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CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
NATAL
2015
JONALSON NOGUEIRA ARAÚJO
NATAL
2015
Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do
Centro de Biociências
96 f.: il.
À minha querida esposa Emanuella pelos empurrões e por ter me estendido a mão
Aos meus filhos, Bianca e Ian, que sem ainda nem saber foram meus grandes
incentivadores.
À outra parte da minha família, meu sogro Josa, minha sogra Fátima, minha
cunhada Kyzis e minha tia/mãe Isaura, que me deram todo o suporte que precisei e
ainda minha mãe Socorro e minha irmã Gabi pelo apoio e compreensão.
Ao meu pai, João (in memoriam) pelo caloroso abraço que ainda sinto até hoje.
AGRADECIMENTOS
Ao senhor nosso Deus, por ter me proporcionado todas as condições para que eu
conseguisse chegar até este momento.
À minha família, por todo o apoio que me deram durante todo este tempo.
À minha graciosa e amada esposa Emanuella e aos meus amados filhos Bianca e
Ian, que tanto me ajudam e me inspiram a seguir em frente.
Ao meu grande amigo Anderson Felipe (Negão), pela ajuda, pelas brincadeiras, pela
honestidade e acima de tudo por ser uma pessoa que pude conversar e contar em
todos os momentos deste mestrado.
À minha querida amiga Luciana Rabêlo, que muitas vezes me deu uma direção
quando me senti perdido, pela companhia e conversas matinais.
Aos grandes amigos Antônio e Raphael, que além da amizade, me ajudaram muito
na realização dos experimentos.
Aos novos amigos e colegas de laboratório Leandro e John que me deram uma
grande força na reta final do meu trabalho
À minha grande amiga Isabela, que me ajudou muito durante este trabalho
À Adeliana, que sempre me deu muita força e é uma pessoa que respeito muito.
À minha fabulosa turma de mestrado e aos amigos que fiz neste período e que
perduram até hoje: Demétrios, Paula, Diego, Sinara, Kahena, Romulo, Marina,
Evellyn, Mayara.
À Professora Adriana Ferreira Uchôa, por ter me aceito como seu aluno, por ser
sempre gentil e acolhedora e por todo o apoio e incentivo durante a minha formação
na graduação e na pós-graduação.
Ao professor Hugo Alexandre de Oliveira Rocha, pela amizade, por ter me acolhido
e ter se preocupado em momentos essenciais em que necessitei.
Ao professor João Paulo Matos Santos Lima, pelos conselhos, explendorosas aulas
e por ter me dado a honra de tê-lo em minha banca de defesa.
À Dra. Jailma Almeida de Lima, pelo carinho e atenção e por ter me dado o privilegio
de tê-la em minha banca de defesa.
Plant seeds are reservoirs of molecules with great potential for development of
bioproducts and for this reason special attention has been directed in the search of
bioactive proteins with antimetabolic and pharmacological properties action. Plant
lectins are proteins with biological activities related to defense, but that can be used,
heterologously as interfering with the metabolism of other organisms. A Canavalia
marítima seeds lectin (CML) was purified in two steps by ammonium sulfate
fractionation followed by affinity chromatography on Sephadex G-50 column. CML was
analyzed by SDS-PAGE and part of its amino acid sequence determined by mass
spectrometry. The 20 resulting residues identified showed 100% identity with conm.
ConM was tested against erythrocytes of human peripheral blood and it was observed
absence of toxicity when incubated with up to 1000 µg/mL of protein. Since against
mononuclear cells, the lectin was not significantly toxic at concentrations of 1, 2.5 and
5 µg/mL, but it was from concentration 7 µg/mL. Against RAEC lineage protein showed
no significant toxicity with 25 µg/mL of protein. Other cytotoxicity assays revealed that
CONM is toxic for the tumor cell lines A549, 786-0, HT-29 and HeLa in the range
between 24 and 72 hours, particularly at concentrations of 5, 7 and 10 µg/mL. ConM
was still able to agglutinate promastigotes of Leishmania spp at concentrations of 6.25
µg/mL. About action against Candida spp any of the tested concentrations (1 to 500
µg/ml) was able to interfere with growth. When evaluated bacteriostatic activity, ConM
in concentrations ranging from 0.39 to 400 µg/mL did not inhibit the growth of
Escherichia coli, but the concentration of 25 µg/mL proved active aganist
Staphylococcus aureus, reducing its growth by 75%. Based on these data, the lectin
corresponds to a isolectin ConA-like, and its anti-tumor properties, bacteriostatic and
binder for Leishmania need to be further investigated for its biotechnological potential
exploited.
2 OBJETIVOS ................................................................................................... 38
3.2 MÉTODOS............................................................................................... 41
3.2.1 PURIFICAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DA LECTINA DO TIPO ConA DAS
SEMENTES DE C. Maritima (CML - ConM)....................................................... 41
4 RESULTADOS ............................................................................................... 53
5 DISCUSSÃO .................................................................................................. 70
7 REFERÊNCIAS .............................................................................................. 81
1 INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA
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Cuba e “Noumahlanga” em várias partes da África. Taxonomicamente possui a
seguinte sinônimia botânica: Canavalia rosea, Canavalia apiculata, Canavalia
arenicola, Canavalia obtusifolia, Dolichos emarginatus, Dolichos roseus e Dolichos
maritimus (MENDOZA-GONZÁLEZ; MARTÍNEZ; LITHGOW, 2014). Abaixo segue a
descrição taxonômica:
Reino: Plantae
Subreino: Tracheophytas
Filo: Magnoliophyta
Classe: Magnoliopsida
Subclasse: Rosidae
Ordem: Fabales
Família: Fabaceae
Subtribo: Diocleinae
Gênero: Canavalia
Subgênero: Canavalia
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Figura 1 – Canavalia maritima em seu local de coleta, fruto e sementes. Visualiza-se a flor característica
e as folhas arredondadas. Os frutos são vargens robustas, deiscentes, que possuem de três a sete
sementes dormentes de cor marrom marmorizado. Fonte: autor e stuartxchange.org.
1.3 LECTINAS
A característica que define todas as lectinas é sua capacidade de ligação a
carboidratos e a preservação desta interação durante a evolução sugere que esta
atividade é essencial para o papel funcional destas proteínas (GADELHA et al., 2004,
2005). O termo lectina é amplamente empregado para designar todas as proteínas,
que não imunoglobulinas, que possuem pelo menos um domínio não catalítico,
chamado de domínio reconhecedor de carboidratos (DRC) ou sítio de ligação a
carboidratos (SLC).
São amplamente distribuídas na natureza e capazes de reconhecer e se ligar
especificamente e reversivelmente a monossacarídeos ou oligossacarídeos, sem
alterar as estruturas covalentes de qualquer ligante glicosídico (ASSREUY et al.,
2009; DELATORRE et al., 2013; MOREIRA et al., 1993; PINTO et al., 2013; THAYS
et al., 2013). Seus efeitos biológicos são normalmente bloqueados pela presença de
carboidratos (BEZERRA et al., 2007 DELATORRE et al., 2006; MARQUES &
BARRACO, 2000). Ao interagirem com glicoconjugados de superfície celular, as
19
lectinas podem promover a formação de ligações cruzadas entre células adjacentes,
desencadeando o processo denominado aglutinação (ALONSO, et al., 2001;
PEUMANS & VAN DAMME, 1995).
No decorrer dos anos as lectinas têm se firmado como proteínas bastante
atrativas devido seu uso extensivo como sondas para caracterização e isolamento de
açúcares simples e complexos (RAMOS et al., 1996a, 1996b). A distribuição espacial
dos sítios de ligação a carboidratos em proteínas oligoméricas determina suas
habilidades de distinguir e de cruzar ligantes sacarídicos multivalentes ou arranjos de
glicoconjugados específicos da superfície celular (DELATORRE et al., 2006). Estas
interações celulares mediadas por lectinas podem ocorrer de duas maneiras: Quando
lectinas da superfície celular transduzem um sinal depois da interação com um
sacarídeo ligante ou quando lectinas solúveis se ligam a carboidratos de glicolipídios
ou glicoproteínas na superfície da célula (BREWER et al., 2002).
Algumas famílias de lectinas apresentam sítios de ligação altamente
conservados, mas exibem diferentes atividades biológicas assim como diferentes
níveis de potência. A mutagênese, um processo evolucionário que causa alterações
pontuais nos genes, que pode modificar a sequência de aminoácidos das proteínas e
a interações existentes entre essas cadeias de aminoácidos podem aumentar ou
reduzir a potência dos efeitos biológicos, até para aquelas proteínas que possuem
estruturas muito similares (DELATORRE et al., 2006).
Sabendo dos efeitos biológicos das lectinas contra os mais diversos tipos de
organismos, cientistas de todo o mundo estão investindo em pesquisas que possam,
de alguma forma, utilizar estas proteínas como precursores na produção de novos
medicamentos, na vetorização de fármacos de difícil absorção a sítios específicos no
organismo ou até como marcadores na detecção de doenças e microrganismos;
apresentando grande potencial para o diagnóstico e tratamento de doenças (GOMES-
FILHO, 2014; THAYS et al., 2013).
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Merolectina B Hololectina
A
Heveína ConA
C Quimerolectina D Superlectina
Ricina
TxLC-I
E Multilectina
Jacalina
22
1.3.2 LECTINAS E SUAS FUNÇÕES
As lectinas estão presentes em quase todos os organismos, ou seja,
microrganismos, plantas e animais. Entretanto essas proteínas são encontradas em
maior quantidade em leguminosas e gramíneas (IORDACHE et al., 2015; PUSZTAI,
1989). O fato das lectinas terem larga distribuição em plantas sugere alguma
importância fisiológica para estas moléculas (DIAS et al., 2015; ETZLER et al., 1985;
LIENER et al., 1976). As funções das lectinas em vegetais podem ser variadas e
parecem ter relação com os estágios de maturação e germinação das sementes
(HAMID et al., 2013; HOWARD et al., 1972), assim como parecem estar relacionadas
com os mecanismos de defesa da planta (DIAS et al., 2015; LIENER et al., 1976). As
proteínas em plantas podem exercer papeis autólogos como reserva, na regulação de
fitohormônios que controlam seu crescimento e desenvolvimento (DELATORRE et al.,
2013), no armazenamento e transporte de carboidrato em sementes e na associação
do vegetal a simbiontes (FERNANDES, 2008).
As plantas são excelentes fontes nutritivas para os organismos. Como tal, elas
são constantemente desafiadas por herbívoros, vírus, bactérias, fungos, nematoides
fitófagos e insetos que diretamente as utilizam como fontes de micro e
macronutrientes (ARAÚJO-FILHO et al., 2010a; DELATORRE et al., 2013). Muitas
lectinas de plantas mostraram-se específicas para glicoconjugados presentes em
organismos fora deste reino, enquanto que estes glicoconjugados são pouco
abundantes ou ausentes em vegetais (HOPKINS; HARPER, 2001; RIPOLL et al.,
2003; WONG et al., 2010). Peumans e Van Damme (1995) propuseram que as
lectinas de plantas desempenham um papel fundamental nas defesas gerais contra
um grande número de fitoagressores.
Foi avaliado que quando ingeridas, as lectinas não são degradadas durante sua
passagem pelo trato digestório e podem reconhecer resíduos de carboidratos
presentes nas células intestinais, ligando-se a eles. Essa ligação às células das
microvilosidades intestinais provoca interferência na absorção e utilização de
nutrientes, levando a uma rápida perda de peso e inibição do crescimento de
organismos experimentais. Além dos efeitos degenerativos nas membranas celulares,
as lectinas mostraram a capacidade de inibir várias enzimas intestinais
(VASCONCELOS; OLIVEIRA, 2004).
23
Devido a habilidade das lectinas em decifrar glicocódigos, integrais de
membrana ou solúveis, elas participam em inúmeros processos biológicos, que vão
desde comunicação celular, reconhecimento de célula-alvo, adesão celular, interação
célula-matriz, defesa dos hospedeiros, fertilização, na caracterização de grupos
sanguíneos (DIAS et al., 2015; LIS; SHARON, 1998); na estimulação da mitogênese
de linfócitos; e outros a infecções virais, bacteriana, micoplasmal e parasitaria,
metástases, crescimento e diferenciação em cânceres (ASSREUY et al., 2009;
BEZERRA et al., 2007; IORDACHE et al., 2015; JIANG et al. 2015; SHARON; LIS,
2004).
As lectinas ainda podem ser utilizadas na investigação de estrutura de proteína
e carboidratos em células (SILVA; SILVA, 2000); na utilização em matrizes comerciais
de afinidade, empregadas na purificação e caracterização de polissacarídeos e
glicoconjugados (HAMID et al. 2013; LIMA et al., 1997); e como agentes defensivos
na agricultura, em função de sua ação fungicida, bactericida e inseticida
(GAIDAMASHVILI; VAN STADEN, 2002; HAMID et al., 2013; PEUMANS et al., 2000.).
24
relacionados evolutivamente e estruturalmente (DIAS et al., 2015; VAN DAMME et al.,
2008). Estes diferentes domínios de ligação a carboidratos foram nomeados:
homólogos da aglutinina de Agaricus bisporus, amarantininas, homólogos da quitinase
classe V, família das cianovirinas, família das aglutininas de Euonymus europaeus,
Família das aglutininas de Galanthus nivalis, proteínas com domínios heveína,
jacalinas, proteínas com domínios lectínicos de leguminosas, domínios LysM, família
das aglutininas de Nicotiana tabacum e família da ricina-B. Cada domínio lectínico tem
suas próprias características interagindo com um ou mais sítios de ligação a
carboidratos (DIAS et al., 2015; IORDACHE et al., 2015; VAN DAMME et al., 2008,
1998).
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comumente conhecida como feijão de praia ou pela nomenclatura binária Canavalia
maritima (DELATORRE et al., 2013). É uma hemaglutinina de aproximadamente 25.5
kDa por monomêro, classificada como hololectina. O tetrâmero que forma a proteína
consiste de dois dímeros canônicos de lectinas de leguminosa, sendo cada monômero
formado por uma cadeia polipeptídica de 237 resíduos de aminoácidos (DELATORRE
et al., 2013; MOREIRA E CAVADA, 1984).
28
similaridade com ConA, entretanto, alguns resíduos foram corrigidos por Gadelha et
al. (2005), resultando em um aumento na similaridade para 98%. Assim, apenas cinco
resíduos de aminoácidos diferem a ConA (D58, A70, M129, E192 e P202) da ConM
(G58, G70, S129, D192 e S202). O principal alvo dos estudos de afinidade das lectinas
é como diferenças estruturais podem alterar a atividade biológica e melhorar a
especificidade por glicanos na superfície celular. Em ConM, uma única modificação
na sequência de aminoácidos observada em comparação com outras lectinas do tipo
ConA amplifica suas propriedades. (DELATORRE et al., 2006).
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A B
Figura 3 – Contato entre os dímeros canônicos de ConM. Cada resíduo nos sítios C1 e C2 interconecta
os dímeros (A) e as interações que estabilizam a estrutura estão na mesma linha (B). Adaptado de
Gadelha et al. (2005b).
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A B
Figura 4 – O duplo sítio de ligação iônica na ConM nativa (A) e o potencial eletrostático na superfície
do dímero canônico de ConM. Neste último o círculo amarelo aponta o potencial eletrostático negativo
dos DRC. Adaptado de Gadelha et al. (2005b).
Uma outra atividade descrita para ConM está relacionada a sua interação com
diferentes formas de Ácido acético 3 idoleico (IAA) é uma estratégia para tornar o este
fitohormônio indisponível para a célula. Assim este papel fisiológico proposto para as
lectinas de plantas pode ser um novo mecanismo pela qual os níveis de IAA são
diminuídos além da destruição e formação de novos complexos em determinados
estágio da germinação de sementes (DELATORRE et al., 2013).
Também foi observado por microscopia de fluorescência que ConM liga-se aos
31
conídios não germinados do fungo Colletotrichum gloeosporioides que causa doenças
em plantas (ARAÚJO-FILHO et al., 2010a, 2010b). ConM também é capaz de inibir o
crescimento planctônico e a formação de biofilmes por Streptococcus mutans,
interferindo na expressão de genes que codificam enzimas relacionadas com a
adesão formação e regulação dos biofilmes (CAVALCANTE et al., 2011; THAYS et
al., 2013).
32
As interações entre lectinas e carboidratos promove uma mudança na fisiologia
da célula. As expressões gênicas são alteradas e como resultado pode-se observar,
alterações metabólicas (FAHEINA-MARTINS et al., 2011). A alta especificidade de
interação com carboidratos faz das lectinas potentes marcadores moleculares para
glicoconjugados específicos de células tumorais. Além disso, estas proteínas podem
ser conjugadas com uma série de agentes carreadores agindo pontualmente em
células malignas (RABELO et al., 2012).
As lectinas de plantas representam um bem definido e não tradicional recurso
acerca de componentes anticâncer, entretanto seu papel na morte celular programada
ainda é pouco conhecido. Nos dias atuais existe um grande interesse em Lectinas de
leguminosas, principalmente pela sua potencial aplicação como um agente
antitumoral. Tem sido demonstrado que lectinas de plantas desencadeiam
importantes processos celulares, além de atuarem como adjuvantes na quimioterapia
e radioterapia (HAMID et al., 2013; JIANG et al., 2015; ZAROGOULIDIS et al., 2015)
Estas proteínas têm atraído o interesse de pesquisadores devido as suas
vastas atividades biológicas, da qual incluem a habilidade de parar o ciclo celular nas
fases G1 e G2/M, alterar a expressão de caspases pró-apoptótica e aumentar a taxa
de Bax/Bcl-2 em células neoplásicas (KLAFKE et al., 2013). Neste contexto, as
lectinas de leguminosas têm sido amplamente destacadas por possuírem efeitos
inibitórios específicos ou citotoxicidade e por induzir apoptose em uma ampla
variedade de células tumorais (SILVA et al., 2014).
33
membrana vem sendo identificados como mediadores da ligação parasito-célula,
dentre estas moléculas destacam-se dois glicoconjugados: a protease gp63 (uma
glicoproteína) e o lipofosfoglicano (LPG) que ligam-se ao receptor do complemento do
tipo 3 (CR3), manose-fucose e fibronectina. A superfície celular dos
tripanosomatídeos é revestida ricamente por moléculas glicosiladas, a maioria
ancorada à membrana celular. Estes glicoconjugados formam uma densa camada
superficial protetora, cobrindo por inteiro a superfície da célula, intermediando as
interações do parasito com seus hospedeiros. (BARBOSA, 2012). Leishmania
apresenta em sua superfície glicoconjugados ricos em manose que são críticos para
virulência parasitária (GOMES-FILHO, 2014). Além disso, outros glicoconjugados
estão presentes na superfifie celular deste protozoário, como os glicosil-fosfatidil-
inositol (GPI), os proteofosfoglicanos (PPG) e outras glicoproteínas contendo âncoras
GPI.
Leishmania (Viannia) brasiliensis é o princicipal agente etiológico da
leishmaniose cutânea nas américas sendo responsável por causar duas diferentes
formas clínicas: a leishmaniose cutânea localizada (LCL) e a leishmaniose
mucocutânea (LMC) (FARIAS et al., 2012).
Leishmania amazonensis é o agente causador da leishmaniose cutânea
humana (LCH) no novo mundo, na qual a maioria dos casos envolve uma severa
leishmaniose cutânea difusa e anérgica (CHAVES et al., 2003).
Lectinas são frequentemente utilizadas para sondar os carboidratos de
membrana de diferentes cepas de leishmania para discriminar entre cepas
patogênicas e não patogênicas deste parasita e ainda distinguir entre diferentes
estágios morfológicos (BARBOSA et al., 2012). Lectinas também tem sido utilizadas
em purificação por afinidade de diferentes glicoconjugados de leishmania (ANDRADE;
SARAIVA, 1999), identificação de cepas e espécies e composição do glicocálix
(IORDACHE et al., 2015; MEDEIROS et al., 2010). Em algumas espécies de
Leishmania, promastigotas metacíclicas são purificadas por seleção negativa. Relatos
apontam que é possível purificar formas metacíclicas a partir de culturas axênicas com
lectinas (DA-SILVA et al., 2002).
34
1.7 LECTINAS E CANDIDA
Os fungos do gênero Candida são patógeno comuns em humanos, sendo
componentes da microflora endógena da pele, mucosas, e trato digestório de
hospedeiros sadios. Entretanto, quando as defesas imunológicas são comprometidas
ou o balanço da microflora normal é perturbado, Candida transforma-se em um
patógeno oportunista potencialmente letal. De fato, a disseminação de Candida lidera
as causas de doenças fúngicas invasivas em diabéticos, nascidos prematuros,
pacientes cirurgiados ou com doenças orofarígeas bem como pacientes com AIDS
(WANG et al., 2013). Candida está classificada como a quarta entre os patógenos
nosocomial e a infecção por cândida tem um importante impacto na medicina e na
economia ligado as dificuldades no diagnóstico clínico e biológico (DAMIENS et al.,
2012). Nos últimos anos, a procura por novas moléculas antifúngicas tem recebido
uma atenção especial tendo em vista o surgimento de casos de fungos oportunistas e
de difícil tratamento. (CHARUNGCHITRAK et al., 2011; COELHO, 2011; ISLAM;
KHAN, 2011).
Lectinas de plantas não são bem exploradas nas suas habilidades de inibir a
atividade de fungos patogênicos em humanos. A respeito do grande número de
lectinas e hemaglutininas que já foram purificados, apenas poucas manifestaram uma
atividade antifúngica, o que é contraditório se levarmos em consideração o papel
destas proteínas no mecanismo de defesa de plantas. (CHARUNGCHITRAK et al.,
2011; ISLAM; KHAN, 2011; KLAFKE et al., 2013).
A inibição do crescimento fúngico pode ocorrer através das ligações das lectinas
com as hifas, resultando em uma pobre absorção de nutrientes, assim como pela
interferência no processo de germinação dos esporos. Relatos apontam lectinas que
se ligam a quitina mostram um maior índice de interferência contra fungos,
prejudicando na síntese e ou na deposição de quitina na parede celular (KLAFKE et
al., 2013).
As lectinas provavelmente não inibem o crescimento de fungos por modificações
nas estruturas ou na permeabilidade em suas membranas. Assim, deve existir efeitos
indiretos produzidos pela ligação de lectinas a carboidratos na parede celular das
células dos fungos (HAMID et al., 2013; ISLAM; KHAN, 2011; REGENTE et al., 2014).
Por exemplo, a síntese e deposição de quitina nos fungos são atenuados por algumas
lectinas, que são livres de quitinases e inibidores que se ligam a quitina na síntese da
35
parede celular; outras lectinas de plantas também suprimem o crescimento fúngico,
mas não causam a sua morte (ANG et al., 2014; COELHO, 2011).
36
nas interferências contra biofilmes ainda são pouco explorados (TEIXEIRA, 2012). Um
outro interessante mecanismo de ação é o bloqueio dos movimentos das bactérias,
causando perda de motilidade e prevenindo a invasão pelos patógenos (DE SOUZA
CANDIDO et al., 2011).
1.9 JUSTIFICATIVA
37
2 OBJETIVOS
38
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 MATERIAIS
3.1.1 EQUIPAMENTOS
Além dos aparelhos usuais do laboratório, pode-se destacar:
Banho Maria (Tecnal – Te 056)
Balança analítica eletrônica - BEL Engineering
Balança eletrônica – Tecnal (mod. B-tec 2200)
Centrífuga refrigerada HITACHI CR G
Cuba de eletroforese BIORAD
Espectrofotômetro Pharmacia Biotec (mod, ultrospec 2100 – pro)
Purificador de água Milli-Q® Water System (Millipore Corp.)
Bancada de Fluxo Laminar (PACHANE Pa300)
Incubadora Thermoforma Serie II Water CO2 Incubator HEPA Filter Model
3110
Liofilizador TERRONI FAUVEL – LB 1500 TT
Microcentrífuga para eppendorf 5410
Microcentrífuga para hematócrito (Modelo spin 1000)
Microscópio invertido NIKON Eclipse TE300
Peagâmetro Analyser (pH 300)
3.1.2 REAGENTES
Todos os reagentes utilizados neste trabalho foram de grau analítico,
adquiridos comercialmente, sendo manuseados segundo recomendação do
fabricante, quando especificado.
39
3.1.3.1 Canavalia maritima (FEIJÃO DE PRAIA)
As sementes da leguminosa Canavalia maritima foram coletadas na praia do
Forte, localizada no litoral sul da região metropolitana de Natal, estado do Rio Grande
do Norte (coordenadas: lat: -5.766228, long: -35.196658 WGS84). A exsicata da
planta foi identificada e catalogada no herbário da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte (UFRN) sob o número de registro 16787 e pode ser visualizado no
site do Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia Herbário Virtual da Flora e dos
Fungos (INCT-HVFF) em inct.florabrasil.net ou splink.org.br.
40
3.1.3.4 MICROORGANISMOS PATOGÊNICOS
Os testes realizados com Leishmania spp contaram com a parceria da profa.
Dra. Márcia Rosa de Oliveira, do laboratório de Leishmaniose, Departamento de
Biologia Molecular da Universidade Federal da Paraíba. Foram utilizados formas
promastigotas de Leishmania (Viannia) braziliensis (MHOM/BR/2011/AF) e
Leishmania amazonensis (IFLA/BR/67/PH8).
Os ensaios feitos com Candida spp só foram possíveis com a colaboração do
Professor Dr. Guilherme Chaves do Laboratório de Micologia Clínica, Departamento
de Análises Clínicas e Toxicológicas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
Foram utilizadas as seguintes espécies de importância médica: Candida albicans
(ATCC® número 90028), Candida dubliniensis (CBS® número 7987), Candida
tropicalis (ATCC® número 13803), Candida parapsilosis (ATCC® número 22019),
Candida glabrata (ATCC® número 2001), Candida rugosae (ATCC® número 10571) e
Candida krusei (ATCC® número 6258).
As atividades bactericidas e bacteriostáticas foram realizadas em parceria com
o prof. Ermeton Duarte do Nascimento do LaBMed - Laboratório de Bacteriologia
Médica, Departamento de Microbiologia e Parasitologia, Universidade Federal do Rio
Grande do Norte. Foram testadas cepas de Escherichia coli (ATCC® número 25922 )
e Staphylococcus aureus (ATCC® número 25932 ).
3.2 MÉTODOS
41
Figura 5 – Amostra de sementes de C. Maritima. Da esquerda para direita: semente ao natural,
cotilédones livres de seus tegumentos e farinha de C. maritima. Elaborada pelo autor.
42
cromatográfico. A fração de interesse, F60-90, foi redissolvida em NaCl 1 M, contendo
5 mM de CaCl2+ e 5 mM de MnCl2+ (chamada de solução de equilíbrio) e aplicado em
uma coluna Sephadex G-50, equilibrada com a mesma solução. A coluna foi
primeiramente eluída com a solução de equilíbrio seguido da solução de Glicina-HCl,
0,1M, pH 3, contendo 1M NaCl e 5 mM de CaCl2+ e 5 mM de MnCl2+ (Chamada de
solução de eluição). Foi utilizado um coletor automático (Frac-920, Amersham
Biosciences), ajustado para um fluxo de 45 mL/hora em frações de 3 mL por tubo. A
análise do eluído foi feita em espectrofotômetro (Utrospec-2100 pro, Amersham
Biosciences), no comprimento de onda de 280 nm e utilizando uma cubeta de quartzo.
O nível de proteína nas eluições foi considerado zerado quando as absorbâncias das
frações atingiram um platô de 0,05.
43
Uma vez diluída em tampão de amostra (Tris-HCl 0,0625 M, SDS 2%, glicerol 10%
v/v, 0,01% de azul de bromofenol e 1mM de DTT) num volume de 10 µL, a alíquota
foi aplicada no gel (10 x 14 cm, com espaçadores de 0,75 mm), o qual foi submetido
a uma amperagem constante de 30 mA por aproximadamente 2 h. O gel foi corado
em solução de Coomassie Blue R. Para determinar a massa molecular da proteína
isolada, foram utilizados marcadores padrão de proteína.
44
lectinas depositadas no banco de dados do NCBI (National Center for Biotechnology
Information, disponível em www.ncbi.nlm.nih.gov), usando BLASTp (ALTSCHUL et
al., 1997) e formatadas utilizando a ferramenta Jalview 2.8.2.
45
Farinha de sementes de
Canavalia maritima
Sobrenadante
F 30-60
Precipitação protéica com sulfato de amônio
60-90%
Reservados sob refrigeração a 8 °C
Centrifugação: 8000 x g - 4ºC por 30 min
Resuspensas em água destilada
Diálise contra água destilada
F 60-90 Sobrenadante
Cromatografia G50
Eletroforese
Sequenciamento
46
3.2.2 TESTES DE ATIVIDADES BIOLÓGICAS
47
3.2.2.2.2 OBTENÇÃO DE CÉLULAS MONONUCLEARES (CMN) DE SANGUE
PERIFÉRICO HUMANO
Para a obtenção de CMN, 10 mL de sangue venoso foi utilizado. Em tubos
Vacutainer heparinizados, realizou-se a diluição de 20µL de sangue em 400µL de
líquido de Turck para a contagem de leucócitos totais. Foi realizada distensão celular
a partir do sangue total para contagem do diferencial de leucócitos.
O sangue total heparinizado foi centrifugado durante 20 minutos a 2000 x g sob
temperatura de 18 ºC para obtenção do anel leucocitário. O anel leucocitário foi
extraído, transferido para um tubo Falcon e adicionada Solução Salina Tamponada
(PBS) a fim de completar 10 mL. Posteriormente, para obtenção das CMN, o
homogeneizado foi aplicado sobre o meio de gradiente de densidade (Ficoll-Paque,
densidade = 1, 077 g/L, Amersham). Esta solução foi centrifugada por 20 minutos a
3000 x g sob temperatura de 18ºC para obtenção da nuvem leucocitária. As células
da interfase foram extraídas com o auxílio de uma pipeta de Pasteur e lavadas por 3
vezes em PBS (10 minutos, 2000 x g, 18ºC). Após a última lavagem, as células foram
mantidas em meio RPMI 1640 com 20 mM de HEPES (Gilco-BRLTM, Grand Island,
NY, EUA) acrescido de 10% de Soro Fetal Bovino (SFB), 2mM de L-glutamina (Gibco-
BRLTM).
48
Foram utilizadas no experimento as suspensões celulares que apresentaram o
grau de viabilidade ≥95%.
50
nm. O ensaio foi realizado em triplicata. A análise da viabilidade celular foi realizada
em comparação com o controle contendo células não tratadas com a lectina isolada.
51
O meio de cultura utilizado, Caldo Mueller Hinton (MHC - Difco), foi preparado
de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, foram adicionados 100 μL de
MHC em placas de microtitulação nos poços das colunas de 2 à 11 e 200 μL na coluna
12. Em seguida, foram adicionados 100 μL da fração protéica solubilizada em meio,
em uma concentração inicial de 10 mg/mL, nos poços das colunas 1 e 2. Foi realizada
uma diluição seriada partindo da coluna 2 até a coluna 10, desprezando os 100 μL
restantes. Após a montagem das placas, foram adicionados 100 μL da suspensão de
células de leveduras em cada poço, exceto na coluna 12 (Controle Negativo). As
placas foram incubadas sob 37 °C por 48 horas. As leituras foram realizadas após o
período de incubação, observando-se o crescimento nas respectivas diluições através
de comparação visual. A CIM foi considerada como a menor concentração da capaz
de inibir 100% do crescimento de cada espécies, tomando como referência o controle
negativo à inibição, onde o PBS foi utilizado.
4 RESULTADOS
53
sem tratamento e tratados enzimaticamente (proteases: papaína e tripsina), realizado
com amostras de extrato bruto (EB), resultante de extrações com várias soluções
tampão, em diferentes pH, indicaram que o tampão de extração utilizado proporcionou
uma melhor solubilidade das proteínas que promovem hemaglutinação em sangue do
tipo A papainizado (tabela 1).
Posteriormente o extrato bruto escolhido foi fracionado pela adição de sulfato de
Amônio em concentrações crescentes. O procedimento resultou na obtenção de três
frações proteicas, F 0-30, F 30-60 e F 60-90, na qual também foram testadas quanto
a sua capacidade de aglutinação de eritrócitos. Dentre as frações, a F 60-90 se
destacou por apresentar maior atividade hemaglutinante específica contra hemácias
humanas do tipo A papainizado (figura 7).
Atividade específica (UH/mg)
4.5×10 6
4.0×10 6
3.5×10 6
3.0×10 6
2.5×10 6
2.0×10 6
1.5×10 6
1.0×10 6
5.0×10 5
0
EB
0
30
-6
-9
0-
30
60
F
Figura 7 – Atividade específica das frações proteicas de C. marítima. O extrato bruto (EB) em tampão
acetato de sódio, 0,1 M, pH 5,0 foi obtido pela extração sob agitação branda por 4 horas e
posteriormente fracionado pela adição de sulfato de Amônio em concentrações crescentes (F 0-30, F
30-60 e F 60-90). A atividade específica é dada pela razão entre as unidades de hemaglutinação (UH)
e a quantidade de proteína (mg) em 25 µL da fração.
54
P1
3 CML
DO 280nm (UA)
2
Glicina-HCl,
0,1 M, pH 3
1
0
0 20 40 60 80 100
Frações (3mL/tubo)
Figura 8 - Perfil cromatográfico da F 60-90 em coluna Sephadex G50. A coluna foi previamente
equilibrada com uma solução de NaCl, 1 M, contendo 5 mM de ambos CaCl2 e MnCl2 e a F 60-90,
reconstituída na mesma solução, foi aplicada. As frações (3 mL/tubo) foram eluídas primeiramente com
a solução de equilíbrio seguido da solução de Glicina-HCl, 0,1M, pH3, contendo 1M NaCl e 5 mM de
CaCl2 e 5 mM de MnCl2 (CML) e monitoradas em espectrofotômetro a 280 nm. A atividade
hemaglutinante foi detectada fortemente na presença de 4% de eritrócitos humanos do tipo A tratado
com papaína.
55
kDa (1) (2) (3) (4)
180
130
95
72
55
43
34
26
17
10
Figura 9 - Eletroforese (SDS-PAGE) da CML, em presença do agente redutor DTT. (1) – Marcador; (2)
– Extrato Bruto; (3) – F 60-90; (4) – CML;. As proteínas foram visualizadas com o corante Coomassie
Blue.
56
Figura 10 – Alinhamento comparativo do sequenciamento da lectina de Canavalia maritima (CML).
Análise do sequenciamento de CML comparando com a sequência da ConM - pdb 2CWM e com a
sequência da ConA - pdb CVJB. A procura foi realizada pelo BLASTp, utilizando bases de dados de
sequência de proteínas não redundantes e a formatação do alinhamento realizada pela ferramenta
Jalview 2.8.2.
57
hemolítica. Além de não interferir nestas células, a ConM, quando comparada com
perfil do controle negativo, apresentou um resultado ainda menor (Figura 11).
50 ***
0
00
M
S
PB
on
X1
C
n-
ito
Tr
Figura 11 - Avaliação do efeito hemolítico de ConM sobre hemácias humanas. Como controle negativo
e positivo foram utilizados tampão fosfato salino (PBS) e Triton X-100 1%, respectivamente. ***p<0,001
em relação ao controle positivo.
58
100
Viabilidade celular (%)
PBS
** **
*** ** ** 1 g/mL
**
2,5 g/mL
50 5 g/mL
***
***
7 g/mL
*** 10 g/mL
20 g/mL
0
h
h
24
48
72
Figura 12 – Efeito da ConM sobre a viabilidade das células mononucleares do sangue periférico
humano. A avaliação da citotoxicidade de ConM sobre células mononucleares foi feita pelo ensaio de
exclusão por azul de Trypan. As células teste foram tratadas com diferentes concentrações de ConM
(1 µg/mL – 20 µg/mL) por 24, 48 e 72 horas em microplacas de cultura. PBS (150 mM) foi usado como
controle positivo à viabilidade celular. A viabilidade das células tratadas com ConM foi expressa como
porcentagem da viabilidade em relação as células controle não tratadas. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001
em relação ao controle.
59
***
*
Viabilidade celular (%)
PBS
100 *** 25 g/mL
*** 50 g/mL
***
50
0
h
h
24
48
72
Figura 13 – Efeito da ConM sobre a viabilidade da linhagen celular RAEC. A avaliação da citotoxicidade
de ConM sobre a linhagem RAEC foi feita pelo ensaio de Alamar Blue. As células teste foram tratadas
com diferentes concentrações de ConM (25 µg/mL – 50 µg/mL) por 24, 48 e 72 horas em microplacas
de cultura. PBS (150 mM) foi usado como controle positivo à viabilidade celular. A viabilidade das
células tratadas com ConM foi expressa como porcentagem da viabilidade em relação as células
controle não tratadas. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001 em relação ao controle.
60
Viabilidade (%)
ConM (µg/mL) 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h
1 91 ±2,1 91 ±3,4 105 ±4,8 99 ±4,2 93 ±0,4 110 ±3,3 55 ±2,1 114 ±0,5 117 ±4,3 97 ±0,5 97 ±1,8 83 ±7,8
2,5 87 ±3,2 91 ±0,8 87 ±4,2 96 ±0,7 89 ±3,2 105 ±2,9 56 ±2,8 114 ±0,4 106 ±1,9 100 ±6,1 96 ±0,6 75 ±6,6
5 84 ±2,3 85 ±0,84 63 ±2,4 90 ±6,4 82 ±1,4 81 ±1 51 ±2,9 106 ±7,1 101 ±0,8 98 ±6,2 101 ±8,3 75 ±0,9
7 70 ±2,2 42 ±2,5 59 ±5,8 65 ±3,2 38 ±4,7 32 ±1,8 53 ±1,6 113 ±2 99 ±2,3 102 ±2,4 102 ±0,4 58 ±1,9
10 42 ±6,1 21 ±2,4 47 ±2,3 70 ±3,2 37 ±6,5 30 ±2,5 47 ±0,7 105 ±5 98 ±0,8 105 ±6,1 100 ±2,6 48 ±2,1
Tabela 2 – Efeito da ConM sobre a viabilidade das linhagens celular A549, 786-0, HT29 e HeLa. A avaliação da citotoxicidade de ConM sobre as linhagens
tumorais foi feita pelo ensaio de redução de MTT. As células teste foram tratadas com diferentes concentrações de ConM (1 µg/mL – 10 µg/mL) por 24, 48 e
72 horas em microplacas de cultura. PBS (150 mM) foi usado como controle positivo à viabilidade celular. O resultado das células tratadas com ConM foi
expressa como porcentagem da viabilidade em relação as células controle não tratadas. O desvio padrão é apresentado individualmente.
61
Os resultados indicam que para linhagem A549 a lectina é citotóxica em todas
as concentrações em 24 horas e nas quatros maiores concentrações com 48 horas e
72 horas. Destacaram-se as reduções da viabilidade nas concentrações de 7 e 10
µg/mL, sendo que em 48 horas observou-se uma redução para 42 e 21%,
respectivamente. Foram observadas também reduções na viabilidade nas
concentrações de 2,5 e 5 µg/mL, principalmente nos tempos 48 horas e 72 horas,
sendo que neste último tempo as viabilidades caíram para 87 e 63 %, respectivamente
(figura 14 e tabela 2). A IC50 foi estimada para 24 horas, 8,47 µg/mL, para 48 horas,
6,41 µg/mL e para 72 horas, 4,17 µg/mL.
Viabilidade celular (%)
100 * ** ** **
PBS
** ***
*** 1 g/mL
*** 2,5 g/mL
*** ***
5 g/mL
*** 7 g/mL
50 *** ***
10 g/mL
***
0
h
h
24
48
72
Figura 14 – Efeito da ConM sobre a viabilidade da linhagen celular A549. A avaliação da citotoxicidade
de ConM sobre a linhagem tumoral A549 foi feita pelo ensaio de redução de MTT. As células teste
foram tratadas com diferentes concentrações de ConM (1 µg/mL – 10 µg/mL) por 24, 48 e 72 horas em
microplacas de cultura. PBS (150 mM) foi usado como controle positivo à viabilidade celular. A
viabilidade das células tratadas com ConM foi expressa como porcentagem da viabilidade em relação
as células controle não tratadas. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001 em relação ao controle.
62
concentração de 5 µg/mL persiste nesta redução sendo viável em aproximadamente
80% (figura 15 e tabela 2). A IC50 foi estimada para 48 horas, 5,67 µg/mL e para 72
horas, 5,24 µg/mL.
***
*
Viabilidade celular (%)
100 * *
PBS
**
*** 1 g/mL
*** 2,5 g/mL
***
5 g/mL
7 g/mL
50 *** ***
10 g/mL
*** ***
0
h
h
24
48
72
Figura 15 – Efeito da ConM sobre a viabilidade da linhagen celular 786-0. A avaliação da citotoxicidade
de ConM sobre a linhagem tumoral 786-0 foi feita pelo ensaio de redução de MTT. As células teste
foram tratadas com diferentes concentrações de ConM (1 µg/mL – 10 µg/mL) por 24, 48 e 72 horas em
microplacas de cultura. PBS (150 mM) foi usado como controle positivo à viabilidade celular. A
viabilidade das células tratadas com ConM foi expressa como porcentagem da viabilidade em relação
as células controle não tratadas. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001 em relação ao controle.
63
***
** ** ** *
*
Viabilidade celular (%)
100 PBS
1 g/mL
2,5 g/mL
5 g/mL
*** ***
*** ***
*** 7 g/mL
50
10 g/mL
0
h
h
24
48
72
Figura 16 – Efeito da ConM sobre a viabilidade da linhagen celular HT29. A avaliação da citotoxicidade
de ConM sobre a linhagem tumoral HT29 foi feita pelo ensaio de redução de MTT. As células teste
foram tratadas com diferentes concentrações de ConM (1 µg/mL – 10 µg/mL) por 24, 48 e 72 horas em
microplacas de cultura. PBS (150 mM) foi usado como controle positivo. A viabilidade das células
tratadas com ConM foi expressa como porcentagem da viabilidade em relação as células controle não
tratadas. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001 em relação ao controle.
64
Viabilidade celular (%)
100 PBS
**
1 g/mL
***
***
2,5 g/mL
*** 5 g/mL
*** 7 g/mL
50
10 g/mL
0
h
h
24
48
72
Figura 17 – Efeito da ConM sobre a viabilidade da linhagen celular HeLa. A avaliação da citotoxicidade
de ConM sobre a linhagem tumoral HeLa foi feita pelo ensaio de redução de MTT. As células teste
foram tratadas com diferentes concentrações de ConM (1 µg/mL – 10 µg/mL) por 24, 48 e 72 horas em
microplacas de cultura. PBS (150 mM) foi usado como controle positivo. A viabilidade das células
tratadas com ConM foi expressa como porcentagem da viabilidade em relação as células controle não
tratadas. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001 em relação ao controle.
65
Quando a lectina, competitivamente, foi bloqueada pelo carboidrato observou-se uma
brusca reversibilidade da aglutinação (figuras 18 e 19 - B).
A integridade do experimento foi avaliado utilizando a ConA (50 µg/mL) como
controle positivo, na qual, conforme o esperado, aglutinou fortemente as células das
duas cepas do parasito (figuras 18 e 19 - C). O controle negativo foi estabelecido com
PBS e não apresentou aglutinação das células (figuras 18 e 19 - D).
A B
C D
66
A B
C D
67
4.2.6 AS ATIVIDADES BACTERICIDA E BACTERIOSTÁTICA DE ConM
Previamente a realização dos ensaios bacteriostáticos e bactericidas, os
inóculos foram testados quando a sua viabilidade após 30, 45 e 60 minutos de
incubação a 37 ºC somente com a solução salina (NaCl 0,9%). Após este tempo,
repiques foram feitos em placa de petri com ágar nutriente e incubado por 24h a 37
ºC. Tanto a cepa E. coli quanto S. aureus cresceram sem diferenças significativas
quanto comparado ao controle, onde o inóculo foi repicado sem a incubação prévia.
O teste indicou que a incubação por até 1 hora sem meio de cultura não altera a
viabilidade das cepas bacterianas utilizadas. A mensuração do crescimento das cepas
de E. coli e S. aureus foi realizado com concentrações variadas da ConM (0,39 µg/mL
a 400 µg/mL), utilizando como parâmetro de comparação o controle PBS 150 mM.
Para E. coli, não foi observado inibição do crescimento, não obstante, todas as
concentrações foram capazes de causar um aumento deste crescimento em
praticamente igual teor percentual (figura 20).
*** ***
*** *** *** *** *** *** *** *** ***
Crescimento (%)
100
50
0
25
50
39
78
56
12
25
,5
l+
C l-
0
0
0
10
20
40
12
tr
0,
0,
1,
3,
6,
tr
C
ConM (g/mL)
Figura 20 – Efeito da ConM sob o crescimento da cepa bacteriana E. coli. A avaliação bacteriostática
de ConM sobre a cepa E. coli foi feita pelo ensaio de determinação da concentração inibitória mínima
(MIC). A cepa teste foi tratada com diferentes concentrações de ConM (0,39 µg/mL a 400 µg/mL) por
24 horas em microplacas de cultura. PBS (150 mM) foi usado como controle negativo. O crescimento
das células tratadas com ConM foi expressa como a porcentagem em relação as células controle não
tratadas. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001 em relação ao controle (teste t - pareado).
68
Já em relação a cepa S aureus, observou-se uma inibição dependente de
concentração, onde os valores medianos causaram uma maior atividade de inibição.
A concentração 25 µg/mL destacou-se frente as outras por apresentar uma inibição
do crescimento de 71 % quando comparado ao controle. As concentrações mais altas,
chegando a 400 µg/mL apresentaram uma redução menor do crescimento,
alcançando nesta concentração o patamar de 65% quando comparado ao controle
(figura 21).
Crescimento (%)
100
0
25
50
l+
0
0
0
,5
C l-
39
78
56
12
25
10
20
40
12
tr
0,
0,
1,
3,
6,
tr
C
ConM (g/mL)
71
sobre a viabilidade de linfócitos e monócitos foi feito por contagem em câmara de
Neubauer onde foi possível diferenciar as células integras das não integras. ConM
não foi significativamente tóxicas nas concentrações basais de 1, 2,5 e 5 µg/mL, mas
apresentou toxicidade a partir da concentração 7 µg/mL. Não foi o objetivo deste
trabalho avaliar a atividade mitogênica sobre células mononucleares, mas não se
observou nenhuma alteração significativa na proliferação destas células com as
concentrações testadas, quando comparados ao controle sem a lectina. Lectinas de
leguminosas são pouco conhecidas quanto a sua atividade citotóxica para células
sanguíneas. A ConA, por exemplo, possui atividade mitogênica para algumas células
em cultura ou pode ser tóxica para outras (CHANG et al., 2007). Foi relatado que esta
mesma lectina, dependendo da concentração utilizada, tem o poder de induzir a
ativação de linfócitos onde a sensibilidade destas células foi atribuída ao seu conteúdo
de glicose e manose na membrana. A ConA, em doses de 1 a 10 µg/mL, apresenta
atividade mitogênica, mas se torna tóxica em doses acima de 50 µg/mL (CHANG et
al., 2007).
Outra proposta deste trabalho foi avaliar a atividade de ConM, que
estruturalmente é bem relacionada com a ConA e com outras lectinas da mesma
subtribo, utilizando um modelo de células tumorais e não tumorais in vitro. Ensaios
para avaliação da viabilidade celular, redução do Azul de Alamar e MTT, foram
realizados na perspectiva da lectina se comportar como um inibidor da viabilidade em
células tumorais e em contrapartida não ter ação contra células não tumorais. Os
testes mostraram que a ConM para linhagem não tumoral RAEC não é tóxica quando
testada com o dobro da maior concentração que foi tóxica para células tumorais
utilizadas neste trabalho, causando uma discreta redução em sua viabilidade. Sendo
assim, para as linhagens tumorais A549, 786-0, HT29 e HeLa a lectina é
significativamente capaz de reduzir a viabilidade em pelo menos um dos três tempos
testados e em pelo menos três das cinco concentrações avaliadas. Destacaram–se
as concentrações 5, 7 e 10 µg/mL da ConM como concentrações que causam maiores
danos ao metabolismo destas células transformadas diminuindo a viabilidade em
média 79 %. Os resultados sugerem que a ConM possui um potencial antitumoral para
as linhagens A549, 786-0, HT29 e HeLa em detrimento ao resultado do teste realizado
com a linhagem não tumoral RAEC e aos resultados dos testes de toxicidade contra
72
células do sangue, não sendo avaliados neste tabalho os mecanismos de ação
responsáveis pelas diminuições nas viabilidades.
Agentes anticâncer têm sido extraídos das mais diversas fontes naturais,
incluindo plantas, organismos marinhos e microrganismos (CRAGG; NEWMAN,
2005). As propriedades anticâncer das lectinas tem sido demostradas in vitro e in vivo
sugerindo um importante potencial destas biomoléculas como agentes terapêuticos.
Estas proteínas já são conhecidas por interferirem em diversas células, ligando-se em
suas membranas ou receptores, inibindo suas viabilidades ou proporcionando
estimulações, intervindo em seu metabolismo e crescimento (DE MEJÍA;
PRISECARU, 2005; LIU; BIAN; BAO, 2010). É possível constatar nos bastidores de
diversos trabalhos, situações que inserem as lectinas em um papel de destaque no
protagonismo de uma série de modificações sofridas por estas células transformadas.
Atualmente a literatura nos apresenta os efeitos destas proteínas na indução de
citotoxicidade, apoptose e necrose contra células tumorais (FAHEINA-MARTINS et
al., 2012; JIANG et al., 2015; LIU; BIAN; BAO, 2010; MONTE et al., 2014; OLIVEIRA
et al., 2014; SEIFERT et al., 2008; ZAROGOULIDIS et al., 2015).
As lectinas de leguminosas podem ser consideradas uma classe de
biomoléculas com potencial atividade antitumoral. Um dos primeiros trabalhos que
relata a atividade antitumoral de C. maritima foi divulgado em 2013. A atividade
citotóxica do extrato bruto alcoólico das sementes do feijão de praia foi testada pelo
ensaio de MTT e impactos diferentes foram observado nas linhagens celulares
cancerígenas MCF-7 e HT-29, onde o extrato aquoso cozido destas sementes
apresentou atividade anticâncer quando comparado com o extrato cru (NIVEDITHA;
VENKATRAMANA; SRIDHAR, 2013). Wong; Ng (2005) e Faheina-Martins et al.
(2012) constataram efeitos antiproliferativos de lectinas isoladas de Lotus
corniculatus, Canavalia gladiata, Canavalia ensiformis e Canavalia brasiliensis em
linhagens tumorais tais como L1210 (Células leucêmicas) inibindo significativamente
e seletivamente a proliferação sendo a apoptose como o principal mecanismo de
morte. Oliveira et al. (2014) mostraram que a ConBr (lectina de Canavalia brasiliensis)
inibe a proliferação celular em linhagens B16F10 (melanoma murino) e destacou em
seu trabalho que as lectinas de leguminosas possuem uma estrutura oligomérica que
aparentemente é fundamental ao aumento da afinidade em suas interações com
carboidratos complexos nas membranas de células tumorais. O efeito citotóxico de
73
uma lectina de soja (SBL) foi constatado, também utilizando o ensaio de MTT, em
diferentes células tumorais in vitro. A proteína foi confrontada contra HeLa (câncer
cervical), Hep2 (câncer oral), HepG2 (câncer de fígado), MDA MB 231 (câncer de
mama) e U373 MG (glioblastoma) (KUMAR et al., 2014). Silva et al. (2014) mostraram
que uma lectina purificada apartir das sementes de Bauhinia ungulata foi capaz de
reduzir a viabilidade em adenocarcinoma de colo humano (HT-29). A lectina de
Polygonatum cyrtonema, uma leguminosa, possui um efeito antiproliferativo e foi
descrito que ela é capaz de induzir apoptose em linhagem HeLa, MCF7 (câncer de
mama) e A375 (melanoma) (ELIGAR et al., 2012).
As lectinas vegetais se mostram eficientes tanto como interferentes no
desenvolvimento de tumores quanto apresentaram propriedades mitogênicas para
linfócitos ou esplenócitos (CHAN et al., 2012). A ConA (lectina de Canavalia
ensiformes), por exemplo, reconhecida por ser mitogênica, demostrou ter um potente
efeito anti-hepatoma (LEI; CHANG, 2009). A ConA pode ser considerada,
terapeuticamente, como um agente anti-hepatoma pela sua ação autofágica e
imunomodulatória. A lectina ainda induz apoptose em linhagens humanas A375
(CHANG et al., 2007; ELIGAR et al., 2012). Faheina-Martins et al. (2012) mostrou que
ConBr e ConA são tóxicas em linhagens leucêmicas MOLT-4 e HL-60 demostrando
uma alta seletividade para estas células tumorais. Madariaga et al. (2014) relatam uma
importante aplicabilidade das lectinas vegetais como biomarcadores de células
tumorais. Em seu trabalho o mesmo apresenta lectinas com a capacidade de
reconhecer glicopeptídeos associados ao tumor. Tentar burlar qualquer tipo de morte
celular é uma característica exclusiva de células transformadas e neste aspecto a
indução de morte celular certamente será a principal estratégia no desenvolvimento
de qualquer potente droga para o tratamento do câncer (KUMAR et al., 2014) e as
lectinas certamente assumirão seu papel na vanguarda dos produtos naturais com
este propósito.
Tendo em vista que as plantas se utilizam de uma gama de compostos bioativos
que são capazes de protegê-las contra predadores e impedir infecções, testes
realizados com a ConM avaliou o grau de atividade frente a microrganismos
patogênicos, como protozoários, fungos e bactérias. Sendo assim, foi verificada a
capacidade que a ConM possui em aglutinar espécimes de duas espécies de
Leishmania e interferir no crescimento de 7 espécies de Candida e duas espécies
74
bacterianas. Embora a concanavalina A tenha sido muito utilizada como uma sonda
para estes organismos, muitas outras lectinas têm sido utilizadas para estudar as
moléculas da superfície celular, e identificação e diferenciação dos parasitos.
Em algumas instâncias, a patogenicidade de protozoários parece ser
correlacionada com suas propriedades de superfície, como revelado pelas interações
com lectinas. Assim, diversas investigações consideram a comparação de açúcares
de superfície de parasitas muito importante para o conhecimento das diferenças nas
características da virulência (IORDACHE et al., 2015). ConM na concentração mínima
de 6,25 µg/ml foi capaz de aglutinar as formas promastigotas, em fase logarítimica de
crescimento, de duas espécies testadas, L. amazonensis e L. brasiliensis. Estas
formas de leishmania são características por apresentarem em suas membranas
glicolipídeos (LPG) e estas macromoléculas estão inteiramente relacionados na
interação e desenvolvimento dos parasitos com o intestino do inseto vetor (SOARES-
COSTA et al., 2002) bem como na internalização e sobrevivência do parasito dentro
dos macrófagos no hospedeiro mamífero (TURCO; DESCOTEAUX, 1992; SACKS et
al., 1994; KAMHAWI, 2006). Os ensaios realizados com a ConM sugerem que as
promastigotas, na fase de crescimento logarítimico, apresentam estruturas ricas em
D-glicose, haja vista a reversão da aglutinação quando 100 mM de D-glicose foi
adicionado no meio celular. A atividade hemaglutinante da ConM é inibida por Glicose
e manose, mas é também inibida fortemente por trealose e maltose (DELATORRE et
al., 2006) tornando promissora a avaliação dos pardões de carboidratos de superfície
em leishimania por testes de reversibilidade da aglutinação com estes outros
carboidratos. O bloqueio destes sítios de ligação pode reduzir a interação que
naturalmente acontece com o vetor ou com o hospedeiro mamífero além de indicar a
potencialidade desta lectina como uma ferramenta molecular para o estudo de
carboidratos de superfície abordando especificidades quanto a virulência das fases
parasitárias (ANDRADE; SARAIVA, 1999; SACKS et al., 1985).
Farias et al. (2012) explorou a capacidade aglutinante de Lectinas de plantas,
ConA, RCA I (aglutinina de Ricinus communis) e SBA (aglutinina de soja) em
diferentes fases de promastigotas de L. (V.) brasiliensis cutânea e mucocutânea. O
mesmo constatou que as lectinas, a primeira com especificidade para manose, a
segunda para galactose e a terceira para N-acetil-galactosamina, aglutinavam as
promastigotas em diferentes fases de crescimento estacionário, mostrando as
75
diferenças na expressão dos carboidratos nas suas diferentes fases de crescimento.
Barbosa et al. (2012) avaliou o grau de aglutinação de lectinas de plantas com
especificidade para D-glicose/D-manose contra L. amazonensis constatando uma
maior intensidade durante a fase logarítmica de crescimento. Andrade e Saraiva
(1999) testaram outras 27 lectinas quanto a sua atividade aglutinante quando estas
eram incubadas com resíduos de carboidratos de 19 isolados de Leishmania incluindo
a L amazonensis em fase estacionária. Os autores alegam que esta espécie de
leishmania apresenta unidades repetidas de glicose no LPG e em outros fosfoglicanos
de membrana. A análise das diferenças observadas na expressão dos carboidratos
em cepas de Leishmania podem relacionar diferentes resultados a diferentes espécies
deste protozoário. Sacks et al. (1995) e McConville et al. (1992) apresentaram a
purificação de Leishmania utilizando lectina de amendoim bem como a Concanavalina
A por seleção negativa. Destaca-se também a aglutinação de formas promastigotas
pela lectina de lentilha. As reações específicas e reversíveis entre lectinas e
oligossacarídeos pode ser utilizada como base para análise de glicoproteínas e
glicolipídios da membrana do protozoa parasita (ROSSELL et al., 1990). Pinto-da-
Silva et al. (2002) mostrou que a lectina de Bauhinia purpurea facilitou a purificação
de promastigotas metacíclicas em cultura na fase estacionária por seleção negativa,
indicando mais uma aplicação na especificidade de reconhecimento de carboidratos
de lectinas. O mesmo testou e constatou a capacidade aglutinante de 12 diferentes
lectinas de plantas contra diferentes fases de Leishmania spp.
Quanto a ação da ConM contra Candida spp, nenhuma das concentrações
testadas foram capazes de interferir no crescimento destas leveduras. Lectinas de
leguminosas sem ação antifúngica, que se ligam a glicose e manose tem sido
reportado (FREIRE et al., 2002; TEIXEIRA, 2012). Ang et al. (2014) relatam que a
atividade antifúngica é rara entre as a lectinas e que diversos testes realizados com
espécies de leguminosas e outras famílias falharam na inibição do crescimento de
leveduras. Lectinas que se ligam a quitina demonstram um significante efeito
antifúngico, entretanto, a presença ou ausência deste fator é dependente da
combinação do fungo com a lectina (KLAFKE et al., 2013; SILVA et al., 2014). O
mecanismo de atividade antifúngica pelas lectinas ainda não está claro, mas é
possível relacionar esta atividade com o reconhecimento dos carboidratos da parede
celular e com outras estruturas dos fungos (KLAFKE et al., 2013). Estudos sugerem
76
que as lectinas podem formar uma barreira na superfície da parede celular sem
modificar sua estrutura ou sua permeabilidade. Algumas lectinas ainda podem
atravessar a parede celular e agir diretamente na membrana plasmática (KLAFKE et
al., 2013). Outros estudos apontam que a interferência no crescimento de alguns
fungos por lectinas pode ser devido a inibição da germinação dos esporos ou do
crescimento dos micélios (ANG et al., 2014; GOMES, 2012).
Ainda no contexto dos microrganismos, duas espécies bacterianas foram
testadas quanto a atividade bactericida e bacteriostática da ConM. O cultivo de E. coli,
quando incubada por 24 horas com a proteína, não apresentou inibição do seu
crescimento. Para S. aureus foi possível observar uma inibição significativa no
crescimento em todas as concentrações da ConM, quando comparado ao controle,
destacando-se a concentração de 25 µg/mL, onde a lectina diminuiu o crescimento da
colônia chegando ao patamar de 29%. Em relação a viabilidade das colônias após a
incubação com a ConM em meio nutritivo, ficou evidente que a lectina não possui uma
capacidade bactericida, tendo em vista que repiques das duas espécies em ágar
nutriente, resultaram em colônias vigorosas e semelhantes ao controle onde a lectina
não foi incubada com as bactérias. Já foi relatado a atividade contra bactérias da
ConM e de outras lectinas do gênero Canavalia. Cavalcante et al. (2011) constataram
a ação inibitória e antibiofilme destas proteínas em duas espécies bacterianas,
Streptococcus mutans e Streptococcus oralis, onde a ConM foi capaz de inibir o
crescimento de S. Mutans e, diferentemente, estimular o crescimento de S. oralis.
Estes mesmos autores, em trabalhos posteriores, relataram que a ConM altera a
expressão de genes relacionado à virulência e a formação de biofilmes em S. mutans.
No contrário, ConA não alterou a expressão destes genes estudados. Pelo fato das
duas lectinas possuírem um alto grau de similaridade em suas sequências de
aminoácidos, a diferença nas ações de ConM e ConA pode ser explicada pela
pequena diferença estrutural no domínio de reconhecimento de carboidratos (DRC)
das lectinas (CAVALCANTE et al., 2011; THAYS et al., 2013).
Algumas lectinas apresentam diferentes espectros de atividade antimicrobiana,
interferindo em bactérias Gram-positivas e não tendo atividade alguma contra
bactérias gram-negativas. Presume-se que este evento tenha relação com a topologia
do envelope das células Gram-negativas onde a membrana externa formada por LPS
proteja o acesso das lectinas ao peptídeoglicano da membrana interna (MIKI;
77
HOLSTS; HARDT, 2012). Dentro do grupo de lectinas de plantas que possuem
atividade bacteriana existem aquelas com capacidade inibitória ou estimulante do
crescimento. Iordache et al. (2015) relataram que a lectina isolada das sementes de
Eugenia uniflora apresenta uma extraordinária atividade antibacteriana contra
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Klebsiella sp e com menos
intensidade E. coli, Bacillus subtilis e Streptococcus sp. Interações entre lectinas de
plantas com a parede celular das bactérias podem proporcionar a atividade
antibacteriana em células Gram-negativas e Gram-positivas ou estimular a respiração
celular, induzindo seu crescimento (DE VASCONCELOS et al., 2012; IORDACHE et
al., 2015).
As interações com os ácidos N-acetilmurâmico e N-acetilneuramínico de
algumas lectinas e em especial da ConM são de grande interesse, pois são os mais
comuns carboidratos existentes na parede celular das bactérias, ou de outros
microrganismos patogênicos, e que desempenham um papel chave na comunicação
entre o hospedeiro e o patógeno (RAMOS et al., 1996a, 1996b). Cada glicano exposto
na superfície se torna um possível sitio reativo com lectinas. A capacidade das lectinas
de formar agregados com os glicoconjugados microbianos podem bloquear os sítios
das bactérias pela interação do hospedeiro prevenindo infecções (IORDACHE et al.,
2015).
78
perspectiva de utilização de seus princípios ativos na formulação de novos fármacos
(GEMEINER et al., 2009).
O investimento em pesquisas básicas no campo das lectinas de plantas está
atrelado, na maioria dos casos, a um retorno satisfatório e são grandes as
expectativas de utilização destas biomoléculas como um aparato biotecnológico.
Atualmente, com os avanços nas pesquisas relacionados com lectinas vegetais, é
possível sugerir potenciais aplicações que vão deste a síntese de produtos que agem
como bioinseticida quanto na utilização dessas proteínas como uma fármaco na
terapia contra o câncer. Algumas vertentes se enquadram de forma adequadas às
proposições de utilização dessas proteínas como um agente de diagnóstico e terapia,
tais como, diagnóstico de patologias, identificação de tumores, distinção de
patógenos, distinção de epítopos celulares com relevância funcional na adesão
celular, entrega de drogas em células alvo dentre outras aplicabilidades, e seguindo
esse raciocínio, a identificação do mecanismo de ação e a elucidação da região da
proteína que desencadeia a atividade biológica pode servir como um precursor para
o desenvolvimento de fármacos que atuem da mesma forma sem os mesmos efeitos
adversos. A utilização de lectinas na área clínica está associado a um amplo espectro
de vantagens que atribui valores às rotinas dos procedimento de diagnósticos. Slifkin
e Doyle (1990) já destacavam algumas das vantagens de se trabalhar com lectinas
de plantas: estabilidade, suas atividades em pequenas concentrações, a viabilidade
comercial e suas habilidades de sondar as diferenças nas estruturas de superfície em
vários isolados. Essas lectinas vegetais demonstram ser um material de fácil obtenção
além de serem bastante estáveis. A purificação a partir de sementes ou até mesmo a
expressão funcional dessas lectinas nos oferece novas perpectinas de utilização que
precisam ser exploradas e seus mistérios desvendados.
79
revelou 100% de identidade com a lectina ConM. Visando excluir reações tóxicas
adversas, a citotoxicidade desta proteína foi avaliada para células sanguíneas, e não
apresentou atividade hemolítica e efeito tóxico para células mononucleares nas
concentrações analisadas. ConM também não apresentou atividade tóxica para
linhagens de células epiteliais de aorta de coelho. No entanto, a viabilidade das
linhagens tumorais A549, 786-0, HT-29 e HeLa foi afetada pelo cultivo das células na
presença da ConM no meio. Quando analisado o potencial de ConM para identificação
e estudo de leishmania, a lectina acrescida ao meio de cultivo promoveu a aglutinação
de formas promastigotas de duas espécies de Leishmania. ConM não revelou
atividade fungistática contra Candida spp. Nenhuma atividade bactericida foi
detectada nas concentrações testadas contra E. coli e S. aureus, porém a ConM
apresentou atividade bacteriostática para S. aureus. Baseado nos dados de
sequência, a lectina isolada corresponde a uma isolectina do tipo ConA, e suas
propriedades anti-tumoral, bacteriostático e aglutinante de Leishmania precisam ser
melhor investigados para que seu potencial biotecnológico seja explorado.
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