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قسم البيولوجيا
Département de Biologie
N° d’ordre : ……/2018
MÉMOIRE
En vue de l’obtention du diplôme de Master
THEME
Isolement et caractérisation du pathogène Clostridium
difficile
Présenté par :
Soutenu publiquement le :
Devant le jury:
A mes frères
A mes sœurs
AHLEM
Dédicace
encouragements.
Walid
Summary
Over the last two decades, Clostridium difficile infections (CDI) have increased globally and
have become a major public healthcare problem. The extent of CDI in health care facilities in Algeria
is unknown, and it is in this context that this study was undertaken.
The main objective of this study was to isolate C. difficile strains from patients admitted to
some hospitals in Chlef and Ain-Defla.
Although this study has its limitations, especially in terms of sample size and at the same time,
nevertheless the results obtained provide a platform for further studies to better understand the
prevalence of CDI in our healthcare facilities.
Résumé
Au cours des deux dernières décennies, on a assisté à une augmentation des infections à
Clostridium difficile (ICD) à l'échelle mondiale, et ont devenu un problème majeur de santé publique.
L’ampleur des ICD dans les établissements de soins en Algérie est méconnue, et c'est dans ce contexte
que cette étude a été entreprise.
L’objectif principal de cette étude était d'isoler des souches de C. difficile de patients admis
dans quelques hôpitaux de Chlef et Ain-Defla.
Nos résultats confirment la présence de C. difficile dans les établissements de soins algériens.
على مدى العقدين الماضيين ،كانت هناك زيادة في االلتهابات المتعلقة ب Clostridium difficileفي جميع أنحاء العالم
وأصبحت مشكلة صحية عامة كبيرة .إن مدى اإلصابة ب C.difficileفي مرافق الرعاية الصحية في الجزائر غير
معروف ،وفي هذا السياق تم إجراء هذه الدراسة.
الهدف الرئيسي من هذه الدراسة هو البحث عن C.difficileعند المرضى الذين تم إدخالهم في بعض مستشفيات الشلف
وعين الدفلى.
تم تحليل عينات من البراز اإلسهالي الناتج عن استعمال المضادات الحيوية و التي تم جمعها من 39مريضا في
المستشفى من خالل االختبارات الميكروبيولوجية والجزيئية لتحديد سالالت .C.difficile
أظهرت هذه نتائج أن 5مرضى أصيبوا بهذا الممرض ,نتائجنا تؤكد وجود C.difficileفي مرافق الرعاية الصحية
الجزائرية.
على الرغم من أن هذه الدراسة لها حدودها ،خاصة فيما يتعلق بحجم العينات و كمية الوقت إال أن النتائج التي تم الحصول
عليها توفر منصة دراسات أخرى من أجل فهم أفضل النتشار االلتهابات المتعلقة ب C.difficileفي مرافقنا الصحية .
Introduction générale………………………………………………………………………… 01
Conclusions et perspectives………………………………………………………………… 36
Références bibliographiques…………………………………………………………….…. 37
Annexes…………………………………………………………………………………….... 48
Liste des figures
Pendant les 40 années qui ont suivi, C. difficile a été considéré comme un commensal
de l’homme et ce n’est qu’à partir de 1978 qu’il a été reconnu responsable de colites pseudo-
membraneuses (CPM) associées à l’utilisation des antibiotiques (Bartlett et al., 1978), bien
que le premier cas de CPM ait été décrit en 1893 par John Finney chez une jeune femme suite
à une opération chirurgicale (Finney, 1893). Ce pathogène est responsable de plus de 95%
des cas de colite pseudomembraneuse et de 15 à 25% des diarrhées post-antibiotiques
(Larson et al., 1978).
Les infections à C. difficile (ICD) surviennent suite à une prise d’antibiotiques et plus
fréquemment lors d’une hospitalisation, et représentent la première cause de diarrhées
nosocomiales chez l’adulte. Cependant l’existence de formes communautaires d’infections à
C. difficile (ICD) a été aussi récemment démontrée. Une des particularités des ICD est la
tendance aux rechutes observées chez certains patients.
La grande majorité des ICD sont acquises au niveau des établissements de soins. La
transmission des spores se produit entre patients, ou à partir du personnel soignant, ou de
l’environnement hospitalier. Ce pathogène opportuniste tire avantage de la perturbation de la
microflore normale de l’intestin, suite à une prise d’antibiotiques, pour proliférer, coloniser et
nuire á l’hôte (Zar et al., 2007).
Les principaux facteurs de risque des ICD sont l’âge (supérieur à 65 ans),
l’administration d’antibiotiques et la durée d’hospitalisation.
Des épidémies de formes sévères d’ICD, avec des taux de mortalité élevés, ont été
signalées au Canada, aux Etats-Unis puis en Europe durant les deux dernières décennies. Ces
épidémies sont liées à l’émergence d’un clone particulièrement virulent de C. difficile appelé
027. L'impact économique des ICD est très important à travers le monde, le coût associé au
traitement est estimé à plus de sept milliards de dollars par an (Cariou, 2013).
Dans ce manuscrit, nous allons tout d’abord présenter une revue bibliographique sur
C. difficile, ainsi que sur les aspects de la virulence, la physiopathologie et l’épidémiologie de
Introduction
ce pathogène. Nous développerons ensuite nos travaux expérimentaux qui ont consisté à la
mise en évidence de ce germe en Algérie, plus particulièrement au niveau de quelques
hôpitaux de la wilaya de Chlef et Ain Defla. Pour en tirer enfin quelques conclusions à partir
des principaux résultats de ce travail.
Chapitre I Synthèse bibliographique
1. Bactériologie
Clostridium difficile (C. difficile) est un bacille à Gram positif (Figure 1), anaérobie
strict, sporulé retrouvé dans l’environnement ainsi que dans l’intestin de l’homme et de
l’animal (Eckert et al., 2011), il s’agit d’un bacille de 0,5 à 1,9 μm de diamètre sur 3 à 16,8
μm de longueur, non hémolytique caractérisé par la formation des colonies rhizoïdes sur
gélose au sang et ayant une odeur caractéristique de crottin de cheval. Il peut se regrouper en
chaînettes de 2 à 6 cellules, généralement mobiles grâce à une ciliature péritriche.
La bactérie C. difficile est capable d'utiliser de nombreux sucres tels que le glucose, le
fructose et le maltose. Le lactose et l’amidon ne sont pas utilisés comme source de carbone
(Hafiz et al., 1976).
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Chapitre I Synthèse bibliographique
Figure 2 : Culture de C. difficile sur gélose à base du sang (Doosti et Farsani, 2014).
1.2.1. Toxinogénie
1.2.1. A. Toxines A et B
Les gènes tcdA et tcdB codant respectivement pour la toxine A et la toxine B font
partie d’un locus de pathogénicité bien défini, le PaLoc (pathogenicity locus) (Figure 3), tous
deux possèdent leurs propres promoteurs, respectivement P1 et P2, ainsi que leurs propres
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Chapitre I Synthèse bibliographique
sites de liaison ribosomale, mais peuvent être exprimés à partir d’un seul et même promoteur
commun. Chez les souches non toxinogènes, le PaLoc est remplacé par 127 bases d’ADN non
codant. L’élément entier du locus de pathogénicité représente 19,6 Kb constitué de 5 gènes
dont les deux gènes tcdA et tcdB codant les toxines TcdA et TcdB, les gènes tcdR et tcdC
codent pour des régulateurs positif et négatif, le gène tcdE, qui est organisé en opéron avec
tcdB, code une protéine de type holine impliquée dans la sécrétion des toxines (Kuehne et al.,
2011).
La toxine binaire ou CDT (Clostridium difficile transférase), n’est produite que par
certaines souches de C. difficile. Ces souches étaient auparavant rarement trouvées comme
une cause de l'infection à C. difficile (CDI) dans les populations humaines, mais sont
devenues de plus en plus fréquentes au cours des 10 dernières années (Gerding et al., 2014).
La CDT appartient à la famille des toxines ADP-ribosylantes binaires, cette toxine est
constituée de deux sous-unités A et B, la première présente une activité ADP-
ribosyltransférase qui peuvent modifier l'actine, la seconde est responsable dans la liaison de
la toxine aux cellules hôtes et la translocation de la sous-unité A dans le cytosol (Gerding et
al., 2014).
Les protéines exprimées en surface ont plusieurs fonctions. Elles peuvent intervenir
dans la protection de la bactérie face aux agressions extérieures telles que les conditions
toxiques ou les défenses immunitaires de l’hôte, ces protéines vont aussi permettre
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Chapitre I Synthèse bibliographique
l’utilisation des nutriments présents dans l’environnement. L’adhésion spécifique ainsi que les
interactions bactérie-bactérie sont aussi des mécanismes pour lesquels les protéines de surface
ont un rôle (Scott et Barnett, 2006).
1.2.2. A. Capsule
1.2.2. B. Chimiotactisme
La protéine de surface Cwp 84, à une activité protéolytique (Eckert et al., 2010), cette
protéine appartient de la famille cystéine protéase qui joue un rôle dans la dégradation
tissulaire de la cellule hôte ainsi que dans la dissémination du pathogène (Borriello, 1998).
1.2.4. Spore
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Chapitre I Synthèse bibliographique
nombreux stress environnementaux comme les désinfectants, l’alcool, la chaleur, le pH, les
antibiotiques et l’oxygène (Lawley et al., 2009).
2. Epidémiologie
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Chapitre I Synthèse bibliographique
En 2003 et 2004 plus de 2000 personnes sont mortes au Québec, Canada à cause de ce
pathogène (Loo et al., 2005), cette recrudescence est liée à l'émergence de souches
épidémiques dites hyper virulentes dont en premier lieu la souche NAP1/BI/027 (North
American pulsotype 1, Restriction endonuclease analysis groupe BI, PCR ribotype 027). Les
premiers cas ont été recensés au Canada et dans la province du Québec, au début des années
2000, ensuite, l’épidémie s’est propagée aux Etats-Unis puis à l’Europe (Pepin et al., 2004).
Figure 06 : Epidémiologie de la souche 027 aux Etats Unis (Clement et al., 2010).
C. difficile est un germe ubiquitaire largement répandu dans la nature, il se trouve dans
l’eau et le sol (forme sporulée) ainsi que dans le tube digestif de l'homme et de nombreuses
espèces animales sous forme végétatif (Freeman et al., 2010). Le tractus intestinal des
animaux porteurs de C. difficile est une niche écologique pour la multiplication de la bactérie
et la dissémination des spores dans l’environnement (Rupnik, 2007), c’est retrouvé aussi dans
les matières fécales des nouveau-nés avec une fréquence pouvant aller jusqu’à 70 % (Gerding
et al., 1986).
2.2. Transmission
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Chapitre I Synthèse bibliographique
Les porteurs sains, qui sont asymptomatiques, peuvent aussi être une source de
dissémination et de contamination (Alasmari et al., 1981), par ailleurs en milieu hospitalier,
le contact avec les spores de C. difficile .est élevé compte tenu de la présence de patients
hospitalisés infectés par C. difficile facilitant les transmissions croisées, le taux de
contamination environnementale par C. difficile augmente en fonction du portage et/ou de la
présence de symptômes liés à l’ICD, moins de 8 % dans les chambres de patients avec une
culture négative, 8 à 30 % dans les chambres des patients colonisés asymptomatiques et 9 à 50
% des chambres des patients avec une ICD (Sethi et al., 2010; Barbut et al., 2009; Jernigan
et al., 1998). Le personnel de santé peut aussi être impliqué dans ces transmissions croisées
entre patients lors d'un mauvais suivi des règles d'hygiène (Figure 7) (Eyre et al., 2013).
3. Facteurs de risque
3.1.1. Antibiothérapie
Le principal risque de développer une ICD dans plus de 95 % des cas, est la prise des
antibiotiques, en effet, ces derniers vont perturber le microbiote intestinal (Barbut et al.,
2004), ce qui favorise la multiplication et la colonisation de C. difficile, particulièrement les
souches résistantes aux antibiotiques administrés (Merrigan et al., 2003). Les antibiotiques
incriminés sont généralement des antibiotiques à large spectre tels que les céphalosporines de
deuxième et troisième générations, la clindamycine, l’amoxicilline additionné à l’acide
clavulanique, et les fluoroquinolones (Barbut et al., 2000).
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Chapitre I Synthèse bibliographique
Selon Elliot (2007), presque tous les antibiotiques peuvent induire des ICD
(Tableau1), même la vancomycine et le métronidazole qui sont les antibiotiques de choix
pour le traitement des infections à C. difficile.
Tableau 1 : Classification des antibiotiques selon le risque d’ICD (Barbut et al., 2004).
3.1.2. Chimiothérapie
Un autre facteur de risque important pour le développement d’une ICD est l'utilisation
d'inhibiteurs de la pompe à protons (Gerding et al., 2004; Akhtar et Shaheen, 2007).
Cependant, le rôle des IPP dans le développement d’ICD est encore controversé (Novack et
al., 2014; Khanafer et al., 2017).
3.2.1. L’âge
L’âge avancé est l’un des principaux facteurs de risque d’ICD, une valeur d’incidence
élevés a été observés chez les personnes de plus de 65 ans (Pepin et al., 2004; McDonald et
al., 2006), les nourrissons et les enfants sont beaucoup plus susceptibles que les adultes d’être
porteurs asymptomatiques du C. difficile dans leur tube digestif (Viscidi et al., 1981). Le
risque de développer une ICD avec une colite pseudomembraneuse (CPM) est plus important
chez les personnes âgées hospitalisées (Khanna et al., 2012).
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Chapitre I Synthèse bibliographique
Des études ont montré que les patients avec un faible taux d’anticorps sériques
antitoxine A ont plus de risque de développer une ICD (Kyne et al., 2000). Aussi, une
réponse immunitaire insuffisante est associée à un risque de récidives (Kyne et al., 2001).
L'hospitalisation fréquente et la durée de séjour ont été identifiés comme des facteurs
de risque pour les ICD (Freeman et al., 2010), les établissements de santé représentant un
milieu d’infection particulièrement courant et problématique. Les spores sont surtout
transférées aux patients par les mains de membres du personnel soignant qui ont touché une
surface ou un objet contaminé (Viscidi et al., 1981).
Selon Clabots (1992), le taux d'acquisition de C. difficile pour les patients hospitalisés
pendant deux semaines ou moins, est d'environ 13%, et pour les patients hospitalisés plus de
quatre semaines, le taux d'acquisition est de 50%. Plus de 66 % des patients colonisés par C.
difficile au cours d’une hospitalisation restent asymptomatiques (Buyse et al., 2005).
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Chapitre I Synthèse bibliographique
L’hospitalisation d’une personne est donc un facteur de risque non négligeable, surtout
pour les hospitalisations de longue durée qui vont accroitre le risque de colonisation par C.
difficile (Khanna et al., 2014).
4. Physiopathologie
La contamination par C. difficile se fait par l’ingestion de spores qui résiste à l’acidité
gastrique, ces spores se transforment dans l’intestin en formes végétatives qui colonisent le
côlon, cette étape de colonisation est favorisée par une perturbation de la flore digestive
anaérobie de barrière souvent liée à un traitement antibiotique, qui va permettre à C. difficile
de s’implanter et de se multiplier (Eckert et al., 2015; Janoir et al., 2007), la seconde étape
repose sur la production, par la souche toxinogène, de deux toxines A (TcdA) et B (TcdB) qui
sont dotées à la fois de propriétés entérotoxiques et cytotoxiques et qui agissent en synergie
(Eckert et al., 2011; Lyras et al., 2009).
4.1.1. Toxine A et B
Les deux toxines sont capables d’inactiver les protéines de bas poids moléculaire de la
famille Rho liant le GTP en les glycosylant (Just et al., 1998), cette inactivation des GTPases
est un mécanisme original de cytotoxicité par perturbation de la signalisation intracellulaire,
ses effets délétères affectent le cytosquelette et s’exercent à travers la stimulation de signaux
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Chapitre I Synthèse bibliographique
Le mécanisme d’action de la toxine binaire a été très peu étudié, mais il serait
apparenté au mécanisme d’action des autres membres de la famille des ADP-
ribosyltransférases. L’élément CDTb serait activé par clivage, il formerait alors un heptamère
à la surface cellulaire et il se fixerait sur des récepteurs spécifiques. Tout récemment, une
équipe allemande a identifié le LSR (Lipolysis-stimulated lipoprotein Receptor) comme étant
le récepteur membranaire de la toxine binaire de C. difficile. Une fois CDTb fixé au récepteur,
CDTa se lie à CDTb et est internalisé par endocytose, puis CDTa est transloqué dans le
cytosol après acidification de l’endosome (Kaiser et al., 2011). D’après Gulke (2001). La
partie N-terminale de CDTa est responsable de l’interaction avec CDTb et la partie C-
terminale est responsable de l’activité enzymatique, CDTa agirait, par la suite, en ribosylant
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Chapitre I Synthèse bibliographique
L’infection liée aux C. difficile est définie par la combinaison de signes cliniques et de
symptômes, confirmés par la preuve microbiologique de toxines de C. difficile et d’une
souche toxinogène dans les selles, en l’absence d’autre cause, ou par la présence d’une colite
pseudomembrane (Debast et al., 2014).
Une ICD nosocomiale est définit comme celle développant 48 h après le début de
l’hospitalisation ou dans les quatre semaines suivant la sortie de l'établissement de soins. En
revanche, dans le cas d’une ICD communautaire, les premiers symptômes apparaissent dans
la communauté en dehors de tout établissement de soins (Clabots et al., 1992).
Après colonisation du tractus intestinal par C. difficile, le sujet peut soit resté
asymptomatique et être porteur sain soit développer des signes cliniques d'ICD.
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Chapitre I Synthèse bibliographique
Le portage asymptomatique chez les enfants de plus de 2-3 ans est équivalent à celui
des adultes. En revanche, chez le nourrisson (moins de 2 ans), le portage est plus fréquent, il
est de 70 % dans la première année de vie (Rousseau et al., 2011), mais il diminue
rapidement après la première année de vie pour atteindre le pourcentage de 3 % vers l’âge de
2 à 3 ans (Hedge et al., 2008).
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Chapitre I Synthèse bibliographique
Lors d’un cas d’ICD, le patient présente une diarrhée modérée le plus souvent sans
signes généraux d'infection, dans 25 % des cas, la guérison du patient est observée deux à
trois jours après l’arrêt du traitement antibiotique responsable (Barbut et al., 2004).Ce type
d’ICD est souvent rencontré chez l’adulte ne présentant pas de facteurs de risque de
complications. La diarrhée simple est la forme d'ICD la plus observée en communauté,
l'hospitalisation est requise dans les cas les plus graves (Khanna et al., 2012).
Dans 10 % des cas d’ICD, le malade présente des signes cliniques de CPM, les signes
observés sont une diarrhée liquide et abondante non sanglante, avec fièvre dans 75 % des cas,
et des douleurs abdominales dans 70 % des cas (Barbut et al., 2004; Bartlett, 1996), il est
souvent observé chez les malades une anorexie, des nausées, une hyperleucocytose, un taux
de protéine réactive C élevé ainsi qu’un taux d'albumine bas (Hedge et al., 2008).
Le diagnostic d’une CPM se fait par un examen endoscopique qui révèle la présence
de lésions aphtoïdes jaunâtres caractéristiques au niveau de la muqueuse (Figure 10), ces
lésions peuvent être éparses ou confluentes selon le stade de la maladie, ces
pseudomembranes sont constituées de débris cellulaires, de mucus, de fibrine et de leucocytes
(Barbut et al., 2004).
Dans certains cas, une complication avec perforation colique ou mégacôlon toxique
peut se développer, ces deux complications sévères sont parfois fatales (Bauer et al., 2009).
Dans ces cas extrêmes, le taux de mortalité est de 4 %, mais il peut atteindre 35 à 50 % dans
les cas de CPM compliquées (Barbut et al., 2004). Dans de rares cas, il arrive que l’infection
à C. difficile ne se limite pas au côlon, en effet, des manifestations extra-coliques peuvent être
observées, comme une atteinte de l’intestin grêle avec la formation de pseudomembranes
(Jacobs et al., 2001).
D’autres pathologies provoquées par C. difficile ont été rapportées, telles que des
bactériémies, une arthrite réactionnelle, des abcès viscéraux (Ben Abdelghani et al., 2010).
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Chapitre I Synthèse bibliographique
5.2.3. Récidives
La souche mise en cause est, dans 50 % des cas, la souche à l’origine du premier
épisode d’ICD qui a persisté sous forme sporulée dans le côlon; il s'agit alors de rechute.
L’autre moitié des récidives implique une autre souche d'origine exogène, il s'agit alors de ré-
infection (Barbut et al., 2004).
Les récidives peuvent être multiples sur une échelle de temps pouvant s’étaler sur
plusieurs mois voire plusieurs années. Une étude a rapporté le cas d’un patient ayant subi 26
épisodes diarrhéiques (Bartlett, 1996).
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Chapitre I Synthèse bibliographique
Les ICD sont responsables de tableaux cliniques de gravité très variable, allant de la
diarrhée simple, aux formes sévères dominées par la CPM, rare mais potentiellement mortelle
(Debast et al., 2014).
Le tableau clinique de la diarrhée simple est une diarrhée fécale au moins 3 selles non
moulées par jour, sans glaire ni sang visible, nauséabonde, elle peut s’accompagner d’une
fièvre modérée, mais il n’y a pas d’altération marquée de l’état général (Aslam et al., 2005).
Selon les recommandations européennes de l’ESCMID, l’infection a C. difficile sera
considérée comme sévère, dont toute cas présentant au moins 1 signe de colite tels que la
fièvre ≥ 38,5 °C, frissons, instabilité hémodynamique y compris choc septique, défaillance
respiratoire, péritonite, d’iléus, hyperleucocytose (> 15x109/L), augmentation de la créatinine
(>50 % de la valeur de base), élévation du lactate sérique, hypo-albuminémie (<30 g/L),
pseudo-membranes (l’endoscopie), distension colique, diminution du mur colique, infiltration
de la graisse péri-colique, ascite, et les formes d’emblées compliquées (choc, passage en
réanimation, colectomie cas de mégacôlon toxique ou de perforation digestive) (Bauer et al.,
2011; Debast et al.,2014).
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Chapitre I Synthèse bibliographique
Pour garantir la bonne conservation d’un échantillon de selles pour la détection des
toxines et pour la culture, il est recommandé de le stocker à +4°C ou à -80°C (Lalande et al.,
2004).
6.3.1.1. Culture
Le milieu CCEY (cefoxitin cycloserine egg yolk agar: Brazier’s medium) est très
utilisé pour l’isolement et la purification de C. difficile, il est commercialisé sous forme
déshydraté avec une supplémentassions des antibiotiques (Mullany, 2010).
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Chapitre I Synthèse bibliographique
Le glutamate déshydrogénase est une enzyme produite par les souches de C. difficile et
peut être détectée dans les selles soit par agglutination de particules de latex soit par méthode
immuno-enzymatique (IEA), ces tests IEA peuvent se présenter sous forme unitaire ou sous
forme de plaques de micro-titration; ils sont simples et rapides d’exécution (Lalande et al.,
2004).
Malgré une bonne spécificité de ce test vis-à-vis de la bactérie, la GDH peut être
produite aussi bien par les souches toxinogènes que par les souches non-toxinogènes, ce qui
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Chapitre I Synthèse bibliographique
en fait un excellent marqueur de la présence de souche de C. difficile dans les selles mais ne
permet en aucun cas de déterminer le caractère toxinogène ou non de la souche détectée
(Lalande et al., 2004).
6.3.2.2. La sérologie
La mise en évidence des anticorps sériques anti-toxines peut être réalisée par réaction
de neutralisation de l’effet cytopathogène ou par technique ELISA, mais aucun test permettant
le dosage de ces anticorps n’est actuellement disponible (Lalande et al., 2004).
L’interprétation d’une sérologie est difficile étant donné que les IgG anti-toxines A et
B sont détectées dans environ deux tiers de la population mondiale, de plus, lors d’une
infection symptomatique, on relève une augmentation du taux d’IgG anti-toxine A dans
seulement 11 à 68 % et une augmentation du taux d’IgG anti-toxine B dans 44 à 71 % des cas,
ce qui rend l’interprétation d’une sérologie pratiquement difficile (Freeman et al., 2003).
Une étude en 2011 par l’équipe de Eckert, démontre une réponse immunologique
systémique de type IgG et locale de type IgA plus faible Chez les patients présentant une
forme sévère ICD, Eckert observe que les patients présentant une bonne réponse
immunologique lors d’un premier épisode présentent un taux de rechute plus faible.
Le CTA est considéré comme le gold standard historique choisi par la Food Drug
Administration (FDA), L’objectif est de détecter l’effet cytopathogène produit par la toxine B
(Figure 13), manifesté par la ballonisation des cellules (Eckert et al., 2011). Il s’agit
d’inoculer un filtrat stérile d’une suspension de selles sur une culture cellulaire. Plusieurs
lignées cellulaires peuvent être utilisées, Vero, MRC5, CHO, HeP2 (Lalande et al., 2004).
Figure 13: Test de cytotoxicité sur cellules MRC-5 (Lalande et al., 2004).
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Chapitre I Synthèse bibliographique
Cette méthode est sensible, avec un seuil de détection de l’ordre du picogramme, mais
la sensibilité de cette méthode peut varier suivant la lignée cellulaire utilisée (la plus sensible
étant la lignée Vero). La sévérité de l’ICD n’étant pas corrélée à la quantité de toxines, le
titrage de la toxine B ne présente aucun intérêt Les valeurs prédictives positives et négatives
de ce test sont respectivement de l’ordre de 80 à 100 % et de 95 à 100 % (Karasawa et al.,
1997).
Cette technique est peu coûteuse, simple et facile à réaliser, ce qui en fait la méthode
diagnostique de référence d’une infection à C. difficile (Lalande et al., 2004), mais elle
comporte néanmoins quelques inconvénients, parmi lesquels la longue durée d’incubation
allant de 24 à 48 heures (Eckert et al., 2013). De plus, afin de s’assurer de la spécificité de
l’effet cytopathogène, il est nécessaire de neutraliser l’effet cytopathogène obtenu à l’aide
d’un antisérum anti-C. difficile ou anti-Clostridium sordellii (Lalande et al., 2004).
L’identification se fait par la recherche des gènes codant pour les toxines A et B par
amplification génique en utilisant la technique de chaine de réactions de polymérisation
(PCR). Cela permet d’avoir un diagnostic rapide (de 1 à 6 heures) avec une sensibilité
supérieure à 90% et une spécificité de 100% (Barbut et al., 2014).
7. Traitement
7.1. Antibiothérapie
La prise en charge d’un patient avec une ICD simple, ou avec des symptômes peu
sévères est relativement simple. En effet, un arrêt des antibiotiques incriminés ou un
changement d’antibiotique, ainsi qu’une bonne réhydratation et un rééquilibrage
électrolytique du patient, permettent le plus souvent d’arrêté l’infection, en cas de persistance
des symptômes, un traitement spécifique contre C .difficile doit être mis en place. Trois
antibiotiques, le métronidazole, la vancomycine, et récemment la fidaxomicine, sont
recommandés pour le traitement d’une ICD (Figure 14) (Ackermann et al., 2001).
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Chapitre I Synthèse bibliographique
Ces dernières années, le taux d’échec des traitements par métronidazole est en
augmentation surtout avec l’émergence de la souche hyper-virulente NAP1/B1/027 (Sinh et
al., 2011).
Figure 14: Protocole de traitement des infections à C. difficile (Bauer et al., 2009).
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Chapitre I Synthèse bibliographique
Les rechutes des ICD peuvent être multiples, sévères et de plus en plus invalidantes
pour les patients, les deux paramètres, sévérité et chronicité, peuvent avoir des conséquences
pour le quotidien des patients. Pour ces patients, la transplantation fécale peut être envisagée
(Silverman et al., 2010).
La transplantation fécale, permet dans la majorité des cas de guérir les patients
(Gough et al., 2011), une étude par Aas en 2003 sur 317 patients traités par transplantation
fécale, démontre un pourcentage de guérison de 92 % jusqu’à la guérison totale.
Les probiotiques ont été utilisés afin de restaurer l’équilibre du microbiote (Hickson,
2011). Certaines espèces de micro-organismes comme Saccharomyces boulardii ou des
souches de Lactobacillus ont donné des résultats dans la prévention des récidives de
l’infection (Hickson et al., 2007; McFarland, 2006).
Outre l’antibiothérapie et la transplantation fécale, les récidives des ICD peuvent aussi
être prévenues par une immunothérapie passive par des immunoglobulines en intraveineuse
(Surawicz et al., 2013). Des études ont montré un taux de récidives de 7% dans le cas de
24
Chapitre I Synthèse bibliographique
traitement par les anticorps monoclonaux, mais il restent à valider par d’autres études
(Abougergi et al., 2010; Koulaouzidis et al., 2008).
7.5. Vaccination
Plusieurs cibles vaccinales sont actuellement étudiées pour prévenir les récidives
d’ICD ainsi que pour empêcher la colonisation de C. difficile dans le tube digestif (Surawicz
et al., 2013).
8. Prévention
La prévention de l’infection repose sur le bon usage des antibiotiques, une diminution
d’incidence d’ICD a été observée suite à la restriction d’usage de certaines classes associées à
un risque élevé d’ICD (Climo et al., 1998). La plupart de ces études prennent rarement en
compte une exposition au C. difficile lors de l’évaluation des résultats, ainsi, les efforts pour
démontrer les effets de la restriction des antibiotiques peuvent être gênés par les interventions
de contrôle de l’infection qui affectent le risque d’acquérir le C. difficile (Davey et al., 2013).
25
Chapitre I Synthèse bibliographique
Les désinfectants de surfaces habituellement utilisés ne sont pas efficaces sur les
formes sporulées de C. difficile, la désinfection de surfaces avec une solution à base
d’hypochlorite a été associée à une incidence réduite de l’ICD (Hacek et al., 2010; Fawley et
al., 2007; Wilcox et al., 2004). De nouveaux produits à base de peroxyde d’hydrogène se sont
montrés aussi efficaces mais des considérations pratiques, la nécessité de clore
hermétiquement les chambres et d’avoir accès à un équipement spécialisé, et financières
limitent son application (Barbut et al., 2009; Shapey et al., 2008; Doan et al., 2012).
26
Chapitre II Matériel et méthodes
1. Échantillonnage
Cette étude a été entretenue dans trois Hôpitaux à la wilaya de Chlef (hôpital de Hay
Bensouna, Chettia et Chorfa) et un hôpital à la wilaya d’Ain Deffla (Sidi Bouabida) à partir de
10 services différents durant la période allant du mois de Janvier jusqu'à mois de Mai; afin
d’isoler, identifier et caractériser le pathogène nosocomial anaérobie, C. difficile.
Un total de 39 prélèvements a été effectué à partir des selles diarrhéiques des patients
hospitalisés sous traitement antibiotiques, et récoltés dans des pots de coproculture stériles.
Prélèvements Etablissement
Source Total
hospitalier
SERVICE Nº
Pédiatrie 7
Merouani Abed (Chettia)
Médecine interne 3 13
Isolement 3
Oncologie 1
Pédiatrie 8
Bouabida(Sidi Bouabida) 11
Medecine interne 3
27
Chapitre II Matériel et méthodes
Un volume de selles diarrhéiques est melangé avec le même volume d’éthanol absolu.
Le mélange est homogénéisé par vortex (VWR, W3S40); ensuite laissé pendant 1 heure (h) à
température ambiante. Le mélange est centrifugé (MSE Micro Centaur, sanyo, UK) à 13 000
tr/min pendant 10 minutes (min). Le surnageant est éliminé et le culot contenant les spores
est laissé sécher à température ambiante pendant 15 minutes, puis suspendue dans 0.5 ml
d’eau physiologique stérile. Ce traitement permet de sélectionner exclusivement les spores en
éliminant toutes les bactéries de la flore fécale (Borriello et Honour, 1981; Tenover, 2011).
4. Identification de C. difficile
28
Chapitre II Matériel et méthodes
Une observation macroscopique des colonies a été faite à l’œil nu et par une loupe
binoculaire, ce qui permet de décrire la taille, l’aspect, la couleur, l’odeur, la consistance, le
contour, l’opacité, et la forme des colonies (Denis et al., 2007).
Le test de Gram est utilisé pour classer les bactéries, selon la structure de leur paroi
cellulaire, en Gram positif ou négatif.
5. Identification moléculaire
Les souches de C. difficile isolées par culture ont été identifiées par PCR en utilisant
une paire d’amorce (908 CLD-gluDs : GTCTTGGATGGTTGATGAGTAC et 909 CLD-
gluDas : TTCCTAATTTAGCAGCAGCTTC) permettant d’amplifier le gène codant pour
l’enzyme glutamate déshydrogénase (GluD), uniquement présente chez C. difficile.
L’amplicon généré est de 158 pb (Paltansing et al., 2007).
29
Chapitre II Matériel et méthodes
1g d’agarose est dissoudre dans 100 ml du tampon de (TAE) pour préparé un gel de
1%, puis placé au four à micro-onde jusqu'à dissolution total et obtention d’une phase
homogène (limpide). Après refroidissement ,10µl de BET est incorporé.
5.3.2 Migration
30
Chapitre III Résultats et Discussion
Durant la période entre Janvier et Mai 2018, 39 échantillons de selles diarrhéiques ont
été collectés à partir de patients admis aux hôpitaux de Chettia, Hay Bensouna, Chorfa et Sidi
Bouabida. Chaque prélèvement de selle est accompagné d’une fiche de renseignements
(annexe 1). L’ensemble de ces renseignements sont montrées dans le tableau (annexe 2).
Cette étude a été menée dont l’objectif était d’estimer la prévalence des infections à C.
difficile au niveau de quelque hôpitaux à Chlef et Ain Defla. L’isolement de C. difficile a été
réalisé à partir de selles diarrhéiques de patients hospitalisés.
Pour rappeler, les patients étaient inclus dans cette étude s'ils présentaient une diarrhée
aqueuse, et ont reçus des antibiotiques, 48 heures après leur admission. L’identification de C.
difficile a été effectuée par des méthodes microbiologiques et moléculaires (PCR).
Figure 17 : Aspect des colonies de C.difficile sur columbia au sang après 48h d’incubation en
anaérbiose.
31
Chapitre III Résultats et Discussion
La coloration de Gram mis en évidence des bacilles gram positif avec la présence des
spores ovales subterminales non déformantes (Figure18).
Ces souches suspectes de C. difficile ont été soumises à une identification par PCR,
par l’amplification du gène codant pour le glutamate déshydrogénase (GluD).
Les résultats de la PCR (figure 19), montrent que 5 souches sont positives, suite à la
présence d’une bande d’un amplicon de 158 pb correspondant à la taille attendue de
l’amplification du gène gluD par la paire d’amorces utilisée.
32
Chapitre III Résultats et Discussion
Parmi les 39 prélèvements obtenus entre Janvier et Mai 2018 à partir de quatre
hôpitaux, cinq souches en total ont été isolées et identifiées par culture et PCR ; trois souches
(27,27%, 3/11) de l’hôpital de Hay Bensouna, une souche de l’hôpital de Chettia (7,69%,
1/13) et une de l’hôpital de Sidi Bouabida (9,09%, 1/11). Aucune souche n’a été isolée à
partir de l’hôpital de Chorfa (Figure 20).
Il est clair que la fréquence d’isolement la plus élevé s’est produite au niveau de
l’hôpital de Hay Bensouna ; ceci peut être expliqué par le fait que cet hôpital est le plus grand
de Chlef.
Notre résultat montre une présence des ICD en Algérie et précisément au niveau des
wilaya de Chlef et Ain Defla.
33
Chapitre III Résultats et Discussion
Hay Bensouna
B4 Féminin 60 ans Cardiologie Claforan
Les quatre patients B2, B4, B8 et C5, de sexe féminin, sont âgées de 70, 60, 69 et 32
ans respectivement. La première patiente (code d’échantillon B2), était sous chimiothérapie,
alors que les trois autres patientes (B4, B8 et C5) ont subi une antibiothérapie par
l’administration de claforan, céfotaxime (céphalosporine de 3ème génération), et flagyl
additioné au claforan respectivement.
Barbut et al. (2004) ont reportés que le principal risque de développement d’une ICD
dans plus de 95 % des cas, est la prise des antibiotiques. Nos résultats confirment cette
information, car tous les patients porteurs de C. difficile ont subi une antibiothérapie lors de
leur période d’hospitalisation.
Dans notre étude, les quatre patients (B4.B8.C5.D4) ont été traités par claforan et
céfotaxime (céphalosporine de 3ème génération), amoxypen (amoxyciline) qui sont les
antibiotiques les plus incriminés dans les ICD (Barbut et al. 2004).
34
Chapitre III Résultats et Discussion
Dans cette étude une patiente été admise pour un traitement chimio-thérapeutique
contre un cancer. Chez cette patiente une souche de C. difficile a été isolée. La présence de C.
difficile chez des patients cancéreux subissant des traitements chimio-thérapeutiques a été
rapportée de se produire avec une fréquence de 5 à 9 % (Kohn et al., 2015). La
chimiothérapie, par fluorouracil ou méthotrexate, a été démontrée comme une facteur qui
augmente le risque d’ICD, en causant la perturbation de la flore gastro-intestinale, et
l’affaiblissement du système immunitaire (Fekety, 1997; Nylund et al., 2011).
Il est bien établit que les infections liées à C. difficile acquises aux niveaux hospitaliers
est de l’ordre de (15-30%) (Mylonakis et al., 2001). Nos fréquences d’isolements
préliminaires (7-27%) sont proches de ces valeurs. Cependant, il se peut que ces fréquences
ne reflètent pas la réalité à cause de l’échantillonnage limitée dans le temps et l’espace de
notre étude.
35
Conclusion
Les fréquences d’isolement obtenues dans notre étude sont de l’ordre de 0%, 7,69%,
9,09%, 27,27% dans les hôpitaux de Chorfa, Chettia, Sidi Bouabida et Hay Bensouna,
respectivement.
A la lumière de cette étude, il est important de sensibiliser les personnels soignants sur
les risques posés par C. difficile au niveau des hôpitaux.
En perspective, il est donc raisonnable, sur la base des résultats de notre étude,
d’envisager une enquête plus étendu dans le temps, l’espace et la taille de l’échantillon, afin
de mieux comprendre l’ampleur de la prévalence des ICD au niveau de nos hôpitaux ; et ceci
est primordial pour une meilleure prise en charge des patients.
Enfin, les résultats de telles études pourraient être utiles aux autorités de la santé
publique afin de mettre en œuvre des programmes de surveillance et de prévention contre
cette redoutable bactérie pathogène.
36
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Annexes
Annexe 1 : Fiche de renseignements
48
Annexes
Annexe 2 : Données des patients sources des prélèvements de selles pour C. difficile
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