PCR = Reação em cadeia da polimerase

Em 1993 – Kary Mullis

-Lançou método que permite sintetizar uma grande
quantidade de um determinado fragmento de DNA em
poucas horas e in vitro

- À partir evolui técnicas relacionadas ao diagnóstico de

doenças e medicina forense, etc

- Foi então desenvolvido o PCR – Replicação do DNA in vitro

• São usadas elevadas temperaturas de forma a separar as moléculas de DNA
em duas cadeias simples

• Permite a ligação de oligonucleotídeos inciadores (primers)

• Para amplificar uma determinada região são necessários dois iniciadores

complementares das sequências que apoiam o fragmento de DNA a ser
amplificado

• Os iniciadores são colocados nos terminais 3’ de modo a permitir a atuação

da DNA polimerase durante a síntese da cadeia complementar

• Usa-se como molde cada uma das duas cadeias simples constituintes do
DNA a amplificar
Para realizar PCR são necessárias:

-Pequenas quantidades de DNA-alvo

- Tampão salino contendo a polimerase
- Oligonucleotídeos iniciadores
- 4 desoxinucleotídeos constituintes do DNA
- Cofator Mg 2+
Esta mistura é submetida a vários ciclo de amplificação que consiste em:

-Desnaturação do DNA alvo pelo calor , de modo a separar as duas cadeias

1 minuto a 94 – 96°C

-Associação dos iniciadores por ligações de hidrogênio ao DNA alvo em

cadeia simples. Para permitir essa associação, a mistura é resfriada

1 minuto a 50 – 65°C

-Extensão dos iniciadores através da síntese da cadeia complementar de

cada cadeia molde, catalisada pela DNA polimerase

1 minuto a 72°C
Este processo de temperaturas em 3 passos pode ser repetido por várias vezes (25 a
30 ciclos)

Cada ciclo é possível aumentar duas vezes a concentração de DNA pré-existente

O DNA pode ser aumentado em 1 milhão de vezes

OBS: As DNA polimerases devem ser termoestáveis

Ex: Thermus aquaticus

O produto de PCR pode ser visualizado

por eletroforese em gel de agarose e o
seu tamanho ser estimado por
comparação com padrões lineares de DNA
O fato central que faz o PCR ser útil é que todo organismo
vivo possui sequências de nucleotídeos no DNA que são
únicas e específicas para cada espécie.

Pode se obter DNA a partir de amostras de diferentes

materiais biológicos
Sangue
Urina
Outros fluidos corporais
Cabelo
Cortes de tecidos
Amostras de microorganismos
Células animais e vegetais
 Para execução da PCR é preciso que se tenha conhecimento prévio da
sequência do ácido nucléico = sequência alvo

1º passo: coleta da amostra biológica

2º passo: extrair o DNA a partir do material coletado

Utiliza-se substâncias desproteinizantes (fenol-clorofórmio) – retira proteínas
que estão acopladas ao DNA

3º passo: Preparar a mistura contendo substâncias para fazer novas cópias

de DNA

4º passo: utiliza-se um termociclador que aquece e resfria o tubo em vários

ciclos consecutivos para amplificar o DNA
Problemas:

1- contaminação da amostra com material genético que

pode gerar cópias de DNA não relacionadas ao DNA alvo

2- Presença de substâncias que inibem a reação (Ex:

hemoglobina)