Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
1. (Yahya et al., 2017) Comparison of DNA Extraction Methods Between Conventional, Kit, Alkali
and Buffer-Only for PCR Amplification on Raw and Boiled Bovine and Porcine Meat
Modified Buntjer et al, 1995
Vortex
5 M ammonium acetate
at 0.5 times volume
Pellet
100 μL TE buffer
Supernatan
Materials
2 ml NaOH (0,5 per gram)
5 M ammonium acetate needs 0,5 times volume
Absolute ethanol needs 2-3 times volume
500 μL of 70% ethanol
100 μL TE buffer
Equipment
1,5 mL microtube
Micropipette
Vortex
Incubator thermomixer
Centrifuge
2. (Yalçınkaya, 2016) Comparison of DNA extraction methods for meat analysis
Modified Lenstra et al, 2001
50 mg homogenate sample
Vortex
Vortex 20 s
600 μL of isopropanol
Natan
Equipment
Microtube
Micropipette
Vortex
Incubator thermomixer
Centrifuge
3. (Lenstra et al 2001) On the origin of meat - DNA techniques for species identification in meat
products
a. Rapid alkaline extraction of DNA from meat
Materials
∙ Extraction buffer: 0.5 M NaOH, 10 mM EDTA
Method
1. Weigh 100 mg tissue in a 2-ml Eppendorf tube.
2. Add 0.2 ml extraction buffer, vortex and incubate at 100°C for 7 min.
3. Centrifuge for 2 min at 12,000 rpm and transfer supernatant to a new tube, avoiding floating fat.
4. Repeat step 3.
Ekstraksi DNA
Ekstraksi DNA pada sampel dilakukan dengan menggunakan metode standar fenolkloroform
(Sambrook et al. 1989) yang telah dimodifikasi untuk produk tercemar daging babi.
Preparasi Sampel
Sebanyak 75 mg sampel bakso diambil dari 5 titik yang tersebar pada sampel.
Selanjutnya sampel dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 1.5 mL.
Degradasi Protein
Sampel dalam tabung ditambahkan 1×STE sampai volume 340 µL, 40 µL SDS 10%, dan 20 µL protein
kinase K 5 mg/mL.
Campuran diinkubasi pada suhu 55oC selama 2 jam sambil digoyang perlahan.
Degradasi Bahan Organik
Sampel yang telah diinkubasi ditambahkan 400 µL larutan fenol, 400 µL kloroform-isoamil alkohol (24:1),
dan 40 µL NaCl 5 M.
Campuran digoyang dalam suhu kamar selama 1 jam.
Presipitasi DNA
Sampel hasil ekstraksi selanjutnya disentrifugasi pada kecepatan 12 000 rpm selama 5 menit hingga fase
air terpisah dengan fase fenol.
Fase air dipindahkan ke dalam tabung baru dengan volume terukur (± 400 µL).
Molekul DNA diendapkan dengan cara menambahkan 800 µL alkohol absolut dan 40 µL NaCl 5 M.
Campuran kemudian diinkubasi pada suhu -20 oC selama semalam, dan selanjutnya disentrifugasi pada
kecepatan 12 000 rpm selama 1 menit.
Endapan DNA yang diperoleh dicuci dengan alkohol 70% kemudian diendapkan lagi.
Endapan DNA yang telah bersih dari alkohol dipulihkan dengan menambahkan 100 µL TE. Sampel DNA
disimpan pada suhu -20 oC dan siap digunakan.
Pengujian DNA Total
Pengujian DNA hasil ekstraksi secara kualitatif dilakukan dengan elektroforesis pada gel agarosa 1%.
Gel dibuat dari 0.3 g agarosa dan 30 mL larutan bufer (0.5 × TBE) yang dipanaskan. Larutan agarosa
dibiarkan agak dingin sambil diaduk dengan pengaduk magnet, lalu ditambahkan 1.25 μL pewarna etidium
bromida. Sebanyak 5 μL sampel DNA dilarutkan dalam 1 μL loading dye, lalu elektroforesis dilakukan
selama 40 menit pada tegangan konstan 100 volt sampai pewarna mencapai bagian bawah gel. Pengujian
DNA hasil ekstraksi secara kuantitatif dilakukan dengan spektrofotometer GeneQuant 1300. Sampel DNA
3 μL dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 1.5 mL dan ditambahkan akuades 597 μL. Larutan TE
digunakan sebagai blangko, dibuat dengan cara yang sama, yaitu sebanyak 3 μL larutan TE ditambah
597 µL akuades, lalu dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 1.5 mL. Sampel dan blangko di-spin down
selama 0.5 menit, kemudian dilakukan pengujian dengan spektrofotometer
Rapid alkaline extraction of DNA from meat (Lenstra, 2001)
100 mg tissue
Vortex
Materials
0,5 M NaOH
10 mM EDTA
Equipment
Microtube
Micropipette
Vortex
Incubator thermomixer
Centrifuge
Alkalin lysis for buffalo
P. S. Girish & S. Haunshi & S. Vaithiyanathan & R. Rajitha & C. Ramakrishna (2013)
DNA extract
Protocol B: DNA extraction using NaOH
E.M. Santos1 , J.F.R. Paula1 , P.M.C. Motta1 , M.B. Heinemann1 , R.C. Leite1 , J.P.A. Haddad1 , H.L.
Del Puerto2 and J.K.P. Reis1 (2010)
400 µL TNE:
0,1 M Tris, pH 8.0
0,15 M NaCl
0,05 M EDTA
Washed
40 µL lysis solution
(50 mM NaOH)
resuspended
Vortex 5 minutes
15 µL 0,50 M Tris-HCl, pH 8
Resuspended, 2 minutes
Stored at -20OC
Supernatan
BUFFERS AND REAGENTS FOR DNA EXTRACTION
Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 8.0
Di-sodium hydrogen phosphate 13.48 g
Sodium di-hydrogen phosphate, hydrated 00.78 g
Sodium Chloride 04.05 g
Distilled water to make 1000 m l
70 % alcohol
Absolute alcohol 30 ml
Distilled water up to 100 ml and mix thoroughly
Sodium chloride 5 M
Sodium chloride 29.22 g
Distilled water up to 100 ml
Sterilized by autoclaving
0
Incubated for 5 min at -80 C
vortex
2 µl of 20 mg/ml
Proteinase K
0
Gently shaken 15 min, 55 C, 1,200 rpm
50 µl of 5 M NaCl
500 µl of P:C:I
alcohol (25:24:1)
vortex
pallet
Salt Method
50 mg homogenate sample
Vortex
2 µl of 20 mg/ml
Proteinase K
0
Incubated for 1 hour at 65 C
300 µl of 6 M NaCl
Vortex 30 sec
Supernatant
330 µl of isopropanol
0
Incubated at 20 C for 10 min
pellet