Sunteți pe pagina 1din 19

CAPITOLUL 6

INIŢIEREA CULTURILOR "IN VITRO"


După inoculare, recipientele se aşază în camerele de regenerare, care posedă sub formă programată regimul
termic şi de iluminare. Durata incubaţiei este în funcţie de tipul culturilor, specie, provenienţa explantelor, condiţii
de climatizare etc. La speciile ierboase durata regenerării este de până la 10-12 zile, iar la speciile lemnoase de 45-
60 zile.
Iniţierea unei culturi "in vitro" porneşte de la pregătirea materialului iniţial (spălare, sterilizare),
confecţionarea explantelor şi inocularea lor, subiecte tratate în capitolul 4.
Tipurile de culturi "in vitro" pot fi clasificate, mai practic, după natura materialului vegetal folosit la
iniţierea unei culturi:
- culturi de plante (multiplicare vegetativă provocată) prin: divizare, separare, butăşire/minibutăşire,
marcotaj/minimarcotaj, altoire/microaltoire etc. (figura 10);
- culturi de embrioni somatici (embriogeneză somatică);
- culturi de organe (organogeneza): apexuri, rădăcini, antere etc.;
- culturi de meristeme (ţesuturi primare, secundare şi porţiuni de organe);
- culturi de calus (calusogeneză);
- culturi de celule sau celule în suspensie;
- culturi de protoplaşti;
- obţinerea şi folosirea haploizilor.
Tipurile de culturi "in vitro" au la bază natura explantelor şi scopul urmărit (tabelul 5):
Tabelul 5
Tipurile de culturi "in vitro" şi scopul organizării lor
Nr.
Tipul de cultură Scopul organizării culturii "in vitro"
crt.
1 2 3
- scurtarea ciclului de ameliorare
- prevenirea avortării embrionilor
1 Cultura de embrioni
- depăşirea incompatibilităţii postzigotice
- producerea haploizilor
- eliminarea patogenilor
- clonarea plantelor
2 Cultura de meristeme
- conservarea germoplasmei
- stocarea plantelor libere de virusuri
Cultura de apexuri şi - lăstărirea axilară pentru clonare
3
noduri - crioprezervarea
- clonarea prin formarea organelor adventive
Cultura explantelor fără
4 -izolarea mutantelor
muguri preformaţi
- obţinerea poliploizilor
- clonarea plantelor prin formarea organelor adventive
- obţinerea variaţiilor somaclonale
Cultura de calus sau
5 - selecţia mutantelor
celule în suspensie
- producerea metaboliţilor secundari
- biotransformarea
- producerea haploizilor şi liniilor homozigote
Cultura de antere şi
6 - producerea plantelor supermascule
microspori
- selecţia mutantelor
- depăşirea incompatibilităţii pre şi postzigotice
Cultura de ovule şi flori
7 - prevenirea absciziei florilor
excizate
- realizarea fecundării "in vitro"
- hibridarea somatică
- crearea cibrizilor
8 Cultura de protoplaşti
- transferul de gene
- crearea variabilităţii somaclonale
1 - Studii de fitopatologie:
Cultura de protoplaşti, - pătrunderea şi replicarea virusurilor
9 celule, ţesuturi şi - cultura paraziţilor obligaţi
organe - interacţiunea gazdă-parazit
- cultura nematozilor

3
- testarea fitotoxinelor
- studierea nodulării
2 - Studii de fiziologie:
- studierea ciclului celular
- studierea metabolismului
- studierea nutriţiei
- efectele stresului abiotic
- studierea morfologiei şi dezvoltării
3 - Elemente de biologie moleculară şi inginerie
genetică:
- izolarea genelor
- studierea funcţionării promotorilor
- transferul genelor, direct sau prin
intermediul vectorilor

Fig. 10 - Schemă referitoare la metodele de înmulţire vegetativă provocată

4
6.1. INIŢIEREA CULTURILOR DE PLANTE
(MULTIPLICARE VEGETATIVĂ PROVOCATĂ)
Multiplicarea vegetativă a plantelor poate fi spontană şi provocată.
1. Multiplicarea vegetativă spontană se întâlneşte la un număr mare de specii şi a apărut ca urmare a
selecţiei naturale şi consolidării unor caractere specifice, cum ar fi: producerea unui număr mare de muguri, care
pot genera noi plante după separare, acumularea substanţelor de rezervă în organe specializate (bulbi, stoloni,
drajoni etc.), care pot genera plante noi şi rezistenţă la frig, secetă, infecţii etc.
În multiplicarea vegetativă spontană predomină activitatea mugurilor axilari sau terminali şi mai puţin
activitatea celor adventivi. Explicaţia constă în dominanţa apicală a mugurilor terminali, în special ai tulpinii,
asupra mugurilor adventivi. În cazul unei dominanţe apicale totale (cazul inului), planta nu se multiplică vegetativ
spontan şi, dimpotrivă, dominanţa apicală redusă (cazul gramineelor) oferă posibilitatea multiplicării vegetative
spontane.
Tehnologia culturilor "in vitro" are disponibilităţi pentru remedierea acestor neajunsuri, în sensul că
mugurii axilari sau adventivi pot ieşi de sub incidenţa dominanţei mugurilor apicali prin inducerea florală, prin
secţionarea trunchiului, răniri ale cambiului tulpinal etc. De asemenea, acelaşi lucru se realizează şi la unele genuri
ca Rubus, Robinia etc., la care mugurii adventivi se formează pe rădăcini sau la genul Allium, la care mugurii apar
pe seama inflorescenţelor.
2. Multiplicarea vegetativă provocată se bazează pe capacitatea multiplicării vegetative spontane a
plantelor, provocată de om din cele mai vechi timpuri (metode convenţionale), dar şi prin folosirea ultimelor
descoperiri ştiinţifice legate de totipotenţialitatea celulară, care permite obţinerea unei plante dintr-o singură celulă
(metode neconvenţionale sau tehnologiile culturilor "in vitro").

6.1.1. Metode convenţionale de multiplicare vegetativă provocată


Principalele metode convenţionale de multiplicare vegetativă provocată sunt: altoirea, butăşirea,
marcotajul, divizarea, separarea etc. (figura 10).
6.1.1.1. Altoirea
Altoirea este o metodă cu largă folosire în pomicultură, viticultură, silvicultură, floricultură etc.
Altoirea reprezintă îmbinarea (grefarea) artificială a două plante întregi sau numai a unor părţi viabile
(muguri, ramuri etc.) dintr-o plantă donatoare cu o altă plantă care are sau va avea sistem radicular propriu.
Porţiunea prelevată din planta mamă donatoare se numeşte altoi, iar partea care are sau va forma rădăcini se
numeşte portaltoi. Altoirea artificială este asimilată concreşterii naturale, rezultată prin atingerea (presarea) de
lungă durată a unor ramuri, în urma căreia acestea se unesc. Concreşterea se manifestă adesea la pin, stejar, molid,
duglas, la subarbuşti, specii ornamentale etc. Distingem mai multe tipuri de grefă:
- autogrefă (autoaltoire) - altoiul şi portaltoiul aparţin aceluiaşi individ;
- homogrefă (homoaltoire) - altoiul şi portaltoiul aparţin unor indivizi diferiţi, dar din aceeaşi specie;
- heterogrefă (heteroaltoire) - altoiul şi portaltoiul aparţin unor indivizi diferiţi şi de la specii diferite.
Avantajele altoirii:
- posibilitatea multiplicării vegetative a unor clone greu de înmulţit prin alte metode vegetative (butăşire,
divizare, separare etc.);
- obţinerea de plante valoroase (altoi) prin folosirea de portaltoi cu rezistenţă activă la boli şi dăunători;
- obţinerea unor plantaţii (de pomi) cu un echilibru mai adecvat în producţii de calitate, în polenizatori etc.;
- grăbirea maturării sexuale a unor plante tinere, cu intrarea pe rod întârziată;
- obţinerea de forme speciale de coroane (ex. plângătoare, fastigiate etc.);
- refacerea părţilor vătămate a unor specii valoroase;
- conservarea unor resurse genetice valoroase.
Fazele creşterii altoiului cu portaltoiul sunt (Hartmann, 1990):
- producerea de calus "in vivo", ca urmare a activităţii meristematice a altoiului şi parenchimatice a
cambiului de la portaltoi;
- întrepătrunderea celulelor parenchimatice cu cele meristematice;
- diferenţierea unor noi celule parenchimatice (unui nou cambiu) formate de calusul nou ce înconjoară
altoiul şi portaltoiul;
- producerea de ţesuturi vasculare noi de către noul cambiu, sub formă de xilem spre interior şi floem spre
exterior, stabilirea legăturilor dintre ţesuturile vasculare ale altoiului şi portaltoiului, care să permită trecerea
substanţelor nutritive şi a apei către altoi şi invers a asimilatelor.
Metodele de altoire sunt:
1. Altoirea prin apropiere (autogrefă) - altoiul şi portaltoiul rămân pe rădăcinile proprii, părţile din aceeaşi
plantă se alipesc şi după prindere, altoiul se va desprinde din ramura de provenienţă.

5
2. Altoirea cu muguri detaşaţi (homo sau heterogrefă) - constă, în principiu, în detaşarea unui mugure de pe
ramura-altoi şi transferul lui pe un portaltoi înrădăcinat, în curs de înrădăcinare sau neînrădăcinat.
6.1.1.2. Butăşirea
Butăşirea reprezintă metoda convenţională de multiplicare vegetativă provocată, care foloseşte un segment
dintr-un organ vegetativ (butaş), care va forma concomitent rădăcini adventive la bază şi ramificaţii tulpinale în
partea superioară. Această capacitate a butaşilor de a forma plante întregi are la bază totipotenţialitatea celulară şi
procesul dediferenţierii.
În raport cu partea din plantă din care se obţine butaşul, Hartmann (1990) identifică butaşi de tulpină,
butaşi de frunză, butaşi de mugure şi butaşi de rădăcină. Materialul donator din care se vor preleva butaşii trebuie
să fie liber de viroze, moderat viguros şi cu identitate cunoscută.
Rădăcinile noi, formate pe ţesuturile tulpinii (aparatul caulinar), poartă denumirea de rădăcini adventive şi
sunt de două categorii: rădăcini adventive preformate (formate natural pe tulpini şi aflate în stare latentă când
tulpina se află pe planta mamă, cu declanşarea formării lor când tulpina este separată de planta mamă) şi rădăcini
adventive de rană (formate pe locul secţionării tulpinii).
Rădăcinile adventive de rană se formează prin parcurgerea a trei etape (Hartmann, 1990):
- Formarea unui strat protector al rănii prin moartea primului strat de celule, care devin plate, necrozate şi
suberoase. Acest strat protejează zona tăiată de deshidratare.
- Formarea de calus (celule parenchimatice) prin diviziunea celulelor aflate sub primul strat protector.
- Apariţia în interiorul calusului a celulelor cambiului vascular şi a floemului, care vor iniţia primele
rădăcini adventive.
Toate aceste etape se petrec pe baza dediferenţierii celulare, care permite, mai întâi, apariţia rădăcinilor
adventive (rizogeneza) şi apoi formarea tulpinii (caulogeneza). Facem precizarea că aceste procese sunt complexe,
iar activitatea mitotică celulară regenerativă imprimă transformări majore anatomice, histologice şi funcţionale.
Factorii biologici, care influenţează formarea rădăcinilor adventive sunt:
- acţiunea inhibitoare a sistemului radicular existent asupra noii rizogeneze, în sensul că apariţia noilor
rădăcini este posibilă dacă se elimină total sau parţial influenţa inhibatoare a vechilor rădăcini;
- starea de funcţionare a ţesuturilor caulinare ale butaşului în momentul prelevării, determină înrădăcinări
diferite. Butaşii care posedă formaţii secundare (ţesuturi) deficitare sau în fază incipientă, ori inexistente, vor
înrădăcina mai greu (mai tardiv) faţă de cei care manifestă un început de funcţionare cambială;
- formarea cicatricilor la nivelul secţiunii inferioare a butaşului indică tendinţa unei dezvoltări normale a
rizogenezei şi, prin analogie, cicatricea de la partea superioară va genera startul caulogenezei normale;
- repausul vegetativ (perioada rece) reduce activitatea regenerativă în condiţii naturale şi necesită măsuri
speciale în condiţiile de cultură "in vitro";
- înflorirea sau perioada de la începutul până la sfârşitul înfloririi diminuează regenerarea vegetativă,
necesitând aceleaşi măsuri specifice culturilor "in vitro";
- vârsta plantei donatoare, cu cât este mai mică, butăşirea are mai bune rezultate, după care succesul
butăşirii scade treptat pe măsura creşterii vârstei (senescenţa plantei donatoare);
- starea juvenilă a ramurilor tulpinale, prezintă diferenţe semnificative în funcţie de poziţia pe plantă şi
chiar pe lungimea unei ramuri, raportul juvenil/matur fiind favorabil juvenilului, în creştere de la bază spre vârf.
6.1.1.3. Marcotajul
Marcotajul reprezintă metoda convenţională de multiplicare vegetativă provocată, prin care rădăcinile
adventive se formează la nivelul unei tulpini/ramuri, anterior desprinderii de planta mamă. După formarea
rădăcinilor adventive, segmentul de tulpină cu rădăcini (marcota) se desprinde (secţionează) de planta mamă şi se
transferă definitiv sau temporar pe mediul nou de cultură.
Factorii de inducere a formării rădăcinilor adventive pe tulpini/ramuri sunt:
- aplicarea de tratamente cu hormoni de creştere pe anumite zone ale tulpinii/ramurilor;
- eliminarea luminii şi acoperirea zonelor de interes ale tulpinilor/ramurilor cu mediul de cultură (pământ)
sau alte materiale;
- reîntinerirea prin tăieri repetate a tulpinilor/ramurilor de interes pentru a se provoca formarea rădăcinilor
adventive, după ce aceste ramuri tăiate s-au muşuroit (acoperit cu pământ).
Metodele folosite în marcotaj sunt:
- Marcotaj la vârf - prin introducerea în sol a vârfului ramurilor. Se foloseşte la mur, zmeur.
- Marcotaj simplu - prin curbarea ramurilor, primăvara şi acoperirea acestora cu pământ în zonele unde se
vor forma rădăcinile adventive.
- Marcotaj aerian - prin acoperirea ramurilor, primăvara, cu folie de plastic, în zonele unde se vor forma
rădăcinile adventive.
- Marcotaj în muşuroi - practicat la pomii fructiferi valoroşi, prin receparea (tăierea) tulpinii şi acoperirea
cu sol fertil, primăvara. Toamna, lăstarii nou formaţi şi înrădăcinaţi la bază vor fi separaţi de tulpină şi vor fi
transferaţi pe noile amplasamente.

6
Ca metodă comercială de multiplicare vegetativă, marcotajul este greoi, costisitor şi solicită multă
manoperă.
6.1.2. Metode neconvenţionale de multiplicare vegetativă provocată
Principalele metode neconvenţionale de multiplicare vegetativă provocată sunt: microaltoirea,
minibutăşirea, minimarcotajul, culturile "in vitro" de embrioni (embriogeneză), de organe (organogeneză), de
meristeme, de calus (calusogeneză), de celule etc.
6.1.2.1. Microaltoirea "in vitro"
Microaltoirea constă în grefarea unui apex (altoi) luat de la o plantă donor, pe o plantă (portaltoi) crescută
fie "in vivo" (seră, pepinieră), fie "in vitro" (condiţii aseptice de eprubetă). Această metodă se foloseşte în
ameliorarea speciilor lemnoase valoroase, a pomilor fructiferi şi în studiul compatibilităţii/incompatibilităţii
partenerilor la altoire.
Etapele microaltoirii se diferenţiază în funcţie de materialul iniţial cu care se iniţiază cultura.
a - Când se porneşte de la sămânţă, etapele microaltoirii "in vitro" sunt:
- stratificarea seminţelor la rece "in vitro", la 3-4 0C, timp de 60-90 zile, la întuneric, în vase Petri, cu hârtie
de filtru interstraturi, sau prin imersia şi agitarea 24 ore a seminţelor într-o soluţie de agar cu fitohormoni, care vor
suplimenta acţiunea fitohormonilor endogeni, facilitând astfel scurtarea fazei de repaus embrionar;
- apariţia apexului, care va constitui viitorul altoi, ce se va folosi la microaltoire.
Etapele următoare sunt similare punctului b.
b - Când se porneşte de la un lăstar tânăr de pe care se va preleva apexul, se procedează astfel:
- excizarea apexului şi fasonarea la dimensiunile de 0,5-1 mm;
- transferul apexului în eprubetă "in vitro", pe mediul de cultură aseptic (se foloseşte suport din hârtie de
filtru);
- dezvoltarea apexului în eprubetă timp de 2 săptămâni;
- pretratarea apexului şi apoi excizarea altoiului astfel format.
Pretratarea apexului (altoiului) măreşte procentul de prindere la altoire.
Grefarea (altoirea) pe portaltoi se face cât mai intim şi mai aproape de zona cambială a portaltoiului.
- după altoire, complexul altoi-portaltoi se transferă într-un mediu mineral lichid; după finalizarea sudurii
(concreşterii) se va repica în recipienţi speciali, expuşi aclimatizării în seră;
- plantarea noilor plante altoite în locul definitiv.
Domeniile de aplicare a microaltoirii sunt:
- reîntinerirea meristemelor apicale;
- obţinerea de plante libere de viroze;
- studii complexe ale compatibilităţii/incompatibilităţii partenerilor la altoire.
6.1.2.2. Minibutăşirea "in vitro"
Minibutăşirea reprezintă metoda neconvenţională de multiplicare vegetativă provocată, practicată în
sistemul culturilor "in vitro". Metoda prezintă numeroase avantaje de ordin economic: este ieftină, rapidă şi cere un
număr redus de plante donatoare (chiar o singură plantă). Noile plante obţinute în condiţiile "in vitro" sunt copii
fidele a plantei donatoare.
Modalităţile de realizare a minibutăşirii (explantului) sunt diverse şi în general sunt respectate
caracteristicile de bază ale unui butaş, adică pot fi segmente tulpinale, de frunză, rizomi, tuberculi, bulbi sau de
rădăcină.
Important este ca materialul din care se vor preleva explantele cu minibutaşi să fie liber de viroze (alte
boli), să fie viguros şi cu identitate cunoscută. Se vor evita plantele donatoare care au suferit efectele nocive ale
gerurilor, secetei, atac de boli, de dăunători sau plantele stresate nutritiv ori hidric.
Indiferent de provenienţa explantului minibutaş, un rol important în procesul de iniţiere a culturilor "in
vitro" pentru această metodă neconvenţională, îl are balanţa hormonală care există la planta donatoare în momentul
prelevării. Astfel, predominarea auxinelor va favoriza înrădăcinarea şi dimpotrivă, predominarea citochininelor va
stimula creşterea şi diferenţierea celulelor tulpinale, iar predominarea giberelinelor va provoca alungirea tulpinilor.
Cunoaşterea balanţei hormonale din mediul plantei donatoare impune măsuri de constituire adecvată a mediului în
care va fi transferat explantul minibutaş.
De asemenea, alţi factori care influenţează minibutăşirea "in vitro", cu referire la calitatea materialului
biologic donator folosit sunt:
- starea de juvenilizare a materialului donator;
- gradul de lemnificare al explantului (lemnificat, nelemnificat, verde);
- timpul din an când se prelevează explantul (indicat toamna);
- prezenţa/absenţa atacului de boli etc.
Astfel, rezultatele prinderii inoculului minibutaş vor fi bune dacă explantul s-a prelevat de la un donator
bine nutrit mineral, ţesutul este turgescent (dimineaţa), lemnificat (conţinut ridicat în glucide), prelevat toamna.
6.1.2.3. Minimarcotajul

7
Minimarcotajul reprezintă metoda neconvenţională de multiplicare vegetativă provocată, ce se practică în
condiţiile culturilor "in vitro". Explantul de inoculat pe mediile "in vitro" provine din zona rădăcinilor adventive.
Apariţia rădăcinilor adventive, în stadiul primar, poate fi provocată artificial şi la părţile aeriene ale plantei
donator, prin mai multe metode. Printre asemenea metode avem: incizarea (rănirea) tulpinii în zone diferite şi
obţinerea de noi formaţiuni radiculare adventive, acoperirea cu folie sau cu benzi textile a unor ramificaţii tulpinale
(cu acelaşi efect ca incizarea) etc.
Important este faptul că minimarcotajul foloseşte explante din rădăcini adventive, în timp ce minibutăşirea
foloseşte explante tulpinale aeriene sau subterane. Iniţierea culturilor "in vitro" şi tehnologia multiplicărilor
ulterioare este aceeaşi la ambele metode neconvenţionale.

6.4. INIŢIEREA CULTURILOR DE MERISTEME


6.4.1. Definirea, clasificarea, caracterizarea şi morfogeneza meristemelor
Meristemele sunt ţesuturi de tip formativ, cu celule tinere ce-şi menţin capacitatea regenerativă
(proprietatea de a se divide şi de a forma noi celule) pe toată durata vieţii plantelor. Asemenea meristeme pot fi:
1 - de tip primar:
- terminale (apicale) - localizate în vârful tulpinii (meristeme apicale caulinare) şi rădăcinii (meristeme
apicale radiculare), inclusiv în vârfurile ramificaţiilor acestora. Meristemul caulinar poate fi vegetativ, generând
primordiile foliare sau generativ (floral), rezultat printr-o serie de transformări ale apexului vegetativ, generând
primordiile pieselor florale. Aceste meristeme au rolul de a asigura creşterea în lungime a rădăcinii şi tulpinii
plantelor (figura 16);
- laterale - la plantele ierboase, la nivelul structurilor primare există ţesut meristematic de tipul
procambiului sau al cambiului inter şi intrafascicular;
- intercalare - poziţionate între două zone diferenţiate (ţesuturi definitive), asigură formarea nodurilor şi
creşterea asimetrică a internodurilor tulpinii plantelor;
- foliare - asigură formarea frunzelor. Ele au o perioadă limitată de funcţionare şi pot prezenta, pe o aceeaşi
frunză, o activitate continuă sau secvenţială. În momentul în care frunzele au atins forma şi mărimea normală
meristemele foliare îşi încetează activitatea.
2 - de tip secundar - care asigură creşterea în grosime a rădăcinilor, tulpinilor. Meristemele secundare sunt:
- cambiul - asigură creşterea în grosime, generând ţesut conducător liberian secundar spre exteriorul său şi
ţesut conducător lemnos secundar spre interiorul său (centrul organelor);
- felogenul - generează stratul subero-felodermic (parenchimul secundar) cu suberul spre exterior, cu rol
protector şi feloderm spre interiorul organelor.
Când explantul se prelevează prin delimitarea strictă a tipului de meristeme clasificate anterior, inoculul
respectiv va avea dimensiuni de 0,1-0,2 mm în diametru sau 0,25-0,30 mm în lungime şi se va denumi cultură de
meristem radicular, caulinar, floral, foliar, intercalar, cambiu, felogen. Dacă dimensiunile explantului prelevat dintr-
o anumită zonă este mai mare, înseamnă că deţine şi celule învecinate ţesutului meristematic respectiv. În această
situaţie reacţia acestor explante în condiţiile "in vitro" nu are la bază totipotenţialitatea reală (specifică) a
meristemului respectiv, ci se manifestă ca rezultat al interacţiunilor dintre meristem şi primordiile respective.

Fig. 16 - Schemă reprezentând structura meristemului apical caulinar

I-meristem primordial, II-meristeme primare, III-ţesuturi definitive primare


1-zonă meristematică distală (meristem de aşteptare), 2-zonă meristematică axială,
8
3-zonă meristematică periferică (inel iniţial), 4-protodermă, 5-procambiu, 6-meristem fundamental, 7-epiderma, 8-scoarţa, 9-
fascicul conducător libero-lemnos, 10-măduva, 11-primordii foliare
Primele tipuri de explante, cu cât sunt mai mici, nu formează calus, dar, rata de obţinere a plantelor este
foarte mică (de ex. explantele de 0,1 mm lungime regenerează până la 5%, explantele de 0,2 mm lungime
regenerează până la 10%), în timp ce culturile de apexuri, cu explantele mai mari de 0,3-0,5 mm lungime formează
calus şi se utilizează mai mult pentru obţinerea plantelor devirozate etc.
Celulele meristematice deţin caracteristici structurale specifice, care le conferă capacitate de proliferare
continuă şi anume: au pereţii celulari subţiri, celulozici, nemodificaţi secundar, sunt bogate în citoplasmă, au
mitocondrii numeroase, nucleul este mare, nucleolii bine reliefaţi, vacuolele sunt mici şi nu deţin metaboliţi. În
raport cu celulele parenchimatice, celulele meristematice sunt mici, strâns unite între ele, fără spaţii intercelulare,
forma celulelor fiind poligonală la meristemele primare şi tubulară la meristemele secundare. Dispunerea celulelor
derivate din celula mamă este perpendiculară în cazul meristemelor primare şi radială la meristemele secundare.
După formă, mărime şi conformaţie meristemele sunt diferite la criptogamele vasculare, la gimnosperme şi
la angiosperme. Interesul major şi majoritatea lucrărilor la culturile "in vitro" cu meristeme se realizează însă la
angiosperme.
Meristemele caulinare (figura 16) se împart în: meristeme apicale, provenite din muguraşul embrionului,
meristeme axilare, aflate la axila frunzelor, meristeme adventive, formate pe diverse organe aeriene (frunze,
internoduri, rădăcini) sau neoformate, generate din calus.

Fig. 17 - Schemă reprezentând structura meristemului radicular


c-caliptră, cl-centru "liniştit", cx-cortex, s-stel
Meristemele radiculare (figura 17) se împart în: meristeme apicale (poziţionate în vârful rădăcinilor),
meristeme laterale, meristeme adventive (formate la nivelul tulpinilor sau a altor organe subterane: butaşi, marcote,
bulbi, tuberculi sau reprezentate de calusul ce se formează în culturile "in vitro" - meristeme neoformate, situaţie
asemănătoare tulpinilor).
Mugurele reprezintă porţiunea cea mai tânără a plantei şi reprezintă un lăstar nedezvoltat, constituit dintr-
un apex meristematic din activitatea căruia rezultă un ax, format din noduri şi internoduri, pe care, lateral, se
diferenţiază primordiile foliare sau ale pieselor florale. În mugure, axul ramurii se îngustează treptat, internodurile
devin din ce în ce mai scurte, iar meristemul apical se află la capătul propriu-zis al axului principal sau al axului
ramificaţiilor laterale (secundare, terţiare ş.a.m.d.). Primordiile foliare, subiacente meristemului apical, cu cât sunt
mai îndepărtate de ax, sunt din ce în ce mai dezvoltate, formând o înfăşurare de frunzuliţe.
Mugurii, la rândul lor se pot clasifica în:
- muguri terminali (apicali) - poziţionaţi în vârful axului tulpinii principale ori ale ramificaţiilor acesteia;
- muguri laterali (axilari) - poziţionaţi la nivelul nodurilor tulpinii fiind protejaţi de o bractee (frunză
modificată) sau de teaca frunzei;
- muguri adventivi - mugurii ce apar în locuri nedeterminate de pe plantă (frunze, rădăcini etc.) sau obţinuţi
din calusul culturilor "in vitro". Ei sunt de tip regenerativ şi pot fi folosiţi la multiplicarea vegetativă.
Nu omitem a menţiona existenţa dominanţei apicale, adică controlul morfo-genetic dominant ce se
manifestă de mugurele şi meristemul terminal (apical) asupra mugurilor (meristemelor) laterali (axilari).
Suprimarea mugurelui (meristemului) terminal (apical) determină creşterea mugurelui (meristemului) lateral
(axilar) aflat în imediata vecinătate. Atât timp cât mugurele (meristemul) terminal (apical) desfăşoară activitate,
mugurii (meristemele) laterali (axilari) sunt latenţi (inhibaţi).
Continuarea activităţii meristemelor apicale determină o creştere în volum a mugurelui terminal şi o
diferenţiere celulară de la centru spre periferie, în xilem, floem şi ţesut parenchimatic. La periferia mugurelui vor
apare primordiile frunzelor (mugurii vegetativi) şi la mugurii generativi vor apare primordiile florale (mugurii
floriferi). a culturile "in vitro" explantele prelevate din primordiile vegetative vor forma frunze, în timp ce
primordiile florale vor forma frunze şi flori. Conceptul existenţei unui determinism genetic al tipului de meristem,
9
în sensul că meristemele vegetative vor regenera numai părţi vegetative, iar cele florale numai inflorescenţe sau
flori nu mai este valabil în prezent, întrucât tehnologiile moderne practicate la culturile "in vitro" oferă posibilitatea
trecerii de la apexuri vegetative la cele florale, şi invers. Evoluţia meristemelor apicale de tip vegetativ spre tipul
floral este dependentă de factorii exogeni (temperatură, fotoperioadă) şi de factori endogeni (hormoni -
citochinine). Prin cultivarea explantelor în condiţii "in vitro" (mediu aseptic), meristemele neoformate vor da
naştere la organe şi în continuare organogeneza asigură multiplicarea vegetativă. În majoritatea cazurilor, în calusul
neoformat se vor forma la început meristeme radiculare (determinate de acţiunea stimulatoare a auxinelor) şi apoi
vor apare meristemele caulinare (prin acţiunea citochininelor şi eliminarea auxinelor). Cele mai importante
explante pentru iniţierea unor culturi "in vitro" cu meristeme sunt cele care folosesc meristemele apicale (radiculare
şi caulinare), regenerarea inoculilor fiind în acest caz de până la 32% (la crizanteme, după Badea Elena Marcela şi
colab., 2001). Dar cum asemenea meristeme sunt puţine (numai în vârful tulpinii şi rădăcinii principale) suntem
obligaţi să apelăm şi la meristemele laterale şi chiar la meristemele adventive (inclusiv cele neoformate).
Cambiul şi felogenul sunt meristeme de îngroşare ale tulpinii aeriene sau subterane metamorfozate
(tuberculi, bulbi etc.) şi prezintă interes pentru culturile "in vitro" doar culturile cambiale.
6.4.2. Tehnica de cultivare "in vitro" a meristemelor
Cultura explantelor prelevate din meristemele primare (apexuri) sau din meristemele secundare necesită
aceleaşi echipamente speciale existente în dotarea unui laborator obişnuit destinat culturilor "in vitro". Etapele
succesive ale culturilor de meristeme sunt (figura 18):
Stadiul 0
Materialul biologic folosit pentru prelevarea explantelor este preferabil să fie reprezentat de lăstari în
creştere, care dispun de meristeme active. Sterilizarea materialului biologic se face prin spălare cu apă (preferabil
curgătoare de la robinet), imersia timp de 30 secunde maximum un minut în alcool etilic (70 0, 960 sau chiar
absolut), imersia în soluţii sterilizante (hipoclorit de calciu sau sodiu, apă oxigenată, apă bromată, clorură
mercurică etc.) şi clătiri repetate cu apă bidistilată.
Stadiul I
Prelevarea meristemelor şi inocularea au loc în incinte cu flux de aer laminar (orizontal sau vertical) şi
începe cu eliminarea (excizarea) frunzelor, una câte una şi obligatoriu, sterilizarea instrumentelor folosite, înaintea
fiecărei excizări. Vor fi eliminate cu atenţie toate frunzuliţele ce înconjoară apexul (conul muguraşului) prin
răsucirea uşoară de la bază spre vârf.
Stadiul II
Meristemul integral împreună cu două primordii foliare subiacente se desprind de axul tulpinii (ramificaţia
tulpinii) şi se inoculează rapid în mediul de cultură (sterilizat în prealabil).
Stadiul III
Transferul inoculilor în camera de creştere se face la interval de timp scurt. Recipienţii cu mediul de
cultură şi inoculi se aşază pe rafturi (stelaje) special amenajate, în poziţie verticală şi cu asigurarea unei temperaturi
constante (de 300C pe durata iniţierii rădăcinilor şi de 25 0C pe durata caulogenezei), luminozitate de 1 oră din 24
ore cu tuburi fluorescente de 40 W (600 lucşi), iar umiditatea relativă a aerului să fie de 70%. Pe o durată de 10-12
zile, mediul nutritiv cu predominanţă în auxine va facilita rizogeneza. În momentul apariţiei primelor ramificaţii ale
rădăcinii explantul se va transfera într-un alt mediu în care preponderenţa va aparţine citochininelor, ce vor stimula
formarea şi creşterea tulpiniţei şi temporizarea rizogenezei. După alte 15-20 zile explantul care are o tulpiniţă de 2-
3 cm şi un sistem radicular bine dezvoltat va fi transferat pe ghivece cu compost ca medii de cultură.

10
Fig. 18 - Schemă privind stadiile care trebuie parcurse la cultura "in vitro" a meristemelor
Stadiul IV
Aclimatizarea la sol a noilor plante
Ghivecele cu noile plante se amplasează mai întâi în sere la 15 0C acoperite cu borcane de sticlă pentru a
proteja plantele firave de ofilire, care se poate datora fie temperaturii aerului înconjurător care provoacă transpiraţia
la nivelul frunzuliţelor prea tinere, fără cuticulă foliară bine dezvoltată, fie incapacităţii sistemului radicular, încă
neancorat în sol, de a acoperi cerinţele pentru apă a aparatului vegetativ aerian. Durata acestei etape este cuprinsă
între 4-16 săptămâni (Badea Elena Marcela şi colab., 2001), timp în care noile plante urmează mai multe etape ale
aclimatizării şi adaptării la condiţiile de sol naturale.

6.4.3. Obţinerea de plante libere de agenţi patogeni


Un aspect important al multiplicărilor "in vitro" constă în obţinerea de material săditor sănătos, în ţesuturile
nou formate nefiind atacuri sau infecţii cu agenţi patogeni. Plantulele generate "in vitro" din meristemele apicale
(însoţite numai de prima pereche de primordii foliare) sunt libere de viroze sau boli păgubitoare, unele din acestea
imposibil de evitat (combătut) pe calea înmulţirii vegetative tradiţionale. Explicaţia lipsei infecţiilor nu este
definitivă, dar sunt unele presupuneri cum ar fi:
- rata de multiplicare a celulelor meristematice este mai mare comparativ cu rata de multiplicare a
particulelor virale;
- absenţa din meristeme a elementelor vasculare şi a plasmodesmelor care facilitează trecerea de la o celulă
la alta a agenţilor patogeni;
- prezenţa în meristeme a unor inhibatori naturali ceea ce explică de ce seminţele obţinute de la plantele
produse prin sistemul culturilor "in vitro" sunt libere de infecţii patogene.
Frecvenţa cu care se obţin plantele libere de virusuri (infecţii patogene) diferă în funcţie de tipul agentului
patogen şi de mărimea explantului. De exemplu, la căpşun, numai 10% din totalul meristemelor de 0,2 mm au
regenerat plante şi toate au fost libere de viroze. Situaţia este mai complicată la cartof unde virusul X poate fi
eliminat total, fie dacă este singur ori asociat cu virusul A, în timp ce asocierea virusului X cu virusurile Y, M ori
sau S, nu formează plante libere, deoarece aceştia colonizează întreg mugurele apical. De aceea, prelevarea
explantelor este precedată de un tratament termic timp de 5-10 săptămâni la 35-38 0C, când virusurile nu se pot
dezvolta, iar meristemele apicale vor regenera segmente noi (juvenile) fără infecţii virotice. Explantele prelevate
din aceste zone sunt libere de viroze şi vor forma plante perfect sănătoase.

6.4.4. Avantajele culturilor de meristeme "in vitro"


Prin cultivarea "in vitro" a meristemelor (apicale, laterale sau axilare) se realizează o regenerare de plante
(clonarea plantelor) identice din punct de vedere genetic cu planta donatoare, aspect foarte important pentru
speciile horticole, silvice şi ornamentale. Importanţa acestei tehnologii constă în:
- folosirea unui număr redus de plante mamă donatoare (sunt suficienţi numai câţiva muguri pentru
iniţierea culturii);
- pe suprafaţa de 1 m2 de etajeră din camera de creştere (regenerare) se poate obţine anual până la 35.000
arbori sau 150.000 plante de căpşun, forme biologice libere de agenţi patogeni şi cu un potenţial de producţie
ridicat;
- această multiplicare rapidă a plantelor oferă posibilitatea schimbării sortimentului cultivat la intervale mai
scurte de timp, fără a se diminua nivelul productivităţii la unitatea de suprafaţă;
- folosirea spaţiilor protejate şi prin controlul factorilor de mediu există posibilitatea continuării activităţii
de multiplicare pe toată durata anului, indiferent de anotimp ori ciclul biologic natural (latenţa) caracteristic speciei
folosite. Există astfel posibilitatea livrării la termen fix pentru orice comandă - chiar imprevizibilă - deoarece
multiplicatorul nu este condiţionat de starea materialului biologic din teren, ci acesta este păstrat şi conservat în
camerele frigorifice. Este cazul cartofului care se poate multiplica vegetativ de 80 ori, numai în 40 zile, comparativ
cu multiplicarea vegetativă tradiţională prin tuberculi;
- posibilitatea stocării şi păstrării până la 4-6 luni a materialului biologic folosit la multiplicarea "in vitro"
sau conservarea materialului în bănci de gene datorită volumului redus şi numărului mare de indivizi clonaţi (într-
un frigider de 200 litri pot fi conservaţi aproape 10.000 de pomi clonaţi);
- materialul înrădăcinat poate fi uşor transportabil, fără agar, la distanţe mari, deoarece ocupă un volum
redus şi greutate mică (40.000 plante + ambalajul specific = 15 kg);
- se pot multiplica specii rare, valoroase, care formează seminţe puţine sau specii a căror seminţe
germinează greu, în condiţii speciale, dificil de realizat. Unele exemplare de plante valoroase (elită), greu de
multiplicat pe cale sexuată pot fi salvate şi multiplicate pe cale vegetativă prin sistemul culturilor "in vitro". Este
cazul unor orhidee, multiplu heterozigote, forme de Asparagus androsterile sau unele forme parentale homozigote
folosite la hibridările sexuate. De asemenea, prin sistemul culturilor "in vitro" se realizează "juvenilizarea"

11
indivizilor şi prin aceasta creşterea vigurozităţii tulpinilor, numărul ramificaţiilor tulpinii, mărimea şi intensitatea
coloritului frunzelor, a florilor (este practicată la ferigi, căpşuni, mur, măr, piersic etc.). De exemplu, plantele de
măr provenite prin cultura "in vitro" au fructificat după 3-4 ani de vegetaţie, iar producţia direct proporţională cu
vârsta, dar numai până la al 10-lea ciclu de vegetaţie. Plantele juvenilizate nu sunt numai viguroase şi foarte
productive, ci sunt foarte sănătoase întrucât multiplicarea vegetativă tradiţională atrage după sine şi infecţiile cu
boli de la plantele mamă, donatoare;
- există posibilitatea multiplicării unui număr infinit de indivizi pornind de la o singură plantă donatoare;
- clonele obţinute se pot păstra la rece, într-un spaţiu mic şi pot fi păstrate mai mult timp (ani) până a fi
transferate în seră sau pepinieră.
În Olanda, numai un singur multiplicator de plante "in vitro" a realizat în 1995 un număr de 46.822 plante,
la un număr de 27 specii, din care 13.002 plante de Nephrolepsis, 6044 plante de Gerbera, 5130 plante de Lilium,
4422 plante de Phalaenopsis, 3185 plante de Spatiphyllum, aproape 2000 plante de Alstromeria, ş.a.m.d. (Badea
Elena Marcela şi colab., 2001).

6.4.5. Riscurile culturilor "in vitro" de meristeme


Cunoscând avantajele culturilor "in vitro" de meristeme, trebuie luate în considerare şi anumite riscuri, mai
ales în situaţia când această tehnologie se transformă în tip industrial şi devine generatoare de material destinat
plantării. Printre posibilele riscuri ar fi (Cachiţă-Cosma Dorina, 1987):
- posibilitatea suprasaturării pieţei cu anumite produse obţinute de la anumite specii "la modă" şi care
printr-o cerere mai mică diminuează preţul desfacerii sub nivelul preţului de producţie;
- răspândirea în cultură a unui număr redus de forme biologice (culturi monoclonale) ce vizează o
diversitate redusă a cerinţelor de consum (uman, animal, industrial etc.), o sărăcire genetică a speciilor, toate
acestea oferind şanse mari intensificării agresivităţii atacului de boli şi dăunători, precum şi o intervenţie majoră şi
brutală a selecţiei naturale în eliminarea formelor valoroase, dar sensibile;
- lipsa de profesionalism (seriozitate) din partea persoanelor operatori, care realizează prelevarea
explantelor şi inocularea lor pe mediile de cultură "in vitro" pot genera fenomene nedorite, cum ar fi: vitrificarea
(dezordine fiziologică), anergia (insensibilitatea sau nonreactivitatea explantelor la acţiunea stimulativă a auxinelor
sau citochininelor) etc.;
- posibilele accidente pe durata fluxului tehnologic al culturilor "in vitro" pot determina pierderi majore în
activitatea economică a acestor practici, care, pe cât sunt de rentabile, tot atât de rapid devin nerentabile.

6.5. INIŢIEREA CULTURILOR DE CALUS (CALUSOGENEZA)


Cultura de calus oferă o altă posibilitate în producerea unor celule nediferenţiate, cu o structură histologică
uniformă aflate în stare mitotic-active, cu diviziune pronunţată în special la calusurile tinere. Un anumit tip de calus
se produce şi în mod natural "in vivo", fie la nivelul zonelor traumatizate (mai ales prin tăiere) şi au rol de
cicatrizare a rănilor (activitatea mitotică este limitată), fie se formează la baza butaşilor plantaţi pentru înrădăcinare,
când are loc formarea rădăcinilor adventive.
În dependenţă cu obiectivul urmărit, obţinerea de calus este pozitivă când reprezintă punctul de plecare în
iniţierea culturii de celule şi de aici culturile de protoplaşti, sau poate fi negativă când apariţia calusului la baza
explantului perturbă dirijarea proceselor de morfogeneză la multiplicarea clonală rapidă.
Obţinerea calusului se face pe mediu de cultură solid (agarizat) pe un suport-cartuş, ori hârtie de filtru, ce
va susţine masa celulară în creştere. Periodic, calusul format este fragmentat şi subcultivat, altfel intră în senescenţă
şi în final se necrozează.
Instabilitatea genetică a celulelor calusului şi poliploidizarea uşoară a acestora, în anumite condiţii de
cultură (natura şi tipul hormonilor prezenţi în substratul de cultură, agenţi mutageni sau şocuri de natură externă)
fac din cultura de calus şi din cultura de celule un material biologic valoros nu numai în multiplicarea clonală ci şi
ca metode specifice de ameliorare (mutageneza, poliploidia, hibridarea somatică prin folosirea protoplaştilor).
După Naborus, 1982, se disting două tipuri de calus: calus de tip regenerativ (embriogen), care este dens,
optic translucid sau opac, de culoare alb-lăptoasă spre galbenă sau galben-verde, din care se vor forma totdeauna
noi plante şi calus de tip neregenerativ (neembriogen), format dintr-o masă cristalină, transparentă, de culoare alb,
alb-brunie sau verde, din care se vor forma rădăcini, uneori muguraşi, dar niciodată plante.
Aceste două tipuri de calus necesită hormoni şi doze diferite atât pentru impulsionarea şi susţinerea
creşterii, cât şi pentru diferenţierea celulară. De regulă, calusul neregenerativ creşte abundent (vegetativ), în timp ce
calusul regenerativ are o creştere mai lentă, chiar şi în condiţiile de stimulare a creşterii acestuia. Din totalul masei
calusale, calusul regenerativ, în condiţiile unei culturi normale, deţine o pondere de până la 10%, în timp ce calusul
neregenerativ, deţine o pondere de până la 90%. Dacă regiunile cu calus regenerativ se cultivă pe medii
stimulatoare regenerării (amestec de 1 mg 2,4,5-T cu 1 mg/l AIA şi 0,5 mg/l chinetină) se vor obţine plante noi. La
culturile de calus neregenerativ, obţinerea de noi plante nu este facilă, fiind necesară o bogată experienţă personală

12
a cercetătorilor, care trebuie să identifice cu precizie cele mai favorabile momente de separare a calusului şi
transferul acestuia pe un mediu de stimulare specific.
Mecanismul inducerii calusului constă în dediferenţierea celulară (transformarea progresivă a celulelor din
starea de celulă specializată în celulă meristematică, aptă diviziunii) provocată fie prin acţiunea directă a auxinelor
şi citochininelor (vezi figura 3, capitolul 2) administrate în mediul de cultură, fie prin rănire (tăiere "in vivo") şi
apariţia calusului reparator, specific dicotiledonatelor şi mai puţin eficient la monocotiledonate, fie prin infecţii
(naturale sau artificiale), când se formează calusul tumoral etc.
Multiplicarea clonală prin calus nu este posibilă în toate cazurile, deoarece la unele specii de plante
(bumbac, stejar etc.) are loc cu multă uşurinţă poliploidizarea celulelor, în timp ce la alte specii (morcov, tutun,
crizanteme) se pot obţine cu multă uşurinţă noi plante.
Celulele plantelor cultivate prin sistemul culturilor de calus, culturi de celule (suspensii de celule) prezintă
un pronunţat proces de poliploidizare, fie prin euploidizare (± x), fie prin aneuploidizare (± un număr de
cromozomi) sau aberaţii cromozomice. Puţine sunt speciile de plante care îşi menţin constantă structura genetică în
condiţiile "in vitro", asemănătoare condiţiilor "in vivo". Cauzele acestei pronunţate variabilităţi cromozomice sunt
multiple, prezintă interes în studiile de genetică, iar amelioratorii caută metode adecvate de inducere controlată şi
obţinerea poliploidiei, a haploidiei (mono, di şi trihaploidie) şi chiar a formelor mutante.
Creşterea calusului este considerată ca nedefinită, întrucât el poate fi înmulţit şi cultivat la infinit, iar pentru
aceasta, periodic este necesară fragmentarea şi repicarea lui. Fiecare fragment este subcultivat pe un mediu specific
proaspăt, această repicare având loc la un interval de 4-6 săptămâni, în dependenţă de natura ţesuturilor de unde a
provenit şi condiţiile mediului de cultură în care a fost realizat. Vitalitatea celulelor din calus se menţine la un nivel
ridicat numai prin repicaje repetate. Nefragmentarea şi nerepicarea la timp a calusului provoacă o îmbătrânire a
celulelor, masa tisulară îşi schimbă progresiv culoarea de la gălbui spre galben-verzui-cenuşiu sau galben brun-
roşiatic-vişiniu, datorat formării şi acumulării de antociani în sucul vacuolar.
Formarea de calus destinat culturilor de celule (cultura de protoplaşti - hibridările somatice) are un
randament sporit când explantele se prelevează din meristeme, muguri, internoduri, fragmente de frunze,
parenchim de rezervă, liber secundar etc., iar mediul de cultură este bogat în 2,4-D (Raicu, 1984). Primul calus
obţinut în intervalul de 4-6 săptămâni se numeşte calus primar (dintr-un inocul se poate obţine calus primar cu cca.
50.000 celule), iar prin fragmentare şi subcultivare, după încă 4-6 săptămâni se obţine calusul secundar, care
suportă şi el aceleaşi operaţii de fragmentare-subcultivare. Aceste operaţii pot continua mai mulţi ani, existând
cazuri (calusul de la explantele de tutun) când subcultivarea s-a repetat timp de 5 ani, în timp ce la
monocotiledonate repetarea s-a făcut până la 10-15 ori, dar prin aplicarea de măsuri speciale de stimulare a
calusogenezei.

6.5.1. Etapele iniţierii culturilor de calus

Obţinerea de calus trebuie să parcurgă următoarele etape (fig. 19):


1 - Alegerea materialului donator, de prelevare a explantelor trebuie corelată cu scopul şi destinaţia
calusului. Asemenea donatori pot fi: seminţe, embrioni, rădăcini, ţesuturi de rezervă, frunze, ramuri, muguri, antere,
ovare etc.
2 - Prepararea mediilor de cultură se face de asemenea în corelaţie directă cu destinaţia calusului. În linii
generale mediul sărac în azot (tip HELLER), cu pH de 5,5 sunt preferabile culturilor de calus la dicotiledonate;
dimpotrivă la cereale (monocotiledonate) se mai adaugă 2,4-D sau 2,4,5-T în concentraţii mici de 5 x 10 -5 M,
pentru stimularea calusogenezei.
În scopuri deosebite când este necesar obţinerea de calus tumoral, pentru inducerea toleranţei la un anumit
agent patogen, mediul de cultură trebuie să conţină macro şi microelemente, FeEDTA, vitamine, mezoinozitol,
zaharoză, regulatori de creştere etc. În lipsa agarului, se poate folosi o punte de hârtie de filtru, calusul fiind
realizabil şi pe explantele cultivate în mediile lichide, în submersie, dar cu efectuarea unei aerisiri repetate.
3 - Sterilizarea recipientelor, a materialului biologic şi a mediilor de cultură, se efectuează după metodele
prezentate anterior.
4 - Prelevarea şi dimensionarea explantelor se face în spaţiile aseptice dotate cu flux de aer laminar;
explantele vor fi de 4x4 mm sau 4x6 mm dimensiune şi de 1-2 mm grosime.
5 - Inocularea explantelor pe mediul solid se va face imediat după prelevarea acestora.
6 - Incubarea inoculilor se face fie la lumină, fie la întuneric şi la o temperatură de 25 0C. Incubarea
inoculilor la întuneric, fiind generatoare de calus mai mult, se preferă de regulă, comparativ cu incubarea la lumină.
7 - Observarea formării calusului şi urmărirea creşterii acestuia durează 4-6 săptămâni, după care urmează
etapa de repicare şi transfer (pasare).
8 - Fragmentarea şi repicarea (pasarea) calusului primar, pe medii proaspete. Se va ţine o evidenţă strictă a
numărului şi datei fragmentărilor efectuate.

13
9 - Organogeneza sau embriogeneza fragmentelor de calus, când scopul este obţinerea de noi plante sau
embrioni vegetativi.
Se pot observa domeniile multiple de utilizare a calusului, după cum urmează:
- obţinerea de noi plante prin inocularea repetată, cu fragmente de calus pe medii de cultură ce stimulează
rizogeneza şi caulogeneza;
- obţinerea de forme biologice cu toleranţă ridicată la stresul agenţilor patogeni;
- obţinerea de culturi de celule în suspensie cu aceleaşi utilizări ca folosirea fragmentelor de calus;
- obţinerea culturilor de protoplaşti (celule fără membrană) prin izolarea acestora din suspensiile de celule;
- realizarea de hibridări somatice prin fuziunea protoplaştilor.

Fig. 19 - Regenerarea plantelor din calus cultivat "in vitro"

Menţionăm că inducerea calusogenezei prezintă interes şi pentru cercetări de fiziologie (studierea


morfogenezei), dar şi în evidenţierea reacţiei celulei vegetale la acţiunea stimulatorilor/inhibitorilor de creştere, la
pesticide, noxe, ioni grei, respiraţie, produşi primari şi secundari de metabolism, enzime etc.

6.6. INIŢIEREA CULTURILOR DE CELULE


Cultura de celule reprezintă creşterea pe medii lichide a celulelor libere sau a unor mici agregate celulare
(fragmente de calus). Gradul de agregare al celulelor se apreciază în funcţie de momentul (vârsta) celulelor
componente (tinere în momentul inoculării, mature în perioada de creştere şi bătrâne în momentul instalării
senescenţei), de corectitudinea şi precizia separării lor, precum şi în funcţie de numărul diviziunilor care au avut
loc.
Sistemele de celule neorganizate pot fi cultivate nu numai sub formă de fragmente de calus, ci şi sub formă
de celule singure sau mici colonii de celule, dispersate în mediul lichid agitat (suspensii celulare).
O cultură de celule perfectă nu este alcătuită numai din celule libere (izolate); pentru a reduce numărul de
agregate celulare (colonii celulare) se practică filtrarea culturii cu sisteme de filtre care să permită a fi reţinute
14
agregate celulare formate din 2-10 celule mari, sferice, cu diametrul de 4 nm şi uniforme din punct de vedere
genetic (Street, 1977).
Gradul de dispersare al celulelor într-o suspensie "in vitro" depinde de durata creşterii celulelor pe mediul
de cultură, de compoziţia mediului şi de condiţiile de cultură (Street, 1977). Conţinutul ridicat în auxină măreşte
numărul de celule în suspensie, scăderea auxinelor provoacă reducerea capacităţii celulelor de a se separa.
Idealul unei culturi de celule constă în omogenitatea ei morfologică şi biochimică, rezultate prin clonarea
repetată a unei singure celule, cu o identitate perfectă şi stabilitatea structurii genetice, care să permită izolarea unor
linii celulare-mutante valoroase şi reproductibile prin mutageneză.
Culturile de celule de lungă durată manifestă o diversitate genetică în rândul populaţiei celulare (există
celule cu număr diferit de cromozomi şi cu diferenţe morfologice semnificative). De aceea, subcultivările repetate
la intervale de timp mai scurte menţin celulele într-o activitate reproductivă mare. Un asemenea ciclu de creştere a
culturii (durata de timp de la iniţierea până la fragmentarea şi subcultivarea unui nou agregat de celule) se
desfăşoară în 3 faze (figura 20):
- faza incipientă, cu activitate intensă a diviziunii celulare;
- faza staţionară, cu plafonarea diviziunii celulare;
- faza de declin: diviziunea celulară se opreşte, cultura îmbătrâneşte şi se degradează dacă nu se trece pe un
alt ciclu de creştere (subcultivare).
Celulele explantelor inoculate "in vitro", pentru a-şi organiza un mod de viaţă propriu trebuie să sufere un
proces de conversie prin trecerea de la celule definitivate structural şi funcţional, la celule meristematice apte de
multiplicare. Această transformare funcţională a celulelor inoculate în suspensiile celulare poartă numele de
dediferenţiere celulară.

Fig. 20 - Ciclul de regenerare al plantelor prin culturi de celule


1-triturare în omogenizator; 2-separarea celulelor; 3,4-formarea calusului; 5-segmentarea calusului; 6,7-formarea rădăcinilor
sau a embrioizilor; 8,9,10-plantule regenerate şi transplantate în sol
Acest proces este complex şi atrage modificări biochimice, fiziologice, morfo-structurale şi morfo-
funcţionale prin mai multe faze succesive (Cachiţă-Cosma Dorina, 1987):
- amorsarea proceselor de diferenţiere;
- producerea dediferenţierii celulelor până la dobândirea caracteristicilor ţesuturilor meristematice de tip
secundar (cambiu);
- continuarea dediferenţierii celulelor până se formează meristemele de tip primar, după care vor regenera
plante. Tot în continuarea dediferenţierii, în această fază pot să mai apară şi centri embriogeni, cu care se poate
continua embriogeneza secundară.
Celulele cultivate într-un volum finit de mediu (cel al flaconului) constituie o microentitate ecologică de
grup celular. Când nutrienţii sunt consumaţi sau concentraţia acestora se reduce, activitatea diviziunii celulare se
reduce treptat până încetează.

15
În general, pentru iniţierea unei culturi de celule în suspensie este necesar să se pornească de la o cultură
stabilă şi activă de calus friabil, uneori aceeaşi cultură de celule se poate obţine direct din explantele unor ţesuturi
vegetale. Rata de creştere a suspensiilor celulare este totdeauna superioară creşterii calusale, datorită accesului
direct, permanent şi uniform al celulelor la elementele nutritive din soluţie. De asemenea, datorită practicării aerării
prin agitarea recipientelor rata de acumulare este mai mare şi favorizată la suspensiile celulare faţă de culturile de
calus. În acest context menţionăm şi faptul că există unele specii de plante şi tipuri de ţesuturi mai sensibile la
schimbul de gaze şi care nu pot fi cultivate prin sistemul suspensiilor celulare.
Culturile de celule se practică fie în recipienţi închişi, metodă care necesită filtrarea periodică şi
introducerea unui nou mediu proaspăt, fie prin sistemul de cultură continuă de tipul bioreactoarelor destinate
culturilor de bacterii şi drojdii. Bioreactoarele au destinaţia obţinerii unor cantităţi mari de biomasă celulară
necesare producerii substanţelor bioactive sau metaboliţi secundari.
6.6.1. Domeniile de utilizare a culturilor de celule
Prin sistemul culturilor de celule s-au obţinut linii celulare specializate în sinteza unor produşi metabolici
de mare valoare economică.
1 - Obţinerea de produşi metabolici secundari
În celulele izolate prin sistemul culturilor "in vitro" se acumulează substanţe foarte variate (uleiuri, răşini,
arome, taninuri, esenţe, coloranţi, alcaloizi etc.) care pot fi utilizate direct sau indirect, în alimentaţia umană, la
prepararea unor medicamente sau produse cosmetice şi ca materii prime în industrie. Având o natură chimică
extrem de diversă, aceste substanţe prezintă proprietăţi variate, ceea ce lărgeşte paleta utilizării lor. Prin
complexitatea lor, anumiţi compuşi extraşi din celulele vegetale nu pot fi înlocuiţi prin sinteze chimice. Tehnologia
culturilor de celule "in vitro", prin controlul riguros şi automatizat al tuturor factorilor necesari şi al proceselor de
fabricare oferă posibilitatea ca indiferent de zona naturală sau sezonalitatea vegetaţiei plantelor, prin sistemul
bioreactoarelor să se obţină cantităţi mari de produse la costuri reduse şi cu mare valoare economică. După C. I.
Milică, 1999, compuşii sintetizaţi prin culturile de celule sunt următorii (tabelul 6):
2 - Multiplicarea prin embriogeneză somatică directă folosindu-se suspensiile celulare embriogene ale
explantelor provenite din lăstari adventivi sau embriogeneză somatică indirectă provenită din culturile de calus.

6.7. INIŢIEREA CULTURILOR DE PROTOPLAŞTI


Protoplastul este acea parte a celulei vegetale care poate fi plasmolizată (deshidratată parţial) şi izolată
prin eliminarea peretelui celular, dar care-şi păstrează potenţialul de a regenera un nou perete celular, de a creşte şi
a se divide (Badea Elena Marcela şi colab., 2001). Fără peretele celular, protoplastul poate fi folosit în lucrări
specifice ingineriei genetice (manipulări genetice), cum ar fi:
- obţinerea de organisme modificate genetic (OMG) prin transgeneză;
- realizarea hibridărilor somatice, cu implicaţii în ameliorarea plantelor;
- regenerarea de plante din calusurile originare din protoplaşti prin organogeneză.
6.7.1. Izolarea protoplaştilor
Protoplaştii se pot izola dintr-o gamă largă de ţesuturi tinere şi organe vegetale cum ar fi: frunze, apexuri,
rădăcini, fructe, coleoptile, stratul de aleuronă (la cerealele boabe), nodurile rădăcinilor, celulele-mamă din
microspori, tetrade de microspori, tuburi polinice, petale de flori, hipocotile, cotiledoane, tulpini, embrioni etc.
(figura 21).

Fig. 21 - Sursele posibile de celule "competente" pentru obţinerea de protoplaşti

16
Izolarea protoplaştilor se poate face cu mare uşurinţă din culturile de calus sau culturile de celule, ambele
cultivate "in vitro" şi în condiţii aseptice, care au avantajul unui control riguros al proceselor care au loc.
Totuşi izolarea protoplaştilor întâmpină două dificultăţi:
- existenţa peretelui celular cu o structură complexă (celuloză 20-30%, hemiceluloză şi pectine 70-80% şi
proteine 10%) imprimă dificultăţi în alegerea enzimelor care realizează degradarea lui;
- turgescenţa celulei (lichidul intra şi intercelular, de tip hipotonic) determină limitarea pătrunderii apei în
exces (potenţial osmotic negativ) prin controlul presiunii exercitată de peretele celular.
Remedierea dificultăţilor prezentate se face prin folosirea unor enzime industriale obţinute prin cultivarea
unor ciuperci ca Trichoderma viride, Aspergillus niger etc. şi prin folosirea plasmolizei provocate de soluţiile
hipertonice, care provoacă pierderea apei din celulă. Astfel, protoplastul se desprinde de peretele celular şi poate fi
izolat. Substanţele utilizate sunt sorbitolul şi manitolul, în concentraţie moderată de 0,5 M pentru a nu extrage toată
apa celulei, provocând un stres hidric dăunător.
Primele încercări de izolare a protoplaştilor au folosit metode mecanice (tăierea ţesutului vegetal
plasmolizat în fâşii subţiri, urmată de absorbţia osmotică a fragmentelor de membrană şi eliberarea protoplaştilor),
care s-au dovedit ineficiente, deoarece sunt greoaie, numărul protoplaştilor viabili obţinuţi este foarte mic şi se
poate aplica numai la ţesuturile cu celule mari şi vacuolizate.
A doua metodă de izolare a protoplaştilor este cea enzimatică, metodă propusă şi aplicată de Cocking E. C.
în 1960 şi care s-a bazat pe folosirea enzimei celulaza, obţinută de la ciuperca Myrothecium verrucaria. Această
enzimă, la care ulterior s-au mai adăugat şi alte enzime de către numeroşi cercetători, distruge prin macerare sau
digestie peretele celular şi rămân protoplaştii.
Cele mai folosite preparate enzimatice sunt grupate în celulaze şi hemicelulaze (celulaza, celulaza R-10,
celulaza RS, celulizină, hemicelulază H-2125, meicelază P etc.), pectinaze (macerozimă R-10, pectinază, pectinal
R-10 etc.) şi alte enzime (glurulază, helicază, zimolază etc.). În general, se folosesc amestecuri de enzime în
distrugerea structurii complexe a peretelui celular, iar concentraţia fiecărei enzime se stabileşte în funcţie de natura
şi vârsta materialului biologic folosit.
Pe lângă enzimele de degradare a peretelui celular, în amestecul de izolare se mai adaugă regulatori
osmotici (sorbitol, manitol), surse de carbon (glucoză, zaharoză), iar pentru păstrarea viabilităţii protoplaştilor este
necesară prezenţa calciului (2-5 mM), a fosforului (0,2-2 mM).
6.7.2. Etapele procesului de izolare şi cultură a protoplaştilor
Sursele de material biologic folosite la izolarea protoplaştilor cu cele mai bune rezultate sunt frunzele
tinere, hipocotile, cotiledoane, ţesuturi embrionare sau meristematice şi chiar suspensiile celulare embriogene în
cazul cerealelor. Cantitatea, viabilitatea şi calitatea protoplaştilor depinde de vârsta (tinereţea) frunzei, condiţiile de
mediu (lumină, temperatură, umiditate) în care au crescut plantele şi de conţinutul în amidon. Pentru ca amidonul
să fie mai redus, ţesutul de pe care se vor preleva explantele se ţine 24-72 ore la întuneric şi astfel protoplaştii
obţinuţi vor fi mai viabili.
Dacă se folosesc frunze de dimensiuni mai mari, provenite de la plantele cultivate în câmp, se elimină
epiderma inferioară, iar dacă frunzele provin de la plantele cultivate "in vitro" limbul se va separa de nervurile
principale şi se taie în fragmente înguste, ce vor fi trecute în soluţia de digestie enzimatică (figura 22).

17
Fig. 22 - Schema generală a obţinerii protoplaştilor şi regenerarea plantulelor
Digestia enzimatică are loc timp de 20-24 ore (la concentraţii mai mici ale soluţiei enzimatice, durata este
mai mare, şi invers), la temperatura de 25-30 0C şi reacţia mediului slab acidă (pH = 5,6-6,8). Soluţia amestecului
enzimatic trebuie să cuprindă un stabilizator osmotic (manitol sau sorbitol), o pectinază (ce va dizolva lamela
mediană şi va separa celulele) şi celulaze + hemicelulaze (care degradează peretele celular celulozic).
Denumirile comerciale actuale la enzime sunt: celulaza R-10, pectinaza Macerozim R-10, Drisdelaza
(celulază + pectinază) etc. Tipurile de enzime şi concentraţia acestora se stabileşte prin tatonări prealabile.
Purificarea protoplaştilor, după digestia enzimatică, se face prin filtrare (filtre speciale de nylon sau din
oţel inox) sau prin centrifugare la viteză redusă. Spălarea protoplaştilor se face cu soluţii osmotice (manitol,
sorbitol) repetat, de 2-3 ori, după care se va adăuga clorura de calciu 0,05-0,4 M pentru stabilizarea membranei
protoplaştilor. Înainte de cultivare se determină viabilitatea protoplaştilor cu coloranţi vitali: albastru Evans sau
diacetatul de fluoresceină.
Cultura protoplaştilor este faza cea mai critică şi necesită parcurgerea unor procese foarte importante:
regenerarea peretelui celular, diviziunea celulară, formarea calusului cu colonii de celule, regenerarea de noi plante
prin culturi "in vitro" folosind calea organogenezei sau embriogenezei.
Protoplaştii se cultivă în medii adecvate lichide, solide sau combinate, lichide cu solide, în funcţie de etapa
evoluţiei lor, dar, în linii generale, aceste medii sunt similare culturilor de celule, cu singura deosebire ce constă în
reducerea concentraţiei, deoarece, în absenţa peretelui celular, protoplaştii sunt foarte eficienţi în preluarea
nutrienţilor din mediu. Aceste medii de cultură trebuie să îndeplinească următoarele cerinţe specifice:
- reducerea treptată a concentraţiei osmotice, în special după regenerarea peretelui celular şi realizarea
primelor diviziuni celulare (după 2-7 zile de la izolare). Menţinerea concentraţiei osmotice iniţiale, după această
fază, afectează diviziunea celulară (formarea calusului). Astfel, dacă la început concentraţia osmotică este de 500-
600 mM/litru, după prima fază aceasta se diminuează progresiv prin diluare;
- densitatea protoplaştilor din mediul de cultură se diminuează pe măsura parcurgerii fazelor regenerative,
având în vedere cerinţele creşterii volumelor de material biologic neoformat. Este cunoscut că densitatea
protoplaştilor pe ml soluţie se determină periodic folosind hemocitometrul şi aceasta are valori pornind de la 0,5-2
x 105 protoplaşti/ml;
- mediile de nutriţie indicate sunt Kao şi Michayluk (1975) pentru formarea calusului şi Murashige-Skoog
(1962) pentru embriogeneză.
Metodele de cultură a protoplaştilor pot fi (Badea Elena Marcela şi colab., 2001):
- suspendaţi într-un strat subţire, de mediu lichid, într-un vas Petri;
- în micropicături de 20-40 ml plasate pe capacul Petri (în vas este mediul);
- în micropicături de mediu lichid în vase Petri;
- pe straturi hrănitoare;
- suspendaţi în mediul lichid aşezat pe un mediu solid;
- imobilizaţi în agar, agaroză sau alginat, situaţie când aceştia pot fi separaţi în mici cubuleţe şi transferaţi
apoi pe alte medii lichide cu concentraţie osmotică ajustată.
Factorii fizici care influenţează succesul culturii protoplaştilor sunt:
- lumina, care poate inhiba diviziunea celulară, mai ales în primele faze (culturile se expun la lumină difuză
sau întuneric);
- temperatura trebuie să fie de 24-260C;
- electrostimularea stimulează morfogeneza (impulsuri electrice de 250-1500 V, timp de 10-50 msec).
În continuare, protoplaştii astfel obţinuţi, dacă nu urmează calea regenerativă prin organogeneză sau
embriogeneză, ceea ce înseamnă multiplicare, se continuă, de regulă, folosirea acestora la metodele manipulării
genetice: hibridarea somatică, transferul de gene cuprins în "tehnologia ADN recombinant" sau ingineria genetică.

18
GLOSAR
de termeni de specialitate

ACID ABSCISIC - hormon vegetal cu rol în latenţă şi senescenţă.


ADN - acidul deoxiribonucleic: constituent esenţial al cromozomilor, suportul molecular al informaţiei genetice, care
codifică sinteza tuturor proteinelor din organism.
ADVENTIV - dezvoltarea unui organ sau embrion, altfel decât în mod obişnuit (din primordii sau zigot); organe
neoformate în locuri neobişnuite.
AGAR - produs extras din alge, utilizat pentru solidificarea mediilor de cultură.
AGREGAT - elemente care unite la un loc formează noduli sau ciorchini. În culturile de ţesuturi, o masă de celule,
de formă diferită, care se pot greu disocia unele de altele, chiar şi prin agitare.
ANDROGENEZĂ - formarea de embrioni haploizi în cazul cultivării "in vitro" a unui grăuncior de polen sau, altfel
spus, dezvoltarea de plante din gametofitul mascul.
APĂ DISTILATĂ - Apă obţinută prin distilare, care nu conţine compuşi organici sau anorganici.
APEX, APICAL - extremitatea unui organ; meristeme apicale = meristeme terminale.
ASEPTIC (sterilizat) - lipsit de ciuperci, bacterii, virusuri, micoplasme şi alte microorganisme.
AUTOCLAV - aparat utilizat pentru sterilizarea cu abur sub presiune.
AUXINE - clasă de substanţe regulatoare de creştere, care determină alungirea celulei vegetale, dominanţa
apicală, iniţierea rădăcinilor etc.
AXILĂ - subsuoară.
CALUS - ţesut vegetal care se formează în mod natural la nivelul suprafeţelor tăiate sau vătămate, cicatrizându-le.
În culturile "in vitro" prin acest termen se înţelege o aglomerare de celule cu o creştere haotică (neorganizată)
şi nelimitată. Calusul poate fi cultivat indefinit, prin transplantări repetate şi din el se pot regenera organe sau
chiar plante întregi.
CALUSOGENEZĂ - formarea calusului.
CAMBIU - meristem; în sens strict - meristem secundar. Ţesut vegetal generator de liber şi lemn, prin care se
asigură creşterea în grosime a tulpinilor, ramurilor, rădăcinilor etc.
CAULIS - tulpină.
CAULOGENEZĂ - procesul de diferenţiere şi dezvoltare a tulpinii.
CIBRID - Hibrid citoplasmatic, care se formează prin fuziunea unui citoplast (citoplasma fără nucleu) cu un
protoplast.
CITOCHININE - substanţe regulatoare de creştere responsabile de diviziunea celulară, de diferenţierea acestora,
formarea de muguraşi, înlătură dominanţa apicală exercitată de mugurele terminal etc.
CLONĂ - un grup de indivizi descendent dintr-un unic individ prin mitoze, fără fecundare, identici din punct de
vedere genetic.
CULTURĂ - totalitatea metodelor folosite pentru înmulţirea şi creşterea organismelor vegetale indiferent de
provenienţa şi dimensiunile lor. În cultura de celule şi ţesuturi vegetale prin această noţiune se înţelege orice
modalitate de creştere a microorganismelor, celulelor, ţesuturilor şi organelor, pe un mediu preparat artificial.
DEDIFERENŢIERE - anularea procesului de diferenţiere a celulelor vegetale şi revenirea lor la starea embrionară,
meristematică. Este un fenomen obişnuit in condiţii "in vitro".
DIFERENŢIERE - pierderea progresivă a caracterelor morfologice şi citofiziologice specifice celulelor embrionare şi
dobândirea caracteristicilor celulelor adulte potrivit unei anumite specializări funcţionale. Celulele diferenţiate îşi
pierd capacitatea de a se divide.
EMBRIOID - embrion nezigotic, generat în cultură. Structura sa este analoagă cu aceea a embrionului zigotic.
Embrioizii pot deriva din celule diploide ("embrioni somatici") sau din celule haploide (din polen = embrioni
androgenetici sau din celulele haploide ale sacului embrionar = embrioni ginogenetici). Are totdeauna
caracteristică structura bipolară, deţinând un pol corespunzător muguraşului şi unul opus, corespunzător
rădăciniţei.
EMBRIOGENEZĂ - dezvoltarea embrionului dintr-un ou. În culturile "in vitro" defineşte procesul prin care se
regenerează un embrion, prin organizarea celulelor şi ţesuturilor în formaţiuni similare embrionului rezultat dintr-
un ou (zigot). Aceste formaţiuni poartă denumirea de "embrioni adventivi" sau "embrioni somatici".
EXCIZIE - tăierea şi prepararea unui ţesut vegetal, organ etc. pentru cultură.
EXOGEN - care se formează, se dezvoltă la exterior; care se datoreşte unei cauze din afara organismului.
EXPLANT - fragment dintr-un organism (apex, organe, fragmente de organe) detaşat de la locul de origine. Prin
cultivare constituie baza unei noi culturi. Operaţiunea de desprindere a explantului se numeşte explantare.
FRIABILITATE - tendinţa celulelor de a se separa unele de altele.
GAMEŢI - celule sexuale mature, mascule şi femele, care se unesc prin fecundare pentru a forma celula ou
(zigotul).
GENĂ - Segment din molecula de ADN (sau ARN viral la ribovirusuri) care conţine informaţia genetică necesară
pentru sinteza unei catene polipeptidice.
19
GENOM - Totalitatea genelor unui organism, prezente în toate celulele acestuia.
GINOGENEZĂ - dezvoltarea unui individ haploid din celulele gametofitului femel.
HAPLOID - cu un singur set de cromozomi.
HIBRID SOMATIC - hibrid (celulă mononucleată) rezultat din contopirea celulelor somatice provenite din părinţi
diferiţi din punct de vedere genetic.
IMPLANT - fragment desprins dintr-un organism şi introdus sau grefat într-un alt organism sau ţesut.
IMPLANTARE - operaţiune prin care o celulă sau un fragment de ţesut este introdus sau grefat în interiorul unui
organism. În cultura de celule şi ţesuturi vegetale prin aceasta se înţelege şi includerea celulelor şi a ţesuturilor
într-un mediu de cultură.
INCUBARE - reprezintă timpul scurs de la inoculare până la sfârşitul perioadei de creştere "in vitro".
INGINERIE GENETICĂ - Ansamblu de tehnici care permit modificarea patrimoniului ereditar al unei celule prin
manipularea genelor "in vitro".
INOCUL - cantitatea de celule aflate sau introduse într-un mediu de cultură pregătit în acest scop.
"IN VITRO" - defineşte un proces care are loc în condiţii sterile de cultură, pe medii artificiale, folosind recipienţi de
cultură din sticlă sau din plastic.
"IN VIVO" - defineşte un proces care se produce în condiţii naturale sau în interiorul unui organism integru.
LĂSTAR - ramură tânără.
LIBER DE VIRUSURI - plante, celule, ţesuturi sau meristeme care nu conţin particule virale şi nici nu manifestă
simptome virale
LINIE CELULARĂ - cultură derivată dintr-o singură celulă. O "linie celulară" se obţine prin izolarea unei singure
celule, care formează apoi o cultură primară. Din aceasta, ulterior, se pot preleva explante pentru o cultură care
va aparţine aceleiaşi "linii".
MEDIU DE BAZĂ - mediu de control al unei culturi, de regulă compuşii anorganici şi organici de bază fără
regulatori de creştere şi vitamine.
MERISTEM - ţesut vegetal tânăr situat la extremitatea organelor, care se înmulţeşte continuu în vederea creşterii
acestora; masiv celular cu celule care se înmulţesc şi din care rezultă toate celelalte categorii de ţesuturi.
MERISTEMOID - grup de celule meristematice cu caracterele respective a cărui potenţială transformare în
meristem radicular sau caulinar este imprevizibilă; astfel de cazuri apar mai ales la nivelul calusului sau sunt
localizate în alte zone decât meristemele.
MICROEXPLANTE - explante de dimensiuni microscopice.
MICROPROPAGARE - propagarea pe cale asexuată sau vegetativă a plantelor "in vitro" (sinonim cu
microînmulţire).
MORFOGENEZĂ - (dezvoltarea formei) - diferenţiere histologică complexă care are ca rezultat constituirea
organelor şi individualizarea organismelor cu tot ceea ce au caracteristic ca formă sau structură; morfogeneza
se petrece în timp, ea este înscrisă în programul genetic al celulelor şi în decursul desfăşurării ei este
confruntată permanent cu condiţiile de mediu.
MULTIPLICARE VEGETATIVĂ - reproducere sau înmulţire asexuată.
MUTAŢIE - schimbarea ereditară, bruscă, a informaţiei genetice dintr-un genom.
NEOFORMAŢIE - formarea de structuri noi: ţesuturi, meristeme, embrioizi etc. Neoformaţiunile se constituie după
dediferenţiere.
OMG - organism modificat genetic - organism al cărui genom a fost modificat prin inginerie genetică; prin
intermediul celulelor sexuale modificarea se transmite la descendenţi.
ORGANOGENEZĂ - formarea şi dezvoltarea organelor. În cazul particular al culturilor de celule şi ţesuturi
vegetale, formarea de rădăcini şi muguri care pot, în final, să regenereze întreaga plantă.
PASAJ - transferul sau transferarea celulelor, cu sau fără diluarea acestora, dintr-un vas de cultură, în altul.
Termenul este sinonim cu cel de "subcultură".
PLANTĂ HAPLOIDĂ - plantă cu un număr gametic de cromozomi (redus la jumătate faţă de numărul diploid).
PLANTULĂ - tulpiniţă generată "in vitro" şi înrădăcinată, ori embrionul germinat.
POLIPLOID - celulă sau organism conţinând trei (triploid), patru (tetraploid) sau mai multe seturi de cromozomi
într-un nucleu.
PRELEVA - a lua o anumită cantitate (relativ mică) dintr-o cantitate totală.
PROLIFERARE - înmulţire anormală prin diviziune.
PRIMORDIU - grup de celule care reprezintă primul stadiu de dezvoltare al unui organ.
PROPAG - structuri folosite în înmulţirea vegetativă (în sens larg).
PROTOPLAST - celula vegetală debarasată de peretele pectocelulozic.
REPICARE - în culturi de celule şi ţesuturi vegetale semnifică procedeul prin care un explant este transplantat sau
răsădit în alt mediu de cultură.
REPRODUCERE - înmulţire - generare de noi indivizi. În natură se întâlnesc mai multe modalităţi de reproducere:
sexuată, cu participarea a doi gameţi diferenţiaţi, unul mascul şi unul femel; asexuată, prin diviziune celulară,
înmugurire, spori, înmulţire vegetativă etc.
SOMATIC - care ţine de corp; referitor la părţi sau procese vegetative, cu două seturi de cromozomi, una maternă
şi una paternă.
SUBCULTURĂ - transferarea celulelor dintr-un vas de cultură în altul. În culturi "in vitro" semnifică operaţia prin
care cultura este subdivizată şi apoi transferată pe un mediu de cultură proaspăt.

20
SUSPENSIE CELULARĂ - tip de cultură în care celulele sau agregatele celulare cresc şi se multiplică suspendate
în mediu lichid.
TOTIPOTENŢIALITATE - proprietatea celulei de a produce un organism întreg sau, altfel spus, capacitatea unei
celule de a forma toate tipurile de celule care se găsesc într-un organism adult.
TRANSPLANT - sistemul viu care este supus operaţiei de transplantare.
TRANSPLANTARE - operaţiunea prin care o celulă, un ţesut sau un organ luat din corp este grefat în altă parte a
corpului, pe un alt organism sau pe un mediu de cultură.
TUMOARE - ţesut care se dezvoltă într-un organism prin înmulţire continuă, anormală, a celulelor. Tumorile pot să
apară în urma unei infecţii (virale sau bacteriene) sau a tulburării echilibrului hormonal, ori pot să aibă o cauză
genetică.
ZIGOT - celulă, în general diploidă, rezultată din fecundarea gameţilor de sex opus.

21