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revisión

La secuencia de los secuenciadores: La historia de secuenciación de ADN

James M. Heather • , cadena Benjamin

División de la infección y la inmunidad, UCL cruciforme de construcción, Gower Street, Londres, Reino Unido

artículo info resumen

Historia del artículo: La determinación de la orden de residuos de ácido nucleico en muestras biológicas es un componente integral de la variedad awide de aplicaciones de
Recibido el 4 de agosto de 2,015 mil
investigación. Sobre el último fi cincuenta años un gran número de investigadores se han dedicado a la producción de técnicas y tecnologías para facilitar esta
Recibida en forma de noviembre de 1 revisado el año 2015 aceptamos 6
hazaña, sequencingDNA y RNAmolecules. Esta escala de tiempo ha sido testigo de enormes cambios, moviéndose de secuenciación de oligonucleótidos
personas de noviembre de el año 2015 Disponible en Internet el 10 de
cortos a millones de bases, de luchar hacia la deducción de la secuencia de codificación de un solo gen a la rápida secuenciación del genoma availablewhole
noviembre de el año 2015
andwidely. En este artículo se atraviesa esos años, iteración a través de las diferentes generaciones de la tecnología de secuenciación, destacando algunos de
los principales descubrimientos, los investigadores y las secuencias a lo largo del camino.
palabras clave:

RNA
DNA © 2015 Los Autores. Publicado por Elsevier Inc. Este es un artículo de acceso abierto bajo la licencia CC BY
Secuenciación ( http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ ).
Historia

secuenciador

Contenido

1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1

2. La secuenciación del ADN de primera generación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1

3. La secuenciación de ADN de segunda generación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3

4. La secuenciación del ADN de tercera generación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5

5. Conclusiones. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6

Referencias. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6

1. Introducción La secuenciación de ADN 2. Primera generación

“... [ UNA] conocimiento de las secuencias puede contribuir mucho a nuestra comprensión de la Watson y Crick resueltos famoso la estructura tridimensional del ADN en 1953, trabajando a

materia viva. ” partir de datos cristalográficos producidos por Rosalind Franklin y Maurice Wilkins [2,3] , Que

[Frederick Sanger [1] ]
El orden de ácidos nucleicos en las cadenas de polinucleótidos en última instancia contiene la
información de las propiedades hereditarias y bioquímicos de la vida terrestre. Por lo tanto la
capacidad de medir o deducir tales secuencias es imprescindible para la investigación biológica. Esta
revisión se ocupa de cómo los investigadores a lo largo de los años han abordado el problema de
cómo secuenciar el ADN, y las características que los de fi ne cada generación de metodologías para
hacerlo.
contribuyó a un marco conceptual para tanto la replicación del ADN y las proteínas que codifican en
los ácidos nucleicos. Sin embargo, la capacidad de ' leer ' o secuencia de ADN no siguió por algún
tiempo. No parecían estrategias desarrolladas para inferir la secuencia de cadenas de proteínas para
aplicar fácilmente a las investigaciones de ácido nucleico: las moléculas de ADN eran mucho más
largos y hechas de menos unidades que eran más similares entre sí, por lo que es más difícil de
distinguir entre ellos [4] . Nuevas tácticas necesarias para desarrollarse. Los esfuerzos iniciales se
centraron en la secuenciación de las poblaciones más fácilmente disponibles de especies de ARN
relativamente puros, tales como ribosomal microbiano o de ARN de transferencia, o los genomas de
bacteriófagos de cadena simple de ARN. No sólo podrían estos ser fácilmente producidos a granel en
cultivo, sino que también no se complican por una cadena complementaria, y son a menudo
considerablemente más corto que las moléculas de ADN eucariotas. Además, RNasa enzimas
capaces de cortar las cadenas de ARN en especí fi sitios c ya eran conocidos

• Autor correspondiente.
Dirección de correo electrónico: James.Heather.10@ucl.ac.uk (JM Heather).

http://dx.doi.org/10.1016/j.ygeno.2015.11.003
0888-7543 / 2015 © los autores. Publicado por Elsevier Inc. Este es un artículo de acceso abierto bajo la licencia CC BY ( http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ ).
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y disponible. A pesar de estas ventajas, el progreso sigue siendo lento, ya que las técnicas disponibles
para los investigadores - prestado de la química analítica - sólo fueron capaces de medir la composición
de nucleótidos, y no ordenar [5] . Sin embargo, mediante la combinación de estas técnicas con los
tratamientos de ribonucleasa selectivos para producir fragmentos de ARN total y parcialmente
degradadas [6] (E incorporando la observación de que el ARN contenía una base nucleotídica diferente [7]
), En 1965 Robert Holley y sus colegas fueron capaces de producir la fi primer conjunto secuencia de
ácido nucleico, que de ARNt de alanina a partir de Saccharomyces cerevisiae [ 8] . En paralelo, Fred
Sanger y sus colegas desarrollaron una técnica relacionada basado en la detección de fragmentos de
digestión parcial radiomarcados después del fraccionamiento en dos dimensiones [9] , Lo que permitió a
los investigadores a añadir de manera constante a la creciente charco de ribosomas y la transferencia
de secuencias de ARN [10,11,12,13,14] . También era mediante el uso de este 2-D fractionationmethod
laboratorio thatWalter Fiers' fue capaz de producir la fi primera completa que codifica la proteína de
secuencia de genes en

1972, la de la proteína de cubierta del bacteriófago MS2 [15] , Seguido cuatro años más tarde por su
completa del genoma [dieciséis] .
Fue en esta época que varios investigadores comenzaron a adaptar sus métodos con el fin de
secuenciar el ADN, ayudado por el reciente puri fi cación de bacteriophageswithDNAgenomes,
proporcionando una fuente ideal para newprotocols de prueba. Haciendo uso de la observación de
que Enterobacterias fagos
λ poseída 5 ' sobresaliente ' cohesivo ' extremos, Ray Wu y Dale Kaiser utilizan ADN polimerasa para fi ll
los extremos en con nucleótidos radiactivos, que suministran cada nucleótido de uno en uno y
midiendo la incorporación de deducir la secuencia [17,18] . No pasó mucho tiempo antes de que este
principio se generalizó a través del uso de la especificación fi c oligonucleótidos para cebar la ADN
polimerasa. La incorporación de nucleótidos radiactivos entonces podría utilizarse para inferir el
orden de los nucleótidos en cualquier lugar, no sólo en los extremos finales de los genomas de
bacteriófagos [19,20,21] . Sin embargo, la determinación real de bases todavía estaba restringida a
tramos cortos de ADN, y todavía típicamente implicado una cantidad considerable de procedimientos
de química y de fraccionamiento de análisis.

El siguiente cambio práctico hacer un gran impacto fue la sustitución de fraccionamiento 2-D
(que a menudo consistía en tanto electroforesis y cromatografía) con una sola separación por la
longitud del polinucleótido mediante electroforesis a través de geles de poliacrilamida, que
Figura 1. tecnologías de secuenciación de primera generationDNA. Ejemplo de ADN a ser secuenciado (a) se ilustra de someterse
proporcionó mucho mayor poder de resolución. Esta técnica se utilizó en dos en Florida sin embargo
a cualquiera de Sanger (b) o Maxam - Gilbert (c) secuenciación. (B): Sanger de
influyente protocolos complejos a partir de mediados de la década de 1970: Alan Coulson y Sanger ' más ' de terminación de cadena ' secuenciación. radio- o Florida etiquetados uorescently-nucleótidos ddNTP de un tipo dado - que
y menos ' sistema en 1975 y la técnica de escisión química de Allan Maxam Gilbert andWalter [22,23] . una vez incorporada, prevenir la extensión adicional - se incluyen reacciones de polimerización inDNA a bajas

La técnica más utilizada andminus ADN polimerasa para sintetizar a partir de un cebador, la
incorporación de nucleótidos radiomarcados, antes de realizar dos reacciones de polimerización de
segunda: una ' más ' de reacción, inwhich sólo un único tipo de nucleótido está presente, por lo tanto
todas las extensiones terminará con esa base, y una ' menos '
de reacción, en la que se utilizan tres, que produce secuencias hasta la posición antes de que el
siguiente nucleótido que falta. Mediante la ejecución de los productos en un gel de poliacrilamida y la
comparación entre los ocho carriles, uno es capaz de inferir la posición de los nucleótidos en cada
concentraciones (cebado de un 5 ' secuencia, no mostrado). Por lo tanto en cada una de las cuatro reacciones, fragmentos
de secuencia se generan con 3 ' truncamientos como un ddNTP se incorpora al azar en un caso particular de que la base
(subrayado 3 ' personajes terminal). (C): Maxam y Gilbert de ' secuenciación química ' método. ADN debe fi primer ser
etiquetado, por lo general mediante la inclusión de P radiactivo 32 en su 5 ' resto fosfato (que se muestra aquí por Ⓟ). Diferentes
tratamientos químicos se utilizan entonces para eliminar selectivamente la froma base pequeña proporción de sitios de ADN.
La hidracina elimina bases frompyrimidines (citosina y timina), mientras que de hidrazina en presencia de altas
concentraciones de sal sólo puede eliminar los fromcytosine. Acid puede utilizarse entonces para eliminar los frompurines
bases (adenina y guanina), con sulfato de dimetilo se utiliza para atacar guaninas (aunque adenina también se verá afectada
en un grado mucho menor). Piperidina se utiliza entonces para escindir la cadena principal de fosfodiéster en el sitio
abásico, produciendo fragmentos de longitud variable. (D): Fragmentos fromeithermethodology generados entonces puede
ser visualizado a través de electroforesis en un gel de poliacrilamida de alta resolución: secuencias son entonces inferirse

posición en la secuencia de cubierta (excepto para Aquellasque liewithin un homopolímero, es decir un por lectura ' arriba '

funcionamiento de la misma de nucleótidos). Se estaba utilizando esta técnica que Sanger y sus colegas
secuenciaron el fi genoma de ADN primero, el de bacteriófago φ X174 (o ' PhiX ', que goza de una posición
el gel, ya que los fragmentos de ADN más cortas migran más rápido. En la secuenciación de Sanger (izquierda) la secuencia
en muchos laboratorios de secuenciación hoy en día como un genoma control positivo) [24] . Mientras que se infiere por fi Nding el carril en el que la banda está presente para un sitio dado, como el 3 ' terminación labelledddNTP

aún usando geles de poliacrilamida para resolver los fragmentos de ADN, la técnica de Maxam y Gilbert
difería signi fi cativamente en su enfoque. En lugar de depender de la ADN polimerasa para generar
fragmentos, el ADN radiomarcado se trata con productos químicos que rompen la cadena en especí fi bases
c; después de correr en un gel de poliacrilamida de la longitud de los fragmentos escindidos (y por tanto
la posición de especi fi nucleótidos c) se pueden determinar y por lo tanto la secuencia de inferido (ver Figura
1 , derecho). Este fue el fi técnica de primera a ser ampliamente adoptada, y por lo tanto podría ser
considerado como el verdadero nacimiento de ' fi primera generación ' Secuencia ADN.
Sin embargo, el gran avance que cambió para siempre el progreso de la tecnología de
secuenciación de ADN se produjo en 1977, con el desarrollo de Sanger ' de terminación de cadena ' o
la técnica didesoxi [25] . La técnica de terminación de cadena hace uso de análogos químicos de los
desoxirribonucleótidos (dNTPs) que son los monómeros de DNA
corresponde a la base en que position.Maxam - secuenciación Gilbert requiere un pequeño paso lógico adicional: Ts y como
puede inferirse directamente de una banda en la pirimidina o purina carriles respectivamente, mientras que G y C se indican
por la presencia de bandas dobles en el G y + carriles A G, o C y C + T carriles respectivamente.
hebras. Didesoxinucleótidos (ddNTPs) carecen de la 3 ' grupo hidroxilo que se requiere para la
extensión de cadenas de ADN, y por lo tanto no puede formar un bondwith el 5 ' fosfato de la siguiente
dNTP [26] . Mezcla ddNTPs marcados radiactivamente en una reacción de extensión de ADN a una
fracción de la concentración de dNTPs resultados estándar en cadenas de ADN de cada longitud
posible siendo producido, como los nucleótidos didesoxi se incorporen al azar como la hebra se
extiende, deteniendo la progresión adicional. Mediante la realización de cuatro reacciones paralelas
que contienen cada base ddNTP individual y la ejecución de los resultados en cuatro carriles de un gel
de poliacrilamida, uno es capaz de utilizar la autorradiografía para inferir lo que la secuencia de
nucleótidos en la plantilla original
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fue, ya que habrá una banda radiactiva en el carril correspondiente a esa posición del gel (ver Figura
1 , izquierda). Whileworking en el mismo principio que otras técnicas (el de la producción de todas las
posibles secuencias de longitud incrementales y etiquetar el nucleótido final), la precisión, robustez y
facilidad de uso llevaron al método de terminación de cadena didesoxi - o simplemente,
secuenciación Sanger - para convertirse en la tecnología más común utilizada para la secuencia de
ADN en los años venideros.
Se realizó una serie de mejoras a secuenciación de Sanger en los años siguientes, que
involucró principalmente la sustitución de phosphoor tritrium-radiomarcaje con Florida uorometric
detección basada (permitiendo que la reacción se produzca en un recipiente en vez de cuatro) y
mejora de la detección a través de electroforesis basado capilar. Ambas de estas mejoras
cambio de paradigma en que permitieron la paralelización masa de reacciones de secuenciación,
contribuyeron al desarrollo de máquinas de secuenciación de ADN cada vez más automatizados [27,28,29,30,31,32,33]
Y, posteriormente, la
fi cultivo primera de las máquinas de secuenciación de ADN comercial [34] que se utilizaron para
secuenciar los genomas de especies cada vez más complejos.
Estas fi primera generación máquinas de secuenciación de ADN producen lee poco menos de un
kilobase (kb) de longitud: el fin de analizar más largos fragmentos investigadores hecho uso de
técnicas tales como ' secuenciación escopeta ' donde se clonaron fragmentos de ADN que se solapan
y se secuenciaron por separado, y luego se ensamblan en una secuencia contigua de largo (o ' contig ')
in silico [35,36] . El desarrollo de técnicas tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) [37,38] (CCD) sensor debajo de los pozos. Esta distribución era capaz de producir alrededor de 400 lecturas -
y tecnologías de ADN recombinante [39,40] ayudado aún más la revolución genómica por
providingmeans de la generación de las altas concentraciones de especies de ADN puros necesarios
para la secuenciación. Las mejoras en la secuenciación también se produjeron por rutas menos
directas. Por ejemplo, la ADN polimerasa fragmento Klenow -
un fragmento de la Escherichia coli ADN polimerasa que carece de 5 ' a 3 '
actividad exonucleasa, producido a través de la digestión con proteasas de la enzima nativa [41] - originalmente ampliamente disponible para los consumidores fue la máquina original 454, llamado el GS 20, que
se había utilizado para la secuenciación debido a su capacidad para incorporar ddNTPs ef fi cientemente.
Sin embargo, los genomas secuenciados y herramientas más para la manipulación genética siempre y
cuando los recursos para fi nd polimerasas que eran mejores para el alojamiento de los moeities químicas
adicionales de la cada vez modi fi ed dNTPs utilizados para la secuenciación [42] . Eventualmente,
secuenciadores didesoxi nuevos - tales como la gama ABI PRISM desarrollado la investigación de
fromLeroyHood, producido byAppliedBiosystems
[43] , Lo que permitió la secuenciación simultánea de cientos de muestras
[44] - llegó a ser utilizado en el Proyecto Genoma Humano, ayudando a producir el fi proyecto de
primer año que las empresa gigantesca antes de lo previsto [45,46] .
La secuenciación de ADN 3. Segunda generación
Concurrentwith el desarrollo de esfuerzos de secuenciación didesoxi a gran escala, apareció
otra técnica que sentó las bases para la fi onda primera en la próxima generación de secuenciadores
de ADN. Este método marcadamente diferenciado de los métodos existentes en que no dedujo de
identidad de nucleótidos o mediante el uso de radio- Florida dNTPs u oligonucleótidos uorescently
marcado antes de visualizar con la electroforesis. En lugar investigadores utilizaron un método
luminiscente recientemente descubierta para la medición de la síntesis de pirofosfato: Este consistía
en un proceso de dos enzima en la que se utiliza ATP sulfurilasa para convertir pirofosfato en ATP,
que se utiliza entonces como el sustrato para la luciferasa, produciendo así luz proporcional a la
cantidad de pirofosfato [47] . Este enfoque se utilizó para inferir secuencia midiendo la producción de
pirofosfato ya que cada nucleótido se lava a través del sistema a su vez sobre el af ADN molde fi fijo a
una fase sólida [48] . Tenga en cuenta que a pesar de las diferencias, tanto dideoxi de Sanger y este
método son pirosecuenciación ' secuencia-bysynthesis '( SBS) técnicas, ya que ambos requieren la
acción directa de la ADN polimerasa para producir la salida observable (en contraste con la Maxam - Gilbertracimos en ciclos. En cada ciclo, la identidad del nucleótido que incorpora se puede controlar con un
técnica). Esta técnica de pirosecuenciación, iniciada por Pål Nyrén y colegas, poseía un número de
características que se considera bene fi cial: podría ser realizada usando nucleótidos naturales (en
lugar de la fuertemente-modi fi ed dNTPs utilizados en los protocolos chaintermination), y se observa
en tiempo real (en lugar de requerir largos electroforesis) [49,50,51] . mejoras posteriores incluyeron
3
unir el ADN a paramagnética perlas, y enzimáticamente dNTPs no incorporados degradantes para
eliminar la necesidad de largas etapas de lavado. La principal dif fi cultad planteado por esta técnica
es fi Nding cómo muchos de los mismos nucleótidos que hay en una fila en una posición dada: la
intensidad de la luz liberada corresponde a la longitud del homopolímero, pero el ruido producen una
lectura no lineal por encima de cuatro o fi cinco nucleótidos idénticos [51] . Pirosecuenciación más
tarde fue licenciado a 454 Life Sciences, una compañía de biotecnología fundada por Jonathan
Rothburg, donde se convirtió en el fi primer gran éxito comercial ' secuenciación de próxima generación '(
) La tecnología NGS.
Las máquinas de secuenciación producidas por 454 (más tarde adquirido por Roche) eran un
aumentando enormemente la cantidad de ADN que puede ser secuenciado en cualquier una carrera [52]
. Bibliotecas de DNAmolecules son fi primer unido a perlas a través de secuencias adaptadoras, que
luego se someten a una emulsión de agua-en-aceite PCR (emPCR) [53] para recubrir cada perla en
una población de ADN clonal, donde idealmente en promedio una molécula de ADN termina en un
talón, que Ampli fi es en su propia gotita en la emulsión (véase Figura 2 A y C). Estas perlas
recubiertas con ADN se lavan después sobre una placa de reacción picolitros que fi ts una perla por
pocillo; pirosecuenciación entonces se produce como pequeñas enzimas y dNTPs de talón ligado se
lavan sobre la placa, y la liberación de pirofosfato se mide usando un dispositivo cargado pareja
500 pares de bases (pb) de longitud, para themillion o menos pozos que se esperaría para contener
perlas adecuadamente recubiertos clonalmente [52] . Esta paralelización aumentó el rendimiento de
los esfuerzos de secuenciación por órdenes de magnitud, por ejemplo permitiendo a los
investigadores secuencia completamente el genoma de una sola humana - que la pertenencia
pionero estructura toDNA, JamesWatson - mucho más rápido y más barato que un esfuerzo similar
por el equipo de secuenciación de ADN empresario Craig Venter mediante la secuenciación de
Sanger el año anterior [54,55] . los fi primera secuenciación (HTS) de la máquina de alto rendimiento
más tarde fue sustituido por el 454 GS FLX, que ofrecía un mayor número de lecturas (por tener más
pozos en el ' PicoTiter ' placa), así como datos de mejor calidad [56] . Este principio de la realización de
un gran número de reacciones de secuenciación en paralelo en una escala del micrómetro - a
menudo hecho posible como resultado de las mejoras en la microfabricación y de alta resolución de
imagen - es lo que vino a de fi ne la segunda generación de secuenciación de ADN [57] . Un número
de técnicas de secuenciación paralelas surgido tras el éxito de 454. El más importante entre ellos es
sin duda el método Solexa de la secuenciación, que más tarde fue adquirida por Illumina [56] . En
lugar de parallelising mediante la realización de emPCR basado en perlas, moléculas de ADN
adapterbracketed se hacen pasar sobre un césped de oligonucleótidos complementarios unido a una Florida
owcell; una fase sólida posterior PCR produce racimos vecinas de poblaciones clonales de cada uno
del original individuo Florida ow de células cadenas de ADN de unión [58,59] . Este proceso ha sido
denominado ' amplificador de puente fi catión ', debido a la replicación de las hebras de ADN que tienen
que arco sobre para cebar la siguiente ronda de polimerización de superficie boundoligonucleotides
vecina (ver Figura 2 b andd)
[56] . Secuenciación en sí se consigue de una manera SBS utilizando Florida fluorescente
' reversible-terminador ' dNTPs, que no puede unirse inmediatamente más nucleótidos como la Florida fluoróforo
ocupa la 3 ' posición hidroxilo; esto debe ser escindido de distancia antes de la polimerización puede
continuar, que permite la secuenciación que se produzca de una manera síncrona [60] . estas modi fi ed
dNTPs y la ADN polimerasa se lavan sobre el cebado, monocatenario Florida De células ow obligado
CCD por el emocionante Florida uorophores con láseres apropiados, antes de la eliminación
enzimática del bloqueo Florida restos fluorescentes y continuación a la siguiente position.While la fi primera
GenomeAnalyzer (GA) machineswere inicialmente sólo capaz de producir muy corto lee (hasta 35 pb
de longitud) que tenían la ventaja de que podían producir de extremo emparejado (PE) de datos, en
el que la secuencia en ambos extremos de cada grupo de ADN se grabado. Esto se consigue fi primero
la obtención de uno SBS lee de la monocatenario
Florida ow-célula ADN unido, antes de realizar una sola ronda de fase sólida
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extensión del ADN de restante Florida ow-célula oligonucleótidos unidos y extracción de la hebra
secuenciado ya. Habiendo así invertido la orientación de la DNA strands con relación a la Florida De
células ow, se obtiene entonces una segunda lectura desde el extremo opuesto de las moléculas a la
fi en primer lugar. Como las moléculas de entrada son de una longitud aproximada conocida, que
tiene datos de PE proporciona una mayor cantidad de información. Esto mejora la exactitud
whenmapping lee para hacer referencia a secuencias, especialmente a través de secuencias
repetitivas, y ayuda en la detección de los exones empalmados y DNA reordenado o genes
fusionados. La versión estándar Genome Analyzer (GAIIx) fue seguido más tarde por el HiSeq, una
máquina capaz de aún mayor longitud de lectura y la profundidad, y luego el MiSeq, que era un
menor rendimiento (pero menor coste) de la máquina con de respuesta más rápido y ya leer
longitudes [61,62] .
Un número de otras compañías de secuenciación, cada uno recibiendo sus propios
metodologías
fluorescentes novedosas,
nucleótidos también han aparecido
reversible-terminadoras (y de
en los extremos desaparecido)
una reacción deyextensión
tenía impactos
de proceder,
bothwhat experimentos son factibles y themarket en general. En los primeros años de la
secuenciación de segunda generación tal vez la tercera opción importante (junto con la secuenciación
de 454 y Solexa / Illumina)
[63] fue la secuenciación por ligación de oligonucleótidos y sistema de detección (sólido) de Applied
Biosystems (que se convirtió en Life Technologies siguientes una fusión con Invitrogen) [64] . Como
bewashed sobre a su vez, y dNTP incorporationmonitored (por ejemplo a través de pirofosfato o liberación de iones de hidrógeno). racimos obligado flujo de células producidas mediante amplificación puente fi catiónico (d) se puede visualizar mediante la detección de Florida
su nombre indica, SOLiD secuenciado no por síntesis (es decir, catalizada con una polimerasa), pero
por la ligadura, utilizando una ligasa de ADN, la construcción en los principios establecidos
previamente con el de código abierto ' polony ' secuenciación desarrollado en el grupo de George
Church [sesenta y cinco] . Mientras que la plataforma sólido no es capaz de producir la longitud de
lectura y la profundidad de las máquinas de Illumina [66] , Lo que hace más difícil el montaje, se ha
mantenido competitiva sobre una base de coste por la base [67] . Otra tecnología notable basado en
la secuencia por ligación fue completa genómico de ' nanoballs de ADN '
técnica, donde las secuencias se obtienen de manera similar de probeligation pero la generación de
la población clonal de ADN es nuevo: en lugar de una perla o puente ampli fi catiónico, círculo rodante
ampli fi catión se utiliza para generar cadenas largas de ADN que consiste en unidades de repetición
de la secuencia molde bordeada por adaptadores, que luego auto ensamblarse en nanoballs, que
son af fi jos a una diapositiva para ser secuenciados [68] . La última notable plataforma de
secuenciación de segunda generación es el desarrollado por Jonathan Rothburg 454. Después de
salir de Ion Torrent (otro producto de Life Technologies) es el fi primera llamada ' secuenciación
post-luz ' tecnología, ya que no utiliza ninguno Florida fluorescencia ni luminiscencia [69] . De una
variables
sobre
que requieren manera
mediciones y la análoga
eliminación a la secuencia
de terminadores 454,
de ciclo por ciclo.perlas
4 que portan poblaciones clonales de fragmentos de ADN
(producidos a través de un emPCR) se lavan sobre una placa picowell, seguido por cada nucleótido a
su vez; sin embargo la incorporación de nucleótidos no se mide por la liberación de pirofosfato, pero
la diferencia en el pH causado por la liberación de protones (H + iones) durante la polimerización, que
son posibles usando el metal-óxido-semiconductor complementario (CMOS)

pueden leer en una altamente parallelizedmanner: emPCR-producedmicrobeads se pueden lavar sobre una placa PicoTiter, containingwells suficiente para gran fi t sólo un talón (c). ADN polimerasa entonces se puede añadir a thewells, y cada nucleótido puede

y durante isotérmica PCRwill replican en una estafa fi área Ned, agacharse para cebar en sitios vecinos, produciendo un clúster local de moléculas idénticas. (C) y (d) demuestran cómo estas dos formas diferentes de clonalmente-ampli fi secuencias ed entonces se

de ADN clonales en una reacción de PCR en fase sólida plana, como ocurre en la secuenciación Solexa / Illumina. ADN de una sola hebra con la terminación de secuencias complementarias a los dos césped-oligos se reasociará whenwashed sobre el Florida ow-célula,

separado de todos los demás, con moléculas hijas permaneciendo unidos a las microperlas. Esta es la base conceptual subyacente en la secuenciación 454, protocolos Ion Torrent y secuenciación polony. (B): ampli Puente fi catión para producir grupos de poblaciones

emulsión que contienen solamente un talón (ilustrada en las dos gotitas de más a la izquierda, con diferentes moléculas indicadas en diferentes colores). amplificación clonal fi catión entonces se produce durante el emPCR ya que cada plantilla de ADN es físicamente

puede bemade monocatenario y inmovilizada sobre adecuadamente individuo oligonucleótido taggedmicrobeads. conjugados Bead-ADN pueden entonces ser emulsionante fi ed usando ampli acuosa fi reactivos de cationes en el aceite, produciendo idealmente gotitas de

Figura 2. ampli secuenciación de ADN de segunda generación paralelizado fi catión. (A): DNAmolecules ser clonalmente ampli fi ed en una emulsión de PCR (emPCR). ligación del adaptador y PCR produce bibliotecas de ADN con apropiado 5 ' y 3 ' termina, que luego
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utilizado en la fabricación de chips de microprocesadores [69] . Esta tecnología permite muy rápida
secuenciación durante la fase de detección real [67] , Aunque como con 454 (y todas las otras
tecnologías de pirosecuenciación) es menos capaz de interpretar fácilmente secuencias de
homopolímero debido a la pérdida de la señal como multiplematching dNTPs incorporan [70] . La
OFT-descrito ' revolución genómica ', impulsado en gran parte por estos notables cambios en la
tecnología de secuenciación de nucleótidos, se ha alterado drásticamente el costo y la facilidad
asociada con la secuenciación del ADN. Las capacidades de los secuenciadores de ADN han
crecido a un ritmo aún más rápido de lo que se ve en la revolución de la computación se describe
por la ley de Moore: la complejidad de los microchips (medido por el número de transistores por
unidad de coste) se duplica aproximadamente cada dos años, mientras que las capacidades de
secuenciación entre 2004 y 2010 duplicado cada
fi cinco meses [71] . Las diversas tecnologías rama son diversos en sus capacidades y las químicas,
especi fi cationes, proporcionando a los investigadores una caja de herramientas diversa con la que el
diseño de experimentos. Sin embargo en los últimos años, la plataforma de secuenciación de
Illumina ha sido la más exitosa, hasta el punto de casi monopolio [72] y por lo tanto probablemente
puede considera que han hecho la mayor contribución a la segunda generación de secuenciadores
de ADN.
La secuenciación de ADN 4. Tercera generación
Existe un considerable debate acerca de lo de fi nes las diferentes generaciones de la tecnología
de secuenciación de ADN, en particular respecto a la división del segundo al tercer [73,74,75,76] . Los
argumentos se hacen que la secuenciación sola molécula (SMS), la secuenciación en tiempo real, y
la divergencia simple a partir de las tecnologías anteriores deberían ser la de fi características Ning de
la tercera generación. También es factible que un technologymight particular, a horcajadas. Herewe
consideran tecnologías de tercera generación a ser aquellos capaces de moléculas individuales de
secuenciación, negando la necesidad de ampli DNA fi cación compartida por todas las tecnologías
anteriores.
los fi la tecnología SMS primero fue desarrollado en el laboratorio de Stephen Quake [77,78] ,
Más tarde comercializado por Helicos BioSciences, y ha trabajado ampliamente de la misma manera
que lo hace Illumina, pero sin ningún tipo de amplificador de puente fi catión; plantillas de ADN se
adhieren a una superficie plana, y luego decoro Florida dNTPs terminador reversible fluorescentes (los
llamados ' terminadores virtuales ' [ 79] ) Se lavan sobre una base de una vez y la imagen, antes de la
escisión y el ciclismo la siguiente base terminado. Aunque es relativamente lento y caro (y la
producción de relativamente
lee corta), este fue el fi tecnología RST para permitir la secuenciación de la no-ampli fi ADN ed,
evitando así todos los sesgos y errores asociados
[73,75] . Como Helicos fi conducido en quiebra a principios de 2012 [80] otras empresas tomaron el
relevo de tercera generación.
En el momento de la escritura, la tecnología de tercera generación más ampliamente utilizado es
probablemente la única plataforma en tiempo real molécula (SMRT) del Pacífico fi c Biosciences [81] ,
Disponible en la gama de máquinas PacBio. Durante SMRT se ejecuta la polimerización de ADN se
produce en arrays de nanoestructuras microfabricados llamados cero-modo de guías de ondas
(ZMWs), que son esencialmente pequeños agujeros en un metálicos fi lm que cubre un chip. Estos
ZMWs explotan las propiedades de la luz que pasa a través de aberturas de un diámetro menor que
su longitud de onda, lo que hace que se descomponga de manera exponencial, iluminando
exclusivamente la parte inferior de thewells. Esto permite la visualización de solo Florida uorophoremolecules
cerca de la parte inferior de la ZMW, debido a la zona de excitación láser de ser tan pequeña, incluso
sobre el fondo de las moléculas vecinas en solución [82] . La deposición de moléculas individuales de
ADN polimerasa dentro de las ZMWs los coloca dentro de la región iluminada ( Fig. 3 a): por lavado
sobre la biblioteca de ADN de interés y Florida dNTPs fluorescentes, la extensión de cadenas de ADN
por los nucleótidos individuales se pueden monitorizar en tiempo real, como Florida nucleótido
fluorescente se incorpora - y sólo aquellos nucleótidos - proporcionará detectable Florida fluorescencia,
después de lo cual el tinte se escinde de distancia, terminando la señal para esa posición [83] . Este
proceso puede secuenciar moléculas individuales en un lapso muy corto de tiempo. La gama PacBio
posee un número de otras características ventajosas que no están ampliamente compartidos entre
otras máquinas disponibles comercialmente. Como secuenciación se produce a la velocidad de la
polimerasa que produce datos cinéticos, permitiendo la detección de modi fi bases ed [84] . máquinas
PacBio también son capaces de producir increíblemente largo lee, hasta e superior a 10 kb de
longitud, que son útiles para conjuntos de novo del genoma [73,81] .
Quizás el área más esperado para el desarrollo de la secuenciación del ADN de tercera
generación es la promesa de secuenciación de nanoporos, en sí una rama de un mayor fi campo de
la utilización de nanoporos para la detección y cuantificación fi cación de todo tipo de moléculas
biológicas y químicas [85] . El potencial de sequencingwas nanoporos fi primer establecido incluso
antes había surgido secuenciación de segunda generación, cuando los investigadores demostraron
que el ARN monocatenario o ADN podrían ser conducidos a través de una bicapa lipídica a través de
grandes α- canales iónicos hemolisina por electroforesis. Por otra parte, el paso a través de los
bloques de canal de iones Florida ow, disminuyendo la corriente para una longitud de tiempo
proporcional a la longitud

Fig. 3. Tercera generación de detección de secuenciación de ADN de nucleótidos. (A): la detección de nucleótidos en una guía de ondas en modo cero (ZMW), tal como se presenta en secuenciadores PacBio. polymerasemolecules de ADN están unidos a la
eachZMW bottomof (*), y el objetivo de ADN y Florida se añaden nucleótidos fluorescentes. A medida que el diámetro es más estrecha que la light'swavelength de excitación, la iluminación rápidamente decae viajando el ZMW: nucleótidos se incorporan durante la
polimerización en la base de la ZMW proporcionar ráfagas en tiempo real de Florida señal fluorescente, sin interferencia indebida de otros dNTPs marcados en solución. (B): la secuenciación del ADN Nanopore como se emplea en secuenciador Minion de ONT. ADN
de doble cadena se desnaturaliza por una enzima progresiva ( †) que trinquetes una de las cadenas a través de un nanopore biológica ( ‡) incrustado en una membrana sintética, a través de la cual se aplica un voltaje. A medida que el ssDNA pasa a través de la
nanopore las diferentes bases impiden iónica Florida ow de una manera distintiva, permitiendo que la secuencia de la molécula a inferirse mediante el control de la corriente en cada canal.
6 JM Heather, B. Cadena / Genómica 107 (2016) 1 - 8
del ácido nucleico [86] . También existe la posibilidad de utilizar no biológico, la tecnología de estado
sólido para generar nanoporos adecuados, que también podría proporcionar la capacidad de
secuenciar moléculas de ADN de doble hebra [87,88] . Oxford Nanopore Technologies (ONT), la
fi compañía que ofrece secuenciadores primera nanoporos, ha generado una gran cantidad de
entusiasmo sobre sus plataformas de nanoporos GridION y Minion ( Fig. 3 segundo) [89,90] , El último
de los cuales es un teléfono móvil dispositivo USB de tamaño pequeño, que era fi primero lanzado a
los usuarios finales en una prueba de acceso a comienzos de 2014 [91] . A pesar de la mala calidad
pro cierto fi les observó Actualmente, se espera que tales secuenciadores representan una tecnología
realmente perjudicial en la secuenciación de ADN fi campo, produciendo increíblemente largo de
lectura (no ampli fi los datos ed) de secuencia mucho más barato y más rápido que antes era posible [92,90,85]
. Ya Minions se han usado por sí mismos para generar secuencias de referencia genoma bacteriano [93,
94] y amplicones [95,96] , O el programa usado para generar un andamio para iluminación mapa lee a
[97,98,96] , La combinación de la longitud ultra larga leer de la tecnología de nanoporos y la alta
profundidad de lectura y la precisión proporcionada por la secuenciación de lectura corto. El tiempo y
la naturaleza compacta correr rápido del MinIONmachine también presenta la oportunidad de
descentralizar la secuenciación, en un alejamiento de los servicios básicos que son comunes hoy en
día. Incluso se pueden implementar en el fi campo, como se ha demostrado por Joshua rápida y
Nicholas Loman a principios de este año, cuando se secuenciaron los virus Ébola en Guinea dos
días después de la recogida de muestras [99] . Por lo tanto, secuenciadores nanoporos podría
revolucionar no sólo la composición de los datos que se puede producir, pero dónde y cuándo se
puede producir, y por quién.
5. Conclusiones
Es difícil exagerar la importancia de la secuenciación del ADN para la investigación biológica; en
el nivel más fundamental es medir howwe una de las principales propiedades por las que las formas
de vida terrestres pueden ser de-
fi Ned y diferenciado unos de otros. Por lo tanto, durante el último medio siglo muchos investigadores
de todo el mundo han invertido una gran cantidad de tiempo y recursos para desarrollar y mejorar las
tecnologías que sustentan la secuenciación del ADN. En la génesis de esta
fi campo, trabajando principalmente de los objetivos de ARN accesibles, los investigadores podrían
pasar años laboriosamente secuencias productoras que podrían número de un docenas a cientos de
nucleótidos de longitud. A través de los años, las innovaciones en protocolos de secuenciación, la
biología molecular y la automatización aumentaron las capacidades tecnológicas de secuenciación
mientras que disminuye el coste, lo que permite la lectura de ADN cientos de pares de bases de
longitud, masivamente parallelized para producir gigabases de datos en una sola carrera. Los
investigadores se trasladaron desde el laboratorio a la computadora, de verter sobre geles a la
ejecución de código. Se decodifican los genomas, trabajos publicados, las compañías comenzaron - y
con frecuencia se disuelve más tarde -
con repositorios de ADN de secuencia de datos en crecimiento todo el tiempo. Por lo tanto la
secuenciación de ADN - en muchos aspectos, una disciplina de investigación relativamente reciente y
hacia adelante centrado- - tiene una rica historia. La comprensión de esta historia se puede obtener una
apreciación de las metodologías actuales y proporcionar nuevas perspectivas para las futuras, como las
lecciones aprendidas en la generación anterior informan el progreso de la siguiente.
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