pentru subcultivarea explantelor caulinare sau foliare

(multiplicarea prin butăşire sau regenerare prin organogeneză directă):

MSO

MSP1 = MSO + 6 BAP (0,5 mg/l) + ANA (2,0 mg/l)

MSD3 = MSO + 6 BAP (1,0 mg/l) + AIA (2,0 mg/l)

MSZ = MSO + Z (1,0 mg/l)

UM = MSO + 2,4 D (2,0 mg/l) + Kin (0,25 mg/l) +Tiamină (9,9 mg/l) + Piridoxină
(9,5 mg/l) + Acid nicotinic (4,5 mg/l) + hidrolizat de cazeină (2000 mg/l).

Mediul de cultură pentru înrădăcinare

MS = MSO + ANA (1,0 mg/l)

Medii de cultură folosite în culturile de calus

Mediile de cultură pentru iniţiere şi creştere
MS1 = MSO + BAP (de la 0,1 la 0,25 mg/l) + zaharoză (30 g/l)
MS2 = MSO + 2,4 D (2,5 mg/l) + BAP (de la 0,1 la 0,25 mg/l) + zaharoză (20 g/l)
MS3 = MSO + BAP (1,0 –3,0 mg/l) + 2,4 –D (2,5 mg/l) + zaharoză (40 g/l)
Mediul de cultură pentru inducerea embriogenezei somatice
MS120 = MSO + 2,4 –D (2,5 mg/l) + zaharoză (120 g/l)
Mediul de cultură pentru regenerare
MS4 = MSO + Kin (1,0 - 3,0 mg/l) + Z (1,0 - 3,0 mg/l)

Exerciţiul 2.: Prepararea mediilor de cultură

Mediile de cultură sunt fie solide (gelificate), fie lichide, compoziţia lor variind de la un

autor la altul în limite destul de restrânse. După cum s-a văzut mai înainte în compoziţia
 lor intră substanţe anorganice (macroelemente, microelemente şi Fe chelatizat) precum şi

o serie de substanţe organice (vitamine, aminoacizi, glucide, hormoni) şi după caz un

agent gelifiant.

În general se prepară soluţii stoc, separate pe: macroelemente, microelemente,

FeEDTA, vitamine, aminoacizi şi hormoni, care în momentul utilizării necesită diluarea lor.
Hormonii se folosesc în soluţii pure şi nu în amestec. Soluţiile de substanţe
anorganice se vor păstra în frigider la 4C, vitaminele în congelator, iar hormonii în
apropierea congelatorului.
Alegerea compoziţiei mediului de cultură se face în raport cu scopul urmărit iar unul
dintre cele mai folosite medii de cultură ar fi: Murashige - Skoog (1962) (MS), Gaborg &
colab. (1968) (B5), Linsmeier - Scoog (1965) (LS), Knop, Heller, Nitsch & Nitsch.
Nu se recomandă scimbarea cantitaţilor din reţetele de soluţii anorganice, întrucât se
produc modificari în ceea ce priveşte proporţia diferiţilor compuşi, alterând echilibrul ionic
fixat ca optim din punct de vedere fiziologic, a stabilităţii în timp a pH-ului.

Exerciţiul 3: Prepararea unor soluţii stoc de fitoregulatori de creştere

La prepararea soluţiilor stoc reţinem câteva reguli generale:
a. dizolvarea substanţelor se face numai în apă bidistilată

b. fiecare compus se dizolvă într-o anumită cantitate de apă proporţional cu

c. numărul ingredientelor ce urmează a fi amestecate şi cu volumul final al

d. soluţiei stoc, după care soluţiile obţinute se amesteca succesiv, în ordinea

e. indicată în reţetar

f. la substantele greu hidrosolubile, amestecul se încălzeşte uşor pe baia de

g. apă (dacă reţeta prevede această indicaţie), agitând

h. regulatorii de creştere - hormonii - vor fi solubilizaţi fiecare în parte, potrivit

i. indicaţiilor din literatura de specialitate

j. deoarece autorii exprimă concentraţia în maniera diferită (g, mg%, g/l sau

k. ppm) se are în vedere calcularea cantităţii de substanţă ce trebuie cântărită

 l. pentru a asigura echivalenţa

m. se are în vedere asigurarea echivalenţei unui compus introdus în mediu

n. când aceasta este o sare cu un anumit conţinut în apă sau în cazul unor

o. săruri cristalizate

p. în prepararea mediului de bază fiecare compus în parte se adaugă eşalonat,

q. într-o anumită cantitate de apă bidistilată apreciată arbitrar, proporţional cu

r. volumul final al soluţiei

s. pH-ul mediului se va regla înainte de adăugarea agarului

t. agarul se va adăuga mediului de cultură după introducerea celorlalte

u. ingrediente, mediul agarizat, cu agarul lichefiat se repartizează în recipiente

v. de cultură. La pH prea acid sau la autoclavare incorectă agarul rămâne în

w. stare lichidă şi mediul de cultură nu se mai poate folosi.

Fişa mediului constă în înregistrarea formulelor utilizate într-o bază de date proprii.
Fişele vor conţine obligatoriu codurile înscrise pe flacoane. MS , B5, WPM, etc.)
 4: Etapele micropropagării

Cultura de ţesuturi reprezintă o metodă comercială rapidă de multiplicare a

cultivarelor nou obţinute, a speciilor rare şi a plantelor cu probleme de multiplicare prin
metodele clasice. Datorită cererii tot mai ridicate pentru material vegetal micromultiplicat, de
la cele câteva laboratoare existente acum câţiva ani, în prezent funcţionează o adevărată
industrie. Cu toate că încă funcţionează unităţi strict şi limitat specializate pentru producţia
plantulelor, care sunt vândute mai departe cultivatorilor, tendinţa generală este ca marile
unităţi cultivatoare să-şi includă şi etapa de multiplicare in vitro a materialul săditor, prin
crearea propiului laborator de micropropagare.
 Procesul de micropropagare
O descriere foarte sumară a procesului de micropropagare poate clarifica aspectele
specifice cerute de aceste proceduri: un fragment mic de ţesut vegetal este tăiat din planta
mamă (cea care trebuie clonată) şi dezinfectat într-o soluţie diluată de agent de sterilizare,
după care este clătit în câteva ape sterile şi fasonat, adică i se decupează zonele marginale
afectate de agentul de dezinfecţie. După această procedură explantul este plasat, în condiţii de
asepsie totală (sub hota sterilă), pe un mediu de cultură adecvat formulat. După parcurgerea
fazei de acomodare, explantul va da naştere unor muguri, lăstari sau calus, în aproximativ 4-
12, în funcţie de specie. Creşţterea şi dezvoltarea explantului sunt deterinate de tipul
fitohormonilor prezenţi în mediul de cultură. După apariţia noilor proliferări acestea sunt
transferate pe medii de cultură proaspete, unde la rândul lor proliferează şi continuă
multiplicarea rapidă fiind şi ele subcultivate ulterior. Rata multiplicării depinde de specie şi
este determinată de o mulţime de factori, dar sunt estimări care atestă posibilitatea obţinerii
unui număr impresionant (de ordinul milioanelor) pornindu-se de la un singur explant.
În 1974 T. Murashige descrie etapele succesive care trebuiesc parcurse la producerea
de plante in vitro, în regim industrial, distingând trei stadii principale :
- Stadiul I, de înfiinţare a culturilor aseptice.
- Stadiul II, de multiplicare şi propagare in vitro
- Stadiul III, de pregătire a plantelor generate in vitro pentru transferarea lor ex vitro
În 1982, din raţiuni de ordin economic, Debergh şi Maene recomandă extinderea
numărului de etape, prin înfiinţarea unui stadiu 0- de pregătire a plantei mame, premergător
explantării şi subdivizarea stadiului III, în două substadii.
Nu există reguli inviolabile pentru propagarea unei anumite specii vegetale prin
culturi de ţesuturi şi adesea este necesară ajustarea şi reajustarea compoziţiei mediului, a
ambientului şi chiar a habitatului astfel încât culturile să poată fi determinate să pornească în
creştere şi dezvoltere.
 Pentru obiectivele micropropagării poate fi descrisă o schemă ce cuprinde cinci etape
de bază:

etapa 0 – de pregătire a plantei mamă

etapa 1 – de iniţiere a culturii in vitro
etapa 2 – de micromultiplicare
etapa 3 – inducere a formării de rădăcini şi pregătirea plantulelor
pentru transferul ex vitro
etapa 4 – transferul ex vitro şi aclimatizarea

Etapa 0 - de pregătire a plantei mamă

În general, la multe din speciile dicotiledonate şi mai ales la cele ierbacee, nu sunt
necesare tratamente de stimulare şi activare a celulelor vegetative în scopul pregătirii plantei
mamă pentru iniţierea culturii in vitro. Există însă unele situaţii, de exemplu în cazul speciilor
lemnoase, a speciilor cu o activitate metabolică intensă, sau când momentul de recolotare a
explantelor în vederea iniţierii se face în faze fiziologice improprii (senescenţă, repaus, etc.)
când este nevoie de o pregătire în prealabil a plantei donoare de explante.
În cazurile care cer pregătiri speciale, alegerea metodei de pretratament a plantei care
urmează să fie propagată in vitro reprezintă o etapă esenţială, de care depinde succesul sau
insuccesul culturilor in vitro.
La alegerea metodei de pretratament se iau în considerare următorii factori:
 Gradul de contaminare a materialului de pornire. Plantele crescute în câmp, de
obicei sunt expuse unui grad ridicat de contaminare bacteriană sau virală, fapt ce are
ca efect o sterilizare foarte dificilă a materialului înaintea iniţierii culturii in vitro.
Când explantele necesare iniţierii unei culturi sunt recoltate din părţile mature ale
plantei sunt necesare procedee foarte complicate de sterilizare. Este de dorit ca
materialul de iniţiere să fie prelevat din stocul de plante crescute într-un mediu
controlat - spaţii protejate - în care nu s-a aplicat o udare excesivă.
 Gradul de vigurozitate a materialului de pornire. Plantele viguroase pot fi obţinute
prin diverse metode, inclusiv tăieri severe pentru încurajarea unei creşteri viguroase,
 aplicarea unor cantităţi mari de fertilizanţi sau practicarea de altoiri pe răsaduri.
Aceste metode determină apariţia unui ţesut juvenil caracterizat printr-un grad mare
de plasticitate şi un înalt potenţial morfogenic. Pentru unele specii metoda cea mai
bună o reprezintă obţinerea de explante capabile de regenerare pornind de la
materialul iniţial, cultivat el însuşi în culturi in vitro înainte de a fi folosit ca sursă de
explante.
 Necesitatea aplicării unor pretratamente speciale.Anumite specii, de exemplu,
bulbiferele sau speciile lemnoase necesită tratamente speciale pentru stimularea
mugurilor dorminzi. Efectul temperaturii s-a manifestat atât pozitiv stimulator cât şi
inhibitor, depinzând de câţiva factori:
- timpul de păstrare la o anumită temperatură;
- concentraţia auxinelor în ţesutul tratat;
- temperatura culturii;
De exemplu s-a inregistrat un efect stimulator asupra bulbilor de lalea şi iris la un
pretratament termic de 30C.
Tot în stadiul 0 este necesară pregătirea plantelor - mame donoare de explante. Ele
trebuie crescute în condiţii speciale de cultură, în spaţii protejate, la temperatura de 25°C , în
umiditatea atmosferică de 70%; plantele vor fi udate numai la nivelul solului. Astfel, se
obţine creşterea considerabilă, a numărului de inoculi necontaminaţi. De regulă, procentul de
inoculi necontaminaţi nu depăşeşte 50%. Se va persevera în aplicarea acestor metode chiar
dacă frunzele din porţiunea bazală a plantelor - mame se brunifică.

Etapa 1 - de iniţiere a culturii in vitro

 stabilirea (iniţierea) culturii axenice, reactivarea ţesuturilor mature

Înfiinţarea culturii constă în exploatarea sau dimensionarea fragmentelor din care vor
fi înfiinţate culturile sau porţionarea inoculilor (calus, culturi de celule ori a suspensiei de
protoplaşti) şi în introducerea acestora în mediu, asigurând pe tot parcursul operaţiilor
condiţii de asepsie totală. Un factor cheie care influenţeaza iniţierea culturilor de ţesuturi îl
reprezintă momentul recoltării explantului. S-a dovedit că momentul optim de recoltare este
primăvara, deoarece vârfurile de creştere sunt caracterizate printr-o vigurozitate considerabilă
şi o rată scăzută de infecţie.
 În această etapă se practică selectarea cu responsabilitate a explantului, ales ca
iniţiator al culturii, a mediilor de cultură şi a condiţiilor de incubare a inoculilor cu menţiunea
că o atenţie cu totul specială trebuie acordată momentului sterilizării materialului biologic.
De asemenea este importantă spălarea la jet de apă, timp îndelungat a materialului biologic
donator de explante astfel obţinându-se bune rezultate în întemeierea culturii aseptice la
materialele biologice dificile. Această etapă de iniţiere a culturii are o durată mai lungă de
cca. 6 luni, în dependenţă cu materialul biologic cu care se lucrează.

Etapa de iniţiere este, poate, cea mai dificilă fază deoarece presupune detaşarea
explantului de pe planta întreagă- ceea ce înseamnă o rănire inevitabilă a ţesutului, stresarea
acestuia prin tratamentul de asepsizare iar mai apoi adaptarea celulelor la condiţii noi de
viaţă. Asepsizarea explantelor trebuie să se decidă prin tatonare şi constă în identificarea
uui echilibru între concentraţia agentului de sterilizare şi timpul de expunere la acţiunea
acestuia. Nu există un raport ideal între concentraţie şi timpul de expunere deoarece, în
reuşita asepsizării, se ţine cond de tipul de material vegetal (ţesut lignificat, suberizat sau
sensibil), de vârsta materialului vegetal, de porozitatea suprafeţei de sterilizat, (lisă sau
încreţită), prezenţa sau absenţa perişorilor (aceştia pot să creeze un strat de izolare între
soluţia de sterilizare şi suprafeţa efectivă a ţesutului), gradul de contaminare precum şi de
gradul de integritate al ţesutului.

Etapa de iniţiere se parcurge în două sub-etape:

1. sub-etapa tratamentului cu agentul de sterilizare/asepsizare:constă în spălarea în
prealabil sub jet de apă curentă, de robinet, apoi imersia în soluţia de dezinfectat;după
parcurgerea minutelor necesar, materialul biologic se cşlăteşte succesiv în mai multe
(3-4) băi de apă sterilizată, pentru diluarea până la spălarea completă a sterilizantului.
După clătire se fasonează explantele care se introduc în flacoanele cu mediu; în
momentul poziţionării explantelor se are în vedere asigurarea contactului unei
suprafeţe cât mai mare (un număr cât mai mare de celule) cu mediul de cultură
peentru a facilita accesul la elementele nutritive din substratul de cultură.
2. sub-etapa a 2-a reprezintă fază de adaptare propiu-zisă a explanztului la noile condiţii
de viaţă. Aceasta constă în trecerea treptată de la sistemul autotrof la ce mixotrof,
respectiv, heterotrof şi pierderea calităţii de “parte a unui întreg”. Explantele devin
independente, îşi reduc activitatea de fotosinteză la minimum (datorită lipsei
schimbului de gaze respiratorii- cultura fiind practicată în flacoane închise ermetic),
 dobândesc capacitatea de absorbţie directă a elementelor nutritive asigurate sub formă
uşor asimilabilă şi încep să crească.
Etapa de iniţiere, ca durată şi efort de adaptare, este diferită de la specie la specie sau de
la un explant la alt tip de explant. Într-o primă fază de cultură pe mediul de iniţiere are loc
cicatrizarea marginilor rănite prin fasonare, acumularea unei cantităţi mari de apă în ţesuturi
(explantele “cresc” în volum dar nu şi în numărul de celule. Uneori apare o necrozare mai
evidentă a ţesutului.

Etapa de iniţiere poare dura de la câteva zile la câteva săptămâni, fiind considerată
parcursă când pot fi sesizate pe suprafaţa explantelor elemente de creştere efectivă a unor
celule noi: calus, muguri care se dezvoltă. Problemele cele mai frecvente care apar în această
etapă sunt apariţia unor contaminări şi apariţia brunificării explantelor.

Contaminările apărute pe suprafaţa explantului denotă o concentraţie sau un timp de

expunere prea mici; cele apărute la capetele tăiate ale explantului (sub formă de halou)
indică o rezervă de agenţi patogeni endogeni, iar cele apărute pe suprafaţa mediului dar nu
în apropierea explantului indică un viciu de tehnică (instrumentar nesteril sau contaminare
prin respirarea asupra flaconului). Deşi nu se folosesc în mod obisnuit, în unele cazuri
pentru eliminarea microorganismelor sunt necesare tratamente cu antibiotice, mai ales în
cazul propagării clonale a unor caractere particulare a unui anumit tip de explant.
a.
b. Controlul brunificării în faza iniţierii culturii de explante se face prin subcultura
repetată la intervale scurte de timp sau prin utilizarea unor substanţe precum:
- cărbunele activ, acidul ascorbic,
- L-cisteina, azotatul de argint, citratul de potasiu
- Glutatione, Rosmanol
Speciile ierbacee răspund fără probleme iniţierii culturilor in vitro folosindu-se ca
explante diferite părţi ale plantei - rădăcini, tulpini, frunze. De obicei, explantul se alege din
zonele meristematice sau mugurii axilari, datorită faptului că aceste părţi vegetale prezintă un
înalt grad de stabilitate genetică în cultură şi un înalt grad de plasticitate morfogenetică. La
speciile de cereale, materialul de iniţiere optim îl reprezintă embrionii imaturi, care vor
produce calus embriogenic, dacă este cultivat pe mediul MS suplimentat cu o auxină. Dintre
auxine, cel mai mare efect pozitiv asupra stimulării formării de calus embriogenic îl are 2,4 -
D, dar rezultate pozitive s-au inregistrat şi în prezenţa auxinelor CPA, 2, 1, 5, T, picloram,
ANA sau Dicamba.
Se pare că alături de efectul informaţiei genetice a materialului, prezenţa auxinelor
este al doilea factor determinant pentru iniţierea culturii, Cantitatea tipică de auxină pentru
speciile ierbacee este cuprinsă între 0,1 - 1 mg/l. Se pot adăuga şi citochininele BAP şi
chinetină în cantitate de 0,1 - 1 mg/l. Rezultate pozitive s-au obţinut şi la adăgarea unor
cantităţi reduse de gibereline 0,03 - 0,3 mg/l. Pentru speciile bulboase sunt folosite în mod
obişnuit cantităţi scăzute de auxine (mai puţin de 10 micromoli).
Protocoalele experimentale desemnate pentru specii cu fructe mici sau viţă de vie
utilizează medii MS suplimentate cu AIB sau ANA şi BAP.
Pentru căpşun folosirea adeninei sulfat în absenţa citochininei poate mări rata de
iniţiere a culturii in vitro.
În cazul unor specii particulare sunt necesare modificări ale mediului. Astfel, în cazul
speciilor de Ribes folosirea mediului MS cu o reducere a proporţiei cu 20% a ionilor de nitrat
a fost benefică, iar la capşun şi zmeură se preferă mediile MS ½ (cu reducerea substanţelor
organice la jumătate).
Coniferele, obişnuit sunt cultivate pe medii iniţiale bogate în săruri, ca de exemplu,
MS sau SH (Skoog - Heller), cu nivele de auxine de 0,005 - 0,5 micromoli.
Combinaţiile regulatorilor de creştere pot îmbunătăţi rata reuşitei, la unele specii fiind
chiar superioare altor tratamente aplicate cu scopul stimulării iniţierii culturilor in vitro. De
exemplu, arbuşti precum azaleea, sunt crescuţi pe medii Lloyd şi McCown (1980) care se
caracterizează printr-un nivel scăzut de nitraţi şi un conţinut ridicat de calciu.
La unele specii, se formează produşi fenolici cu efect inhibitor, având ca rezultat
brunificarea ţesuturilor cultivate. Acest fenomen nedorit poate fi preîntâmpinat prin
tratamente aplicate înaintea iniţierii culturii “in vitro” folosind apa saponificată sau ascorbat.
De asemenea, rezultate bune s-au obţinut în cazul tratamentelor cu cărbune activ sau cu
polivinilpirolidonă. Deşi nu se folosesc în mod obisnuit, în unele cazuri pentru eliminarea
microorganismelor sunt necesare tratamente cu antibiotice, mai ales în cazul propagării
clonale a unor caractere particulare a unui anumit tip de explant.
Etapa 2 – de micromultiplicare
Multiplicarea explantelor este un stadiu crucial pentru propagarea speciilor, în scopuri
comerciale şi mai ales când este cerută o rată rapidă de multiplicare.
Cel mai adesea, mediul standard de creştere este suplimentat cu citochinină, de obicei
BAP sau chinetină. Există cazuri când se înregistrează un efect negativ la aplicarea
citochininelor în concentraţii mari recomandate pentru sporirea ratei de multiplicare.
Alţi factori care afectează rata de multiplicare includ intensitatea luminoasă, tipul de
agar şi cantitatea care se foloseşte, orientarea explantului pe mediu de inducţie.
În 1986 De Fossard propune introducerea a doua faze în etapa 2 şi a trei faze în
etapa 3.: În concepţia lui în stadiul I de inţiere a culturii in vitro se selectează: materialul
vegetal de iniţiere, mediile de cultură , condiţiile optime de incubare a explantelor,
acordându-se o importanţă deosebită sterilizării materialului vegetal El apreciază că etapa 2
trebuie să aibă o durată mai lungă, de aproximativ 6 luni sau chiar mai mult, în funcţie de
materialul biologic folosit .
Pentru etapa 2 el propune două sisteme de multiplicare: unul dintre acestea presupune
scoaterea materialului iniţial de sub influenţa dominaţiei apicale, prin folosirea unor medii de
cultură adecvate şi trecerea direct în etapa 3, de înrădăcinare a lăstarului, etapă care poate
dura cca. 2 luni; un rol important îl reprezintă şi modalitatea de inoculare a materialului
biologic pe mediul de multiplicare. Minibutaşul uninodal dă naştere unor lăstari care ulterior
sunt separaţi şi butăşiţi la rândul lor. În cazul meristemelor, apexurilor, sau a calusului are loc
creşterea inoculului, după care urmează separarea coloniei sau a plantei rezultate, generând
minibutaşi sau propagule, după care se procedează la subcultivarea acestora .

Etapa 3 – inducere a formării de rădăcini şi pregătirea plantulelor

pentru transferul ex vitro
Această etapă se refera la unele modificări în compoziţia mediului de cultură şi la
schimbarea conditiilor de cultură. Dacă în etapa 2 auxinele şi citochininele au fost prezente în
cantităţi foarte mici sau chiar absente din substratul de cultură, în etapa 3 se recomandă
reinstalarea dominaţiei apicale la nivelul tulpinilor generate in vitro si înrădăcinarea acestora.
Există 3 căi de abordare a etapei de înrădăcinare:
1. cultura poate fi transferată pe medii care să permită alungirea lăstarilor: după care vor fi
recoltaţi şi vor fi subcultivaţi pe un mediu proaspăt, pregătit pentru facilitarea rizogenezei la
nivelul minibutaşilor
2. inoculii - vor fi divizaţi - prin fragmentare în unităţi care să deţină o capacitate
regenerativă rapidă - în propagule care apoi vor fi subcultivate, pentru a determina formarea
de rădăcini, în vederea transferării culturii ex-vitro.
3. - tulpiniţele derivate din etapa 2, vor fi înrădăcinate in vitro, pe medii agarizate, având o
balanţă hormonală adecvată acestui scop.
Etapa 3 se caracterizează prin acţiuni specifice menite să pregătească planta pentru
transferul ex vitro; aceste activităţi presupun:
 utilizarea în mediul de cultură a auxinelor (mai ales AIB) în asociaţie cu o
citochinină.
 utilizarea unei concentraţii uşor mărită de agar în mediu în scopul intensificării
formării de rădăcini dar şi în reducerea accesuluzi la apă pentru concentrarea
sucului celular.
 scăderea umidităţii relative din camera de vegetaţie (sau utilizarea unei camere de
vegetaţie special reglată pentru această etapă). În general, în etapa de
micromultiplicare, umiditatea din vasul de cultură este foarte ridicată (90-100%)
ceea ce împiedică formarea unui strat protector de ceară.
 trecerea de la iluminatul continuu la menţinerea culturilor în sistem de iluminat
alternativ (16 ore lumină/ 8 ore întuneric)
 creşterea intensităţii de iluminare şi utilizarea (când este nevoie) a unor spectre
specifice de lumină, în scopul stimulării formării cloroplastelor funcţionale
 scăderea temperaturii din camera de vegetaţie , de la 25 ºC la 18-20ºC.
 alternarea diferitelor regimuri de temperatură în scopul activării stomatelor
 utilizarea unor flacoane prevăzute cu deschideri la nivelul capacului, pentru
egalizarea temperaturii, a presiunii, facilitarea circulaţiei aerului, etc. Aceste
deschideri sunt obturate cu filtre sau bureţi, pentru menţinerea condiţiilor de
asepsie)
Plantele crescute în in vitro se adaptează la mediul artificial în diferite moduri. Forma
cea mai extremă o reprezintă vitrificarea ţesuturilor vegetale, ceea ce face ca materialul
respectiv să nu fie potrivit pentru transferul direct la conditiile ex vitro. În acest caz este
necesară o perioadă de pregătire postregenerativă specială pentru asigurarea supravieţuirii ex
vitro.

Etapa 4 – transferul ex vitro şi aclimatizarea

Etapa 4 se referă la transferarea în mediul natural a plantelor din recipientele de
cultură. Efectiv aceasta constă în deschiderea flacoanelor, scoaterea plantelor înrădăcinate,
spălarea resturilor de mediu de pe rădăcini şi plantarea lor în perlit sau amestec de pământ şi
perlit. În primele zile de acimatizare, plantele se menţin acoperite pentru protejare, fiind
udate cu o soluţie nutritivă (de obicei soluţia are aceeaşi compoziţie de substanţe anorganice
care au fot utilizate în formula de bază a mediului de cultură). Treptat soluţia se diluază astfel
că în final, plantele ajung să fie udate cu apă de robinet.
Factorul cel mai critic în momentul şocului de adaptare îl constituie funcţionarea
maximă a rădăcinilor. Este necesară de asemenea protejarea tulpiniţelor împotriva
uscăciunii atmosferice. Acest stadiu poate fi prelungit, uneori, pana la 4 luni . În consecinţă o
importanţă deosebită trebuie acordată momentului transferării plantulelor, din condiţiile in
vitro, în condiţii naturale de viaţă, precum şi modului în care se realizează această trecere,
respectiv realizării unei acomodări treptate a plantulelor, la condiţiile mediului septic.
Cerinţele sunt în general asemănătoare pentru majoritatea speciilor. În condiţii in
vitro plantele cresc într-un mediu cu un înalt grad de umiditate, ca urmare, pentru
aclimatizare a devenit o rutină folosirea camerelor izolate sau a sistemului de ceaţă artificială.
Umiditatea relativă este menţinută la un nivel relativ ridicat, 80%, atât în timpul zilei cât şi în
timpul nopţii.
Este esenţială o spălare a rădăcinilor plantelor cultivate in vitro pentru îndepărtarea
oricărui reziduu de mediu, care reprezintă o excelentă sursă nutriţională pentru bacterii. O
fertilizare cu un conţinut ridicat de fosfor are un rol benefic. Pentru evitarea infecţiilor, în
special în primele stadii ale aclimatizării, când umiditatea este foarte mare, este necesară
folosirea fungicidelor. Şansele de supravieţuire sunt determinate de pierderile prin
transpiraţie, datorită lipsei stratului de ceară şi a activităţii aproape inexistente a stomatelor.
S-a observat că reducerea umidităţii relative la 80% faţă de maximum cât este recomandat la
unele specii este suficientă pentru a asigura formarea stomatelor funcţionale şi acoperirea cu
un strat de ceară suficient pentru a asigura reducerea pierderilor de apă.
 Această reducere a umiditătii relative se realizează prin deschiderea parţială a vasului
sau prin răcirea bazei vasului cu 2 - 3C sub temperatura atmosferică.
Plantele tratate în acest fel, precum şi prin deschiderea repetată, într-un mediu relativ
umed, dar cu condiţii de umbrire, au o rată de supravieţuire mult ridicată.

5: Cultura de meristeme
Meristemele sunt celule mici (cca. 20 µm), izodiametrice, caracterizate prin perete
celular subţire, nucleu mare, citoplasmă densă, vacuolă centrală, activitate metabolică redusă,
dar capacitate susţinută de diviziune. Datorită spaţiilor inter-celulare aproape inexistente, a
lipsei totale a structurilor vasculare -ceea ce asigură absenţa totală a agenţilor patogeni-
precum şi a potenţialului divizionar foarte ridicat (funcţia principală a meristemului fiind
mitoza) explantele de acest tip sunt cel mai mult folosite pentru iniţierea culturilor in vitro

În corpul plantei, ţesuturile meristematice sunt localizate în zone specifice:

 zona meristemelor apicale, fiind punctele de creştere a rădăcinilor şi a tulpinilor

 zona meristemelor secundare (mugurii laterali), situate la nivelul nodurilor, fiind
locul de iniţiere a ramificaţiilor

 în cazul unor specii, zona circulară de ţesut, denumit cambiu, care se regăseşte în
tulpina matură

Cu timpul, celulele produse în meristem devin diferenţiate. Morfologia tipică a unui

meristem apical (în primul stadiu de dezvoltare) şi iniţierea creşterii radiale (al doulea stadiu)
constă în prezenţa a două regiuni tunica şi corpus. Cele două zone ale domului meristematic
(distală şi subdistală ) sunt caracterizate de prezenţa masivă a celulelor meristematice tipice
care asigură creşterea continuă a meristemului, precum şi începutul diferenţierii celulare.
1. tunica – reprezentând învelişul periferic – formată din una sau mai multe straturi de
celule şi în care planurile diviziunii celulare sunt predominant anticlinale.

2. corpus – reprezentând zona centrală formată din celule aranjate neregulat în care
planurile de diviziune celulară variază; anticlinale şi periclinale, deci, dispune atât
perpendicular cât şi paralel cu suprafaţa meristemului. Deci, trei zone principale se
 disting în corpus: (a) zona centrală, generatoare de celule, situată sub tunică; (b) zona
de delimitare, paralelă cu suprafaţa meristemului; şi (c) zona periferială (epiderma)
care se formează în stratul extern al tunicii.

Folosirea numai a domului meristematic pentru iniţierea unei culturi in vitro, deşi pare
avantajoasă (în special, în scopul eliberării de virusuri), ea este, totuşi, mai greu de realizat
practic. Dificultatea constă în tehnica detaşării unei porţiuni de ţesut aşa de mică (fără a-l
distruge sau a-l dezorganiza) şi în implicaţiile majore ce le generează folosirea exclusiv a
unor ţesuturi meristematice cu celule slab diferenţiate. Datorită acestui fapt, în practică prin
noţiunea de meristem se înţelege întreaga zonă apicală, inclusiv cea organogenă.
Zona apicală - constituie sub aspectul diferenţierii citologice, un tot unitar, iar zona
organogenă - zona de expresie a domului meristematic. Apariţia protuberanţelor foliare, ca
urmare a diviziunii periclinale la nivelul zonei organogene întregeşte imaginea meristemului
cu primul său produs, primordiile foliare.

Diferenţierea celulară ce se manifestă plenar în această zonă are ca rezultat şi apariţia

cordoanelor procambiale, care sunt numai în faza de structurare. Executarea prelevării
apexului prin incorporarea zonei organogene (0,3 mm) oferă, în general, condiţii mai bune
pentru detaşarea explanului, incluzând şi proturberanţele primordiilor foliare.

Practic, izolarea de meristeme se realizează sub lupa binoculară, prin îndepărtarea

succesivă a foliolelor şi a primordiilor foliare până la descoperirea domului meristematic.
Acesta este detaşat cu ajutorul bisturiului şi transferat imediat poe mediu de cultură pentru a
nu se oxida.

Cultura in vitro a unor specii agricole şi horticole este, probabil, primul exemplu
de implicare a cuceririlor biologiei celulare în ameliorarea plantelor. Concret, cultivarea
in vitro a materialului vegetal (ţesuturi meristematice, celule, embrioni) permite obţinerea
rapidă a unui număr impresionant de indivizi identici din punct de vedere genetic.
Potenţialul culturii in vitro este imens, însă incomplet exploatat.

Embriogeneza somatică. Seminţe artificiale

 Obţinerea de seminţe artificiale
Embriogeneza: reprezintă procesul iniţierii şi dezvoltării unui organism. Se
distinge faţă de organogeneză prin faptul că rezultă o structură autonomă care nu mai
are legătură prin intermediul sistemului vascular, cu nici o altă structură iniţială. În
practică, termenul include toate procesele (mai mult sau mai puţin sincrone) de
dezvoltare a celor doi poli: apical şi radicular.

Embriogeneza somatică: reprezintă procesul prin care, pornind de la celule somatice,

fără legătură vasculară cu ţesutul de origine, se formează o structură bipolară
asemănătoare embrionului zigotic. Embrionii somatici se pot diferenţia dintr-un
explant vegetal atât direct, din celule somatice organizate cât şi indirect, prin trecerea
printr-o fază de calus.
Organele plantelor se caracterizează prin anumite trăsături comune şi anume: structura
celulară şi tisulară (substratul material şi sediul proceselor biochimice), caracterul
sistemic al organelor, polaritatea, simetria, orientarea în spaţiu şi regenerarea. Caracterul
sistemic este dat de alcătuirea acestora din ansambluri de ţesuturi specifice, subordonate
activităţii biologice proprii organismului şi subordonarea fiziologică a organelor în cadrul
organismului în ansamblul său, ceea ce asigură realizarea funcţiilor sale biologice.
Polaritatea este dată de deosebirea morfologică şi fiziologică între baza plantei şi vârful
ei. Această trăsătură prezintă o importanţă deosebită în procesele de microbutăşire
deoarece indiferent de poziţionarea unui butaş, rădăcinile adventive se vor forma numai
la bază, crescând în jos, iar lăstăririle numai în partea superioară, crescând în sus.
Simetria, necesară pentru menţinerea echilibrului plantei în asigurarea verticalităţii se
realizează de la bază (cazul rozetelor de frunze) sau pe tulpina plantei.

Precondiţiile morfogenezei vegetale

Totipotenţialitatea celulară
Competenţa de regenerare
 potenţialul pentru diviziune
 efectul de poziţie
 predispoziţia

Totipotenţialitatea celulară
 La începutul secolului XX, Gottlieb Haberland (1902) a experimentat cultura
celulelor de tip mezofilian pe un mediu de cultură. Deşi celulele cultivate nu au intrat în
diviziune, acest experiment este important pentru fundamentarea teoriei totipotenţialităţii
celulei vegetale. Totipotenţialitatea celulară se defineşte ca fiind capacitatea genetică a
celulelor vegetale individuale, nucleate, de a regenera un organism vegetal întreg,
structural şi funcţional, în mod direct sau prin intermediul unei faze de calus.
Teoretic, toate celulele somatice sunt totipotente (Steward et al., 1958; Steward,
1968), dar practic există diferenţe mari între diversele tipuri de celule, speciile vegetale,
gradul de dezvoltare a celulelor de acelaşi tip, etc. În stadiul diferenţiat al celulei,
expresia capacităţii totipoţenţei se numeşte competenţă morfogenetică. Incapacitatea unor
specii/grenotipuri de a manifesta totipotenţa celulară este confundată adesea cu lipsa
capacităţii de regenerare. Expresia variabilă a acestei competenţe este doar rezultatul
gradului de specializare şi a statutului fiziologic al celulei respective sau a incapacităţii
cercetătorului de a identifica condiţiile de cultură optime cerute de acest proces.

Competenţa de regenerare
Într-un organism vegetal intact, la nivelul celulelor înalt specializate, nu mai apar
niciodată schimbări, întrucât prin ultraspecializarea lor acestea îşi pierd capacitatea de a
forma plante noi şi deci, aceste celule nu pot deveni morfogenice. Unele celule îşi
păstrează capacitatea pentru diferenţieri particulare sau pentru morfogeneză, sau pot
dobândi această capacitate ca răspuns la un stimul adecvat; acest tip de celule se numesc
celule competente.
Competenţa reprezintă prima condiţie a unei celule spre morfogeneză, adică de a
urma o cale de dezvoltare definită.
In vitro competenţa de regenerare este influenţată direct de genotip (genele
nucleare, genele citoplasmatice şi genele de interacţiune), faza ontogenetică a explantului
iniţial precum şi de condiţiile de cultură (mediul şi factorii fizici) aleşi. Toţi aceşti facori
sunt folosiţi în stabilirea unui răspuns morfogenic, relativ comun, în cadrul unei specii
vegetale.
  potenţialul pentru diviziune- reprezintă precondiţia esenţială în
alegerea explantului iniţial, fiind definit de prezenţa unei capacităţi de
diviziune ridicată şi o plasticitate morfogenetică pronunţată
 efectul de poziţie – în 1878 Vöchting sublinia importanţa poziţiei unei
celule în organism demonstrând că destinul ei este în funcţie de poziţia
sa (teoria proximităţii celulare). Deşi toate celulele specializate sunt
derivate dintr-o celulă iniţială (celula ou) nediferenţiată, dar care se
divide, forma şi polarizarea celulelor, a ţesuturilor şi respectiv, a
organelor vegetale ale unui organism, este stabilită încă din faza
embrionară. Stadiul de diferenţiere odată fixat, are un rol determinant
în evoluţia ulterioară a explantului prelevat. Astfel, explantele
prelevate din partea inferioară formează muguri vegetativi (lăstari) în
proporţie de 100 %, explantele din zona mediană formează muguri în
procent de aproximativ 25 % care evoluează spre lăstari floriferi iar
explantele prelevate din zona floriferă, sunt capabile să regenereze, pe
substratul de cultură, direct structuri florale.
 predispoziţia- este realizată prin utilizarea ţesuturilor tinere, aflate în
creştere (de exemplu agregate celulare friabile periclinale, celule mari
nediferenţiate din coleoriză, mezocotil, apex radicular, etc.).

Organogeneza directă

Explant primar Meristemoid Primordii de organe

Organogeneza indirectă

Calus Meristemoid
Primordii de organe
Explant primar
 Formarea organelor de novo prin intermediul organogenezei indirecte poate duce
la creşterea posibilităţii de introducere a variaţiei în constituţia cromozomială. De
exemplu, schimburi poliploidice la nivelul celulelor aflate în faza de calus şi astfel, poate
determina apariţia unor organe care să prezinte atât variaţii fiziologice cât şi morfogenice.
Pentru cercetările care sunt dirijate în scopul determinării căilor fizio-chimice a
procesului de organogeneză există un alt motiv care necesită reducerea sau măcar
minimalizarea acestui tip de dezvoltare organogenetică. Prezenţa unui stadiu de calus
aflat în diviziune determină o complicare a analizelor evenimentelor moleculare care
însoţesc şi care pot determina producţia organelor de novo. Grupurile de celule care în
mod particular sunt destinate pentru a deveni organogenice se găsesc într-un număr
relativ redus într-o masă mare de celule de calus aflate în diviziune, ceea ce limitează
foarte mult capacitatea de analiză a fiziologiei şi chimiei specifice acestor celule
(Schwartz şi Beaty, 1996).
Organogeneza directă se realizează fără o fază intermediară de calus, secvenţa
evenimentelor sintezei organelor de novo fiind următoarea:
- explantul de iniţiere
- meristemoidul
- primordiul organului.
Cea mai mare diferenţă dintre cele două căi de sinteză de novo o reprezintă
prezenţa sau absenţa unui stadiu intermediar detectabil de calus. Ţesutul de calus
conţinând celule care au fost diferenţiate în forme mai puţin specializate din punct de
vedere morfologic şi care sunt foarte flexibile schimbărilor, pot servi ca material de
pornire pentru organogeneza de novo. În absenţa unui stadiu intermediar de calus,
celulele prezente în interiorul explantului au capacitatea de a acţiona ca precursori direcţi
ai noului primordiu. (pentru exemple de organogeneză directă sau indirectă pornind atât
de la explante de tip meristematic cât şi nemeristematic, în sisteme diferite de cultură,
vezi Hicks, 1980).
 Culturile în care se induce organogeneza sunt folosite ca modele sistem pentru a
determina evenimentele cauzale prin care sunt produse rădăcinile şi tulpinile în mod
direct, iar prin generalizare, de a da răspunsuri proceselor morfogenice. Într-un astfel de
model, procesul de organogeneză este împărţit în câteva faze, conform schemei adaptate
după Christianson şi Warnick, (1985).
competenţă determinare

EXPLANT ORGAN
(regenerare)
dediferenţiere inducere diferenţiere (rediferenţiere)

Punctul de interes în reprezintă cele două faze iniţiale care preced faza de
diferenţiere, adică de pierderea caracterului de specializat. Aceste faze cuprind
evenimente care încep cu dediferenţierea, ceea ce duce la obţinerea competenţei, urmată
de iniţiere care culminează cu stadiul complet de determinare. Diferenţierile morfologice
şi de dezvoltare ale organului nou format pot duce la realizarea structurii funcţionale
dorită. Primele două faze ale modelului presupun evenimente care se desfăşoară înaintea
morfogenezei (Hicks, 1980). Embrionii, meristemele apicale, organele primordiale şi
straturile de celule ale organelor mature sau fragmente complexe ale organelor mature,
chiar organe intacte şi protoplaşti, pot fi folosiţi ca explantele de iniţiere.

Dediferenţierea (după Schwartz şi Beaty, 1996)

Procesul de dediferenţiere presupune reversia spre un stadiu mai flexibil, plastic,
care poate să dea sau nu naştere unui ţesut de tip calus. În cazul organogenezei directe,
celulele competente care nu au produs calus pot fi considerate ca singurele implicate în
formarea organelor progenitoare, ceea ce presupune că aceste celule previn procesele de
dediferenţiere, fie în mod individual, fie în grupuri mici destinate de a produce noi
primordii. Explantele foliare de Convolvulus arvensis L. produc rădăcini şi lăstari prin
intermediul unei căi organogenice indirecte care implică procese de dediferenţiere ce duc
la formarea unei cantităţi limitate de calus din care sunt generate organe noi (Christianson
şi Warnick, 1983). Rezultatul completării acestei prime etape constă în obţinerea
statutului de competenţă a explantului iniţial, statul care se caracterizează prin capacitatea
de a răspunde la stimulii organogenetici. Atingerea nivelului de competenţă de către
ţesutul implicat nu reprezintă totdeauna un proces realizat într-o singură etapă, uneori
fiind necesară o etapă intermediară în care se folosesc fitoregulatorii de creştere. De
exemplu, în cazul calusului de Medicago sativa care a fost cultivat timp de 4 zile pe un
mediu cu o concentraţie relativ ridicată de chinetină şi o concentraţie scăzută de 2,4-D au
fost obţinute rădăcini. Lăstarii sunt produşi când calusul este tratat în acelaşi regim de
cultură, cu excepţia faptului că raportul regulatorilor de creştere este schimbat
(concentraţii mari de 2,4-D şi scăzute de chinetină). Tratamentul cu fitoregulatori de
creştere urmat de transferul pe un mediu lipsit de regulatori de creştere nu este suficient
ca să aducă ţesuturile în faza a doua de iniţiere, fază cerută pentru producerea rădăcinilor
sau a tulpinilor (Walker et al., 1979). Este necesară o anumită mărime cu o limită minimă
de 105 µm, precum şi o mărime minimă a diametrului agregatelor celulare de calus
pentru a fi competente pentru iniţierea morfogenezei.

C. Regenerare prin embriogeneză somatică (nezigotică)

Embriogeneza somatică a fost observată pentru prima dată de Reinert (1958) şi

apoi de Steward şi Mearks (1958). Regenerarea prin embriogeneză somatică se distinge
evident de regenerarea prin meristeme datorită unor caracteristici specifice de dezvoltare
şi anume:
 Formarea unui embrion (somatic dar şi zigotic) începe de la o singură celulă şi
trece obligatoriu prin fazele globulară, cordiformă, torpedou şi de maturare (faza
cotiledonală); rezultatul este o structură bipolară, deţinând două tipuri de
meristeme: radicular, la un capăt şi, caulinar, la celălalt capăt, în timp ce
organogeneza dă naştere numai la un singur tip din cele două meristeme.
 Embrionii somatici trebuie să îndeplinească obligatoriu criteriul de bază al unei
structuri bipolare, adică formarea unei structuri vasculare proprii şi izolate; în
cazul organogenezei, vasele conducătoare asigură continuitatea legăturii cu ţesutul
original (calusul).
 Proteinele specifice care apar în cotiledoanele embrionilor somatici nu au fost
identificate în frunzele regenerate din lăstarii adventivi (Crouch, 1982).
 Embriogeneza in vitro, pornind de la celule somatice, trebuie văzută ca o
proprietate generală specifică plantelor superioare. Când embrionii somatici sunt obţinuţi
pornind de la o singură celulă procesele decurg de la omogen şi general spre heterogen şi
particular, fenomenul demonstrând indiscutabil totipotenţialitatea celulară; prezenţa unui
program de dezvoltare foarte bine conservat este înnăscut într-un număr mare de tipuri de
celule. Culturile de celule embriogenice permit ca întreg genomul vegetal să poată fi
manipulat genetic prin tehnicile biologice. Odată ce celulele proliferează, pot fi
modificate genetic, iar plantele regenerate din astfel de celule modificate pot fi
reconstituite plante modificate.

Embriogeneza somatică
Un embrion, zigotic, somatic, (direct sau indus), este definit ca “un individ nou,
rezultat dintr-o singură celulă, care nu are legătură vasculară cu ţesutul mamă” (Haccius,
1978) şi este “stadiul primar multicelular al unui individ, stadiu care are loc înainte de
dezvoltarea structurilor şi a organelor caracteristice a unei specii date. În majoritatea
organismelor, embrionul este o entitate distinctă morfologic care funcţionează ca un
stadiu intermediar în procesul de tranziţie de la viaţa gametofitică la cea sporofitică”
(Gray, 1996). La speciile superioare, tipic este embrionul zigotic, care se dezvoltă în
interiorul seminţei. Acest tip de embrion se formează ca produs al fuziunii gametice, în
urma reproducerii sexuale, fiind denumit embrion zigotic.
Caracteristic speciilor vegetale este faptul că din ţesuturi nediferenţiate pot să
formeze embrioni nezigotici, perfect formaţi morfologic şi funcţional. Deoarece acest tip
de embrioni se formează apomictic (pe cale asexuată), plantulele care se dezvoltă din ei
sunt identice genetic cu planta mamă. Tipurile de celule din care pot să apară astfel de
formaţiuni aparţin diferitelor ţesuturi somatice şi sunt într-un număr diferit atât în faza
gametofitică cât şi sporofitică a ciclului vegetal. Iniţial, embrionii somatici au fost
denumiţi embrioizi, pentru a sublinia diferenţa faţă de embrionii zigotici şi din păcate
acest termen mai este menţinut în anumite lucrări. Diferenţa dintre embrionul zigotic şi
cel somatic nu este foarte bine înţeleasă şi descrisă în literatură.
 Tabel.6. Clasificarea embrinilor (după Bhojwani şi Razdan, 1983)
1. Embrioni zigotici Formaţi prin fertilizarea celulelor ou sau a zigotului

Formaţi din alte celule decât cele zigotice

2. Embrioni nezigotici: - formaţi de celulele sporofitice, cu excepţia
- embrioni somatici zigotului
- embrioni somatici formaţi direct din alţi
- embrioni adventivi embrioni sau organe
- formaţi din celule ou nefertilizate
- embrioni partenogenetici formaţi de gametofilul mascul (microspori,
- embrioni androgenetici grăunciori de polen)

Datorită faptului că majoritatea acestor tipuri de embrioni pot fi manipulaţi în

culturile in vitro, sistemele de cultură embriogenice sunt folosite ca bază în metodologiile
destinate îmbunătăţirii calitative a plantelor, deoarece permit nu numai clonarea prin
propagarea vegetativă, dar şi schimbări specifice şi direcţionate care pot fi introduse în
indivizi de elită selecţionaţi. Celulele individuale modificate sau embrionii pot fi după
aceea multiplicaţi eficient in vitro, într-un număr foarte mare de exemplare înainte de
dezvoltarea plantei. Aceasă modalitate de manipulare genetică elimină consecinţele
nedorite ale reproducerii sexuale (recombinarea genetică în masă şi ciclurile de selecţie
cerute), astfel încât tehnologia de ameliorare este net superioară prin reducerea timpului
şi a efortului de execuţie.

Condiţiile de creştere a embrionilor somatici versus embrioni zigotici

În sămânţă, în ţesutul nucelar, embrionul se formează ca rezultat al fertilizării unei

celule ou. Unele specii au tendinţa de a forma mai mult de un embrion, ca urmare a
diviziunii celulei embrionice primare, rezultând poliembrioni (la unele varietăţi de
Citrus).
 Embrionii somatici pot apărea uneori şi în natură, din ţesut ovular fără fuziunea
unor celule sau nuclee, proces denumit apomixie. Originea lor este unicelulară (dintr-o
celulă somatică diploidă a sacului embrionar, fiind denumiţi apospori- sau dintr-o celulă
nucelară, fiind denumiţi embrioni nucelari). Mai rar, embrionii somatici se formează
direct pe frunzele unor specii ca de exemplu Kalanchoe, Ranunculus Asplenium, etc.
În sămânţă, ţesutul nutritiv, endospermul, îmbracă embrionul zigotic aflat în
dezvoltare. În primele faze ale embriogenezei, substanţele nutritive ajung la embrionul
zigotic atât prin celulele suspensoare cât şi prin suprafaţa embrionului propriu-zis. În
funcţie de specie pot să apară diferenţe în modul de nutriţie prin suspensor sau embrionul
propriu-zis, de la o specie la alta. Spre deosebire de aceasta, în cazul embrionilor somatici
faptul că se dezvoltă fără ţesut protector (ei nu sunt îmbrăcaţi de un ţesut precum
endospermul), face ca ei să nu fie subordonaţi unui regim înalt controlat şi specializat
(Gray şi Purohit, 1991). Cel mai adesea, suspensorul este singura legătură între embrion
şi mediul de cultură. Aceasta demonstrează că suspensorul poate servi ca mod de
asigurare a nutriţiei necesare şi că endospermul nu este absolut necesar în timpul
embriogenezei şi a germinaţiei (Gray, 1996).

Ce este o sămânţă ?

O sămânţă vegetală este o structură generativă, alcătuită din embrion, endosperm

şi un înveliş de protecţie denumit testa. La dicotiledonate embrionul este alcătuit din două
cotiledoane ataşate unei axe centrale. Partea apicală, plumula, creşte sub formă de lăstar
iar partea bazală este alcătuită din hipocotil şi radicelă, viitorul sistem radicular.
Endospermul asigură suportul nutritiv pe durata germinaţiei, până când plantula este
capabilă de fotosinteză. Testa, asiguă protecţia embrionului pe durata germinaţiei fiind
îndepărtată pentru eliberarea rădăcinuţei şi apoi a tulpiniţei.

Ce este o sămânţă artificială?

Seminţele arificiale au fost introduce înjurul anilor 1970 ca analog seminţelor

obişnuite. Acest produs se adresează speciilor care nu produc seminţe viabile,
reprezentând metoda de multiplicare a acestora. Datorită dimensiunilor lor mici,
seminţele artificiale prezintă şi avantaje în ceea ce priveşte manipularea, depozitarea,
transportul şi plantarea lor.

Cum se obţine o sămânţă artificială?

Seminţele artificiale se obţin prin încapsularea unui propagul vegetal

(“embrionul“) într-un matrix format dintr-un material ce permite creşterea lor ulterioară
într-o plantă. Propagulele vegetale utilizate în obţinerea seminţelor artificiale pot fi
meristeme sau, cele mai folosite, embrionii somatici obţinuţi din culturi aseptice prin
multiplicarea in vitro, la scară industrială. “Endospermul” este realizat dintr-un hidrogel
obţinut natural din alge (agar, carageenan sau alginat), diferite plante (latexuri, guar) sau
din microorganisme (dextran, gellan sau gumă xantan.). La încapsulare se pot adăuga şi
elemente nutritive, fitohormoni sau pesticide şi fungicide. Bila de alginat, conţinând
embrionul somatic, este drajată (“testa“ seminţei artificiale). În cultură, aceste propagule
vegetale pot fi crescute relativ uşor, pe medii nutritive,dând naştere unor plante
individuale.

Avantajele seminţelor artificiale

Tehnologia seminţelor artificiale prezintă un real potenţial de asigurare a uneii

surse de material vegetal valoros prin combinarea beneficiilor multiplicării vegetative la
scară cu asigurarea uniformităţii genetice foarte ridicată( ca urmare a clonării in vitro) şi a
posibilităţilor de conservare pe termen lung. Seminţele artificiale prezintă potenţial
pentru agricultură prin faptul că tehnologia de obţinere este relativ simplă, ieftină,
pretabilă pentru producţia industrială. (Gray şi Purohit, 1991; Redenbaugh et al., 1991;
Redenbaugh, 1993). Tehnologia seminţelelor artificiale este folosită şi pentru obţinerea
individuală de plante modificate genetic.