Sunteți pe pagina 1din 94

ÎNDREPTAR DE LUCRĂRI PRACTICE

MICROBIOLOGIE
Abrevieri:
➢ UV = ultraviolet

➢ LCR = lichid cefalo-rahidian

➢ PP = produs pathologic

➢ BK = bacilul Koch

➢ BAAR = bacili acid-alcool rezistenţi

➢ ADN =acid dezoxiribonucleic

➢ ARN = acid ribonucleic

➢ pH = potenţial șihydrogen

➢ G(+ / -) = gram pozitiv sau negative

➢ AABTL = Agar Albastru Bromotimol Lactose

➢ MIU = mobilitate indol urează

➢ MILF = mobilitate indol l-fenil alanine

➢ TSI = triplu zahăr și fier (triple sugar iron)

➢ OCST = mediu de îmbogăţire pentru bacilul difteric cuOu, Cistină, Ser, Telurit de potasiu

➢ EMB = eosine-methyl blau

➢ E.coli = Escherichia coli

➢ PISU = mediu pentru bacilul difteric

➢ CFU = unităţi formatoare de colonii

➢ NCCLS = National Committee for Control Laboratory Standards USA

➢ CA-SFM = Commite de l’Antibiogramme-Societe Francaise de Microbiologie

➢ SCN = stafilococi cuagulazo-negativi

➢ S = sensibil

➢ IS = intermediar sensibil

➢ R = rezistent

➢ CMI = concentraţia minimă inhibitory

➢ Ag = antigen

➢ Ac = anticorp

➢ ASLO = Ac anti-SLO (O=SLO=Ag)

➢ RFC = reacţia de fixare a complementului

➢ IF = imunofluorescenţa

➢ ELISA = reacţie imunoenzimatică

➢ RIA = radioimunoanaliza

➢ IDRS = imunodifuzia radiana simplă

➢ Ig A = imunoglobulina A

➢ Ig E = imunoglobulina E

➢ Ig G = imunoglobulina G

➢ Ig M = imunoglobulina M

➢ SLO = streptolizină

➢ MRSA/SARM = S. aureus meticilino-rezistent

➢ Ch = Chapman
➢ CF = clumping factor

➢ VDRL = Veneral Disease Research Laboratory

➢ TPHA = Treponema Pallidum hemagglutianation assay

➢ FTA-ABS = Treponema pallidum-Anticorpi IgG

➢ BK = Mycrobacterium Tuberculosis

➢ SNC = Sistemul Nervos Central

➢ TBC = tuberculoză

➢ AM = Albastru de Metilen

➢ MGG = May Grümwald Giemsa

➢ ZN = Ziehl-Nielsen

➢ IDR = Imunodifuzie Radiară/Intradermo reacţie

➢ BCG = Bacille de Calmette et Guérin

➢ PMN = Polimorfo-nucleare

➢ ADCL = Agar Dezoxicolat Citrate Lactoză

➢ ID = Test ID Bio Meriux

➢ TIA = toxiinfecţii alimentare

➢ EK = eukariot

➢ CIN = CIN Agar (Yersinia Selective)

➢ VF = Liver Meat Glucose Cysteine Broth

➢ SN = Sistem nervos

➢ RMN = rezonanţa magnetică nucleară

➢ VSH = viteza de sedimentare hematiilor

➢ CT = ecografie computerizată

➢ LMV = sindromul de Larva migrans viscerala

➢ PCR = reacţia de amplidicare genică

➢ EBV = Ebstain Barr virus

➢ VERO = linia vero

➢ ECHO11 = mediu de cultura

➢ SPF -specific = animale de laborator liber de patogenii specifici


pathogen free

➢ HIV- human = virusul imunodeficientei umane


immunodefici-
ency virus

➢ IFD = test realizat pe amprente de mucoasă

➢ RT-PCR = reverstranscriere-PCR

➢ MDCK- Madin- = linii celulare de rinichi de câine


Darby canine
kidney

➢ HA = hemaglutinare

➢ HAI = hemaglutinoinhibare

➢ ECP = efect citopatic

➢ AM = Coloratie Albastru de Metilen


CUPRINS

L.P. 1 Pagina
1.1.Organizarea și funcționarea laboratorului de microbiologie. (Carmen Defta)………………………………………………..…1

1.2. Norme de protecție a muncii înlaboratorul de microbiologie. (Carmen Defta)…………………………………………………4

1.3. Metode de sterilizare, antiseptice și dezinfectante. (Carmen Defta, Bogdan Dabu) ……………………………………...4

L.P. 2
2.1. Norme privind recoltarea și transportul produselor patologice în vederea efectuăriidiagnosticului de laborator

în infecții bacterien. ( Andreea Toponiski)…………………………………………………………………………………………………………..9

2.2. Tehnica efectuării frotiului din produs patologic. (Andreea Topolniski)…………………………………………………………….15

2.3. Tehnici de colorare a frotiurilor: tehnica albastrului de metilen, tehnica Gram și tehnica Ziehl-Neelsen.

(Andreea Topolniski)……………………………………………………………………………………………………………………………………………17

L.P. 3
3.1. Tehnici utilizate pentru studiul morfologiei microorganismelor.(Carmen Defta)…………………………………………….19

3.2. Examinarea la microscop a frotiurilor efectuate din produse patologice și culturi microbiene.(Carmen Defta)...
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….20

3.3. Medii de cultură. (Doris Ionescu)…………………………………………………………………………………………………………………………22

3.4. Tehnici de însămânțare a produsului patologic și tehnici de izolare bacteriană.(Doris Ionescu) ……………………24

L.P. 4
4.1. Tehnici de identificare bacteriană. (Doris Ionescu) …………………………………………………………………………………………….26

4.2. Testarea sensibilității la antibioticea tulpinilorbacteriene. (Doris Ionescu) …………………………………………………….27

L.P.5
5.1. Reacția antigen-anticorp de diagnostic. (Carmen Defta)…………………………………………………………………………………..33

5.2. Produse biologice cu rol în diagnosticul bolilor infecțiose. (Carmen Defta)………………………………………………………38

L.P. 6
6.1. Diagnosticul de laborator în infecțiile produse de cocii Gram-pozitivi. (Doris Ionescu)…………………………….....39

6.2. Diagnosticul delaborator în infecțiile produse de cocii Gram-negativi. (Doris Ionescu)……………………………….43

L.P. 7
7.1. Diagnosticul de laborator în infecțiile produse de spirochete. (Bogdan Dabu) ……………………………………………….44

7.2. Mycobacterium tuberculosis:schema diagnosticului de laborator în tuberculoză. (Carmen Defta)……………...47

L.P. 8
8. Diagnosticul de laborator în infecțiile produse de bacilii Gram-negativi.(Carmen Defta)………………………………….49

8.1. Diagnosticul de laborator în infecțiile produse de E. coli.………………………………………………………………………………….49

8.2.Diagnosticul de laborator în infecțiile produse deKlebsiella.……………………………………………………………………………50

8.3.Diagnosticul de laborator în infecțiile produse deProteus.……………………………………………………………………………….51

8.4.Diagnosticul de laborator în infecțiile produse de Samonella.…………………………………………………………………………..52

8.5.Diagnosticul de laborator în infecțiile produse de Shigella.……………………………………………………………………………...52


8.6. Diagnosticul de laborator în infecțiile produse de Yersinia………………………………………………………………………………..53

L.P. 9
9.1. Diagnosticul de laborator în infecțiile produsebacilii Gram-pozitivi. (Carmen Defta)……………………………………..54

9.2. Diagnosticul delaborator în actinomicoza cervicofacială. (Carmen Defta)……………………………………………………...56

L.P. 10
Diagnosticul de laborator în infestarile produse de paraziţi. (Carmen Defta)…………………………………………………………57

10.1. Entamoeba histolytica. ……………………………………………………………………………………………………………………………………57

10.2. Entamoeba gingivalis.………………………………………………………………………………………………………………………………….….58

10.3. Giardia duodenalis……………………………………………………………………………………………………………………………………………59

10.4. Trichomonas vaginalis..…………………………………………………………………………………………………………………………………..60

10.5. Trichomonas tenax ………………………………………………………………………………………………………………………………………….61

10.6. Toxoplasma gondii…………………………………………………………………………………………………………………………………………..62

L.P. 11
11.1. Diagnosticul de laborator în infecțiile produse de: Platelminti. (Carmen Defta)..………………………..………………..64

Trematode…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….64

11.1. a Fasciola hepatica.…………………………………………………………………………………………………………………………………………….64

Cestod.…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………65

11.1. b. Taenia solium.……………………………………………………………………………………………………………………………………………….66

11.1.c. Taenia saginata.…………………………………………………………………………………………………………………………………………...67

11.1.d. Diphyllobotrium latum.………………………………………………………………………………………………………………………………...68

11.1.e. Echinococcus granulosus.………………………………………………………………………………………………………………………………69

11.2. Diagnosticul de laborator în infecțiile produse de:Nematode.………………………………………………………………………..71

11.2. a. Ascaris lumbricoides.…………………………………………………………………………………………………………………………………….71

11.2. b. Toxocara spp.………………………………………………………………………………………………………………………………………………..72

11.2.c.Enterobius vermicularis.………………………………………………………………………………………………………………………………..73

L.P. 12
12.1. Norme privind recoltarea și transportul produselor patologice în vederea efectuăriidiagnosticului de laborator

în viroze.(Carmen Defta)………………………………………………………………………………………………………………………………….74

12.2. Metode de cultivare a virusurilor.…………………………………………………………………………………………………………………….75

12.3. Metode dediagnostic virusologic și serologic.………………………………………………………………………………………………..79

12.4. Diagnosticul de laborator în infecția produsă devirusurile gripale.……………………………………………………………...80

L.P. 13
13.1.Diagnosticul de laborator în hepatita B.(Carmen Defta) ……………………………………………………………………………….82

13.2. Diagnosticul de laborator în infecția produsă de virusul imunodeficienței imune/SIDA………………………………..82

13.3. Diagnosticul de laborator în candidoza bucală.………………………………………………………………………………………………83

L.P. 14
Diagnosticul de laborator în afecțiunile orale – parodontopatii, infecții de canal etc……………………88
LUCRAREA PRACTICĂ 1

1. Organizarea și funcționarea laboratorului de microbiologie.

Laboratorul de microbiologie esteorganizat pentru a primi și prelucra produsele patologice recoltate de la


pacienti, cu scopul de a izola și identifica microorganismele patogene.

Organizarea și dotarea laboratorului trebuie să satisfacă următoarele cerințe:

- Să usureze investigațiilenecesare recunoașteriimicroorganismului considerat agent etiologic, cu obținerea de


culturipure și identificarea patogenului prin examen microscopic;

- Împiedicarea suprainfecției probelor recoltate și mediilor însămânțate;

- Asigurarea după diagnostic a sterilizării materialelor;

- Protecția personalului față de infecțiile produse și manipulate în laborator;

- Pregătirea materialului necesar recoltării probelor pentru efectuarea examenului bacteriologic, pregătirea
mediilor de cultură pentru însămânțarea produselor.

Laboratorul trebuie sădispună de o serie de încăperi luminate natural, ferite de curenții de aer, situate în locuri
fără praf. Aceste spații au următoarele destinațiipentru: pregătirea materialului, primirea produselor patologice,
însămânțarea pe mediii de cultură, incubarea mediilor eventual efectuarea reacțiilor serologice, un spațiu pentru
examenul microscopic, sterilizarea ustensilelor și o boxă. Este impotantă evitarea contactului materialelor sterile cu
cele infectate.

Mobilierul aflate in laborator:

- mese de lucru din metal coperite cu plăci de faianță. Pe mesele cu faianță albă este necesară o placă neagră.

- dulapuri din metal;

- frigidere și congelatoare pentru: conservarea mediilor de cultură, păstrarea tulpinilor isolate și cele de referință;

- scaune rotative;

-becuri Bunsen, sursă de apăși de gaze;

Aparatura și instrumente:

-ansa bacteriologică pentru însământare, repicarea culturilor, prepararea frotiurilor;

-găleți de metal cu capac pentru colectarea materialului infecțios;

- autoclav, etuvă termoreglabilă –pupinel, centrifugă, termostat reglabil, baie-marie;

- truse de reactivi necesar colorațiilor Gram, Ziehl-Neelsen, May-Grümwald-Giemsa;

- microscoape, balanțe, pompe de vid, stelaje, coșulețe metalice, trepiede cu plasă de azbest;

-aparat de preparat apa distilată;


Sticlăria de laborator: eprubete, tuburi, plăcii Petri de diametre diferite, țeavă de sticlă pentru pipete Pasteur,
cilindrii gradați, pahare conice, borcane, cristalizoare, perle de sticlă, lame și lamele, sticle de ceas pentru cântărire
la balanța analitică, markere, leucoplast, foarfeci, instrumente metalice (pense, bisturie, clești, etc).

2. Normele de protecție a muncii în laboratorul de microbiologie.

- echipament de protecție (halat din material textil);

- sunt interzise fumatul și mâncatul în laborator;

- nu se pun obiecte personale pe masa de lucru;

- obiectele contaminate sunt manipulate cu grijă;

- se sterilizează ansa înainte și după fiecare manevră de lucru;

- după utilizarea lamelorși a pipetelor sunt introduse în amestec sulfocromic;

- resturile sunt aruncate la galeata de infecte;

- dacă s-a produs contaminarea suprafețelor se toarnă sublimat 10/00, fenol 5%, clorofom 30/00, timp de 20
minute. După care se curăță corespunzător cu apăși apoi cu alcool.

3. Metode de sterilizare.

Sterilizarea reprezintă ansamblul de metode prin care se distrug toate microorganismele patogene şi
nepatogene fie în forma vegetativă, mai puțin rezistente, cât și în formărezistentă sporulată de pe un obiect,
suprafaţă sau mediu,aceasta fiind o sterilizare completă sau totală.

În sterilizarea incompletă sau decontaminarea sunt omorâte numai formele vegetative nu si cele sporulate.Un
material este steril când este lipsit total de microorganisme vii.

Rolul sterilizarii este de protecție atât a probelor câtși a personalului de laborator.

Moartea celulelor bacteriene reprezintă pierderea ireversibilă a capacității de a genera o culturăși se datorează
denaturării sau dezintegrării structurilor microbiene sub acțiunea agenților sterilizanți.

Clasificarea metodelor de sterilizare:A. Sterilizarea prin Agenți Fizici:

I. Căldură a. Uscată: 1. Încălzirea la roșu

2. Flambarea

3. Incinerarea

4. Sterilizarea prin aer cald

b. Umedă: 1. Fierberea

2. Pasteurizarea

3. Tindalizarea

4. Autoclavarea

II. Filtrarea
III. Prin radiații 1. ionizante- radiații α,β,γ

2. neionizante – radiații UV

IV.Prin ultrasunete

B. Sterilizarea prin Agenți Chimici:

I. steilizare gazoasă

II. sterilizare prin soluții -dezinfectante

-antiseptice

Etapele sterilizării:

• Pregătirea materialului pentru sterilizat;

• Sterilizarea propriu-zisă;

• Controlul sterilizării;

După sterilizare obiectele sunt sigilate, iar pe sigiliuse notează data sterilizăriiși numărul lotului de sterilizare.

• Pregatirea materialului pentru sterilizat :

1. Decontaminarea; sticlaria de laborator (plăci Petrii, baloane, filtre, etc.) se adunăîngăleți de infecte
prevăzute cu capac și se sterilizează prin autoclavare 1 ora la 1340C. Pipetele de orice tip, lamele,
lamelele, baghetele de sticlă se mențin timp de 24 de ore în amestec sulfocromic.

2. Curațarea mecanică: periaj în soluție 1-2% detergent cationic în apă caldă. Urmat de spălare în jet
puternic de apă, clatire perfectă, apoi e efectuează ”tragere” prin soluție de alcool 900.

3. Uscare în stative speciale la temperatura camerei.

4. Ambalarea se face de așa manierăîncât, după sterilizare să nu mai poată venii în contact cu mediul interior
în timpul depozitării (Fig.1.1).

• Sterilizarea propriu-zisa

A. Prin Agenți Fizici

I.a. Căldură Uscată.Prin acest mecanism microorganismelesunt oxidate sau carbonizate.

1. Încălzirea la roșu (aducerea la incandescență)- este folosită pentru Ansa Bacteriologică, manevra se
efectueazăînainte și după fiecare întrebuințare, este contraindicatăpentru sterilizarea instrumentarului
metalic din laborator deoarece în timp acesta se degradează(Fig. 1.2).
Fig. 1.1. Fig. 1.2. Fig. 1.3. Fig. 1.4. Materiale
ambalate Încalzire la roșu Flambarea Pupinel (foto C. Defta)

2. Flambarea –constăîn trecerea materialului prin flacară de câteva ori, timp de câteva secunde, nu este o
metodă de sterilizare ci mai degraba de protecție împotriva contaminării cu germeni din aer(sterilizare de
suprafață). Se flambează capilarul pipetei Pasteur, pipete gradate, gâtul eprubetelorsau baloanelor de
sticlă(Fig. 1.3.).

3. Sterilizarea cu aer cald la Pupinel (etuva termoreglabilă) (Fig. 1.4.), metoda este folosită pentru obiectele
din sticlă, obiectele din porțelan, instrumente metalice neascuțite, unele uleiuri, pulberi (talc).
Contraindicată soluțiilor apoase, obiectelor de cauciuc, țesăturilor etc.Condițiile pentru sterilizare sunt de
170-1800C, timp de o oră de când s-a atins această temperatură. Pupinelul este o cutie paralepipedică cu
pereții dublii prevăzută cu un sistem de ventilație care permite circulația aerului cald în interiorși un sistem
digital pentru setarea condițiilor și timpului de sterilizare.

4. Incinerarea folosită pentru eliminarea reziduurilor contaminate (comprese septice, pansamente, tampoane,
medii de cultură, instrumente de unică folosințăși eventual animale moarte de laborator etc).

I.b. CaldurăUmedă. Este cea mai eficientă metodă de sterlizare. Mecanismul prin care sunt omorâte microor-
ganismele este de coagulare și degradare a proteinelor şi enzimelor.

1. Fierberea constăîn încălzirea la 1000C timp de 30 de minute din momentul în care apa a dat în clocot,în
recipientele corespunzătoare. Temperatura poate fi crescută până la 105-1060C prin adăugarea în apă a
carbonatului de sodiu. Prin fierbere se distrug formele vegetative bacteriene, fungi și unele virusuri, dar nu
sporii. Metoda este indicată pentru: seringi, instrumente de mică chirurgie în urgente (când nu există
posibilitatea autoclavării), lenjerie, sonde etc.

2. Pasteurizarea – este o metodă de sterilizare parțială blândă prin care se distrug doar formele vegetative.
Se folosește pasteurizarea joasă (la 55 – 650C timp de 30 min), pasteurizarea medie (la 65 – 750C timp de
15 min) şi pasteurizare înaltă (85 – 900C timp de 5 min) urmate de scăderea bruscă la 40C, aceasta
completează efectul antimicrobian prin soc termic. Folosităîn industria alimentară, la conservarea de scurtă
durată fară a distruge proteinele, enzimele, vitaminele, unele medii.

3. Tindalizarea – este o pasteurizare repetată cu termostatări între pasteurizări, este o metodă blândă. Se
efectueazăfie într-un tip special de autoclav cu vapori fluenți, sau în baie de apă. Metoda constăîn încălzirea
la 60-75 0C timp de o oră, pe parcursul a 3 zile succesive a materialului ce trebuie sterilizat. Prin tindalizare
de distrug formele vegetative și indirect sporii prin transformarea lor în forme vegetative pe parcursul
termostatării și distrugerea ulterioară la următoarea încălzire. Indicatăîn sterilizarea mediilor ce conțin
substanțe organice ce ar putea fi degradate la temperaturi mai mari ex. medii de cultura, produse
biologice.

4. Autoclavarea – cea mai eficientă şi mai folosită metodă de sterilizarece constăîn sterilizarea cu vapori de
apă sub presiune care sunt extrem de penetranți distrugând atât formele vegetative cât și cele sporulate.
Se realizează în autoclavce se prezintăca un un aparat format dintr-un cazan cilindric cu pereţi metalici
rezistenţi, prevăzut cu un capac metalic masiv ce se va închide etanş. Autoclavul este de asemenea
prevăzut cu un manometru ce indică presiunea interioară şi indirect prin echivalenţă temperatura: la 1atm
corespund 1200C; un robinet pentru eliminarea aerului din interior şi o supapă de siguranţă. Temperatura
și presiunea vor fi după caz: la 1210Cși 1 atmosferă; la 1340C şi 2 atmosfere. Metoda este utilizată pentru
decontaminarea obiectelor de laborator, instrumentarului metalic tăios, materiale din bumbac, obiecte din
cauciuc, uleiuri sau substanțe cu conținut mai mare de 20% apă, filtre, medii de cultură, etc.
Contraindicată substanțelor higroscopice (conținut mai mic de 20% apă), substanțelor termodegradabile
(Fig. 1.5)

Fig. 1.5. Autoclav Fig. 1.6. Hota flux laminar cu UV

(foto C. Defta)

II. Filtrare. Metoda constăîn trecerea lichidului printr-o substanță poroasăîn vederea îndepărtării microorganismelor
de tipul virusurilor, bacteriilor, protozoarelor, lăsând să treacă lichidul,în careacestea au fost suspendate pentru
cultivare sau în urma cultivării, prin aspirația cu ajutorul unei pompe de vid. Indicatăîn obținerea de seruri, soluții
injectabile, lichid de ascită folosit la prepararea unor medii. Filtrele ce se foloseau în trecut erau confecţionate din
porţelan, azbest, sticlă poroasă. În prezent se folosesc filtre din acetat de celuloză.

III. Radiații.Acest tip de sterilizare este indicat materialelor care prin natura lor nu pot fi sterilizate prin alte metode

1. ionizante– radiații α,β,γ necesită instalații speciale împotriva radiațiilor, au acțiune bactericidă puternică, folosite
în sterilizările industriale, instrumentele medicale, alimente, medicamente.

2. neionizante – radiații UV acestea sunt absorbite de acizii nucleici și proteine determinând modificarea structurii
chimice prin ruperea unor legături chimice sau formarea unora noi. Are efect bactericid la lungimi de undă de
280-250nm. Se folosesc lămpi de UV fixate la 40 cm de suprafața ce urmează să fie sterilizată, în boxele de lucru,
sălile de operație sau hotele cu flux laminar (Fig. 1.6.)

3. sterilizarile cu fascicole de neutroni, necesită instalații speciale, folosite în industrie.

IV. Ultrasunetele acestea sunt bactericide prin efectul lor de cavitație pe care o produce unda sonoră la trecerea
prin apa intra sau extracelulară ducând la dezintegrarea structurilor microbiene. Se folosesc ultrasonări în băi cu
soluții de detergenți în cutii metalice cu tijă centrală prin centru. Aceasta metodă este utilizată la sterilizarea și
curațarea instrumentarului stomatologic și chirurgical.

Bactericid –agenți sau substanțe care omoară bacteriile.

Bacteriostatic –agenți sau substanțe care pot oprii dezvoltarea bacteriilor.

B. Sterilizarea prin Agenți Chimici:

I. gazoasăcu *etilenoxidul distruge bacteriile în formă vegetativă și unii sporiacţionând la nivelul acizilor nucleici.
Este o metodă de sterilizare folosită pentru materiale care nu rezistă la căldură (materiale plastice, din cauciuc,
echipamente electronice, etc).

*clorul gazos dezinfectează apa potabilă,

* vapori de azot, β-propiolactona, aldehida formică sub forma de aerosoli, sterilizarea se face cu
aparate speciale, la o anumita temperatură, umiditate, într-o anumită perioadă de timp.

II. prin soluții

–dezinfectantesunt substanțele care în concentrațiile lor active sunt iritante și toxice pentru țesuturile vii,
bactericide omoarând formele vegetative de pe suprafețe sau produse patologice în funcție de timpul de contact
(15-20 minute). Exemplu: amestecul sulfocromic, biclorura de mercur, permanganatul de potasiu în concentrații de
10/00, varul cloros, fenolul, hidroxidul de sodiu, formolul, bromocetul 1%.

-antisepticesubstanțele chimice care în doze active nu sunt toxice pentru organism, ele distrugformele vegetative
ale microorganismelor de pe tegumente mucoase sau plăgi. Exemplu: apa oxigenata, permanganatul de potasiu în
concentrații de 1/5000 și 1/10000, tinctura de iod, cloramina, alcoolul de 900, 700, boraxul, săpunurile, bromocetul
10/00,mertiolatu de sodiu, nitratul de argint.

Controlul sterilizării:Se face prin indicatori fizici, chimici şi biologici.

Indicatorii fizici: termometre, manometre,ce se vor aşeza în interiorul aparatului.

Indicatorii chimici: se folosesc substanţe cu punct de topire cunoscut: benzofenolul 1100C, sulful 1150C, antipirina
1130C, acidul bezoic 1200C folosite pentru autoclav, iar tioureea 1800Cpentru pupinel. La aceste substanţe se
adaugă colorant (albastru de metilen sau fuxină) care atunci când se ajunge la punctul topire vor colora substanţa în
albastru sau roşu.

Indicatorii fizici și chimici ne ajută să verificăm dacă temperatura de sterilizare s-a realizat în interiorul apartului de
sterilizare. Dezavantajul major este ca aceste teste nu ne indică şi timpul de acţiune.

Indicatorii biologici: se folosesc sporii ce rezistă la temperaturi ridicate (spori de bacil antracis, bacil mezenteric sau
bacil stearotemophilus) sterilizarea va fi eficientă dacăînsămînţarea sporilor după sterilizare nu duce la apariția de
colonii. În laborator aceşti spori sunt îmbibaţi în fire de mătase ce sunt închise în tuburi de sticlă. Astfel, la sfârșitul
sterilizării firele se suspendă în mediu lichid și se termostatează la 370C timp de 24 de ore. După incubare dacă
mediul ramâne limpede sterilizarea a fost efectuată corect dacă mediul se tulbură sterilizarea nu a fost corectă și se
repetă sterilizarea. În cazul stearotestului acesta conține mediu de cultură spori de stearo termophilus și indicator
de culoare astfel că după sterilizare și incubare mediul rămâne violet sterilizarea a fost executată corect dacă devine
galben acest lucru dovedește că sporii au germinat iar produșii de metabolism au modificat pH-ul mediului ducând la
virarea indicatorului de pH în galben. Testele biologice se dovedesc a fieficiente deoarece arată atât timpul de
acţiune cît şi temperatura (Fig. 1.7.).

Fig. 1.7. Fiole de stearotest la sfârșitul sterilizării și două fiole cu uree înaintea
sterilizării(foto C. Defta)

LUCRAREA PRACTICĂ 2

2.1.Norme privind recoltarea și transportul produselor patologice în vederea efectuării

diagnosticului de laborator în infecțiile bacteriene.

Produs patologic :materialul biologic în care suspectăm existenţa unor germeni (agenți patogeni).

Exemple de produse patologice: sânge, urină, materii fecale,exsudat naso-faringian, LCR, etc.

Examenul microbiologic va oferi un rezultat corect doar in condiţiile respectării unor reguli de bază privind:
• recoltarea produsului patologic (p.p.)
• transportul p.p.
• conservarea p.p.

Reguli privind recoltarea produsului patologic:


• recoltarea se face înaintea instituirii tratamentului cu antibiotic sau chimioterapice;
• obligatoriu se folosesc recipiente şi metode sterile pentru prevenirea contaminării probelor şi a pacienţilor;
• recoltarea trebuie efectuată cât mai aproape de debutul bolii, sau în momentul, în care probabilitatea de a
găsi agentul etiologic este maximă (ex. în frison - pentru hemocultură);

• produsul patologic trebuie recoltat într-o cantitate suficientă şi din zone reprezentative;
• în unele cazuri trebuie folosite medii de transport;
• produsul să fie însoţit de un bilet de trimitere completat corect;
• probele să fie etichetate şi transportate la laborator în cel mai scurt timp posibil;

Reguli privind transportul produsului patologic:


• produsele patologice se transportă în cel mai scurt timp – max. 1-2 h de la recoltare;
• la temperatură adecvată în funcţie de produsul patologic;
• se previne contaminarea atât a probei, cât si a personalului care o transportă şi a mediului extern;
• în situaţia întârzierii probelor se folosesc: medii de transport (Stuart, Amies, Cary-Blair), recipiente
izoterme 0-4ºC (nu transportăm bacterii termosensibile care nu rezistă la aceste temperaturi: Neisseria
meningitides, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae), pentru izolarea anaerobilor se foloseşte
transportul în seringă cu eliminarea aerului etc.

EXEMPLE DE PRODUSE PATOLOGICE (Metode de recoltare şi transport)

EXSUDATUL FARINGIAN:

Când recoltăm:

- dimineaţa, înainte de spălatul pe dinţi, înainte de masă sau la minimum 4 ore după toaleta gurii, alimentaţie.

Ce recoltăm:

- exsudat din zonele eritematoase, purulente, inflamate, ulcerate situate pe amigdale şi orofaringe.

Cum recoltăm:

- pacientul așezat pe scaun, lângă o sursă de lumină, cu gâtul în uşoară extensie, deschide gura, spune “A”;

- persoana care recoltează deprimă limba cu apăsătorul steril şi printr-o mişcare fermă şterge cu tamponul zonele

modificate .

ATENŢIE: NU se atinge limba!!

Ce folosim pentru a recolta:

-2 / 3tampoane cu vată obişnuită uşor umectate în ser fiziologic (pentru efectuarea frotiului, însămânţare,

numărul tampoanelor diferă în funcţie de boala pe care o suspectăm)(Fig. 2.1.)

& Fig.2.1. Tampoane sterile în tub cu mediu(foto A. Topolniski)


Transport:

- imediat sauîn maximum1-3 ore de la recoltare;

- daca nu se respectă condiţiile de mai sus se recomandă utilizarea mediului de transport (ex. Amies).

EXSUDATUL NAZAL:

Când recoltăm:

- când există simptomatologie clinică.

Ce recoltăm:

- exsudat.

Cum recoltăm:

- pacientul stăaşezat, cu capul în extensie pe spate, orientat spre o sursă de lumina;

- persoana care recoltează introduce tamponul printr-o nară, până la peretele posterior al nazofaringelui, lasă

câteva secunde, retrage puţin, apoi reinseră, roteşte uşor, retrage definitiv tamponul.

ATENŢIE: NU se atinge tegumentul din jurul nărilor!!

Ce folosim pentru a recolta:

-2 / 3tampoane cu vată obişnuită uşor umectate în ser fiziologic (pentru efectuarea frotiului, însămânţare,

numărul tampoanelor diferă în funcţie de boala pe care o suspectăm)(Fig. 2.2.)

* Fig.2.2. Tampoane sterile(foto A. Topolniski)

Transport:

- imediat sauîn maximum1-3 ore de la recoltare;

- dacă nu se respectă condiţiile de mai sus se recomandă utilizarea mediului de transport (ex. Amies).

SPUTA:

Când recoltăm:

- dimineaţa, după toaletarea cavităţii bucale (periajul dinţilor, clătirea energică a gurii cu apă de gură sau soluţie

salină fiziologică)

Ce recoltăm:

- secreţie expectorată, mucopurulentă.

Cum recoltăm:

- pacientul tuşeşte spontan, intens, supravegheat de o persoană calificată;

- stimularea tusei și a expectoraţiei prin inhalarea de aerosoli cu soluţie salină 3% - frotiul oferă informaţii

necorespunzătoare din punct de vedere citologic.

Ce folosim pentru a recolta:

- secreţia expectorată în mod fiziologic de către pacient;

- aspirat bronhoscopic, transtraheal, transtoracic recoltat cu dispozitive adecvate;

Se foloseşte sputa de la expectoraţia matinală sau expectorată în interval de 1 – 2 ore, recoltatăîn dispozitive
sterile.

Este suficientă o cantitate de 2-3 ml spută.

În suspiciunea de TBC se recomandă recoltarea a 3 produse patologice în 3 zile consecutive.


ATENŢIE : NU se examinează probele de spută adunate în 24 de ore!!

Transport:

- imediat sauîn maximum1-2 ore de la recoltare;

- în recipiente sterile, la 4ºC există riscul de a pierde neisseriile și haemophilii;

- dacă nu se respectă condiţiile de mai sus se recomandă utilizarea mediului de transport. (ex. Amies, Stuart)

LCR

Când recoltăm:

- în orice moment se suspectează un sindrom meningeal.

Ce recoltăm:

-LCR.

Cum recoltăm:

- în condiţii de asepsie, la patul bolnavului prin puncţie lombară;

- la nou născuţi se recoltează din fontanela anterioară.

Ce folosim pentru a recolta:

- seringă cu ac special;

- se recoltează o cantitate de 5- 10 ml, în 2-3 tuburi pentru investigaţii microbiologice, biochimice, etc.

Transport:

- se recomandă recoltarea la patul bolnavului

- dacă nu, se transportă în cel mai scurt timp la o temperatură apropiată de cea umană.

ATENŢIE: NU se refrigerează!!! Neisseriile și Haemophilus termolabili – mor prin refrigerare.

URINA:

Când recoltăm:

- când se suspectează o infecţie de tract urinar se recomandă recoltarea primei urini de dimineaţă sau o recoltare

după cel puţin 3 ore de la prima micţiune.

-în cazul infecției cu BK cu localizare renală se recoltează urină timp de 24 de ore într-un recipient steril cu

păstarea lui în frigider între micțiuni.

Ce recoltăm:

- urina.

Cum recoltăm:

- micţiune fiziologică: după toaletarea riguroasă a organelor genitale externe, din jetul mijlociu (bacteriile

saprofite din uretra terminală sunt antrenate o dată cu jetul primar, evitându-se astfel contaminarea);

- puncţie şi aspiraţie suprapubiană;

- cateterizare uretrală;

- pentru nou-născuţi se folosesc pungi sterile din material plastic.

Ce folosim pentru a recoltare:

- recipiente sterile numite urocultoare (Fig. 2.3.);

- este suficientă cantitatea de 20-50 ml urina.


* Fig.2.3. Urocultor(foto A. Topolniski)

Transport:

- imediat sauîn maximum 30 minute;

- dacă nu se respectă condiţiile de mai sus se recomandă menţinerea şi transportul la 4ºC.

- în 2 ore după recoltare, la temperatura camerei, numărul bacteriilor poate atinge o valoare sugestivă pentru o

infecţie de tract urinar (peste 100.000 ufc/ml)(ufc-unități formatoare de colonii)

SÂNGE:

Când recoltăm:

- înaintea instituirii unui tratament cu antibiotice;

- în momente diferite pe parcursul a 24 de ore, minimum 2 probe (pentru flora aerobă și flora anaerobă), dar cel

mai frecvent se recoltează 3 probe.

- în funcţie de patologia clinică a pacientului se recomandă recoltarea probelor de sânge în diferite momente (ex.:

sepsis - se recoltează 3 hemoculturi diferite în momentul, în care pacientul semnalează apariţia frisonului,

endocardită acuta – 3 hemoculturi într-un interval de 1-2 ore, etc.).

- pentru un diagnostic serologic se recoltează sânge la recomandarea medicului clinician.

- Ce recoltăm:

- sânge.

Cum recoltăm:

- se recoltează în vacutainere fără anticoagulant sau cu seringă şi ac prin puncţie venoasă la plica cotului fie

pentru diagnosticul serologic, fie pentru efectuarea hemoculturii;

- se antiseptizează tegumentul cu iod, apoi cu alcool sanitar;

- se decontaminează dopul flacoanelor de hemocultură înainte de a fi transferat sângele din seringă în acestea, iar

în cazul diagnosticului serologic serul este separate în laborator.

Ce folosim pentru a recolta:

- seringă, ac și flacoane speciale pentru hemocultură (Fig. 2.4.).

- vacutainere fără anticoagulant pentru diagnostic serologic (Fig. 2.5.).

- se recomandă recoltarea a 10 ml sânge pentru adulţi și 1-3 ml sânge pentru copiii mici, dar aceste valori pot

fluctua uşor în funcţie de flacoanele de hemocultură folosite.

* Fig.2.4. Flacon hemocultură(foto A. Topolniski)* Fig. 2.5. Vacutainer(foto A. Topolniski)

Transport:

- probele de sânge nu se refrigerează şi trebuie transportate cât mai repede în laborator.


MATERII FECALE:

Când recoltăm:

- înaintea instituirii unui tratament cu antibiotic şi cât mai aproape de debutul unui sindrom diareic;

- în orice moment în care se suspicionează o infecţie parazitară.

Ce recoltăm:

- materii fecale.

Cum recoltăm:

- din scaunul emis spontan – este metoda cea mai indicată atât pentru examenul de coprocultură, cât şi pentru

examenul coproparazitologic.

- prelevare rectală recomandată în shigellozele cronice şi investigarea purtătorilor de Salmonella și Shigella


• cu ajutorul tamponului rectal (tamponul steril umectat în ser fiziologic se introduce la nivel rectal aproximativ
15 cm și prin mişcări de rotire se prelevează secreţiile de la nivelul mucoasei rectale);

• cu ajutorul sondei Nelaton (se procedează identic doar că se adaptează o seringă cu ajutorul căreia se fac 1-2
aspiraţii);

• în ambele situaţii se recomandă introducerea produsului patologic în mediul de transport.

Ce folosim pentru a recolta:

- recipiente sterile numite coprocultoare (Fig. 2.6.);

- coprocultoare cu mediul de transport (în situaţia unui sindrom diareic) şi fără mediu de transport (pentru

examenul coproparazitologic);

- se recoltează zonele modificate macroscopic (sânge, puroi, mucus).

* Fig. 2.6. Coprocultor(foto A. Topolniski)

Transport:

- coprocultoare fără mediu de transport – proba trebuie lucrată în maximum 2 ore.

- coprocultoare cu mediu de transport (Cary Blair) – probele pot fi păstrate 24 de ore la temperatura camerei.

- excepţie de la aceste reguli fac Shigella ce trebuie însămânţată imediat pe mediu de cultură şi V. cholerae ce se

transportă într-un mediu ce are şi rolul de îmbogăţire: apa peptonată

SECREŢII GENITALE – LA FEMEI:

Când recoltăm:

- preferabil după primele 10 zile ale ciclului menstrual – pentru diagnosticul infecţiilor bacteriene;

- la mijlocul ciclului menstrual, în afara perioadei menstruale, după tratarea unor posibile infecţii – pentru

efectuarea unui frotiu cervico-vaginal ( citologie cervico-vaginală Babeş - Papanicolau);

- pentru ambele situaţii se recomandă ca înainte cu 24-48 de ore să se evite contactul sexual, lavajul vaginal,
diverse tratamente sau manopere intravaginale.

Ce recoltăm:

- secreţie vaginală;

- celule ale zonei endocervicale, exocervicale şi de tranziţie dintre acestea.

Cum recoltăm:

- recoltarea este efectuată de către medicul ginecolog, pe masa de ginecologie.


• în vaginite: se recoltează secreţie vaginală din fundul de sac, cu tampon steril;
• în cervicite:se recoltează de la nivelul canalului cervical prin introducerea şi rotirea unui tampon steril;
• la fetiţe: fie se tamponează secreţia din zona vaginală, fie se colectează lichidul de spălătură introdus

în vagin cu ajutorul unui cateter (se introduc 10 ml de ser fiziologic);


• pentru frotiul cervico-vaginal: se recoltează cu ajutorul unei periuţe astfel încât prin rotire să se

recolteze celule atât din zona exocervicală, cât şi din zona endocervicală.

Ce folosim pentru a recolta:

- 3 tampoane sterile – două tampoane le folosim pentru frotiuri Gram şi Giemsa și al treilea îl folosim pentru

însămânţare pe medii de cultură

- periuţe cervicale (citobrush)(Fig. 2.7.)

Fig. 2.7. Citobrush(foto A. Topolniski)

Transport:

- imediat în suspiciunea de gonoree (gonococul nu rezistă la transport şi refrigerare), eventual după

recoltare se recomandă însămânţarea pe medii de cultură încălzite la 37ºC.

- se pot folosii medii de transport conservându-se astfel secreţia vaginală pentru o perioadă de maximum 24

de ore.

SECREŢII GENITALE – LA BĂRBAŢI:

Când recoltăm:

- dimineaţa, înainte de prima micţiune sau la 2 ore după aceasta.

Ce recoltăm:

- secreţie uretrală.

Cum recoltăm:

- secreţia spontană matinală: se recoltează prin ştergerea secreţiei cu ajutorul tamponului de vată;

- secreţie exprimată prin compresia uretrei;

- secreţie intrauretrală cu ajutorul ansei microbiologice sau a tamponului steril: se inseră în interiorul uretrei

2 cm, apoi se roteşte.

Ce folosim pentru a recolta:

- tampoane sterile de vată, anse sterile de unică folosinţă sau platină şi tampoane speciale, mici pentru

recoltarea intrauretrală (Fig. 2.8.)


Fig. 2.8. Anse sterile de unică folosinţă(foto A. Topolniski)

Transport:

- imediat în suspiciunea de gonoree (gonococul nu rezistă la transport și refrigerare), se pot folosii medii de

transport conservându-se astfel secreţia uretrală pentru o perioadă de maximum 24 de ore.

PUROI

Când recoltăm:

- în orice moment există supuraţii, colecţii purulente.

Ce recoltăm:

- puroi din plăgi suprainfectate, flegmoane, abcese.

Cum recoltăm:

- în funcţie de localizare şi de leziune;

-puroiul poate fi recoltat prin ştergere cu tampoane de vată, atunci când nu există altă soluţie sau cu ansa

bacteriologică;

- când este vorba de colecţii purulente se recomandă recoltarea prin biopsiere, chiuretare sau puncţie şi

aspiraţie.

Ce folosim pentru a recolta:

- tampoane de vată sterile, anse bacteriologice, seringi cu ac, bisturie.

Transport:

- imediat sau în maximum 2 ore;

- când se suspectează o infecţie cu germeni anaerobi, seringa folosită la recoltare se închide cu dop pentru

asigurarea condiţiilor de anaerobioză.

2.2.Tehnica efectuării frotiului din produs patologic.

Deşi examenul microscopic nu are de fiecare dată valoare decisivă în diagnosticul de laborator, totuşi de cele
mai multe ori reuşeşte să orienteze medicul de laborator în ceea ce priveşte urmarea unei anumite scheme de
diagnostic.

În diagnosticul de laborator se foloseşte examenul microscopic în etapa a doua când se examinează produsul
patologic şi în etapa a patra când se examinează coloniile crescute pe mediile de cultură.

Prelevarea şi întinderea pe lamă a produsului patologic sau a unui fragment din cultura bacteriană în vederea
unei examinări microscopice poartă denumirea de frotiu.

În practica curentă se utilizează două tipuri de frotiuri :

1. Frotiul umed (lamă - lamelă);

2. Frotiul uscat (colorat).

FROTIUL UMED/nativ sau lamă-lamelă

Tehnică: Pe o lamă se pune o picătura de ser fiziologic apoi se descarcă un fragment din produsul patologic se

ataşează lamela prin poziționarea laterala la locu de incidență lama produs, sub un unghi dupa care se
lasa ușor în jos, evitându-seformarea de bule.

În diagnosticul microbiologic frotiul umed oferă informaţii în ceea ce priveşte :

• mobilitatea germenilor;

• morfologia bacteriană.

Frecvent acest preparat este folosit în diagnosticul parazitologic.

Ţinând cont de faptul ca aceste frotiuri conţin germeni vii, necoloraţi examinarea se face cu:

• microscopul cu fond întunecat - bacteriile se văd luminoase pe un fond întunecat;

• microscopul optic, cu obiective uscate, condensator coborât;

• microscop cu contrast de fază.

FROTIUL USCAT

Etapele realizării unui frotiu uscat din produs patologic lichid sau din cultura microbiană lichidă (Fig. 2.9.):

1. etalarea –produsul patologiclichid acesta se prelevează cu ansa bacterilogică sterilăși se întinde pe lamă

prin mişcări circulare fărăa atinge marginile acesteia;

2. uscarea la temperatura camerei, în urma uscării frotiul apare ca o pată albă neaderentă la lamă, în acest

stadiu frotiul este contaminant;

3. fixarea (la flacără sau chimică) – prin fixare bacteriile aderă strâns la lamăși astfel sunt distruse,cel mai
frecvent se foloseşte fixarea la flacără. Lama este trecută de trei ori prin flacără (călcând flacăra cu frotiul în
sus) și de fiecare dată se testează temperatura prin atingerea dosului palmei la tabacheră. Dacă tolerăm
termic (560C) atunci frotiul a fost fixat corespunzător. Nu trebuie depașită acestă temperatură deoarece se
produce denaturarea frotiului.

Fixarea are rolul de a:

- creşte aderenţa produsului patologic de lamă;

- creşte afinitatea elementelor de pe frotiu pentru colorant.

4. colorarea - se foloseşte una dintre cele mai frecvente trei coloraţii : Albastru de metilen, Gram, Ziehl Neelsen

Fig. 2.9. Etapele efectuării unui frotiu(desen A. Topolniski)

Etapele realizării unui frotiu uscat din produs patologic solid sau din cultură microbiană solidă:

1. etalareadacă produsul patologic este semisolid sau solid se pune mai întâi o picătură de

ser fizilogic, se omogenizează produsul patologic cu serul fiziologic apoi se întinde în strat cât mai

subţire pe lamăprin mişcări circulare fără a atinge marginile.


2. uscarea la temperatura camerei;

3. fixarea (la flacără sau chimică) – cel mai frecvent se foloseşte fixarea la flacără;

4. colorarea se foloseşte una dintre cele mai frecvente trei coloraţii : Albastru de metilen, Gram, Ziehl
Neelsen

Frotiul uscat, colorat ne oferă informaţii în ceea ce priveşte:


• morfologia germenilor
• dispoziţia germenilor
• tinctorialitatea (colorabilitatea)

Examinarea se face cu :
• microscopul optic cu imersie – cea mai uzitată metodă
• microscopul optic cu obiectiv uscat

2.3. Tehnici de colorare a frotiurilor: tehnica albastrului de metilen, tehnica Gram și tehnica Ziehl-

Neelsen

Pentru colorarea frotiurilor se pot folosi diferite coloraţii, dar aşa cum am precizat şi mai sus cele mai
frecvente sunt: albastru de metilen, Gram şi Ziehl Neelsen.

Coloraţia cu albastru de metilen:

Este cea mai simplă coloraţie, foloseşte un singur colorant şi asigură o bună diferenţiere a detaliilor structurale
atât ale celulelor eucariote, cât şi ale celulelor procariote.

Tehnică:

- se acoperă frotiul cu soluţie albastru de metilen, se lasă 1-2 min;

- se spală cu apă de la robinet;

- se lasă la uscat în stativ;

- se examinează la microscopul optic cu imersie (obiectiv de imersie 100x iar între lama și obiectiv de pune
ulei de cedru).

Examen microscopic:

- bacteriile se colorează în albastru

- celulele eucariote se colorează în albastru

- capsula şi sporul bacterian NU se colorează (capsula se observă ca un halou în jurul bacteriilor şi sporul ca o
lipsă de substanţă de formă sferică în interiorul bacteriilor)

Coloraţia Gram:

Este o coloraţie dublă, complexă, foloseşte doi coloranţi şi un decolorant.

Principiu: Coloraţia Gram diferenţiază bacteriile în funcţie de structura peretelui celular, astfel încât bacteriile cu
perete gros fixează primul colorant pe care nu-l cedează în totalitate la decolorare, iar bacteriile cu perete subţire
fixează primul colorant pe care-l cedează la decolorare urmând a se recolora cu ultimul colorant.

Tehnică:

- se acoperă frotiul cu soluţie violet de genţiană, se lasă 1-2 minute după care se varsă;

- se acoperă frotiul cu lugol (mordant, fixator de culoare), se lasă 1-2 minute, după care se varsă;

- se decoloreaza frotiul cu alcool acetonă, se lasă maxim 10 secunde;

- se spală cu apă de la robinet;

- se acoperă frotiul cu fucsină diluata 1/10 (9 părţi apă distilată/1parte fucsină preparata extemporaneu),
se lasă 1-2 minute;

- se spală cu apă de la robinet;

- se lasă la uscat în stativ;

- se examinează la microscopul optic cu imersie.

Examen microscopic:

- bacteriile se colorează în violet (gram pozitive „G +” cu perete gros) şi roşu (gram negative „G -”cu
perete subţire)

- celulele eucariote se vor colora în culoarea ultimului colorant folosit (roşu)

- levurile se colorează în violet

- capsula şi sporul bacterian NU se colorează (capsula se observă ca un halou în jurul bacteriilor şi sporul
ca o lipsă de substanţă sferică în interiorul bacteriilor)

Dacă frotiul uscat este realizat din produs patologic, la microscopul optic vom vizualiza bacterii gram pozitive /
gram negative, celule eucariote colorate în roşu, cu sau fără capsulă (halou necolorat) şi spor (lipsă de substanţă) -
etapa a doua a diagnosticului de laborator.

Dacă frotiul uscat este realizat din cultură, la microscopul optic vom vizualiza doar bacterii cu aceeaşi
morfologie, cu o anumită aşezare, colorate în gram pozitive / gram negative, cu sau fără capsulă şi spor – etapa a
patra a diagnosticului de laborator.

Tabelul 2.1. Exemple de bacterii gram pozitive şi gram negative

Bacterii Gram pozitivi Gram negativi


coci stafilococi, streptococi, pneumococi meningococi, gonococi

bacili b. cărbunos, b. tetanic, b. botulinic, enterobacterii


bacilii gangrenei gazoase

Coloraţia Ziehl - Neelsen:

Este o coloraţie complexă folosită în identificarea bacililor acid-alcoolo-rezistenţi (BAAR).

Principiu: Bacteriile cu perete bogat în lipidoceruri fixează primul colorant (fuxina) la cald şi rezistă la decolorarea cu
acid-alcool.

Tehnică:

-se acoperă frotiul cu fucsină bazică;


-trecem cu o sursă de căldură (un tampon imbibat cu alcool căruia i se dă foc) pe sub lama acoperită cu
fucsină până apar emisii de vapori. Repetăm operaţia de încălzire a lamei de trei ori şi dacă este nevoie
reacoperim cu fucsină. Timpul total de lucru este de max 10 minute, lama se lasă să se răcească;
-se spală cu apă de la robinet;
-se decoloreaza frotiul cu acid-alcool, se lasă 2-3 minute;
-se spală cu apă de la robinet;
-se recolorează frotiul cu albastru de metilen, se lasă 1 minut;
-se spală cu apă de la robinet;
-se lasă la uscat în stativ;
-se examinează la microscopul optic cu imersie;

Examen microscopic:

- bacilii acid-alcool rezistenţi (BAAR) se colorează în roşu

- celelalte bacterii (altele decât BAAR) se colorează în albastru


- celulele eucariote se vor colora în culoarea ultimului colorant utilizat (albastru).

Dacă frotiul uscat este realizat din produs patologic, la microscopul optic vom vizualiza BAAR, alte bacterii ne-
AAR şi celule eucariote - etapa a doua a diagnosticului de laborator.

Dacă frotiul uscat este realizat din cultură, la microscopul optic vom vizualiza doar BAAR coloraţi în roşu.

Tabelul 2.2. Sintetizează modul în care se colorează bacteriile şi celulele în cele trei coloraţii descrise mai sus:

Albastru de Gram Ziehl Neelsen


metilen

Bacterii G pozitiv :VIOLET BAAR: ROŞU


ALBASTRU
G negativ: ROŞU Alte bacterii: ALBASTRU
Celule ALBASTRU ROŞU ALBASTRU
eucariote

LUCRAREA PRACTICĂ3

3.1. Tehnici utilizate pentru studiul morfologiei microorganismelor.

Bacteriile sunt organisme procarioteunicelulare, care au un “nucleu primitive”, fără membranăproprie,


constituit dintr-un ADN dublu catenar covalent circular închis, fiind lipsit de aparat mitotic. Faţăde celula eucariotă
nu prezintă, mitocondrii, reticul endoplasmicşi aparat Golgii.

Majoritatea bacteriilor au dimensiuni cuprinse între 1-10µ şi de aceea, pentru examinarea microorganismelor
sunt necesare aparate de mărit.

În studiul obişnuit al bacteriilor se utilizează microscopul optic darşi microscopul cu fond întunecat,
microscopul cu contrast de fazăşi microscopul cu fluorescenţă.

Fig. 3.1. Microscop optic (din dotarea Disciplinei de

Microbiologie, foto C. Defta)

Microscopul optic,în principiu este un instrument format din două sisteme de lentile, care, folosind lumina,
permite observarea şi studierea microorganismelor invizibile cu ochiul liber. Aparatul este format dintr-o parte
mecanicăşi o parte optică.
Partea mecanică cuprinde piciorul pe care se sprijină microscopul, coloana, revolverul în care se înşurubează
obiectivele (10X,20X,40x, 90X, 100X), platina sau masa port obiect pe care se plasează lama cu produsul de
examinat ce se fixează pe aceasta cu ajutorul a doi călăreţi. Prin orificiul central al platinei trece fanta de lumină.
Platina se poate mişca pe două direcţii perpendicular(stânga-dreapta şi sus-jos). Microscopulprezintăşi tubul pe care
se fixează ocularul la partea superioarăşi obiectivul la partea inferioară. Este prevăzut cu macrovizăpentru reglaje
grosiere necesare prinderii imaginii având o viteză de deplasare mărităşi microvizăpentru reglaje fine cu scopul de a
obţine imaginea clară având o viteză de deplasare lentă.

Partea opticăeste reprezentata de sistemul de iluminare şi două sisteme de lentile numite obiectivşi
respectivocular. Ocularul fiind plasat la capătul superior al tubului prin care priveşte ochiul observatorului. Sistemul
de iluminat este reprezentat de oglindăşi condensator. Oglinda are rolul de a dirija razele de la sursa de lumină spre
axul optic. Condensatorul este format din 2-3 lentile cu ajurorul cărora lumina reflectată de oglindă este concentrată
asupra obiectului. Înainte de a intra în condensator razele de lumină trec printr-un suport de filtre şi o diafragmă de
apertură. Condensatorul are rol esenţial în luminozitatea imaginii (Fig. 3.1.).

Microscopul cu fond întunecat,se foloseşte pentru examinarea preparatelor nativeîn studiul morfologiei şi
mobilităţii germenilor (Treponeme, Leptospirel, etc.). Este asemănător microscopului optic dar are un condensator
cordioidcare împiedică razele luminoase să pătrundă direct în obiectiv. Lumina ajunge numai la margine în
condensator, fiind reflectatăîn sus de suprafaţa concavă.Obiectul este iluminat oblic generând astfel efectul
Tyndall.Astfel particulele în suspensie apar luminoase pe un fond întunecat al câmpului. Obiectul este imersat cu o
peliculă de glicerină pentru a evita reflexia totală a razelor.

Microscopul cu contrast de fază, permite examinarea preparatelor native necolorate pentru urmărirea în timp a
proceselor celulare,spre exemplu diviziunea celular, prin transformarea diferenţelor de fază a luminii în diferenţe de
intensitate care traverseazăpreparatul în funcţie de densitatea particulelor intensitatea luminii variază. Microscopul
prezintă un condensator cu diafragme inelare, obiective de fază notate “Ph”, ocular de centrare, lampă specială,
filtru, etc.

Microscopul cu fluorescenţă, folosit în cazul preparatelor fluorescente (marcate cu fluoresceină – intravital sau
după fixare)în depistarea şi identificarea rapidă a unor microorganismeîn produsele patologice (reacţii serologice cu
anticorpi marcaţi). Sursa de luminăa acestui tip de microscop este o lampă care emite radiaţii UV. Razele UV excită
particulele fluorescente fixate pe microorganismul de cercetat. În final, pe fond întunecat apar vizibile aceste
particule fluorescente. În funcţie de intensitatea fluorescenţei se noteaza cu -, +/-, ++, +++, ++++ fiind o reacţie
calitativă. Microscopul mai dispune şi de un set de filtre:filtrul caloric absoarbe radiaţiile emise de lampă, filtrul de
excitaţie permite trecerea spre preparat a radiaţiilor cu lungimea de undă mică (ex. UV) iar filtrele de baraj asigură
protecţia ochiului celui care examinează. Condensatorul măreşte contrastul imaginii.

3.2. Examinarea la microscop a frotiurilor efectuate din produse patologice și culturi microbiene.

(Carmen Defta)

Examinarea unui preparat lamă/lamelă.

Tehnica: Pe o lamă se pune o picătură din produsul ce urmează să fie examinat, se ataşează lamela la locul de
aderenţă a picăturii la lamă, se lasăuşor în jos pentru a evita formarea bulelor de aer. Se aşeazăfrotiul pe platina
microscopului fixându-se cu ajutorul călăreţilor. Apoi se priveşteîn obiectiv iar cu ajutorul macrovizei se
coboarăobiectivul de 40X până deasupra lamelei. Când s-a obţinut imagineaîn câmpul microscopului, cu ajutorul
microvizei se clarifică imaginea, în acest timp condensatorul este plasat la 1,5 cm sub platină iar diafragma este
semideschisă.
Astfel,se pot examina: sedimentul urinar, materiile fecale din diverse afectiuni digestive, diareei, parazitoze,
frotiurile din micozele cutanate, preparatele din şancrul moale, cele din secreţia obţinutăîn urma tubajului duodenal,
etc.

Examinarea unui frotiu fixat şi colorat.

Tehnica: Frotiul fixat şi colorat este pus pe platina microscopului şi fixat prin intermediul călăreţilor. Se
centrează zona ce urmează să fie examinată, se coboara obiectivulde 40X prin intermediul macrovizei, până obţinem
imaginea apoi căutăm câmpul relevant. După ce cămpul a fost ales, se ridică obiectivul, se pune o picătură de ulei
de cedru pe lamă, se schimbă obiectivul de 40X cu cel de imersie 100X,după care se coboarătubul microscopului
până ce obiectivul se scufundăîn uleiul de cedruatingând lama. Apoi privind în ocular, se ridică lent, rotind
macroviza, pânăce seobţine imaginea în câmp, urmată de clarificare prin manevrarea microvizei.

În funcţie de provenienţa frotiului vom distinge următoarele formaţiuni: în cazul frotiurilor din produs patologic
frotiul va avea bacterii, celulepolimorfonucleare, celule eucariote, mucus sau fibre,în funcţie de zona din care s-a
făcut prelevarea. În cazul frotiurilor din cultură dacă aceasta este pură nu poate prezenta decât un singur tip de
bacteriedar care ar putea prezenta forme diferite dacăîn caracteristica speciei intră polimorfismul.

Aspectele microscopice ale germenilor ţin de formă, dispoziţie, afinitate, tinctorialitate şi dimensiuni, toate
aceste caracteristici aparţin speciei bacteriene.În funcţie de aceste aspecte bacteriile pot îmbrăca forme diverse, se
pot grupa în maniere diferite, aşezarea lor în spaţiu este legată de existenţa unor planuri de clivaj apărute în timpul
diviziunii.

Cocii sunt sferici au dimensiuni între 0,5-2µ, pot fi G(+) aşezaţi în lanţuri - Streptococii cu cât mediul este mai
nefavorabil cu atât lanţurile sunt mai lungi, în ciorchine-Stafilococii, pachete cubice-Sarcina, in diplo lanceolaţi sau
lanţuri de diplo, capsulaţi- Pneuococii. Dar şi coci G(-) reniformi in diplo sau grămezi de diplo iar pe frotiurile din
produse patologice prezintăşi capsula- Neisseria (gonococul şi meningococul).

Bacilii au o lungime de 0,3-2µ şi lăţime de 0,3-0,4µ pot fi scurţi subţiri încovoiaţi dispuşi în corzi –BK (BAAR),
bacili G(+) cilindrici mari cu capete drepte dispuşi în lanţuri capsulaţi - Bacillus anthracis, cilindrici cu spor terminal
(bat de chibrit) b. tetanic (Clostridium tetani), cilindric gros cu spor subterminal (rachetă de tenis) b. botulinic, gros
scurt spor subterminal Clostridium perfringens, măciucaţi dispuşi în palisade sau litere chinezeşti – Bacilul difteric.
Bacili G(-)fusiformi cu capete ascuţite - Fusobacterium, bacili cilindrici cu capete rotunjite – Enterobacteriile.

Cocobacilii au o lungime de 1-5µ şi lăţime de 0,2-0,5µexemplu, Bacilul pertusisşi al pestei.

Bacteriile spiralate pot fi cu spire deformabile cu amplitudine mare – Borelia, sau cu spire nedeformabile
Spirochetele (Treponema şi Leptospira)(Fig. 3.2.)

Fig.3.2.Exemple de forme bacteriene(desen C. Defta)

3.3. Medii de cultură.

Definiţie: reprezintă suportul steril alcătuit din substanţe energetice şi nutritive, care să asigure dezvoltarea
şi izolarea germenilor în afara nişei ecologice.

Condiţiile pe care trebuie să le îndeplinească un mediu de cultură:

1. Să fie steril, aşezat în recipiente ermetice;


2. Să asigure substanţele necesare dezvoltării germenilor (surse de carbon, de azot, etc.), factorii nutritivi

(săruri minerale, factori de creştere, vitamine, etc.) conform necesităţilor metabolice ale germenilor;

3. Să aibe un pH optim (7-7,6)- excepţie fac anumiţi germeni (ex. Vibrio);

4. Să fie izoton;

5. Să aibe o umiditate favorabilă dezvoltării germenilor;

6. Să aibe potenţial de oxido-reducere;


Criterii de clasificare a mediilor şi exemple de medii.

Pe baza diferitelor criterii privind aspectul şi compoziţia lor, precum şi natura ingredientelor folosite la
prepararea lor, mediile de cultură pot fi împărţite:

1. După starea de agregare:

- medii lichide, exemple: bulion Mueller-Hinton, bulion nutritiv, bulion sânge, bulion selenit, bulion thioglicolat, etc.

Fig. 3.3. Geloza sânge Fig. 3.4. Geloza MH cu sânge Fig. 3.5. Medii de identificare(fotoD.Ionescu)

- medii solide, exemple: geloză (agar) (Fig. 3.3.), AABTL, ADCL, Chapman, Müeller-Hinton (Fig. 3.4.);

- medii semi-solide, exemple: Cary-Blair, MIU, MILF, TSI etc. (Fig. 3.5.);

2. După complexitatea ingredientelor:

- medii simple, exemple:agar, bulion simplu, etc.;

- medii complexe, exemple:agar-sânge, geloză chocolat, agar cu factori X şi V.

3. După scopul urmărit:

a) Medii de transport: asigură condiţii optime germenilor de la recoltare pană la însămânţare; exemple: mediul
Cary-Blair pentru enterobacterii, mediul Stuart pentru streptococ, etc;

b) Medii de îmbogăţire: pot fi lichide sau solide, conţin factori care favorizează înmulţirea anumitor bacteriişi
inhibând creşterea altora (prelungesc faza de ”lag” a bacteriilor de contaminare) în produsele patologice cu floră de
asociaţie;

- exemple: mediul Pike pentru îmbogăţirea streptococilor: bulion glucozat cu cristal violet (inhibă dezvoltarea
stafilococilor), acid de Na (inhibă Gram negativii), +/- sânge;

- mediul hiperclorurat pentru îmbogăţirea stafilococilor: bulion + NaCl 7,5%;

- mediul Müller-Kauffmann pentru Salmonella spp.: bulion + verde briliant, carbonat de Ca, bilă, iod-iodurat;

- mediul OCST pentru bacilul difteric: ou, cistină, ser, telurit de potasiu;

c) Medii de izolare

Mediile selective- medii solide, acestea conţin substanţe bacteriostatice care inhibă dezvoltarea anumitor
specii bacteriene din flora asociată, favorizând dezvoltarea altora.

Se pot clasifica în: - slab selective;

- moderat selective;

- înalt selective;

Exemple: -mediul Leifson (ADCL – agar dezoxicholat citrat, lactoză) - pentru enterobacterii:săruri biliare +

lactoză + roşu neutru;


-mediul Levine (EMB – eosine – methyl blau) - pentru enterobacterii, E. coli:eozină + albastru de

metilen + lactoză;

-mediul Istrati-Meitert - pentru enterobacterii: bila, + lactoza + albastru de bromtimol;

-mediul Chapman - pentru stafilococi: NaCl 7,5% + manitol + roşu fenol;

Mediile elective- acestea conţin ingrediente care favorizează dezvoltarea unor anumite specii bacteriene,
exemplu mediu Löffler favorizează dezvoltarea bacilului difteric în 8-12 ore faţă de alte bacterii care se dezvoltă în
18-24 ore;

d) Mediile de diferenţiere sau identificare-permit identificarea germenilor după caracterele biochimice


(fermentarea zaharurilor, capacitatea de oxidoreducere, utilizarea citratului ca unică sursă de carbon,etc.); exemple:

- geloză lactozată: lactoză + albastru de bromtimol – se studiază fermentarea lactozei;

- mediul Hiss: un zahăr + albastru de bromtimol – se studiază fermentarea zaharurilor;

- MIU (mobilitate, indol, urează): agar semisolid pentru studiul mobilităţii, bogat în triptofan pentru studiul
producerii de indol şi conţinut de ureee pentru detectarea producerii de urează;

- TSI (triple sugar iron) conţine glucoza, lactoza, zaharoza pentru studiul fermentării acestora, sulfat de Fe
pentru detectarea producerii de hidrogen sulfurat (Fig. 3.5.)

- Simmons – mediu cu citrat pentru studiul folosirii citratului ca unică sursă de carbon (Fig. 3.5.);

e) Medii de conservare - care permit păstrarea bacteriilor un timp îndelungat; mediul Löwenstein pentru
bacilul Koch, mediul Graves pentru anaerobi.

3.4. Tehnici de însămânțare a produsului patologic și tehnici de izolare bacteriană. (Doris Ionescu)

Insămânţarea reprezintă operaţia de introducere a produsului patologic într-un mediu de cultură artificial.

Izolarea: repicarea unei singure colonii pe alte medii de cultură cu scopul de a obţine o cultură pură.

A. Tehnica însămânţării unui produs patologic pe mediul lichid

Scop: îmbogăţirea unui inocul bacterian dintr-un produs patologic insuficient cantitativ sau care conţine floră de
asociaţie;

Materiale necesare: produs patologic, mediu lichid (bulion), ansa bacteriologică, bec de gaz.

Tehnică:

- Se sterilizează ansa bacteriologică până la incandescenţă, urmată de flambarea portansei;

- Se scoate dopul recipientului care conţine produsul patologic şi se flambează uşor, prin trecerea gurii eprubetei

de 2-3X prin flacără;

- Se introduce ansa, se răceşte de pereţii eprubetei şi se încarcă cu produs patologic;

- Se flambează din nou şi se ataşează din nou dopul;

- Se flambează gâtul eprubetei cu mediu lichid, după ce i-a fost îndepărtat dopul;

- Se introduce ansa în eprubeta cu mediu lichid, fără a se atinge pereţii eprubetei;

- Se descarcă ansa în mediul lichid, prin agitarea uşoară şi lovirea de pereţii eprubetei;
- Se flambează din nou eprubeta, se ataşează dopul şi se agită prin lovirea în palma stângă pentru o mai bună

omogenizare;

- Se introduce la termostat timp de 24 ore la 37 grade Celsius;

Citire: creşterea şi înmulţirea bacteriilor pe mediul lichid se va evidenţia prin tulburarea omogenă a mediului de
cultură;

B. Tehnica însămânţării unui produs patologic pe geloză înclinată.

Scop: identificarea biochimică a bacteriilor.

Materiale necesare: produs patologic, geloză înclinată, ansă bacteriologică, bec de gaz.

Tehnică:

- Se sterilizează ansa bacteriologică până la incandescenţă, urmată de flambarea portansei;

- Se scoate dopul recipientului care conţine produsul patologic şi se flambează uşor, prin trecerea gurii eprubetei

de 2-3X prin flacără;

- Se introduce ansa, se răceşte de pereţii eprubetei şi se încarcă cu produs patologic;

- Se flambează din nou şi se ataşează din nou dopul;

- Se flambează gâtul eprubetei cu mediu lichid, după ce i-a fost îndepărtat dopul;

- Se introduce ansa în eprubetă cu geloza inclinată, fără a se atinge pereţii eprubetei;

- Se descarcă ansa pe suprafaţa gelozei, cu mişcări de zig-zag, începând din capătul opus gurii eprubetei;

- Se flambează din nou eprubeta, se ataşează dopul (Fig. 3.6.);

- Se introduce la termostat timp de 24 ore la 37oC;

Citire: în funcţie de caracterele biochimice se va observa de exemplu fermentarea zaharurilor cu sau fără producere
de gaz, virarea culorii mediului în funcţie de utilizarea substratului, producerea de hidrogen sulfurat, producerea de
indol, etc.

Fig 3.6.Însământare în plan înclinat Fig. 3.7. Însămânţare pentagon Fig.3.8 Culturăîn placă(foto D. Ionescu)

Tehnica însămânţării pe mediul solid, prin tehnica dispersiei în pentagon.

Scop: obţinerea de colonii izolate dintr-un produs patologic pluribacterian.

Materiale necesare: produs patologic, placă Petri cu mediu solid, ansă bacteriologică, bec de gaz;

Tehnică:

- Se sterilizează ansa bacteriologică până la incandescenţă, urmată de flambarea portansei;


- Se scoate dopul recipientului care conţine produsul patologic şi se flambează uşor, prin trecerea gurii eprubetei

de 2-3X prin flacără;

- Se introduce ansa, se răceşte de pereţii eprubetei şi se încarcă cu produs patologic;

- Se flambează din nou şi se ataşează din nou dopul;

- Se ia placa Petri, aşezată cu capacul în jos, se ridică placa şi se descarcă ansa pe suprafaţa mediului trasând 3-4

linii paralele, ce vor constitui primul cadran.

- Se sterilizează ansa şi se răceşte în mijlocul plăcii;

- Se trasează al doilea cadran cu 3-4 linii paralele, care vor intersecta primul cadran;

- Se repeta operaţiile de mai sus pentru cadranul trei şi patru;

- Al cincilea cadran va fi trasat cu o singura linie ce intersectează cadranul patru, după care se epuizează ansa în

zig-zag, spre mijlocul plăcii, fără a intersecta primul cadran;

- Se introduce placa la termostat timp de 18-24 ore (Fig. 3.7).

Citire: în primele cadrane se vor obţine colonii bacteriene suprapuse, confluate; în cadranele patru şi cinci se va
observa apariţia coloniilor izolate (Fig.3.8).

LUCRAREA PRACTICĂ 4

4.1. Tehnici de identificare bacteriană.

Identificarea bacteriana se realizeaz ținând cont de trei criterii: caracteristicile macroscopice, microscopic și

biochimice
I. Caracteristicile macroscopice sau de cultură:

a) morfologia coloniilor: aspect, formă, relief, mărime, margini (Fig. 4.1).

Fig. 4.1.Exemplu de margini și suprafață bacteriană(desen C. Defta)

b) suprafaţa coloniilor: - forma S: netedă, lucioasă, margini regulate;

- forma R: rugoasă, mată, margini neregulate;

c) culoarea coloniilor: determinate de pigmentogeneză sau de virajul indicatorului de culoare inclus în mediu.

- pigmenţi intracelulari – nu difuzează în mediu, vor colora doar colonia (stafilococul-galben auriu/galben citrin);

- pigmenţi extracelulari – difuzează în mediu, colorează şi mediul (Pseudomonas/verde foasforescent).

d)mirosul: unii germeni au miros caracteristic:

Proteus – fetid;

Candida – drojdie;

Esherichia coli – varză acră;

Pseudomonas – miros aromat, floral de tei;

Shigella – miros de spermă.

II. Caractereisticile microscopice în care se observă imaginea microscopică a frotiului obţinut din cultură

bacteriană obţinută în urma izolării agentului patogen.

III. Caracteristicile biochimice

Teste enzimatice:

a) Testul catalazei pe lamă;

Catalaza este o enzimă ce descompune peroxidul de hidrogen în oxigen şi apă.

Tehnică: Pe o lamă de microscop se depune 1 picătură de apă oxigenată 20%, în care, cu ansa, se emulsionează

colonia de testat - se folosesc colonii de pe un mediu fără sânge, pentru a evita reacţii fals pozitive datorită catalazei
eritrocitare (din mediul geloză –sânge).

Citire şi interpretare: Reacţie pozitivă: apariţia bulelor de gaz până la efervescentă

Reacţie negativă: absenţa bulelor.

Exemple: Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli sunt gemeni catalazo-pozitivi, Enterococcus faecalis-catalazo-
negativ (Fig.4.1.).

Fig.4.1.Reacția catalazei (foto D. Ionescu) Fig.4.2. Reacția oxidazei(foto D. Ionescu)

b) Testul oxidazei

Oxidaza (citocrom oxidaza) este o enzimă din lanţul respirator al bacteriilor, care lipseste la bacteriile strict
anaerobe. Reactivul folosit conţine tetrametil-p-fenildiamina care se oxidează determinând apariţia culorii violet sub
acţiunea citocrom oxidazei).
Tehnica: pe o bucată de hartie de filtru se pune o picatură de reactiv pentru oxidază. Cu o ansă se prelevă o
porţiune din colonia de testat, care va fi etalată uşor pe hartia umezită.

Citire şi interpretare:

Test pozitiv: apariţia culorii violet (purpuriu) în maxim 10 secunde.

Test negativ: absenţa culorii (Fig.4.2.).

c) Testul coagulazei - este un test folosit la diferenţierea stafilococilor. S. aureus coagulează plasma prin
producere de coagulază, în timp ce S.epidermidis nu produce coagulază.

Tehnica: - pe lama

Pe o lamă de microscop se pune o picătură de plasmă umană (se poate folosi şi plasma de iepure). În picătură se
omogenizează cu ansa o colonie din cultura pură a bacteriei de identificat. Omogenizarea se continuă imprimând
lamei mişcări de rotaţie.

Citire și interpretare:
• Test pozitiv - apariţia de grunji, care lasă picătura limpede;
• Test negativ - amestecul rămâne omogen;

Orice reacție negativă se continuă cu testarea coagulazei în tub.

- în tub -0,5 ml plasmă se incubează cu 0.5 ml cultură de 24 ore a tulpinii de testat în bulion glucozat,la 37 C

pentru patru ore.

Citire şi interpretare:

• Rezultat pozitiv presupune apariţia unui coagul, se poate prelungi incubarea probei până la 16-18 ore, dacă
coagulul nu a apărut în primele patru ore, cu verificarea periodică a probei;

• Rezultat negativ - lipsa coagulului;

c) Producerea de hemolizine: se observă pe medii ce conţin sânge.

- Hemoliza alfa sau hemoliza parţială (parte din hematii rămân intacte) se evidenţiază prin înverzirea mediului din

jurul coloniei;

- Hemoliza beta sau hemoliza completă: zona clară (toate hematiile sunt distruse);

- Hemoliza alfa-prim – apare o zona de hemoliză incompletă, încojurată de hemoliza completă;

- Hemoliza gamma- impropiu numită, deoarece indică absenţa hemolizei.

Teste biochimice

a) Studierea metabolismului glucidic.

1. Fermentarea manitei pe mediul Chapman.

- fermentarea manitei se face cu producere de acid;

- culoarea indicatorului (roşu fenol) virează în galben;

- se diferenţiază: stafilococii patogeni – manitopozitivi;

stafilococii nepatogeni – manitonegativi.

2. Fermentarea lactozei pe mediul Istrati-Meitert

- fermentarea lactozei se face cu producere de acid;


- culoarea indicatorului (albastru de bromtimol) virează în galben;

- se diferenţiază enterobacteriile;

patogene – lactozonegative

nepatogene – lactozopozitive.

3. Fermentarea lactozei pe mediul Leifson

- fermentarea lactozei se face cu producere de acid;

- culoarea indicatorului (roşu neutru) virează în roşu;

- se diferenţiază enterobacteriile patogene de nepatogene.

4. Fermentarea lactozei pe geloză lactozată

- fermentarea lactozei se face cu producere de acid;

- culoarea indicatorului (albastru de bromtimol) virează în galben;

5. Fementarea zaharurilor pe mediul Hiss

- în mediul Hiss lichid se introduce un glucid;

- fermentarea lui duce la formare de acid;

- culoarea indicatorului (albastru de bromtimol) virează în galben;

- evidenţierea producerii de gaz se face cu tub Durham.

6. Fermentarea zaharurilor pe mediul TSI

- fermentarea glucozei se studiază pe porţiunea dreaptă;

- fermentarea glucozei se face cu producere de acid;

- culoarea indicatorului (roşu fenol) virează în galben;

- fermentarea lactozei, zaharozei se studiază pe porţiunea înclinată.

b) Studierea metabolismului proteic

1. Producerea de indol

- degradarea proteinelor (triptofanul) se face cu producere de indol;

- indolul în contact cu reactivul Erlich (galben) formează de nitrozoindol (roşu).

Metode de evidenţiere:

a). Extragerea indolului cu eter

- în apă peptonată însămânţată + eter + reactiv Erlich

inel roşu – indol pozitiv

inel galben – indol negativ

b). Benzi pentru reacţia indolului

- benzi de hârtie de filtru impregnate cu reactiv Erlich (galbene)

- se ataşează la dopul eprubetei cu apă peptonată sau mediul MIU

banda devine roșie – indol pozitiv

banda rămâne galbenă – indol negativ

2. Producerea de H2S.
- descompunerea proteinelor se poate face cu producere de H2S,

- H2S în contact cu săruri de fier sau plumb formează sulfuri de culoare neagră.

Metode de evidenţiere:

a). Benzi pentru H2S

- benzi de hârtie de filtru impregnate cu acetat de plumb (albe)

- se ataşează la dopul eprubetei cu apă peptonată însămânţată

banda devine neagră – H2S pozitiv

banda rămâne albă – H2S negativ

b). Pe mediul TSI

- mediul conţine săruri de fier şi proteine;

- se însămânţează prin înţepare;

- apariţia unui inel negru între porţiunea dreaptă şi cea înclinată - H2S pozitiv;

c). Pe mediul PISU cu cisteină

- mediul conţine cistină şi acetat de plumb;

- se însămânţează prin înţepare;

- apariţia unui halou cafeniu în jurul înţepăturii - H2S pozitiv;

3.Testul ureazei.

- se studiază pe mediul MIU;

- scindarea ureei se face cu producere de amoniac;

- mediul devine alcalin, culoarea indicatorul (roşu fenol) virează în roşu.

c ) Alte teste biochimice

1. Mobilitateagermenilor se studiază pe mediul MIU

- însămânţare prin înţepare:

mobilitate negativ- mediul rămâne clar

mobilitate pozitiv – mediul se tulbură

2. Folosirea citratului ca sursă de carbon

- se studiază pe mediul Simmons;

- dacă germenii folosesc citratul în metabolism, cresc şi alcalinizează mediul;

- culoarea indicatorului (albastru de bromtimol) virează în albastru.

Teste antigen-anticorp (vezi rectia Ag- Ac)

4.2. Testarea sensibilității la antibiotice a tulpinilor bacteriene- ANTIBIOGRAMA

Antibiograma: reprezintă testarea sensibilităţii unei tulpini bacteriene la antibioticeşi chimioterapice.

1. Metode calitative: Metoda difuzimetrică Kirby-Bauer

Principiul reacţiei constăîn apariţia unei zone de inhibiţie în jurul discului cu antibiotic, aceasta zonă este
proporţională cu sensibilitatea tulpinii testate la anibiotic sau chimioterapic.

Prepararea inoculului:

- se suspensionează 2-3 colonii izolate în ser fiziologic;


- turbiditatea suspensiei trebuie să fie de 0.5 McFarland (1,5x108cfu/ml). Aceasta se controlează nefelometric sau
comparând cu tuburile etalon (conţin suspensii de particule latex/sulfat de bariu având turbiditate determinată);

Însămânţare:- se alege un mediu corespunzător speciei bacteriene testate:

- Müeller-Hinton pentru majoritatea bacteriilor;

- Müeller-Hinton cu sânge pentru pretenţioşi (ex. streptococi);

- medii speciale (pentru Haemophilus spp ., Neisserii);

Tehica însămânţării în pânză:

a. se introduce un tampon în suspensia bacteriană, se stoarce pentru îndepărtarea excesului de lichid;se


însămânţează uniform toată suprafaţa mediului pe 3 direcţii;

b. se inundă uniform placa cu inocul,excesul de inocul este prelevat cu o pipetă Pasteur şi introdus în amestec
sulfocromic pentru a impiedica contaminarea. În ambele cazuri se lasă placa pe masa de lucru cu capacul
desfacut, la uscat cca. 15 min. la temperatura camerei.

Depunerea microcomprimatelor de antibiotice:

- se aleg antibioticele care trebuiesc testate în funcţie de specia bacteriană izolata şi în funcţie de localizarea

infecţiei;

- se depun discurile de antibiotic la 1,5 cm distanţă de marginea cutiei Petri şi la 2 cm distanţă unul faţă de

celălalt;

Incubare:- la 35°C,în funcţie de specia bacteriană: în atmosfera obişnuită sau atmosferă de CO2 (ex. streptococi,

Neisserii.);

- timp de 16-18 ore (pentru germenii pretenţioşi până la 20-24 de ore);

Citire şi Interpretare:- apare o cultură bacteriană confluentă, în jurul microcomprimatelor apar zone de inhibiţie

(lipsa creşterii bacteriene) (Fig. 4.2.);

Fig. 4.2. Antibiograme (foto D. Ionescu)

- se citesc diametrele zonelor de inhibiţie;

- se compară diametrele citite cu diametrele standard în funcţie de antibiotic, cantitatea de

antibiotic din comprimat, specia bacteriană testată;

- pot apărea fenomene de sinergism/antagonism care reflectă diferite mecanisme de rezistenţă;

- colonii izolate în interiorul zonei de inhibiţie: subpopulaţii rezistente(mutante);

Tabel 4.1. : Exemple de diametre standard, conform standardelor NCCLS (National Committee for Control

Laboratory Standards USA). CA-SFM (Commitee de l'Antibiogramme - Societe Francaise de Microbiologie):


Specii bacteriene Antibiotic Sensibil Intermediar Rezistent
sensibil

NCCLS S. aureus Oxacilină 1 µg > 14 mm 11-13 ≤ 10mm

SCN Oxacilină 1 µg > 18 mm - ≤ 18mm

CA-SFM S. aureus sau Oxacilină 5 µg > 20mm - <20mm


SCN

Interpretarea antibiogramelor:

- rezultatul se raportează: sensibil (S), intermediar sensibil (IS) sau rezistent (R) laantibioticul testat;

- nu se comunică diametrele citite (metodă calitativă);

Variabilele care influenţează rezultatele:

- compoziţia mediului (conţinut de cationi, timidină);

- pH (optim: 7,2-7,4);

- grosimea gelozei (standard: 4 mm);

- inoculul - 0,5 McFarland;

- microcomprimate (valabilitate, conţinut, condiţii de păstrare);

- timpul, temperatura de incubare;

- citirea diametrelor (lumină refractată/reflectată, colonii izolate, prezenţa unui văl, margini crenelate);

Control de calitate:a microcomprimatelor iar loturile noi de medii de cultură se testează cu tulpini de referinţă;

2. Metode cantitative:- permit stabilirea concentraţiei minime inhibitorii (CMI) a unui antibiotic

CMI: cantitatea cea mai mică de antibiotic care inhibă complet multiplicarea unei bacterii

Este recomandată testarea cantitativă în următoarele situaţii:

- cazuri clinice grave (septicemii, endocardite, meningite)

- rezultate incerte cu metoda difuzimetrică / sensibilitate nedeterminată;

- situaţii speciale (de ex. testarea sensibilităţii pneumococului la penicilină printr-o metodă cantitativă când
diametrul zonei de inhibiţie la oxacilină este sub 20 mm)

CMI obţinut se raportează la punctele de ruptură superior şi inferior date de NCCLS sau CA-SFM.

Tabelul4.2. Exemplu: Puncte de ruptură CMI în ug/ml pentru ampicilină

Specii bacteriene Sensibil Intermediar sensibil Rezistent

Stafilococi ≤ 0,25 - ≥ 0,5

Enterococi ≤8 ≥16

Enterobacterii ≤8 16 ≥32

3. Metoda diluţiilor (macro/microdiluţie):


- se realizează diluţii succesive din antibioticul de testat în mediu de cultură lichid;

- se adaugă cantităţi fixe din cultura bacteriană cercetată;

- incubare 18ore 35°C;

- se urmăreşte apariţia culturii în mediul lichid;

CMI: cea mai mică concentraţie de antibiotic care nu permite creşterea germenilor (cultură limpede);

4. Metoda diluţiilor în agar:

- se realizează diluţii succesive din antibioticul testat în geloză Müeller-Hinton, se însămânţează cultură
bacteriană în spoturi;

- citire: CMI - concentraţia cea mai mică care inhibă complet creşterea sau apare o singură colonie

5. E-test:

- pe suprafaţa mediului de cultură solid şi însămânţat se aplică fâşii din plastic impregnate cu antibiotic în
concentraţie crescândă - la un capăt concentraţia este minimă, la celălalt este maximă; gradaţiile sunt notate
pe fâşie;

- incubare;

- apar zone de inhibiţie de formă elipsoidală, în dreptul intersectării cu fâşia de plastic se citeşte CMI (Fig. 4.3.);

Fig. 4.3. E-test (foto C. Defta)

LUCRAREA PRACTICĂ 5

5.1. Reacția antigen-anticorp de diagnostic.

Reactia antigen (Ag) - anticorp (Ac) este o reacţie specifică care se realizeazăîntre epitopul antigenului şi
paratopul anticorpului. Complexele Ag-Ac sunt cu atât mai stabile cu cât energia de legare a elementelor implicate în
reacţie este mai mare. Există doi parametrii care influentează interacţia dintre Agşi Ac; primul fiind afinitatea ce
implică structurile complementare dintre Ag şi Ac, în acest caz afinitatea poate fi înaltă ce comportă structuri
perfecte complementare sau mai scazutăîn care forţele de respingere între grupările de legare sunt mai mari decât
cele de legare. Cel de-al doilea este aviditateadintre epitopii multipli ai unui antigen şi paratopii anticorpului.

Clasificarea reacţiilor antigen-anticorp;

1.Reacţia de precipitare: - în mediu lichid –reacţia Ascoli

- în mediu solid-imuno difuzia radiară simplă – teh. Mancinii

2.Reacţia de aglutinare: -în tuburi;reacţie de serodiagnostic - reactia Widal

- pe lamă; reacţie de seroidentificare – identificarea Enterobacteriilor, grupelor de

Streptococi

3.Reacţia de neutralizare: - cantitativă - reacţia ASLO

- calitativă – reacţia Eleck

4.Reacţia de fixare a complementului (RFC)

5.Treacţia Ag-Ac cu markeri: -fluorescenţi –imunofluorescenţa (IF)

-enzimatici - ELISA

-radioactivi – radioimunoanaliza (RIA)

1. Reacţia de precipitare

Reacţia de precipitare este o reacţie în care antigenul solubil vine în contact cu anticorpul specific în faza lichidă sau
solidă, complexele formate Ag-Ac devin insolubile şi stabile fiind astfel vizibile sub forma precipitatelor.

1.1 Reacţia de precipitare în mediu lichid –reacţia Ascoli

Este o reacţie de precipitare în inel utilizată pentru identificarea prezenţei antigenului carbunos (Bacillus anthracis).

Tehnica: Ag se obţine din organe recoltate de la animale moarte cu antrax.

Se utilizează3 tuburi, din care primul este cel de testat iar celelalte 2 sunt martor de Ag şi martor de ser.

În tubul de proba se pun 0,5 ml ser anticarbunos,urmând ca cei 0,5 ml din soluția cu antigen săfie turnaţi lent prin
prelingere pe peretele intern al tubului, aşa încăt, cele 2 soluţii să nu se amestece.În cazul reacţiei pozitive într-un
interval de 5 minute, la limita dintre cei 2 reactivi apare un inel de precipitare alb-opalescent.

În cazul martorului de antigen se pun în tub 0,5 ml ser normal de cal şi 0,5 ml soluţie de Ag.În tubul martor de ser
se pun în tub 0,5 ml ser anticarbunos +0,5 ml ser fiziologic în ambele situaţii nu trebuie să apară precipitarea.

1.2. Reacţia de precipitare în mediu solid –Imunodifuzia radiară simplă (IDRS tehnica Mancini)

Principiul reacţiei constăîn difuzia Ag din serul provenit de la pacient,în gelozaîn care se aflăincorporată ocantitate
constantăşi uniformăde Ac specific. La întâlnirea Ac cu Ag se formează o zonă de precipitare a cărei diametru este
direct proporţional cu concentraţia antigenului. Anticorpul incorporatîn geloză este un anticorp anti elementul pe
care vrem să-l determinăm.

Tehnică: Sunt necesare plăcute cu godeuri, acestea au culori diferite în funcţie de Ac incorporat (ex. plăcutele
pentru determinarea IgG au culoarea roșie, etc.). Serul provenit de la pacient este diluat 1/4 pentru IgG, Ig A,
siderofilina şi 1/2 pentru Ig M).

În godeul din mijloc se pune serul de referință, iar in cele de pe margine se pune ser povenit de la pacienți

(Fig 5.1.)
*

Fig 5.1. Placă cu godeuri(1)Fig.5.2.Placă cu inelele de precipitare(2 –inel, 3- diametrul inelului)

Plăcuţele sunt ţinute pe masă 10 minute, apoi sunt incubate la 370C timp de 24 de ore, iar pentru Ig A şi Ig M
se ţin 48 de ore.

Citirea și interpretarea rezultatelor: Cu ajutorul unei rigle gradate se măsoară diametrul inelului (Ø) de
precipitare din centru unde a fost pus serul de referinţă. Dacă valoarea găsită este cea dată de tabele se merge mai
departe în măsurarea celorlalte diametre exprimate în mm, sunt apoi căutateîn tabelul ce însoţeşte setul de plăcuţe.
Valoarea găsităîn dreptul dimensiunii se înmulţeşte cu inversul diluţiei,în funcţie de diluţia aplicată iar valoarea
găsită se exprimăîn UI/ml(Fig. 5.2)

2. Reacţia de aglutinare

Aceasta este o reacţie Ag-Ac în care Ag este corpuscular (corp bacterian, flagel) iar reacţia decurge în 2 etape. În
prima etapă specifică are loc formarea complexelor Ag-Ac pe bază de specificitate. În cea de a 2-a etapăse
formeazăcomplexele secundare care sunt agregate mai mari legate prin forţe intermoleculare, necovalente, precum
legături de hidrogem, forţe electrostatice, legaturile Van der Waals şi legături hidrofobe.

III.1. Reacţia de aglutinare în tuburi- reacţia Widal

Principiul reacţiei: este o reacţie de serodiagnostic al febrei tifoideşi constăîn identificarea Ac-lor din serul
pacientului prin intermediul Ag-nelor cunoscute de tip O sau H (aparţinând Salmonellei tiphy). Este o reacţie care
stabileşte atât prezența cât şi titrul Ac-lorîn febra tifoidă.

Tehnică: Se pregătesc 2 şiruri de eprubete în care se fac diluţii (1/40, 1/80,1/160 etc.)în ser fiziologic a serului
provenit de la pacient, fiecare tub conţine 0,5 ml. În primul şir se adaugă 0,5 ml ser Ag O iar în cel de al doi-lea
rând se adaugă 0,5 ml Ag H. Pentru fiecare şir se pregătesc şi martorii (ser fiziologic + Ag O sau H).

Dacă se urmăreşte procesul infecţios în dinamică se recoltează produsul patologic la 7-10 zile de la prima
recoltare iar prelucrarea este aceiaşi ca mai înainte.

Cele douăşiruri se incubează astfel: tuburile cu Ag O la 52oC timp de 20 de ore, iar cele cu Ag H se incubează 2
ore la 52oC şi încă 10 minute la temperatura camerei.

Citirea şi interpretarea reacţiei:

Tuburile sunt examinate printr-o uşoară agitaţie, pentru a surprindeaglutinatele sub forma de grunji. Titrul
reacţiei este dat de ultimul tub la care se constată prezenţa grunjilor (Fig. 5.3)

Fig. 5.3. Reactia Widal (bacteria de tuburi şi detaliul reacţie pozitivăşi negativă)(foto C. Defta)

Titrul normal pentru Ag O este de 1/200, iar pentru Ag H 1/1000.


Reacţia este semnificativă dacă se dublezăîn săptămâna III de boală sau dacă titrul creşte de patru ori în
dinamică.

III.2. Reacţia de aglutinare pe lamă

Este o reacţie Ag-Ac de identificare a tupinii bacteriene izolata dintr-o boală infecţioasă. Prin cultivarea

produsului patologic pe medii specifice se obţin colonii izolate pe care le putem identifica prin reacţia de aglutinare
pe lamă.

Tehnică: Materialele necesare - colonie tânără, ser fiziologic şi Ac cunoscuţi faţă de Ag pe care dorim să-l
identificăm, lama de microscop.

Pe o lamă se pune o picătură de ser fiziologic în care omogenizăm un fragment din colonia ce dorim s-o
identificăm. Dacă picătura rămâne opalescentă se continuă reacţia, dacă apar grunji înseamnă că tulpina şi-a
modificat structura (colonia poate fi de tip”R”) iar reacţia nu se continuă deoarece s-ar obţine rezultate fals positive.

Dacă reacţia se poate continua se procedeaza astfel; pe aceiaşi lamă se pune o picătură de ser cu Ac-ul tulpinii
ce urmează să fie identificată apoi se omogenizează un fragment din colonie cu serul aferent, se amestecăpânăce se
obţine o suspensie tulbure. Se roteşte uşor lama pentru a favoriza contactul Ag-lui cu Ac şi respectiv contactul
complexelor Ag-Ac. Dacă reacţia de identificare este pozitivă (s-a realizat reacţia Ag-Ac) vor apăre grunji de
aglutinare picătura devenind limpede; dacă nu picătura rămâne în continuare opalescentă.

Această reacţie de aglutinare directăeste folosită pentru identificarea enterobacteriilor. Pentru identificarea
serologica a Streptococilor, Candidei şi Neisseriilor este necesara liza enzimatică a bacteriilor, urmată de reacţia Ag-
Ac de identificareîn acest caz aglutinarea este indirectă.(vezi tehnica aglutinării pe lamăa cocilor G (+şi -)).

3. Reacţia de neutralizare

Reprezintă reacţia Ag, Ac în care Ac-ului neutralizează efectul toxic al Ag-nului.

Principiul constăîn punerea în contact a unor Ac antitoxici cu Ag omolog iar în final va duce la anihilarea efectului
antigenului.

Seroneutralizarea poate fi- calitativă- testul Eleck

- cantitativă– reacţia ASLO

3.1. Testul Eleckeste o reacţie Ag, Ac în care Ac antitoxina difterică neutralizează antigenul reprezentat de toxina
difterică sintetizată de tulpinile toxigene de bacil difteric.
Tehnică: Pe o placă mare cu geloză se practică central o fantăîn care se pune Ac antitoxina difterică, iar de-o parte şi
alta a fantei se însământează tulpini diferite de bacil difteric. Se introduce placa la termostat la 370C, iar după 24 de
ore se face citirea. Acolo unde tulpina a produs toxina difterică (ex .T1 şi T4 Fig. 5.4.) a difuzat în mediu iar la locul
de întâlnire cu Ac reacţia este vizibilă printr-un arc de precipitareîn vecinătatea fantei.

T11
T2
T3
T4
T5

Fig. 5.4. Reacţia Eleck cu arcurile de precipitare(desen C. Defta)

3.2. Reacţia ASLO

Principiul reacției constăîn neutralizarea efectului hemolitic a streptolizinei O (SLO) asupra hematiilor de iepure sau
de berbec, de către anticorpii anti streptolizina O proveniți din serul pacienților

Tehnică: Se realizeaza o baterie cu tuburi de hemoliză ce conţin ser provenit de la pacienţiîn diluţiilede 1/12, 1/50,
1/100, 1/150/ 1/166, 1/250, 1/333, 1/700, 1/1000în ser fiziologic.Se adaugă aceiaşi cantitate de SLO. Se agită
pentru o bună omogenizare după care se ţin tuburile, la 370C timp de 15 minute. Se adaugă suspensia de hematiide
iepure 0,5 ml/tub. Se agită din nou apoi se incubează 45 de minute la 370C.

Citirea şi interpretarea reacţiei:

Titrul reacţiei este dat de ultimul tub la care se constată absenţa hemolizei. Reacţie pozitivă este caracterizată de
absenţa hemolizei (prezenţa Ac-anti-SLO a neutralizat efectul SLO), reacţia negativă caracteriată prin prezenţa
hemolizei (în absenţa Ac, SLO rămâne liberăşi hemolizeză hematiile)

Titrul normal este de 200 Todd (Fig. 5.5)

Fig. 5.5 Reactia ASLO(foto C. Defta)

4. Reacţia de Fixare a Complementului (RFC)

Este o reacţie Ag, Ac care se bazeză pe proprietatea complementului de ase fixa la complexele Ag-Ac,
aceastareacţie nu este vizibilă direct, de aceea se foloseste sistemul hemolitic care este un complex Ag-Ac format
din hematii de oaie legate cu anticorpi antihematii de oaie. Ag este o cardiolipinăşi reprezintă un extract de cord de
bou adsorbit pe cristale de cholesterol.
Tehnică: se efectuează urmatoarele tuburi- tubul de cercetat şi martorii: martor sigur pozitiv, martor sigur
negativ, martor ser de cercetat, martor Ag, martor de complement, martor sistem hemolitic.

Serului provenit de la pacient i se inactiveazăcomplementul propriu, prin menţinere la 560C timp de 30’ în baie de
apă. Într-o eprubetă se pun în contact Ag cunoscut+ serul inactiv +complementul, iar eprubeta se ţine 24 de ore la
frigider. A2-a zi se adaugă sistemul hemolitic - hematii de oaie pe care sunt fixaţianticorpi antihematie de oaie.
Dacăîn serul pacientului există Ac se va forma complexul Ag-Ac la care se va lega complementul, adăugarea
sistemului hemolitic (SH) duce la depunerea lui la fundul tubului sub forma unui bănuţ/buton roşu de hematii;
reacţie (+). Dacă nu există Ac în serul pacientului, Ag rămâne liber, prin adăugarea complementului acesta rămâne
liber iar prin adăusul SH, complementul se va fixa la complexul Ag-Ac reprezentat de H-AcH de oaie ducând la liza
hematiilor; reacţie (-)(Fig. 5.6.)

Martorii au urmatoarea compozitie:

Martorul sigur pozitiv: Ag+Ac+C+SH= buton hematii

Martor sigur negativ: Ag + 0 + C+SH=hemoliza

Martor de antigen: Ag+SF+C+SH= hemoliza

Martor de complement: SF+SF+C+SH= hemoliza

Martor de sistem hemolitic: SF+SF+SF+SH= buton hematii

Fig.5.6. Reacţia RFC cu martori(foto C. Defta)

5. Reacţia Ag –Ac cu markeri se bazează pe proprietatea Ac de a se cupla cu un marker fără să-şi modifice
capacitatea de legare la Ag

5.1 Reacţia de Imunofluorescenţă se bazează pe proprietatea Ac de a se cupla cu o substanţă


fluorescentă(fluorocrom) fără să-şi modifice proprietaţile biologice şi imunologice.Fluorocromii sunt compuşi
organici care în prezenţa radiaţiilor UV emit radiaţii luminoase. Exemplu de fluorocromi; auramina O, rhodamina
b, etc.

Imunofluorescenţa (IF) poate fi directă sau indirectă.

IF directă: când căutam antigenul folosind Ac marcat (Ac*). Antigenul în acest caz poate fi: cultura bacteriană,
produs patologic, fragment bacterianîn acest caz este o reacţie de seroidentificare.

Tehnică: pe o lamăse pun în contact Ag şi Ac* se lasă 30’ la 370C. Se spală lama cu tampon fosfat, apoi cu apă
distilată, seusucăşi se examinează la microscopul cu fluorescenţă.

Se pot identifica astfel Treponema pallidum, Mycobacterium tuberculosis, Bordetela pertussis etc.

IF indirectă: se caută Ac, în reacţie se introduce un Ag cunoscut şi un Ac* Ig umana, este o reacţie de
serodiagnostic.

Tehnică: pe o lama se pun în contact Ag cunoscut şi Ac din serul de cercetat. Se lasă la incubat 30’, la 370C. Se
spală lama se adaugă apoi Ac anti Ig * şi se incubează din nou 30’ la 370C. Se spală, se usucăşi se observă la
microscop.

Citirea şi interpretarea rezultatelor. Rezultatele se dau sub forma de “+”, astfel: + nesemnificativ, ++slab
semnificativ, +++ semnificativ, ++++înalt semnificativ

5.2. Reacţia ELISA analiza imunoenzimaticăîn acest caz Ac cunoscut este marcat cu o enzimă.
Tehnica ELISA poate fi folosită pentru identificarea Ag cât şi identificarea sau titrarea Ac. Etapele de lucru sunt
următoarele:

-În funcţie de ce dorim să depistăm în acest caz Ac sau Ag cunoscute sunt fixate pe pereţii unor godeuri speciale.

-Se adaugă componenta pe care dorim s-o determinamfie Ag, fie Ac, dacă are loc reacţia se formează complexul Ag-
Ac.

-Se spală cu soluţie tampon pentru eliminarea surplusului de reactivi.

-Se adaugă reactivul marcat cu o enzimă (peroxidază) care se cuplează la complexul deja format.Reacţia este
urmată de o nouă spălare iar în final se adaugă substratul cromogen, pe care enzima îl scindează iar în funcţie de
cantitatea de reactiv marcat, intensitatea culorii va fi mai intensă, atenuată, sau foarte atenuată.

- Se face curba etalon (densitate optică cu concentraţia corespunzătoare) după care se face citirea rezultatelor.

-Interpretarea rezultatelor se face conform indicaţiilor din protocolul care însoţeşte trusa ELISA, este o reacţie cu
specificitate şi sensibilitatea foarte bună.

5.3. Radioimunoanaliza (RIA)în care marcărul este o substanţă radioactivăexemplu3H, 14


C cuplată la Ag

cunoscut. În reacţie se introduce Ac provenit din serul pacientuluişi Ag marcat. Se măsoară radioactivitatea
complexului Ag-Ac cu un contor de scintilaţii. Este o tehnică de mare fineţe putându-se identifica cantităţi minime,
dar tehnica necesită incinte şi echipamente speciale de aceea în timp a fost înlocuită cu ELISA.

5.2. Produse biologice cu rol în diagnosticul bolilor infecțioase.

În principal sunt reprezentate de preparate de antigene şi anticorpi cunoscuţi. Atunci când se cunoaşte Ac şi se
caută identificarea Ag-lui se numeşte seroidentificare, iar când în reacţie se introduce Ag cunoscut pentru
determinarea concentratiei de anticorpi se numeste serodiagnostic.

a. Preparatele de antigene sunt de fapt culturi microbiene sau fragmente macroscopice microbiene.

Spre exemplu Ag-nele din Salmonella typhi se prepară din cultura de Salmonella typhi: Ag H, Ag O, Ag Vi.

Un alt exemplu de antigene sunt treponemele nepatogene-Nikolson, cardiolipinele (extracte de cord de bou
adsorbite pe cristale de cholesterol), SLO etc.Antigenele cunoscute sunt puse în contact cu un ser provenit de
la pacient care conţine anticorpi necunoscuţi. Dacă se produc complexe Ag-Ac, sunt astfel puşi în evidenţa
anticorpii diagnosticându-se astfel boala.

b. Preparatele de anticorpi cunoscuţi. Se obţin prin injectarea Ag-nelor în animalele de laborator, după care se
recoltează serul ţi se separă Ac specifici.

c. Se izoleaza de la pacient un agent etiologic necunoscut, ţinând cont de toate criteriile de izolare suntem
direcţionaţi să folosim un anume tip de Ac cunoscut. Dacăîn urma reacţiei se formează comlexul Ag-Ac
identificăm astfel Ag (necunoscut). Reacţia se numeşte de seroidentificare

Exemple de Ac de diagnostic: Ac specifici enterobacterilor, Ac specifici diferitelor tipuri sau grupe de


streptococi, neiserii, Ac marcaţi cu markeri diferiți etc.
LUCRAREA PRACTICĂ 6

6.1. Diagnosticul de laborator în infecțiile produse de cocii Gram-pozitivi.

6.1.1. Genul Staphylococcus

-Stafilococi coagulazo-pozitivi: S. aureus

-Stafilococi coagulazo-negativi (SCN) cu importanţă clinică: S. lugdunensis, S. schleiferi, S. hyicus, S. epidermidis,


S. haemolyticus, S. saprophyticus

Produse patologice

- portaj: secreţie din cavitatea nazală anterioară, exsudat faringian

- plăgi, otite, infecţii tegumentare ⇒ puroiul (S. aureus)

- infecţii urinare ⇒ urină (S. saprophyticus, S. aureus)

- infecţii gastro-intestinale, toxiinfecţii alimentare ⇒ materii fecale, vomismente, alimente.

- meningite ⇒ LCR

- septicemie, febră puerperală ⇒ sânge (S. aureus, SCN)

- pneumonie ⇒ spută.

- infecţii nosocomiale - S. aureus meticilino-rezistent (MRSA, SARM), SCN meticilino-rezistent

1. Examenul direct al produsului patologic:

- macroscopic: puroi cremos, filamentos, gălbui.

- microscopic: coloraţia Gram: coci gram (+), dispuşi în grămezi asemănătoare ciorchinilor de strugure (Fig. 6.1.)

Fig. 6.1. Frotiu din pp., coci G (+) in diplo, tetrade şi grămezi mai
mari sau mai mici(foto C.Defta)

2. Izolare:

- mediul de îmbogăţire: mediul hiperclorurat lichid

- geloză sânge

- Chapman (Ch)

Incubare aerobă la 37°C, 18 – 24 ore.

3. Identificarea bacteriei:

- Caractere morfotinctoriale: frotiu din cultură pură ⇒ coci Gram (+), in diplo tetrade sau în grămezi.

- Caractere de cultură: col “S” , mari, cu pigment galben-auriu până la citrin, uneori pot fi şi mucoide tip M

- Caractere biochimice:

- oxidază -

- catalază +

- coagulaza liberă +: S. aureus;

- coagulaza liberă -: stafilococi coagulazo-negativi (SCN)

- coagulaza legată (clumping factor - CF) +: S.aureus, S. lugdunesis, S. schleiferi

- producerea de DN-ază: S. aureus, S. schleiferi, S. hyicus


- descompunerea manitolului – pe mediul Chapman ⇒ Ma(+); tulpini patogene;

- producere de pigment: de la auriu la portocaliu, galben citrin (S. aureus, S. lugdunensis, S. Chromogenes,ş.a.)

- producerea de hemolizine – pe geloză-sânge vizibila ca o β-hemolizăîn jurul coloniei

⇒ hemoliza β (S. aureus, S. haemolyticus, ş.a.)

⇒ nu prezintă hemoliză (majoritatea tulpinilor SCN)

- Identificare pe baza rezistenţei la novobiocină a S. saprophyticus

- R. Ag-Ac: determinarea enterotoxinei produsă de stafilococ

4. Determinarea patogenităţii:

in vitro: producerea de coagulază, hemolizine, descompunerea manitolului

in vivo: inoculare la animale de laborator (cobai, iepure)

5. Tipizarea bacteriilor: pentru identificarea sursei de infecţie

- prin lizotipie (determinarea sensibilităţii stafilococului faţă de bacteriofagi; este o sensibilitate stabilă a

stafilococului)

- prin metode de biologie moleculară

6. Antibiograma-obligatorie.

6.1.2. Gen Streptococcus

-S. pyogenes, S. agalactiae, S. grup viridans

- S. pneumoniae (Pneumococ)

- Enterococi – E. faecalis

Podus patologic:

S. pyogenes: exsudat faringian, secreţie din leziuni tegumentare, sânge pentru serologie;

S. grup viridans: segăsesc în mod normal în faringe;

Enterococi: urină, secreţie uretrală, secreţie prostatică, secreţia canalului cervical, puroi din plăgi, bilă, sânge;

S. agalactiae : secreţie vaginală, secreţia canalului cervical –la mamă;

LCR, sânge, aspirat bronşic – la nou-născut;

Pneumococ: spută, LCR, sânge;

Transportul produselor patologice se face în maxim 2 ore de la recoltare, pentru cocimediul de transport este
mediul Stuart, pentru Streptococii βhemolitici de grup A se foloseşte mediul selectiv şi de îmbogăţire Pick în care
germenul poate rezista 3 zile la temperatura camerei.

Examenul direct al produsului patologic:

-macroscopic:-S. pyogenes, S. de grup viridans;

-enterococii - nu este necesar examenul macroscopic a produsului patologic;

-pneumococ ⇒ spută ruginie.

- microscopic: - coloraţia GRAM – coci gram(+):

-S. pyogenes: coci rotunzi, dispuşi în lanţuri (Fig. 6.2.);

- S. de grup viridans: coci rotunzi sau ovalari dispuşi în lanţuri;

- Pneumococii: coci lanceolaţi, dispuşi diplo cu capetele ascuţite spre exterior şi înconjuraţi de o
capsulăproprie (Fig. 6.3);

- Enterococii: coci ovalari, mai mari, dispuşi tot în lanţuri.

Fig
6.2. Coci G(+) în lanţuri mai lungi sau Fig. 6.3. Coci G(+) lanceolaţi in diplo capsulaţi

mai scurte (foto C. Defta)

Izolarea bacteriei:

- mediul de îmbogăţire: PIKE

- Geloză-sângecu cristal violet.

- Bulion-sânge; bulion ser; bulion glucozat

Identificare:

Caractere morfotinctoriale: (vezi anterior)

Caractere culturale : pe geloză sânge:

- col “S” cu hemoliză βeste punctiformă de culoare uşor albastruie pe mediu geloză sânge cu cristal violet

Streptococi β-hemolitici dau o hemolizaclară, transparentă, totală.

sensibilitate faţă de Determinarea hidrocarbonatului C din


BACITRACINĂ - identificare grup peretele bacterian prin reacţii de
A precipitare şi aglutinare – stabilirea
grupelor Lancefield

Testul CAMP- identificarea Streptococilor de grup B

- col “S” cu hemoliză α-incompletă, de culoare verde datorită reducerii Hemoglobinei la Methemoglobină

Bilă Optochin Inulină Esculină Rafinoză

S. de grup viridans Rezistent Rezistent - - +

Enterococi* Rezistent Rezistent - + -

Pneumococi Sensibil Sensibil + - -

Notă: * Enterococii pot fi nehemolitici.

Descompunerea Inulinei, Esculinei, Rafinozei se realizează pe mediul HISS.


Pneumococii dau colonii ”S”, ”R” sau ”M”verzui.

Identificarea Streptococul :-reacţia oxidazei (-), catalazei (-)

-testul la bacitracină: este un test de screening pentru diferenţierea streptococilor β-

hemolitici de grup A faţă de celelate grupe (B,C,D etc.). Tehnica constăîn obţinerea unei culturi în pânză(cultura
pură) apoi fixarea unui comprimat de bacitracină. Citirea se face după 24 de ore de incubare. Dacă zona de inhibare
a creşterii este ≥ 10mm sunt streptococi grup A, dacă cultura creşte pânăîn dreptul discului avem streptococi B, C,
D dacă reacţia nu este foarte sigură se face şi identificarea Ag-nică.

-reacţia de coaglutinareeste o seroidentificare necesită o trusă Streptic care conţine


reactivi pentru streptococii de grup A,B,C,D,preparat suspensie bacteriana. Tehnica suspensia se obţine din câteva
colonii prelevate de pe bulin glucozat, la care se adugă extract pancreatic din trusa cu rol de liză a peretelui
bacterian eliberând Ag (carbohidratul de grup) şi incubarea la 370C. Reactivii conţin seruri antistreptococice de grup
A,B,C,D,G,F (conţin IgG). Pe o lamă se pune câte o picătură de ser aparţinând grupurilor peste care se pune câte o
picătură de suspensie. Se roteşte lama pentru un mai bun contact, acolo unde s-a realizat reacţia Ag-Ac apar grunjii
de precipitare, iar picătura devine limpede, unde nu, picătura rămâne opalescentă (Fig. 6. 4.)

Fig. 6.4.a.- trusa Streptic(foto D. Ionescu)Fig. 6. 4.b.- Reactie (+) la 3 şi (-) la 6(foto D. Ionescu)

Pneumococ :-reacţia oxidazei (-), catalazei (-)

- Diagnostic diferenţial cu St. viridans:

-Eliberează enzime proteloitice, în culturile vechi se produce clarificarea mediului-Autoliză

-Testul la sărurile biliare = biloliza; culturile în mediu lichid + o picătură de bilă de bou
(conţine săruri biliare), după incubare mediul se clarifică. Pentru pneumococ bila are caracter bactericid.

-Testul la optochim similar ca tehnică cu testul la bacitracină. După incubare dacă diametrul
zonei de inhibitie ≥20mm cultura este de pneumococ, dacă creşte pânăîn dreptul discului cultura este cu St.
viridans.

- Identificarea antigenică prin evidenţierea polizaharidelor capsulare de tip:

a. reacţia de umflarea a capsulei: pe o lamă se pun o picătură de culturăîn ser fiziologic, o picătură ser specific, o
picătură albastru de metilen. Se examinează intre lamăşi lamelă. Reacţia Ag-Ac între polizaharidele capsulare şi
Ac antipolizaharide se observă microscopic ca o capsulă mult mărită.

b. reacţia de coaglutinare:pe o lamă se pune o picătură de ser antipneumococ + soluţia lizată de pneumococ.
Daca reacţia este pozitivă se produce complexul Ag-Ac.
După identificare se realizează antibiograma.

Streptococul de grup A: şi-a păstrat sensibilitatea faţă de penicilină – nu se efectuează antibiogramă (numai în
situaţii speciale, de exemplu alergie la penicilină).

Reacţia indirectă prin evidenţierea Ac:

- Streptolizina “O” = SLO= Ag ⇒ determină formarea de Ac anti-SLO = ASLO

Val < 1/200 UI/ml ⇒ nu există infecţie streptococică

Val > 1/200 UI/ml ⇒ este infecţie streptococică în evoluţie.

6.2. Diagnosticul de laborator în infecțiile produse de cocii Gram-negativi de genul Neisseria

Cuprinde mai multe genuri dar numai 2 vor fi luate în discuţie: genul N. gonorrhoeae – Gonococul şi N.
meningitides-Meningococul.

Recoltarea produselor patologice:

- LCR- în cazul infecţiei cu meningococ se face prin puncţie lombară. Se recoltează cu seringa sterilă iar produsul
se transportă imediat la laborator la temperatura de 370C.

- Recoltarea secreţiilor nazale pentru a pune în evidenţă meningococul.

- Secreţia uretrală la bărbat apărută ca urmare a uretritei gonococice. Recoltarea se face dimineaţa înainte de
prima micţiune, dupăce în prealabil pacientul a consumat un pahar de alcool tare înainte de culcare. Secreţia
uretralăare aspect purulent de culoare verde fosforescent, recoltarea se face cu ansa sau cu tamponul.
Transportul se face imediat,la 370C, în microaerofilie.

- La femei se recoltează secreţia vaginalăîn urma gonoreei localizată endocervical. Recoltarea se face pe masa
ginecologică din fund de sac vaginal între a 5-9 –a zi a ciclului.

Examenul direct al produsului patologic:

-macroscopic:- secreţia uretrală este verde fosforescentă,

-secreţia vaginală este purulentă,

-LCR-ul tulbure opalescent cu turbidităţi diferite în funcţie de stadiul infecţiei.

-microscopic: ambele genuri sunt coci G(-), dispuşi in diplo, reniformi, imobili, înconjuraţi de o structură capsulară
comună. Se grupeazăşi în grămezi de diplo.

Pe frotiul din LCR se observă polimorfo nucleare (PMN) care sunt celule inflamatorii şi coci renifomi dispuşi în
diplo, capsulaţi intra şi/sau extracelulari.

Examinarea frotiului din secreţia uretralăşi vaginală, pune diagnosticul, fiind prezente celulele inflamatorii,
PMN, dar şi cocii reniformi dispuşi in diplo capsulaţi. (Fig. 6. 6.)

Fig. 6. 6.Frotiu colorat albastru de

metilen, coci reniformi dispuşi in diplo

capsulaţi intra şi extra celulari.(foto C.Defta)


Însămânţarea: se face pe medii complexe în microaerofilie (3-5%CO2), la 370C.

Mediile sunt: Müller-Hinton cu adaos de colistin, vancomicină, nistatin şi trimetoprim.

Gelozăchocolat, geloză sânge

Nu cresc pe medii simple sau lichide.

Identificarea

Macroscopică: coloniile - apar după 24-48 de ore;

- de tip ”S” de 1-2 mm (meningococul), 0,5-1mm (gonococul) sau ”M”.

Microscopică: coci G (-) in diplo înconjuraţi de o structură capsulară comună

Biochimică: - oxidazo (+)este test cheie în identificare, catalazo (+);

- Fermentează zaharurile: glucoza ambii, maltoza numai meningococul,

- Nu fermentează lactoza, fructoza, zaharoza.

- În funcţie de structura capsulei există mai multe serogrupuri se face printr-o reacţie de identificare
antigenică de tip aglutinare. În cazul meingococcului avem serogrupele A,B, C, Y, sau W-135.Iar în cazul gonococului
identificarea se face cu ser antigonococ de iepure.

Antibiograma este obligatorie pentru ambele genuri

LUCRAREA PRACTICĂ 7

7.1. Diagnosticul de laborator în infecțiile produse de spirochete (Treponema pallidum, treponemele

bucale)

Treponema pallidum subspecia pallidum este agentul etiologic al sifilisului. Trăsătura caracteristică a
treponemelor este prezența a 10 - 20 de spire principale. Treponemele pot evidențiate prin microscopie în câmp
întunecat. Aceste bacterii nu pot fi cultivate pe medii de cultură. Sifilisul este o boală specifică omului. Agentul
patogen se transmite prin contact direct, în majoritatea cazurilor prin contact sexual. Microorganismele invadează
țesutul conjunctiv adiacent prin intermediul microtraumatismelor de la nivelul tegumentelor și mucoaselor. Boala
evoluează în stadii diferite denumite sifilis primar, secundar și terțiar sau stadiile 1, 2 și 3.

Stadiul 1 se caracterizează prin șancrul dur, nedureros și limfadenita locală. Diseminarea conduce la stadiul 2
caracterizat prin limfadenopatie generalizată precum și exantem și enantem generalizat. Stadiul 3 este caracterizat
de prezența neurosifilisului, sifilisului cardiovascular și gomelor sifilitice. În stadiile 1 și 2 agentul patogen de la
nivelul leziunilor poate fi vizualizat în microscopie în câmp întunecat. Testele serologice care pun în evidență
prezența răspunsului imun din partea gazdei sunt VDRL, TPHA și testul de imunofluorescență indirectă FTA-ABS.

Tratamentul de elecție este penicilina.

Morfologie
Aceste microorganisme sunt bacterii subțiri, cu dimensiuni de 0,2 µm lățime și 5-15 µm lungime.

Se caracterizează prin prezența a 10-20 de spire principale, iar motilitatea se realizează prin rotația în jurul
propriului ax. Datorită formei foarte subțiri sunt greu de vizualizat prin colorare. Pot fi observate in vivo la
microscopia în câmp întunecat. Cultivarea in vitro nu a putut fi realizată.

Patogenie și aspect clinic

Sifilisul este o boală specific umană. Se transmite de obicei prin contact sexual. Infecția apare ca urmare a
contactului direct cu leziunile infectante ce conțin treponeme. Perioada de incubație este de 2-4 săptămâni.
Netratată boala se manifestă în mai multe stadii.

Stadiul 1 – leziuni dure, nedureroase, ulterior infiltrative și ulcerate numite șancru dur. Aceste leziuni conțin un
lichid clar care este bogat în treponeme, fiind descris ca ”apa de stâncă”. Se acompaniază cu limfadenită regională
nedureroasă. Șancrul se vindecă spontan.

Stadiul 2 – infecția se generalizează după 4-8 săptămâni de la sifilisul primar. Simptomele clinice întâlnite
cuprind limfadenopatie generalizată, exantem macular sau papuloscuamos, condiloame late și enantem.

Sifilisul latent – stadiul în care simptomele sunt absente, dar agentul etiologic este prezent în organism, iar
testele de detecție a anticorpilor specifici sunt pozitive. Acest stadiu se împarte în sifilis latent precoce (mai puțin de
4 ani) și sifilis latent tardiv (peste 4 ani).

Sifilisul terțiar (stadiul 3)– stadiul de gome sifilitice ce apar la nivelul tegumentelor, mucoaselor și în diferite
organe. Leziunile sunt slab infectante sau neinfectante. Sifilisul cardiovascular se manifestă prin arteriopatie
obliterantă și aortită sifilitică, neurosifilisul se caracterizează prin sifilisul meningovascular și sifilisul parenchimatos.

Transmiterea treponemelor de la mamă la făt după luna a 4-a de gestație conduce la apariția sifilisului
congenital caracterizat prin avort spontan sau multiple afectări de organe la fetus. Infecția în primul semestru de
sarcină este incompatibilă cu viața.

Diagnosticul de laborator include atât izolarea și identificarea agentului patogen, cât și teste serologice.

Identificarea agentului patogen

Se poate indentifica în lichidul din șancrul primar, din secrețiile leziunilor exudative din stadiul 2 sau prin
biopsia ganglionilor limfatici. Metodele utilizate sunt microscopia în câmp întunecat și imunofluorescență directă.
Punerea în evidență a agentului patogen are valoare de diagnostic.

Tehnica în cazul şancrului primar, se îndepărtează crusta de deasupra leziunii iar cu ansa, sau cu o pipetă
Pasteur se recoltează din profunzimea leziunii, deorece este strict anaerobă. Se efectuează un preparat lamă/lamelă
care se observa la microscopul cu fond întunecat. Unde se urmărtesc mişcările caracteristice de flexie caracteristică
treponemelor patogene, de rotaţie axială, de pendulare şi de translaţie.Pe frotiul colorat Giemsa sau cu săruri
argentice Fontana –Tribandeu, apare ca o formă helicoidalăcu spire strânse şi regulate, cu lungime de 5-15 µm şi
lăţime de 0,5µmşi cu 3 flageli polari.

Testele serologice

Se efectuazăîn stadiul secundar şi terţiar al infecţiei.

1. Teste cu Ag cardiolipinic –VDRL, RFC

2. Teste cu Ag treponemic –Imunofluorescenţa şi testul de imobilizare al treponemelor


1. Teste cu Ag cardiolipinic utilizeză ca antigen extracte lipidice nespecifice treponemei = extracte alcoolice din
ţesutul animal. Cardiolipina este un extract alcoolic purificat din muşchi de cord de bou (cel mai frecvent
utilizat), adsorbit pe cristale de colesterol. Se depistează Ac-ul din serul bolnavului.

a. VDRL (Veneral Disease Research Laboratory) este un test serologic în care antigenul este cardiolipina, iar
reacția este de aglutinare. Acest test este pretabil la rezultate false pentru că se folosește un antigen
nespecific.

Tehnică: Se pun la temperatura camerei în placa cu godeuri 0,05 ml ser inactivat (fără complement) şi o
picătură de Ag. Se roteşte placa cu un agitator la 180rot/ minut timp de 4 de minute. Se citeşte imediat pe un
fond negru cu ajutorul unei lupe începând cu martorii (negativ, pozitiv, martor de Ag, martor slab pozitiv).
Rezultatele se dau sub forma de „+”:

+ flocoane mici, lichidul puţin clarificat

++ flocoane evidente

+++ şi ++++ flocoane mari în lichid clar

- absenţa flocoanelor, lichidul opalescent.

b. RFC. Reacţia Bordet –Wasserman (vezi reacţia Ag-Ac de diagnostic)

2. Teste în care se folosesc antigene treponemice

a. TPHA (Treponema Pallidum hemagglutianation assay) este un test în care se folosește antigen specific
treponemic obținut prin tratarea unei culturi celulare de treponeme cu ultrasunete.

Testul de imunofluorescență (FTA-ABS). Antigenul este obținut din treponeme, iar anticorpul de captură este
marcat fluorescent.

b. Testul de imunofluorescenţă,este o reacţie indirectă, Ag este o treponemă patogena Nichols. Astfel, se pun
în contact Ag cu Ac-ul (serul de la pacient) şi Ac marcat cu o substanţă fluorescentă. Preparatul obţinut se
observă la microscopul cu fluorescenţă.

c. Testul de imobilizare al treponemei, se examinează la microscop un preparat nativ în care sunt puse,în
contact suspensii de treponeme vii, ser diluat de la pacient, complement seric. În prezenţa Ac
antitreponema palidum şia Cs mai mult de de 50% din treponeme îşi pierd mobilitatea. Fenomenul este
urmărit la microscopul cu fond întunecat.

Testele serologice pot fi folosite după cum urmează:

Screening: VDRL

Diagnostic primar: VDRL, TPHA și FTA-ABS

Diagnostic special: VDRL cantitativ, FTA-ABS

Succesul terapeutic poate fi monitorizat cu ajutorul VDRL cantitativ. O scădere în titrul anticorpilor indică un
tratament eficient efectuat.

În cavitatea orală se găsesc o multitudine de specii treponemice: Treponema denticola, Treponema


sockranskii, Treponeama pectinovorum, Treponema vincentii, Treponema medium, Treponema maltophilum,
Treponema putidum. Acestea par a fi implicate în patogenia și progresia bolii parodontale, în asociere cu alte
bacterii. Din păcate aceste treponeme sunt foarte greu de cultivat întrucât sunt strict anaerobe. În ultima vreme,
datorită dezvoltării tehnicilor moleculare de diagnostic, identificarea acestora se poate realiza la pacienții cu afectare
parodontală(Fig. 7.1.).

Fig. 7.1.Frotiu gram din punga parodontala, sageata indica treponemele orale
(foto C. Defta)

7.2. Mycobacterium tuberculosis (BK): schema diagnosticului de laborator în tuberculoză

Mycobacterium tuberculosis (BK) reprezintă agentul etiologic al tuberculozei (TBC). Principala localizare
atuberculozei este pulmonară,dar poate fi întălnităşi în alte zone ale corpului:renală, digestive, la nivelul SNC, etc.

Recoltarea şi transporul produselor patologice:

Principalul produs patologic îl reprezintă sputa. Aceasta se recoltează de la pacienţii care expectorează, dimineţa la
prima oră după igiena bucală. În cazul pacienţilor care nu expectorează se fac spălături laringotraheale cu ser
fiziologic,recoltarea se face în plăci Petri sterile în ambele cazuri.

La copii deoarece aceştia au tendinţa de a-şi înghiţii sputa se recoltează materiile fecale (în coprocultoare) şi lichidul
de spălătură gastrică (în plăci Petrii).

În cazul TBC-lui urogenital se recoltează urină timp de 24 de ore, spermă, sânge menstrual în recipiente cu capac
sterile. În cazul urinii recipientele de recoltare se ţin la frigider între micţiuni.

În TBC-ul seroaselor (pleurezis, peritonită) se recoltează exudatele din puncţii în eprubete sterile.

În meningita tuberculoasă se recoltează LCR prin puncţie lombară în eprubete sterile.

Examenul direct de laborator:

Macroscopic: se pune recipientul cu sputa pe un fond întunecat pentru aprecierea, aspectului, consistenţei, culorii,
prezenţei altor formaţiuni. LCR, urină estimarea turbidităţii şi a altor formaţiuni prezente.

Microscopic : Pentru realizarea frotiurilor din spută aceasta trebuie omogenizatăcu Na OH 4%,urmată de
neutralizarea cu tampon fosfat pH 6,8. Examinarea include realizarea urmatoarelor tipuri de frotiuri:

- AM- pentru aprecierea generală aelementelor;

- Gram-pentru flora microbiană de asociaţie;

- MGG-pentru citologie în TBC predomină limfocitele;

- Z-N- pentru punerea în evidenţă a BK care apare sub forma unor bacili
subţiri, de lungime variabilă, drepţi uşor încurbaţi sub formă de corzi.
Pe frotiu apar izolaţi sau grupaţi dând aspect de litere în unghiuri
(N,X,V). Pe frotiu toate celelalte elemente sunt colorate în albastru(Fig.
7.2.)
Fig. 7.2.BK: frotiu din sputăcolorat Z-N, bacili subţiri asezaţi în

corzi coloraţi în roşu.(foto C.Defta)

În cazul urinii se face centrifugarea iar frotiul se execută din sediment, prezenţa a unui singur bacil are
valoare de diagnostic.

Însământarea şi cultivarea:

Mediile folosite sunt: - Löwenstein-Jensen, mediu solid pe bază de gălbenus de ou;

- Baird - Parker mediu pe bază de agar şi gălbenuş de ou;

- Agar cu piruvat, telurit şi gălbenuş;

La aceste medii se adaugă verde malachit care inhibă flora de asociaţie. Incubarea se face în atmosferă de CO2,
8-10%,la 370C. BK are o creştere foarte lentă având o rată de diviziune de 12-27 de ore iar colonia este prezentăîn
2-4 săptămâni.

Identificarea:

Macroscopicăa culturii, colonia are câţiva mm, de tip R conopidiformă foarte caracteristică de culoare galbuie. Pe
mediu lichid creşte numai la suprafaţă mediului,acesta rămân limpede, dă un val care cuprinde treptat toată
suprafaţa, se ridică puţin pe pereţi, se îngroaţăşi se pliseză, fiind o forma de creştere caracteristică.

Microscopic: bacili subțiri roșii dispuși sub forma de corzi.

Biochimic: -reduce nitratul la nitriţi

- testul catalazei la 220C şi dupăîncălzire la 680C sunt pozitive

- ureazo(+)

-testul producerii de niacin

Teste de patogenitate, în urma testăriipe animalelor de laborator determină moartea acestora (2-3 luni): cobai,
iepure.

Antibiograma: poate fi făcută direct sau după cultivare:

-Directă când la examenul microscopic se observă un număr foarte mare de germeni.

-Din suspensie realizată din culturile de pe mediul Löwenstain.

Diagnosticul indirect de laborator –Imunologic este IDR (intra dermo-reacţia) cu PPD (produs proteic preparat
din tuberculina). După injectare se face citirea zonei la 72 de ore, dacă diametrul zonei este mai mare de 10mm se
impune o radiografie, dacă diametrul are 9mmnecesară vaccinarea fiind o reacţie (+) se caracterizeză prin eritem,
induraţie, rară necroză sau ulceraţie. La persoanele neimunizate reacţia este (-), pentru a confirma rezultatul
negative înainte de a decide vaccinarea se repeta IDR cu 10UI/0,1 la 15 zile de la prima testare,dacăşi acesta este
negativăse revaccinează cu BCG (bacil viu cu virulenţă atenuată care dă microinfecţii urmată de imunizare).

LUCRAREA PRACTICĂ 8
7. Diagnosticul de laborator în infecțiile produse de bacilii Gram-negativi- Fam.Enterobacteriaceae

Cuprinde organismele patogene pentru om cum ar fi: Salmonella, Shigella, Yersinia şi condiţionat patogene
Esherichia colii (E. coli), Proteus, Klebsiella.

Enterobacteriile sunt definite ca o grupare de bacili G(-), mobile sau imobili(Klebsiella, Shigella, Yersinia la
370C), aerobeşi facultativanaerobe, nesporulate, necapsulate (exceptie Klebsiellain vivo)

Metabolismul este de tip respirator (aerob) şi fermentative (facultative anaerob)producând acid din glucozăsau
alte zaharuri, cu producere sau nu de gaz. Majoritatea sunt catalazo(+), oxidazo (+), reduce nitraţii la nitriti.

Mobilitatea datorată cililor peritrihi.

Invazivitatea este o caracteristică a tupinilor de Proteusşi Klebsiella. Este inhibată de anumite substanţe
tensioactive(acizii biliari, detergent)şi coloranţi (verde brilliant, cristal violet).

8.1. Diagnosticul de laborator în infecţiile cu E.coli

E. coli cuprinde tulpini condiţionat patogene (saprofite) şi patogene (E.coli enteropatogena, E. coli
enterohemoragica, E. coli enterotoxigena, E.coli enteroinvaziv, etc.)

Recoltarea şi transportul produselor patogene:

-Materiile fecale (în coprocultoare cu mediu de transport ex. Blair) se recoltează din mai multe zone şi porţiuni
edificatoare;

- Lichid de vărsătură (în plăcii Petrii sterile);

-Urina în urocultoare dimineaţa după toaletarea zonei, se recoltează jetul mijlociu.

Transportul se face în maxim 2 ore de la recoltare, la temperatura camerei.

Examenul direct de laborator:

Macroscopic: - materiile fecale pot avea urme de mucus, uneori sanghinolente, cu lambouri de mucoasă epitelială,

- urina este tulbure opalescentă cu sediment şi cu miros de varză acră, uneori pot fi prezente şi urme sanghinolente.

Microscopic: Pe frotiul colorat Gram se observă prezenţa bacililor subţiri cu capete rotunjite G (-), leucocite PMN,
celule EK de diferite tipuri, mucus, resturi obşinute din digestie. Pe frotiul din sedimentul urinar se observă bacilii,
celule inflamatorii PMN-urile.

În practica curentă se fac şi frotiuri native lama/lamelă pentru a observa hematiile şi PMN-le.

Însămânţarea:

Se face pe medii slab selective MacConkey (conţine săruri biliare şi cristal violet) şi ADCL (agar, dezoxicolat,
citrate, lactoza) şi pe Geloză sânge.

În cazul urinii se face o urocultură cantitativă (nr. de bacteria /ml de urină). Se însământează astfel 0,1 ml
urină diluată (diluţie de 1/1000), incubăm după apariţia coloniilor se numără, se înmulţesc cu 10 şi cu 1000 pentru
a afla numărul de bacterii /ml. Astfel dacă numărul de bacterii /ml este mai mare de 100.000 urocultura este
pozitivă. Dacă numărul de colonii este mai mic de 10.000 sau absent rezultatul este negativ. Dacă rezultatul este
pozitiv se trece la etapa de identificare şi respectiv antibiogramă.

Identificarea:
Macroscopic: coloniile nepatogene sunt mari, de culoare roză pe mediul MacConkey şi galbene pe ADCL.

Tulpinile patogene sunt mari şi incolore, iar pe geloza sânge sunt mari de culoare gri închis şi dau hemoliza de tip β.

Microscopic: bacili subţiri capete rotunjite dispuşi aleator pe toată suprafata (Fig. 8.1.)

Fig. 8.1. Frotiu colorat Gram, bacili G (-) dispuşi

aleator (foto C.Defta)

Biochimic: se fac pe mediile de identificare TSI, MILF, MIU, sau în galeriile de identificare a testului ID (Bio Meriux)

- fermentează glucoza cu producere de gaz;în mediu lichid vizualizat prin deplasarea tuburilor Durham.

- tulpinile nepatogene sunt latozo (+), cele patogene sunt lactozo (-);

- nu produc hidrogen sulfurat, pot produce indol, ureazo (+) și sunt mobile.

Teste de identificare antigenica prin reacţii de aglutinare sau latex aglutinare (vezi reacţia Ag-Ac).

Antibiograma obligatorie.

8.2. Diagnosticul de laborator în infecţia cu Klebsiella

Recoltarea și transporul produselor patologice

-Alimentele responsabile de toxinfecţiile alimentare (TIA) de tip infecţios, produsul patologic se

recoltează într-un recipient steril cu capac.

-În infecţiile urinare se recoltează urină (în urocultoare şi în condiţiile prezentate anterior).

-În infecţiile tractului respirator se recoltează sputa (în plăci Petri)

Examenul direct de laborator

Macroscopic: Urina este tulbure opalescentă, sputa este mucoidă de culoare roşu închis “în jeleu de coacăze”.

Microscopic: pe frotiul gram se observă bacilul G (-) sub formă de pişcot cu capsulă, prezenţa celulelor inflamatorii
PMN, macrofage, celule EK.

Însământarea

Pe MacConkey, pe medii obişnuite, pe geloza sânge, incubarea se face la 370C timp de 28 de ore.

Identificare

Macroscopică: colonii mari 2-3 mm la 24 de ore peste 4 mm la 48 de ore, de tip M, bombate, lucioase, vâscoase, cu
aspect de curgere pe mediu, extreme de aderente, cremoase de culoare gri pe mediu geloză sânge.

Microscopică: bacili subțiri asemănători unui pişcot cu capete rotunjite G (-).


Biochimică: - degradează glucoza cu producere de gaz, lactozo (+), nu produce H2S, ureazo (+), indol (-), citrat
(+), citratul este unica sursă de carbon.

- Teste de identificare antigenice: aglutinarea pe lamă, latex aglutinarea

- Testarea sensibilitatii la bacteriofagi.

Antibiograma obligatorie

8.3. Diagnosticul de laborator în infecţia cu Proteus

Recoltarea și transporul produselor patologice:

- În infecţiile urinare produsul patologic este urina (recoltată în urocultore şi în condiţiile discutate anterior),

transportul se face în maxim 30’ de la recoltare;

- În TIA produsul patologic sunt alimentele şi materiile fecale.

- În infecţiile nosocomiale produsul patologic este recoltat în funcţie de sediul infecţiei în condiţiile

corespunzătoare.

Examenul direct de laborator

Macroscopic: urina este tulbure, purulentă cu miros fetid.

Microscopic: edificator este frotiul lamă-lamelă în care se observă mişcările active ale bacteriei. Pe frotiul gram
prezintă fenomenul de polimorfism de la bacili, cocobacili la forme filamentoase, PMN-re, celule EK.

Însământarea

Se face pe medii simple de cultură.

Identificare

Macroscopică: Colonia prezintă fenomenul de invazie în valuri concentrice, succesive cuprinzând întreaga suprafaţă
în 24-48 de ore, prezintăşi fenomenul de căţărare. În cazul a două tulpini diferite însămânţate pe aceiaşi placă ele
creează linia de demarcaţie.

Microscopică: bacili subţiri poliformi G(-) cu capete rotunjite așezaţi oarecum haotic (Fig. 8.2).

Biochimică: lactozo (-), glucozo (+), produc H2S, mobile, ureazo (+), citrate (+) se pot dezvoltă având citratul ca
unică sursă de C.

Antibiograma obligatorie

Fig. 8.2. Frotiu din cultură, colorat Gram prezentand bacili G(-)
de dimensiuni diferite.(foto C.Defta)

8.4. Diagnosticul de laborator în infecţia cu Salmonella


Produce TIA (salmonelozele minore) când diagnosticul este bacteriologic iar în febra tifoidă (salmonelozele majore)
diagnosticul este atât bacteriologic cât şi serologic.

Recoltarea și transporul produselor patologice

-Materiile fecale în TIA, în febra tifoidă, în cazul purtătorilor sănătoşi se pot recolta materiile fecale a doua zi după
administrarea în timpul serii a unui purgativ (sare Epson).

-Sângele în febra tifoidă în prima săptămâna de boală.

-Secreţia biliară în febra tifoidă după prima săptămână de boală şi în cazul purtătorilor sănătoşi obţinută prin tubaj
duodenal.

-Transportul cu medii de transport maxim 2 ore la temperature camerei. Sângele se transport în tuburi sterile,în
maxim 30 ‘.

Examenul direct de laborator

Microscopic: bacili subţiri cu capete rotunjite G(-), cu cili peritrichi, necapsulaţi, PMN, celule EK.

Însământarea

Pe medii lichide de îmbogăţire (bulion selenit), pe medii solide selective MacConkey şi ADCL.

Incubare la 18-24 de ore la 35-370C.

Identificare

Macroscopică: colonii de tip S necolorate pe MacConkey, pe ADCL sunt necolorate cu sau fără mijlocul negru.

Microscopică:bacili subţiri cu capete rotunjite G (-).

Biochimică: lactozo(-), produce H2S, utilizeză citratul ca unică sursă de C, glucozo(+) cu producere de gaz.

Antibiogramaobligatorie

Diagnosticul serologic. Vezi Reacția Widal de la reacţia Ag-Ac.

8.5. Diagnosticul de laborator în infecţia cu Shigella

În genul Shigella există 4 subgrupe: A are 13 serotipuri, B are 6 serotipuri, C cu 18 serotipuri, D un serotip.
Diagnosticul este direct şi trebuie pus rapid.

Recoltarea și transporul produselor patologice

- Produsele alimentarese recoltează în TIA de tip infecţios;

- Materiile fecale după apariţia dizenteriei ca urmare a ingestiei a unui număr de 10-100 bacterii. Transportul se face
de urgenţă pe mediu Cary-Blair

Examenul direct de laborator

Macroscopic: materiile fecale prezintă mucus, sânge, puroi.


Microscopic: bacili G(-) subţiri cu capete rotunjite, numeroase PMN-uri iar dacă PMN sunt în procent de 70% alături
de hematii acesta constituie aspectul sugestiv pentru dizenteria bacteriană.

Însământarea

Se face pe medii moderat selective ADCL şi MacConkey, incubare 24 de ore la 370C.

Identificare

Macroscopică:colonii de tip S mici transparente rourate cu miros


caracteristic.

Microscopică:bacili G(-)(Fig. 8.3.)

Fig 8.3. Frotiu din cultura colorat gram, cu bacili mici subţiri G(-)

(foto C.Defta).

Biochimică:lactozo(-), aerobi şi facultative anaerobi, glucozo(+) fără producer de gaz. Subgrupul A este manito(-),
restul subgrupelor sunt manito (+), nu produc H2S, ureazo (-), indol (-).

Teste de identificareantigenic se utilizeaza reacția de aglutinare pe lamă, cu seruri polivalente anti-subgrup

Antibiogramaeste obligatorie

8.6. Diagnosticul de laborator în infecţia cu Yersinia

Prezintă mai multe specii dar patogene pentru om sunt: Y.enterocolitica, Y. pestis (agentul etiologic al ciumei), Y.
pseudotuberculosis

Recoltarea și transporul produselor patologice

Materiile fecale se foloseşte mediul de transport Cary-Blair

Examenul direct de laborator

Microscopic:bacili sau cocobacili G(-) coloraţi bipolari, prezintă pleomorfism, prezintă PMN şi celule EK

Însământarea

Se efectuază pe medii selective MacConkey, ADCL şi CIN. Incubând la temperatura camerei (22-290C)

Identificare

Macroscopică: colonii de tip S, 1-1,5 mm sau 2-3 mmla 48 de ore, transparente

Microscopică:bacili sau cocobacili G (-), pleomorfi.

Biochimică: lactozo (-), glucozo (+) fără producere de gaz, nu produce H2S, imobili la 370C și mobile la 220C,
indol(-), ureazo (+).

Testeul de identificare antigenic utilizeză serurile specific anti-Yersinia

Antibiogramaobligatorie.
LUCRAREA PRACTICĂ9

9.1. Diagnosticul de laborator în infecțiile produse bacilii Gram-pozitivi.

Bacilii gram pozitivi pot fi aerobi, genul Bacillus sau anaerobi, genul Clostridium

9.1.1 Diagnosticul de laborator în infecţia cu Bacillus anthracis

Genul Bacillus prezintă mai multe specii, dar cele implicate în patologia umană sunt B. anthracis, B. cereus şi B.
subtilis.

Recoltarea şi transpotul produselor patologice

Se face în funcţie de forma de boală:

-Exsudat vezicular este produsul patologic înforma cutanată.La locul de inoculare apare o veziculă cu lichid sero-
sanghinolentcare ulcerează cucrustă neagră,la periferie apar vezicule care diseminează–regiunea subiacentă leziunii
prezintă edem gelatinos nedureros de unde se recoltează lichidulde edem, un alt produs patologic;

-În formă sistemică apare localizarea pulmonarăde unde se recoltează sputa;

-Localizarea digestivă- enterocolita rară la om podusul patologic fiind materii fecale;

-În cazul localizăriimeningeală,mai rar se recoltează LCR,cu sau fără septicemieiar produsul patologic este sângele.

-Fragmente de organe (în diagnosticul retrospectiv): ficat, splină, piele.

Examenul direct de laborator

Microscopic: Frotiuri colorate AM sau Gram unde B. anthracis apare sub formă de bacili groşi cu capete retezate,
dispuşiîn lanţuri acoperite de capsulă.Pe frotiul Gram este G (+) cu PMN şi celule EK specifice tesutului(Fig. 9.1.)

Fig 9.1. Frotiu din produs paologic, colorat gram cu bacil G (+) dispuşi

in diplo sau lanţuri scurte(foto C.Defta)

Însămânţarea:

Se face pe medii simple: bulion simplu, geloza simplă, geloză sânge.


Incubarea se face în aerobiozaîntre 15-420C, optim la 370C.

Identificare:

Macroscopică: colonii de tip R, mari, 2-5 mm cu margini neregulate cu prelungiri laterale ce seamănă cu “capul de
meduză “ sau “coama de leu”. Coloniile sunt nehemolitice.

Microscopică: bacili groşi cu capete drepte sau retezate dispuşi în lanţuri, prezintă capsulă şi cu spor central care nu
deformează bacteria.

Biochimică: catalazo (+), produce lecitinază, indol (-).

Teste de identificare antigenică prin IF direct (seroidentificare) se aplică serul imun fluorescent anticapsular, după
efectuarea preparatului se observa la microscopul cu fluorescenţă.

Antibiogramaobligatorie
Diagnostic serologicîn diagnosticul retroactiv reacţia Asscoli (vezi reacţia Ag-Ac).

9.1.1 Diagnosticul de laborator in infectia cu Clostridii

Genul clostridiilor include mai multe specii care se găsesc în intestinul animalelor şi care eliminate în mediul extern,
sporulează.

Speciile patogene pentru om sunt Cl. tetani, Cl botulinum, Clostridium perfringens care alături de Cl. septicum, Cl.
histoliticum, Cl. sporogenes, Cl. oedematiens sunt agenţii etilogici ai gangrenei gazoase.

Toți au capacitatea dea sintetiza o toxina difuzibilă.

Trecerea de la forma vegetativă la forma sporulată se face în prezenţa oxigenului molecular.

Aceste bacterii sunt strict anaerobe.

Iar pentru cultivare sunt necesare condiții de anaerobioză. Se folosesc fie cutii “Boxanaerob”recipiente mari, care se
închid ermetic şi în care sunt așezate plăcile Petrii însămânţate cu produse patologice. În aceste cutiiînainte de
închidere sunt introduse plicuri cu amestecuri reducătoare care genereazăo atmosferă anearobă,datorită reacţiilor
chimice consumatoare de oxigen. Condiții de anerobioză pot fi obţinute şi în termostate de anaerobioză care au
ataşate butelii cu amestecuri de gaze necesare menţinerii acestor condiţii.

Acest tip de diagnostic de laborator este dificil de realizat, costisitor şi necesită personal calificat. În cazul infecţiilor
cu clostridii diagnosticul de laborator uneori poate fi tardiv, de aceea acesta are mai mult rol în cercetare. Etapele
diagnosticului pot fi următoarele

Recoltarea şi transportul produselor patologice

-Fragmente de ţesut necrozat şi secreţii de culoare închisă;

-Puroi cu sânge recoltat din plăgi, toate acestea pot fi însoțite de miros neplăcut cadaveric sau putrid, transportul

seface în condiţii de anaerobioză în recipient special;

-Conserve alimentare;

-Probe din sol sau obiecte care au stat în sol.

Examenul direct de laborator este orientativ.

Toate clostridile sunt bacili G(+) cu sporul dispus diferit în funcţie de specia care deformează bacteria.

Clostridium tetani e un bacil lung, subţire, cu spor dispus terminal, seamănă cu un băt de chibrit.

Clostridium botulinum e un bacil mare, gros cu sporul dispus subterminal, semănă cu o rachetă de tenis,

Clostridium perfringens eun bacil gros scurt drept, capete rotunjite, spor subterminal.

Însămânţarea

Se face pe medii speciale: mediu lichid VF, geloză sânge cu neomicina pentru condiţiile de anaerobioză. Incubarea
se face 24-48 de ore la 35-370C.

Identificarea

Clostridium tetani

Macroscopicîn mediu lichid colonia are aspect de puf de păpădie, iar


mediul miroase a corn ars, bacteriile sunt mobile.

Microscopic identic cu descrierea din examenul direct de laborator


(Fig. 9.2.)
Fig. 9.2. Frotiu din culturăcu bacili G (+) cu spor terminal cu aspect de “băţ de chibrit”(foto C.Defta)

Biochimic: lichefiază gelatina, nu fermentează nici un zahăr, indol+/-,produce H2S.

Caractere de patogenitateîn cultură pură,produce mii de doze mortale/ml de exotoxină tetanică. Exotoxina prezintă
2 fragmente: tetanolizina-hemolitică, tetanospasmina cu tropism pentru SN, ambele sunt solubile, se sintetizeazăîn
anaerobiozăşi difuzează rapid.

Clostridium botulinum

Macroscopic colonii de tip S cu margini ondulate cu tendinţa de invadare a mediului sunt mobile.

Microscopic identic cu descrierea de sus.

Biochimic: fermetează câteva zaharuri, indol (-), nu produce colagenază, produce lecitinazăîn cantitate mai mică
decâtCl. perfringens.

Caractere de patogenitate în cultură pură produce milioane de doze mortale/ml. Există 6 subtipuri de Cl.
botulinumce produc toxine diferite ca proprietăţi, boala la om este dată de subtipul A mai frecvent în SUA şi subtipul
B mai frecvent în Europa.

Diagnosticul de laborator în botulism se bazează pe evidenţierea toxinei: a. prin IF cu antiser marcat cu izocianat de
fluoresceinăşi b. prin toxinotipie se centrifugheazăalimentul incriminat din supernatant care conţine toxina A/B.

Se inoculează supernatantul la 6 şoareci, la 2 numai supernatant, la 2 supernatant şi serantibotulinic A, lotul 3


supernatant - ser antibotulinic B.

Interpretarea rezultatelor: moartea animalelor din lotul 1 şi 2-Toxina B, moartea animalelor din lotul 1 şi 3 - Toxina
A, supravieţuirea loturilor nu e toxină botulinică.

Clostridium perfringens

Macroscopic colonii de tip S cu margini ondulate, însămânţat în profunzimea mediului are aspect pufos, este imobil

Microscopic identic frotiucu descrierea de mai sus.

Biochimic fermentează toate zaharurile utilizate, produce; hialuronidază, colagenază, hemolizină, lecitinazăîn
cantitate mare. Caractere de patogenitate exotoxina de tip special în cultură pură produce sute de doze mortale /ml.
Prezintă 6 tipuri de toxine notate cu litere mari,în care tipul A este patogenă pentru om şi produce cantitatea cea
mai mare de lecitinază, celelalte tipuri sunt patogene pentru animale şi predomină alte enzime.

9.2. Diagnosticul de laborator în actinomicoza cervicofacială.

Actinomycoza cervico facial este o infecţie primară datoratăActinomyces israelii şi A. naeslundi

Recoltarea produselor patologice

-Prin puncţie cu seringa sterilă din:-nodulii maxilari de culoare roşie, din abcesele vestibulare;

- recoltarea lichidelor de evacuare sinusale;

-Recoltarea lichidului din şanțul crevicularîn parodontopatii cu vârfuri de hârtie;

-Cu ace stomatologice se recolteaza probe din canalul rădăcinii.

Examenul direct de laborator

Macroscopic: lichidul de puncţie are aspect cremos, gros, purulent uneori cu urme sanghinolente.
Microscopic: pe frotiu apar ca bacili G(+) pleomorfi până la filamentoşi, ramificaţi, nesporulaţi, neciliaţi, limfocite
PMN, rare celule epiteliale.

Pe frotiul din lichidul sinusal, pe lăngă formele caracteristice se mai observăşi “granulele de sulf”, mici formaţiuni din
material galben în ţesut.

Însămânţarea se face pe mediu Columbia cu vancomicină, mediu Schaedler cu menadiona şi hemină, în condiţii de
5% CO2 darşi anaerobioză, la 370C.

Identificarea

Macroscopică: Coloniile cresc foarte greu în minim 7 zile până la 21 de zile, sunt colonii de tip R, aderente, care
formează colonii fiice în jur.

Microscopic: identic cu frotiulapar ca bacili G (+) pleomorfi pana la filamentosi, ramificati, nesporulati, neciliati

Biochimic identificarea se face cu teste rapide Api ID32 A.

Fig. 8.2. Exemplu de


test rapid de
identificare (foto C. Defta)

Antibiograma este obligatorie şi se efectuaeză tot în condiţii de anerobioză.

LUCRAREA PRACTICĂ 10
Pentru înţelegerea manierei de abordare a diagnosticului de laborator în cazul paraziţilor este necesar să se
cunoască date succintelegate de morfologia parazitului şi localizare.

10. Diagnosticul de laborator în infestările produse de:

10.1. Entamoeba histolytica.

Clasificarea Amibelor se poate face după patogenitate în:

-amibe parazite, întotdeauna patogene, de ex. Entamoeba histolytica;

-amibe parazite, nepatogene sau condiţionat patogene, de ex. Entamoeba gingivalis

Entamoeba histolyticase mai numeşte şi E. Dysenteriae,are localizare intestinală,estehematofagă. Fiind un parazit


invaziv, pătrunde în ţesuturile intestinale dar poate şi disemina extraintestinal pe calea sângelui.

Entamoeba histolytica provoacă amibioza sau dizenteria amibiană cu anumite caracteristici care diferă de dizenteria
bacteriană dată de Shigella.

Prezintă două forme de trofozoit şi de chist.


Sub formă de trofozoitare 20-30 µ, format dintr-o singură celulă, care își modificăforma datorită
pseudopodelor pe care le emite permanent cu scop de mişcare şi hrănire.Citoplasma este structurată în ectoplasmă
(periferică) şi respectiv în endoplasmă (situată în jurul nucleului), conţine numeroase vacuole precum şi lizozomi.
Nucleul este sferic, excentric, înconjurat de o membrană nucleară cu
cariozom situat central şi cromatină situată periferic (Fig. 10.1).

Fig.10.1.Entamoeba histolitica: 1-endoplasma granulară, 2-


ectoplasma, 3-vacuolă, 4-nucleu, 5-cariozom central, 6- cromatină
periferică, 7-eritocit fagocitat(desen C. Defta)

Forma de rezistenţă în mediul extern este reprezentată de chistşi are o dimensiune de circa 8-20 µ, rotund cu un
perete gros, refractil, conţine patru nuclei.În citoplasmă prezintă baghete siderofile, sau corpii cromatoizi.

Chistul se formează în intestin atunci când condiţiile de supravieţuire nu sunt prielnice.Infecţioşisuntdoar chiştii
maturi, care conţin patru nuclei (Fig. 10.2).

Fig. 10.2.Chist de entamoeba histolitica: 1-membrana chistică,

2-baghetă siderofilă, 3 - citoplasmă, 4 - nucleu,

5 - cariozom central(desen C. Defta)

Diagnosticul poate fi direct sau indirect

Diagnosticul parazitologic direct constăîn punerea în evidenţă a parazitului sau chistului.

În amibioza intestinalăse face examenul coproparazitologiccu frotiuriumede lamă-lamelă, pentru punerea în evidenţă
atrofozoiţilorşiîn care se remarcăatât dimensiunea, structura căt şi mişcarea parazitului.

Examenul coproparazitologic prin preparatelecu lugollamă-lamelă sunt puse în evidenţăşi chisturile.

Se pot realiza şi preparate colorate AM, Gram, Giemsa.

Prin metoda ELISA pot fi detectatecoproantigenele de entamoeba.

Cultivarea se poate realize pe mediu Löffler modificat, urmat deexaminarea la microscop a frotiurilor lamă-lamelă.

Diagnostic imunologic sau indirect se face în cazul localizărilor viscerale atunci când apar modificări ale
probelor de laborator, spre exemplu hemoleucograma evidenţiază leucoitoză, eozinofilie, neutrofilieiarîn cazul
localizării hepatice amibioza este însoţită şi de citoliză hepatică cu transaminaze crescute.

Se utilizează şi tehnici imagisticeradiologie şi ecografie în funcţie de localizarea bolii, tomografia computerizată


este necesarănumaiîn anumite situaţii.

10.2. Entamoeba gingivalis cunoscutăşi ca E. bucalis


Amibă localizată la nivelulcavităţii bucale,face parte din microbiocenoza cavităţii bucale fiind comensală,
neinvazivăspecifică omului.

Poate deveni patogenă în anumite condiţii fie a uneiigiene deficitare, fie ca urmare a apariţiei cariilor, plăcii
dentare,tartrului dentarla persoanele care au diferite forme de parodontopatiisau în scăderea rezistenţei locale la
nivelul cavităţii bucale.

Din punct de vedere morfologic nu prezintă decât forma de trofozoit, neexistând forma chistică. Trofozoitul are
10-30µ, ectoplasma este clară, endoplasma este granularaşi conţine vacuole digestive cu leucocite, bacterii,
niciodată cu hematii, nucleul este sfericceva mai mic (Fig. 10.3).

Fig. 10.3. Trofozoitul de E. gingivalis: 1- nucleu, 2-cariozom , 3-


vacuolă cu un PMN în interior, 4-PMN ,5-vacuole cu bacterii, 6-
endoplasma granulară,7-ectoplasma clara.(desen C. Defta)

Diagnosticul direct de laborator se realizează prin punerea în


evidenţa a parazitului din produsele patologice provenite de la pacienţi. Produsele patologice pot fi: secreţia
recoltată din şantul gingival, secreţia din şantul parodontal, secreţia din alveola dentară, exudatul faringian, sputa.

În cazul acestui parazit se fac numai frotiuri umede lamă-lamelăîn care parazitul este în suspensie într-o
soluţie de ser fiziologic pentru a-i menţine viabilitatea şi ai observa mobilitatea. Nu se fac frotiuri native colorate cu
lugol deoarece acesta conduce la distrugerea trofozoitului.

Frotiurile colorate se obţin prin tehnica MGG,prin aceasta sunt puse în evidenţă atât amibele căt şi bacteriile
existente în produsul patologic. Pentru e se pune un diagnostic corect privind agentul etiologic implicat în afecţiunile
mai sus menţionate, se faceşi un diagnostic microbiologic.

Aceasta amiba poate fi cultivata pe mediul Löffler iar ceea cerezultăîn urma cultivării poate fi observat la
microscop.

10.3. Giardia duodenalis sau G.lamblia

Este un parazit din categoria protozoarelor flagelate cavitare, intestinale, unicelulare, se deplaseză datorită
flagelilor. Prezintă două forme de existenţă, trofozoitul şi chistul care reprezintă forma de rezistenţăîn mediul extern.

Trofozoitul are următorul aspect: o dimensiune de 10-20µ lungime şi 5-15 µ lăţime, este piriform cu o
extremitate anterioară rotunjită iar cealaltă mai ascuţită. Seamănă cu o pară tăiată pe jumătate, de aceea privită
din profil are o latură plată iar cealalta este convexă. Forma vegetativă prezinta patru perechi de flageli iar pe
partea ventralã(plată) prezintă un disc adeziv cu care adera la
enterocit. Discul adeziv ocupă 3/5 din faţa ventrală a parazitului(Fig.
10.4.).

Fig. 10.4. Trofozoitul de Giardia. 1- perechea de flageli anteriori, 2-


nucleu, 3-3 perechi de kinetosomi, 4- corpii mediani, 5- discul adeziv, 6 – citoplasma, 7-flagel posterior, 8- flagel
lateral, 9- flagel caudal, imaginea din dreapta este privire lateral (desen C. Defta)

Forma de rezistență chistul este oval cu perete gros, lung de 11-14µ și lat de 7-10µ, conține un număr par de
nuclei (2 sau 4) care pot fi plasați fie la extremități fie grupați la un cap.În zona mediană se observă niște structuri
lineare, flexuroase, care sunt flagelii și discul adeziv (Fig. 10.5.).

Fig. 10.5. Chistul de Giardia. 1- nucleul chistului, 2- flagel, 3-perete

chistic.(desen C. Defta)

Fig 10.6. Frotiu lama/lamela din pp., sageata indică chistul de giardia

(foto C.Defta)

Diagnosticul în giardioză este direct şi se efectuează din următoarele produse patologice, lichidul duodenal
şisecreţie biliară obţinute prin tubaj duodenal şi materiile fecale.

Examenul microscopic proaspăt (lamă-lamelă)preparat din lichidului duodenal şisecreția biliară, pe aceste frotiuri
pot fi observați trofozoiţi. Din aceste produse patologice pot fi făcute şi frotiuri Giemsa.

Examenul coproparazitologic se face cu soluţie de ser fiziologic lamă-lamelăîn care se observă trofozoiţii, nu se
folosesc preparatele cu Lugol deoarece trofozoiţii sunt distruşi, în schimb pe aceste frotiuri se pot observa uşor
chiştii (Fig 10.6.).

În cazul rezultatelor negative, dar în prezenţa simptomatologiei caracteristice acestei boli parazitare examenul
se repetăde 4-5 ori în decurs de 7-10 zile. În anumite situaţii examenul coproparazitologiceste completat prin
examinarea frotiurilor colorate Giemsa sau hematoxilină-eozină.
Metoda indirectă de identificare specifică (fiind necesară o singură determinare)este identificarea antigenică
din produsul coproparazitologiccare se face prin reacţia ELISA, contra-imuno-electroforeză, imunofluorescenţă(IF) cu
Ac marcaţi, punând în evidenţă coproantigenele.

Poatefi cultivatăcu scop de cercetare pe mediul Löffler modificat.

În cazul acestei afecţiuni nu se constată modificări ale leucogramei, uneori se remarcă o eozinofilie.

Imunodiagnosticul din sereste irelevant în cazul acestei afecţiuni.

Se recomandă repetarea examenului coproparazitologic la 7 zile după tratament.

10.4. Trichomonas vaginalis.

Este un protozoar flagelat cavitar patogen urogenital, se prezintă numai sub formă vegetativă, boala se
numeste tricomoniazăşi este o boală cu transmitere sexuală.

T.vaginalis este piriform de 18-26µ cu citoplasmă granulară cu un nucleu de dimensiuni mari care prezintă un
cariozom situat central, anterior în vecinătatea blefaroplaştilor din care pornesc 4 flageli polari (de dimensiuni egale)
şi un flagel recurent care dă naştere unei membrane ondulante pe două treimi ale parazitului, cu rol în locomoţie la
fel ca şi flagelii liberi(Fig.10.7.).

Fig.10.7. Trofozoitul de T. vaginalis. 1-nucleu, 2-flageli anteriori, 3- costa, 4-


membrana ondulanta, 5 –axostil,6-axostil posterior, 7- filamentul parabazal, 8- grup
de blefaroplasti, 9 –corpusculi cromatici, 10- citoplasma(desen C. Defta).

Diagnosticul parazitologic constăîn evidenţiereaîn secreţia vaginalăşi uretrală a T vaginalis.


Recoltarea secreţiei vaginale trebuie săîndeplinească următoarele cerinţe: la 48 de ore de la ultimul contact
sexual sau lavaj vaginal, în primele zile postmenstruale, la 6-7 zile de la întreruperea unui tratament cu antibiotice
locale sau sistemice. Recoltarea se face din fund de sac vaginal cu tamponul sau spatulă, iar dacă prelucrarea se
face după 2-3 ore de la recoltare se foloseşte mediu de transport format din ser fiziologic cu glucoză 5%.
Recoltarea secreţiei uretrale se face dimineaţa înainte de micţiunecu ajutorul ansei sau tamponului steril de la
nivelul meatului urinar, fără a se fi adminstrat antibiotic înainte. Se poate folosi şi lichidul prostatic, spermatic pentru
evidenţierea parazituluiîn cazul transpotului se foloseşte acelaşi mediu ca mai sus.

Examenul microscopic se face sub forma preparatelor lamă-lamelă pe care se observă mişcările parazitului, se pot
efectua cu preparate colorate Giemsa. Produsele patologice sărace în paraziţi se pot cultiva pe mediul Löeffler
modificat cu amidon de orez, streptomicină, penicilină, pH 4-5. Pentru un rezultat cât mai concludent se pot folosi
concomitant examenul la microscop însoţit de cultivare.

Pe frotiul Giemsa parazitul are citoplasmă bleu, nucleul este roşu violet, flageliişi axostilul roşu carmin.

Imunoidentificarea prin detectarea Ag-nelor parazitare este o metodămodernăşi sigură de diagnostic.


10.5. Trichomonas tenax sau T. bucalis

Este un protozoar localizat la nivel cavităţii bucale, apare ca făcândparte din microbiocenoza cavităţii
bucalespecifice omului. Se hrăneşte cu microorganisme din biocenoza bucală, contaminarea de la un individ la altul
s-ar face prin picăturile de salivă, nu supravieţuieşte în tractul intestinal sau vaginal.
- Aspecte morfologiceeste piriform de 5-12 m, posedă 4 flageli liberi şi un
flagel recurent pe marginea membranei ondulante, deține axostil cost şi un
nucleu(Fig 10.8.).

Fig. 10.8. Trichomonas denticola: 1- flageli liberi, 2- nucleu, 3- axostil, 4-


membrane ondulantă, 5-axostil posterior, 6-filament parabazal, 7-costa, 8-grup
de blefaroplaşti(desen C. Defta).

- A putut fi identificat în biofilmul dentar, în unele cavităti ale dinţilor cariaţi,


celulele necrozate şi criptele amigdaliene,nu a fost dovedităimplicarea
directă în producerea biofilmului dentar sau tartrului şi nici a cariilor sau în
alte afecţiuni patologice orale.

- Cu toate acestea T. tenax(bucalis) este de regulă întâlnit la persoanele care au o afecţiune patologică la
nivelul cavităţii bucale sau în proximitatea acestei cavităţi.La persoanele cu igienădeficitară se
remarcăprezenţa luiT. tenaxîn cavitatea bucală.

10.6.Toxoplasma gondii.

Face parte din clasa Sporozoare care prezintă următoarele caracteristici:are capacitatea de a se reproduce
atât asexuat (schizogonie) cât şi sexuat (sporogonie).În urma multiplicării sexuate, rezultă oochistul care dă naştere
după maturare sporozoiţilor.Sporozoarele au o localizare intracelularaîn cel puţin unul dintre stadiile evolutive.

Gazda definitivă adăposteşte sporogonia, iar gazda intermediară adăposteşte schizogonia.Toxoplasma gondiiîn
patologia umană ocupa un rol important.

Se găseşte sub 3 forme:trofozoit, chist tisular şi oochist;primele două forme se găsesc în organismul uman,
animale (mamifere şi păsări), care sunt gazdele intermediare ale parazitului, oochistul se găseşte la pisică–care este
gazda definitivă a parazitului.

Aspecte morfologice

Trofozoitul (tahizoiţi, endozoiţi)este forma vegetativă,semilunară are un capăt mai


rotunjit,cealalatăextremitateeste mai ascuţitacu o dimensiune de 4-8 µm / 2-3 µm.Are localizare intracelulara şi nu
se multiplică extracelular sau pe medii artificiale.Prin colorare Giemsa are nucleul roşu şi citoplasma bleu (Fig. 10.9.)
Fig. 10.9. Trofozoit de Toxoplama gondii: 1 - conoid, 2 - roptrii, 3 - granule
dense,4 - apicoplast, 5 - complex Golgi, 6 - reticul endoplasmic, 7 -
mitocondrie, 8 - membrana internă, 9 – por, 10 – nucleu (desen C. Defta).

Oochistul se formeazăîn intestinul felinelor infectate şise elimină prin


fecaleîn funcţie de condiţiile de mediu (temperatură,umiditate), sporulează în
câteva zile, poate supravieţui în mediul extern până la 18 luni. Conţine 2
sporochişti iar aceştia conţin la rândul lor, fiecare câte 4 sporozoiţi (formele
infectante)şi are o dimensiune de 12 µm (vezi Fig.10.10).

Fig. 10.10. Oochist: 1-oochistul, 2-sporochişti, 3-sporozoiţii (desen C. Defta)

Chistul tisular se poate localiza în orice ţesut dar cu tropism pentru:ţesutul nervos, ochi, muşchi.Conţine mii
de bradizoiţi (hipnozoiţi fază dormindă), poate atinge 100 µm şi poate persista toată viaţa, fără manifestări clinice
(Fig. 10.11).

Fig. 10.11. Chist: 1 - chist tisular, 2 - bradizoiţi (chistozoiţi)(desen C. Defta)

Diagnosticîn cazul infestării cu T. gondii poate fi pus prin metode directe dar şi indirecte.

- Metodele directe constau înevidenţierea parazitului sau se realizează izolarea acestuia, astfel se folosesc
prelevările de la nivelul ganglionar, muscular, SNC -LCR, cordonului ombilical, placentă sau probe prelevate după
necropsie, constând în ţesuturi de la fetuşi avortaţi spontan sau decedaţi intrauterin.
Se efectuează frotiuri sau preparate histo-patologice din produsele patologice enumerate, de regulă sunt colorate
Giemsa astfel se pot evidenţia tahizoiţii sau chisturile tisulare.
- Metodele indirecte de diagnostic sunt cele uzuale, depistând anticorpi sau antigene de T. gondii prin teste cu
diferite principii de acţiune:
• reacţiile de imuno-fluorescenţă indirectă, dozând IgM (testul Remington) şi IgG;
• recţia de hemaglutino-inhibare;
• testul Sabin-Feldmann (Dye Test) este o metodă foarte laborioasă, se utilizează inocularea la şoarecii de
experienţă;
• reacţiile imunoenzimatice (ELISA);
• testul ISAGA (immunosorbent agglutination assay).
Dintre tehnicile moderne care pot depista antigenele parazitare, se utilizează PCR-ul (reacţia de amplificare
genică) şi Western blotul (immuno-blotting-ul).
În cazul femeilor ce doresc un copil, statusul serologic faţă de parazit trebuie să fie determinat înainte ca femeia
să rămână însărcinată. Astfel prezenţa Ac IgG şi absenţa Ac IgM indică o infecţie cronică dar şi faptul că fătul va fi
protejat faţă de infecţie prin Ac IgG de la mamă (trecând prin bariera placentară).
Se recomandă ca determinarea titrului de anticorpi să se facă în dinamică la 3-6 săptămâni pentru a certifica
stabilitatea concentraţiei Ac de tip IgG. În lipsa Ac IgM cu un titru foarte înalt al Ac IgG, care creşte în dinamică,
poate indica o infecţie relativ recentă sau o reactivare a bolii.
În situaţia prezentatăse recomandă efectuarea concomitenta a două metode de diagnostic, cu principii diferite,
sau care folosesc antigene diferite. Exemplu testul de aviditate IgG, test care permite aprecierea „vechimii” infecţiei,
înainte sau după 20 de săptămâni, interpretare corelată cu momentul concepţiei.
Prezenţa Ac specifici IgM, IgA sau IgE la făt sau la nou-născut, pune diagnosticul de toxoplasmoză congenitală şi
pentru că nu pot străbate bariera înseamnă că sunt sintetizaţi de către făt.
Prezenţa Ac IgG la nou-născut, în lipsa Ac de tip IgM, nu se poate pune diagnosticul de toxoplasmoză congenitală
deoarece ei provin de la mamă şi pot rămâne în organismul nou-născutului şi sugarului, până la vârsta de 1 an.
Se poate pune diagnosticul de primoinfecţie şi în cazul seroconversiei, adică a unei serologii iniţial negative
pentru T. gondii (absenţa Ac IgM şi IgG) cu apariţia acestor Ac pe parcursul sarcinii.
În toate situaţiile în care se pune diagnosticul de primoinfecţie în timpul sarcinii, se recurge la tratamentul cu
spiramicină pe toată durata sarcinii, pentru a evita propagarea infecţiei la produsul de concepţie.
Cea mai frecventa „infecţie reactivată” este toxoplasmoza oculară in care titrul Ac IgG este scăzut şi nu există Ac
IgM. O serologia pozitivă în sângele periferic ce dovedeşte prezenţa în organism a T. gondii, poate fi responsabil de
leziuni cu localizare oculară în peste 80% dintre cazuri,cel mai frecvent în polul posterior ocular.

LUCRAREA PRACTICĂ 11

11.1Diagnosticul de laborator în infecțiile produse de: Platelminţi


Platelminţii sau viermii plaţi, care pot fi nesegmentaţinumiţi trematode(Fasciola hepatica) şi viermii plaţi segmentaţi
numiti cestode (Teniile)

- Trematode
11.1.aFasciola hepatica
Adultul este plat, nesegmentat, foliaceu (seamănă cu o frunză), hermafrodit, cu tub digestiv incomplet, cu două
ventuze pe faţa ventrală cu ajutorul cărora se fixează de peretele canaliculului biliar unde parazitul se răsuceşte „în
cornet”, are dimensiunea de 1,5 – 3/ 1,3 cm.
Corpul este acoperit de o cuticulă cu spini orientaţi antero-posterior, care ajută la înaintarea în căile biliare şi în
acelaşi timp împiedică întoarcerea parazitului ( Fig 11. 1.a. 1)
(Fig. 11. 1.a. 1. Fasciola: În stânga Fasiciola schemă; 1-ventuze de prindere, 2 - corp foliaceu, 3 - sistem

digestiv incomplet. În dreapta imagine macroscopică (desen şifoto C.Defta)

Oul este mare, de formă ovală, cu coajă subţire, operculat, cu diametrul de circa 150 µm, conţine o masă de celule
viteline şi celula ou. El nu este embrionat în momentul eliminării din gazda definitivă, în această situaţie nu este
infecţios (Fig. 11.1.a. 2)

Fig. 11.1.a. 2. Oul:în stânga desen ou de fasciola; 1- opercul, 2-celule viteline, 3- celula ou. În dreapta

imagine microscopică a oului pe un preparat lamă-lamelă (desen şi foto C.Defta)

Diagnosticul poate fi direct sau indirect astfel:

Diagnosticul direct se va pune prin evidenţierea ouălor caracteristice produse de Fasciola hepatica
coproparazitologic din materiile fecale, sau prin examenul microscopic al lichidului duodenal, sau din bilă.

Acest tip de diagnostic cu evidenţierea oului este valabilă numai în momentul în care parazitul a ajuns în faza
de adult, aproximativ în 3 luni de la infestare.

În scaunul pacientului pot să apară „ouă de pasaj”, atunci când se consumă ficat de vită insuficient preparat
termic, care conţine paraziţi. I se recomandă pacientului să ţină un regim fără carne şi să repete examenul
coproparazitologic.

Diagnosticul indirect, imunologic, poate fi realizat în toate fazele bolii parazitare. Se pot depista anticorpi
specifici anti- Fasciola hepatica prin diferite tehnici:

- imunoenzimatice (ELISA);

- imuno fluorescenţă;
- contra imuno electroforeză;

- hemaglutinare;

- dublă difuzie;

În această afecţiune un semn distinct de laborator este prezenţa eozinofilia,cu următoarele semnificaţii:

înregistreazăvalori mari în perioadele de migrare a parazitului prin ţesuturi (20-40%) şi valori ceva mai mici de
10% în perioada de cronicizare a bolii.

Diagnosticul imagistic este tot un diagnostic indirect care se realizeaza prin ecografie abdominală,
colangiografie retrogradă, tomografie computerizată şi are un rol important în perioadele în care nu există încă ouă
în scaun, dar pacientul este simptomatic.

- Cestode
Cestodele sunt viermii plaţi, segmentaţi în careforma adultă este alcătuită din:cap (scolex) ce prezintă
ventuze, cârlige sau botridii, gâtul care dă naştere segmentelor corpului - proglotele,corpul sau strobila, alcătuit din
totalitatea proglotelor cu vârste diferite.
Proglotele au aspect caracteristic speciei în cazul celor adulte; cele tinere sunt în apropierea gâtului, cu
structură internă nediferenţiată în timp ce proglotele adulte sunt mai mari, au aparat reproducător bine diferenţiat
iar cele terminale „bătrâne” au uterul plin cu ouă. Acestea se desprind şi se elimină odată cu materiile fecale în
exterior (gâtul generează noi proglote).

11.1. b. Taenia solium.


Taenia solium produce tenioza, boală manifestată prin prezenţa adultului în intestinul uman şicisticercoza,
manifestată prin existenţa formei larvare frecvente la porc dar şi în ţesuturile umane.
Adultul are un scolex de circa 1 milimetru prevăzut cu 4 ventuze şi 50 de cârlige dispuse pe două rânduri,este
un vierme plat, segmentat, de aproximativ 5 metri, alb, cu aproximativ 1000 de proglote.
Proglotele mature au un raport lungime-lăţime de 3 la 1. Proglotele gravide au uterul situat median,
ramificaţiile primare uterine sunt în număr de 5-10 şi se descriu şi ramificaţii secundare, de tip dendritic, nu are
orificiu de comunicare cu exteriorul şi adăposteşte aproximativ 50.000 de ouă (Fig. 11. 1. b. 1.).
Proglotele se elimină pasivodată cu scaunul în lanţuri mai scurte sau mai lungi, la intervale neregulate de
timpsunt imobile, având o musculatură redusă. Eliminările spontane de proglote pot fi declanşate de consumul de
condimente sau de alcool care pot determina contracţia spastică a parazitului.

Fig 11. 1. b.1.În stânga:1- cârligele scolexului, 2-ventuze, 3- gât, 4- proglote tinere, 5 - proglotă matură, în
dreapta imaginea macroscopica a parazitului(desen şi foto C.Defta)
Oul de T. solium este rotund, are o dimensiune cuprinsăîntre35-45 µm, cu o coroană striată periferică şi un
embrion hexacant situat în interior. Oul este embrionat în momentul eliminării şi este infecţios atât pentru porc cât
şi pentru om (Fig. 11.2.b.).
Larva se numeşte Cysticercus cellulosae şi este o larvă monochist, monocefală, are aspect de veziculă
translucidă, poate ajunge la o dimensiune de 2 centimetri, conţine un lichid cu aspect limpede şi cu scolexul
invaginat.

Fig. 11.1 .b. 2.Oul. În stânga schema:1- înveliş extern albuminos, 2- înveliş gros radiar, 3- embrion hexacant, 4-
bule viteline; în dreapta imaginea microscopică a unui frotiu umed lamă/lamelă(desen şi foto C.Defta)

Diagnosticul în tenioze poate fi direct prin punerea în evidenţă a ouãlor şi indirect prin metode imunologice şi
imagistice.
Diagnosticul directîn tenioză, prin examen coproparazitologic, se pot evidenţia ouă de T. soliumîn aproximativ
10% dintre cazuri.
Ca urma a ruperii accidentale a proglotelor în momentul eliminării, ouăle pot deveni vizibile contaminând
scaunul. Prin metode de concentrare cunoscuta ca metoda Kato-Miura cresc şansele de a evidenţia ouăle în
examenul coproparazitologic.Poate fi utilă în scop diagnostic şi studierea proglotului eliminat pasiv, această
examinare ajută la stabilirea speciei.
Cea mai indicată pentru diagnosticul teniozei este metoda Graham sau amprenta anală “scotch-test”, în care
recoltarea se face cu ajutorul unei benzi transparente de scotch aflata pe o baghetă de sticlă,dimineaţa de la nivelul
pliurilor anale, înainte de scaun şi de toaleta locală. Banda astfel obţinută se pune pe o lamă şi se examinează la
microscop. Se pot observa ouă de T. solium.

Diagnosticul indirect
În neurocisticercoză (larvele aflate la nivelul SNC)se coroborează datele obţinute prin metode imagistice
(computer tomografie, rezonanţă magnetică nucleară), cu cele obţinute prin diagnosticul imunologic, prindepistarea
în ser aanticorpilor anti-Cistercus cellulosae în LCR, prin tehnici de tip ELISA şi urmărind aceste date, în dinamică,
pe parcursul tratamentului bolii.
În cisticercoza oculară se folosescaceleaşi tehnici imagistice,tomografia cerebrală, RMN-ul cerebral dar şi
ecografia oculară. În acest caz, se vor căuta anticorpii în umoarea apoasă.
Pentru formele musculare de cisticercoză se efectueaza biopsia musculară, cu realizarea de secţiuni histo-
patologice care vor fi examinate. Examenul serologic se face folosind sânge periferic. Pentru completarea
diagnosticului se pot face radiografii de părţi moi, când se vizualizează bine formele cu calcificări.

11.1.c. Taenia saginata.


Adultul are o strobilă de 6-8 m sau chiar şi de 10 metri, are aproximativ 2000 de proglote, scolexul are 4
ventuze, nu are cârlige iar dimensiunile acestuia sunt de aproximativ 2 mm. Proglotele terminale au raportul
lungime-lăţime de 5 la 1, o lungime de aproximativ 3 centimetri, uterul este median, are mai mult de 16 ramificaţii
uterine primare care se divid dihotomic şi se termină în fund de sac fiecare proglot conţine aproximativ 100.000
ouăşi nu prezintă orificiu de eliminare al ouălor ( Fig 11.1.c.)

Proglotul este musculos, mobil, poate forţa sfincterul anal şi se poate elimina în afara defecaţiei

Fig 11.1.c. T. saginata: în stânga schema parazitului; 1 – ventuze, 2 – scolex, 3 –proglote tinere, 4 - proglot matur.
În dreapta imagine macroscopică a parazitului (desen şi foto C.Defta)

Oul la examenul microscopic obişnuit nu se poate deosebi de oul de T. soliumfiind foarte asemănător cu
acesta, are in jur de 40 µm, o coroană striată periferică şi în interior un embrion hexacant . Oul este infecţios pentru
bovine fiind gazdele intermediaraale parazitului. Gazda definitivă, care poate adăposti parazitul adult, este omul.

Larva se numeşte Cysticercus bovis este o larvă monochist, monocefală, are aproximativ 1 centimetru şi
aspectul unei vezicule cu scolex invaginat.

Diagnosticul în linii mari este asemănător cu al teniozei data de T solium.

Spre exemplu :- examenul microscopic al amprentei anale -metoda Graham, metodă de elecţie în tenioza cu T.
solium şi T. saginata.Mai rar pot fi evidenţiaţi prin examen coproparazitologic, când se examinează materiile fecale
prin metode de concentrare Kato-Miura.

- examenul macroscopic al proglotului care este musculos, mobilşi care iese în apropiera anusului

Evidenţiindu-se cu raportul 5/1 între lungime şi lăţime.

11.1.d. Diphyllobotrium latum (Botriocefalul)


Diphyllobothrium latum sau„tenia cu spină” este cea mai lungă tenie umană poate ajunge până la 13 m. Are
un scolexul în formă de migdală, prezentând două fante laterale numite botridii cu rol de ventuze, cu care se
ataşează de mucoasa intestinului subţire. Strobila cuprinde 4000 de proglote, proglotele terminale sunt mai mult
late decât lungi, au un uter median rozetat, lipsit de ramificaţii uterine clasice care comunică cu exteriorul printr-un
orificiu numit tocostom.(Fig. 11. 1 d. A.)
Oul de Diphyllobothrium latumeste oval cu undiametrul de 70 / 45 µm, operculat la o extremitate iar la
cealaltă extremitate prezintă un pinten numit carenă. În interiorul oului există celula ou şi o masă de celule viteline,
uşor de identificat la examenul coproparazitologic,acesta este neembrionat şi neinfecţios în momentul eliminării (Fig.
11. 1 d. B)

Fig. 11. 1 d. A. Diphilobotryum: în stânga desenul scolexului:1-botridii, 2 -scolex, 3 - gât. În dreapta imaginea
parazitului(desen şi foto C.Defta)

Fig. 11. 1 d. B. Oul de Botriocefal: în stanga; 1- celula ou,2- opercul,3- membrana, 4- carena, 5- celulele viteline. În
dreapta imaginea microscopica pe un frotiu lamă-lamelă (desen şi foto C.Defta)

Diagnosticul este pus prin examenul coproparazitologic deoarece ouăle se elimină în mod constant şi în număr
mare în intestin.Proglotele apar în situaţii rareîn materiile fecale,doar dacăpacientul a consumat condimente şi astfel
este stimulată contracţia spasticăa parazitului. În mod normal, proglotul se dezintegrează în intestindupă eliminarea
ouălor.
În cazul acestei parazitoze hemoleucograma evidenţiază anemie macrocitară, reticulocitoză, leucopenie cu
neutropenie, trombocitopenie, eozinofilie şi un VSH-ul accelerat. Se constată hipergamaglobulinemie şi
hipoalbuminemie.

11.1.e. Echinococcus granulosus.


Adultul este un cestod mic, de 4-6 milimetri, format din scolex cu 4 ventuze şi o coroană dublă de cârlige, gât
şi strobilăcu 3 proglote. Primul proglot de lângă gât este tânăr, cu organe genitale imature, al doilea este un proglot
matur, cu organe genitale dezvoltate. Cel de al trei-lea are uterul plin cu ouă embrionate, aproximativ 500-800.
Ouăle embrionate sunt infecţioase atât pentru ierbivore cât şi pentru om.
Oul asemănător cu oul de Taenia solium şi Taenia saginata,este rotund de aproximativ 40 µm, cu o coroană
striată periferică şi un embrion hexacant în interior (Fig 11.1.e.).
Larva este cunoscută sub denumirea de hidatidă sau chist hidatic este polichistică şi policefalică, se dezvoltă în
gazda intermediară “normală” reprezentată de oi, vaci şi porci. La om se poate dezvolta accidental cel mai frecvent
cu localizare hepatică şi pulmonară, dar poate fi observată practic în orice organ. Are dimensiuni variabile în funcţie
de vârstă şi de ritmul de creştere, între 1 şi 5 centimetri pe an. Formarea protoscolecşilor necesită o durată mai
mare de 1 an.

Fig. 11.1.e.Ecinococcus granulosus: adultul în stânga; 1- carlige, 2- ventuze, 3- scolex, 4- proglotă 1 tânără, 5 –
proglota a 2-a matura, 6- proglota a 3-a matură cu ouă. Chistul hidatic în dreapta 1- ţesutul gazdă, 2- adventicea,
3- membrana cuticulară, 4- stratul germinativ, 5- capsula proligeră , 6- veziculă fiică liberă(desen C. Defta)

Diagnosticul în infestarea cu E. granulosus poate fi direct prin punerea în evidenţă a chistului hidatic şi indirect
prin metode de laborator.
Diagnostic direct. Boala se numeşte hidatidozaşi este descoperită de cele mai multe ori de un examen radiologic
de rutina în special la nivel pulmonar apărând ca o opacitate netă, omogenă, rotundă, cu contur net în parenchimul
pulmonar carenu se calcifică. Comparativ cu chistul hepatic care în 50% din cazuri, prezintă o margine subţire de
calcifiere.
Pentru precizarea diagnosticului de hidatidoză trebuie coroborate, datele clinice, imagistice şi serologice.
Din punct de vedere imagistic pot fi utile:
- Ecografia reprezintă metoda de elecţie pentru toate localizările, cu excepţiacelor toracice;
- Examenului radiologic i se adaugă o varietate de metode imagistice sensibile care diferenţiază chistul hidatic de cei
de altă natură.Radiografia toraco-pulmonară de faţă, urmată uneori cu imaginea de profil pentru evidenţierea
localizărilor pulmonarefiind vizibile ca o opacitate omogenă, rotundă, cu contur delimitat net în cazul chisturilor
hidatice compacte sau cu nivel hidro-aeric în cazul chisturilor hidatice parţial evacuate.
- Examenul CTpoate evidenţia mai multe detalii ale hidatidozei, decelează chistul hidatic cu dimensiuni mai mici de 1
centimetru, permite aprecieri cu privire la conţinutul chistic. Se foloseştesubstanţă de contrast în special la formele
peritoneale şi retro-peritoneale, în hidatidoza secundară sau în cazul recidivelor postoperatorii, localizări cerebrale,
de orbită, osoase. În diagnostic,examenul CTcompletează util atât examenului ecografic cât şi monitorizarea
tratamentului chistului hidatic, decelează apariţia complicaţiilor: abcese, fistule, rupturi, etc.
- RMN foarte util în anumite localizări cerebrale, în recidivele postoperatorii, în localizările multiple intra-abdominale
şi retro-peritoneale, musculare, osoase şi în cazul, în care se renunţă la o nouă intervenţie chirurgicală şi se face
monitorizarea evoluţiei sub tratament antiparazitar (valabil şi pentru tomografia computerizată).
-Arteriografia este utilă numai în faza preoperatorie, furnizând chirurgului o hartă vasculară completă
indispensabilăîn cazul unei hepatectomii.
- Puncţia exploratorie este contraindicată atunci când se suspicionează boala hidatică, datorită riscului diseminării
hematogene local sau la distanţă (urmată de recidivă).
Diagnosticul indirect, imunologic, completează diagnosticul imagistic şi constăîn detectarea anticorpilor
specifici în serul bolnavilor printr-o serie de tehnici de tipul:
- reacţiei de hemaglutino-inhibare,
- reacţiei de imuno-fluorescenţă,
- contra imuno electroforeză în care se detectează anticorpii faţă de antigenul 5 specific parazitului.
- latex-aglutinare,
- reacţiei imunoenzimatice (ELISA).
Un procent de 10% sau chiar 20% dintre bolnavi pot să aibă serologie “negativă” pentru antigenele lui E.
granulosus, majoritatea dintre aceştia având chistul hidatic localizat la nivel pulmonar, la nivel cerebral sau la
nivel ocular;
Acelaşi răspuns “negativ” se poate întâlni la bolnavii cu chisturi hidatice calcificate deoarece aceștia încetează
de a mai stimula antigenic gazda de multe ori, examenul serologic este negativ şi la copii.
Fisurarea sau ruperea chistului hidatic este urmată de o stimulare bruscă a titrului de anticorpi sau de o
seroconversie (examen “negativ” urmat de examen “pozitiv”).
Post-operator se poate înregistra seroconversia sau creşterea semnificativă a titrului anticorpilor anti-E.
granulosus. Reacţiile serologice pot contribui la monitorizarea în dinamică a bolnavilor, după operaţie. După
creşterea tranzitorie a titrului anticorpilor anti-E.granulosus, post-operator, apare de regulă o scădere progresivă
pe parcursul a circa 1 an; o nouă ascensiune a titrului anticorpilor, ridică suspiciunea de recidivă.
Un procent important dintre pacienţii operaţi de chist hidatic pot să prezinte timp de ani de zile valori pozitive
a titrului anticorpilor anti-E. granulosus,.
Testele de confirmare a hidatidozei se pot face numai în laboratoarele specializate şi implică următoarele tipuri
de analize:
- reacţia de dublă difuzie cu identificarea antigenului 5 (din celulele parenchimatoase ale protoscolecşilor
şi în veziculele proligere),
- reacţia de imuno electroforeză cu identificarea aceluiaşi antigen,
- determinarea IgG4 prin tehnici de tip ELISA,aplicarea tehnicii Western blot pentru diferite antigene
specifice

11.2. Nematode
Sunt viermi cilindrici, au sexe separate.Femela este mai lungă decât masculul si are extremitatile corpului

Drepte, în timp ce masculul are capătul terminal răsucit „în cârjă”.Au aparat digestiv complet.

11.2. a. Ascaris lumbricoides. (Limbricul)


- Adultul cel mai mare nematod parazit la om.

- Femela are o lungime de 20-25 cm şi diametru de 6-7 mm iar extremitătile sunt drepte şi ascuţite.

- Masculul are olungime 10-17 cm şi diametru de 4 mm la capătul anterioreste ascuţitiar cel posterior este răsucit în
formă de “cârje”.

- La capătul anterior se află capsula bucalăce prezintă 3 buze cu margini dinţate cu care se prinde de mucoasa

intestinală.

- Oul produs de femelă poate fi nefertil atunci când nu există un mascul în intestine.
-Aspectul oului nefertil: este mare de 90µm, mai colţuros, cu învelis mamelonat, de culoare galben brun, cu

conturul amorf care umple complet oul.

-Oul fertil este tot oval de dimensiuni mici 65-75/30-50 µm, culoare galben-brun, înveliş mamelonat extern cu rol

de membrană protectoare externă, sub aceasta exista un strat incolor gros, iar în profunzime se află o membrană
subţire

În profunzime se află celula ou care nu umple comple oul (Fig 11.2.a)

-Ambele tipuri de celule sunt eliminate odată cu materiile fecale.

Fig 11.2 a. Ascaris ou şi adult. Pornind din stânga prima imagine e un ou fertil, a doua imagine reprezintă un ou
nefertil, în ultima imagine este un adult mascul cu extremitatea posterioara in carje(foto C.Defta)

Diagnosticul în ascarioză

Pentru diagnosticul ascariozei se efectuează un examen coproparazitologic, care poate evidenţia ouă fertile
sau nefertile cu aspectul descris mai sus prin examen microscopic direct, sau examen coproparazitologic realizat
prin tehnici de concentrare urmat de examinarea microscopică. Pentru a pune in evidență ouale este necesarca
parazitulsă ajungă la stadiulul de maturitate (producător de ouă).

În timpul „pneumoniei verminoase” se examinează sputapentru a evidenţialarvele.

Adultul poate fi eliminat prin anus fie viu, în perioadacât traieşte în intestin (1-2 ani), sau mort şi poate fi prezent în
materiile fecale, putând fi recunoscut ca femelă sau masculdupăcaracteristicilor prezentate. Uneori, în timpul
intervenţiilor pe tractul digestivintraoperator, pot fi descoperiţi adulţi de Ascaris lumbricoides.

Hemoleucograma este modificată manifestând eozinofilie cu valori mai mari în timpul perioadei de migrare tisulară
şi scade sub 10% în perioada în care parazitul este localizat intestinal.

Examenul după tranzitul baritat permite evidenţierea unui „defect de umplere” la nivel intestinal. Uneori, se pot
vizualiza paraziţii adulţi, prin endoscopie efectuată la nivel digestiv superioar.

11.2. b. Toxocara spp.

- Adultul are câţiva cm lungime,o grosime de 1 mm seamănă cu Ascarisul fiind cilindric, alungiţi de culoare gri

prezintă 2 aripioare laterale la extremitatea cefalică.

- Oul:oval, 80 microni, perete subţireeste neembrionat şi neinfecţios în momentul eliminării (Fig.11.2.b.)


Fig.11.2.b.Toxocara.Ou –stânga, adulţi – dreapta(foto C.Defta)

Diagnosticul în toxocaroză

Toxocaroza la om este dată de prezenţa în diverse organe a formelor larvare ale toxocarei sp. care nu ajunge
în faza de adult,în organismul uman.Rămâne în fază larvară dând sindromul de larva migrans visceralis care este
stabilită de obicei pe criteriiclinice, ce implică anamneza, tehnici imagistice şi analize imunologice.

Anameza furnizează informaţii importante legate de contactul pacientului cu animale parazitate, dacă nu
urmează regulile de igienă, sau accidental a ingerat pământ.

Tehnicile imagistice implică:

- Radiografia pulmonara care pune în evidenţă infiltratele pulmonare, care apar ca rezultat al migrării larvelor
prin parenchimul pulmonar.

-CT-ul şi ecografia abdominală care evidenţiază afectările viscerale prin aspectul neomogen al parenchimului
datorită granuloamelor eozinofilice perilarvare.

Diagnosticul serologic poate evidenţia prezenţa anticorpilor prin tehnicile următoare:reacţia de precipitare,
reacţia de aglutinare,RFC, ELISA, IF, tehnica Western blot.

Ac de tip Ig M ar stabili o formă acută, dar în această afecţiune IgM poate persista timp de 8-12 luni.

În cazul Ac IgG testul de aviditate poate arăta daca infecţia este mai recentă sau mai veche.

Western blot din LCR poate confirma sau infirma parazitoza cerebrală.

În diagnosticul sindromului de LMV un rol important îl are prezenţa leucocitozei însoţită de eozinofilie. Dar pot
fi luate în consideraţie şi alte date de laborator,cum sunt creşterea transaminazelor, creşterea altor enzime datorită
colestazei, citolizei musculare, hipergamaglobulinemiei, apariţia diferiţilor reactanţi de fază acută, aceste date sunt
asociate cu diagnosticul serologic pozitiv pentru emiterea unui diagnostic real.

Un alt diagnostic important este dat şi de identificarea larvelor în sputăsau în granuloamele eozinofilice
tisularesau a nodulilor hepatici.

În toxocaroza oculară cunoscută ca sindromul de larva migrans ocularis (LMO) pot apare semne similare ca în
LMV, dar existăşi situaţii în caresingurele manifestări sunt cele oculare. În acestă situaţie diagnosticul constăîn
ecografii oculare, CT cranian, angio-fluorografia și diagnosticul imunologic. Tehnicile de lucru imunologice implică
reacția ELISA, test Western blot, PCR din ser dar și din umoarea apoasă.

11.2. c. Enterobius vermicularis (Oxiurul)

Este un vierme cilindric mic, albicios, femela are 1 cm cuextremităţile drepte,porţiunea mediană mai groasă
datorită celor 2 utere pline cu 15 000 ouă, porţiunea posterioară subţire ca un vârf de aţă, masculul are 3-5 mm cu
extremitatea posterioară răsucită “în carje” şi un spicul terminal.

Extremitatea anterioara atât la femelă cât şi la mascul prezintă un buton cefalic cu care se ataşează de mucoasa
cecului.
Oul – oval, plan convex, cu înveliş dublu, transparent prin care se poate vedea embrionul giriniform cu corp oval
şi prelungire ca o coadă. În 1-4 ore embrionul trece în forma larvarăinfecţioasă(Fig. 11.2.c)

Fig. 11.2.c.
Oxiurul:oul cu larva giriniformăstânga iar în dreapta femela adult(foto C.Defta)

Diagnosticul în enterobioză

Examenul direct coproparazitologic poate evidenţia ouăle în 10-15% dintre cazuri. Se pot observa, uneori,
viermii adulţi în materiile fecale, mai ales după scaune diareice, sau după ce au început să ia un tratament
antihelminticfie după consumul unor alimenta. Mamele pot vedea paraziţii adulţi în pliurile mucoasei anale, la copil,
dimineaţa, atunci când fac toaleta locală a acestuia sau cand copilul acuză mâncărimi în această zonă.
O alta metoda de investigaţie este examenul amprentei anale prin metoda Graham,în care recoltarea se
efectueazăcu o bandă de scotch transparentăînfăşurată pe o bagheta de sticlă, care se aplică în zona anală
dimineaţa, înainte de defecaţie şi toaleta locală imprimându-i o mişcare sus-jos, dreapta-stânga şi apoi se
examinează la microscop. Seaşează banda de scotch pe o lamă adăugând şi o picătură de soluţie salină fiziologică
sau glicerină realizând un preparat lamă lamelă. Această metodă permite creşterea semnificativă a diagnosticului
pozitiv, care ajunge la circa 50% din prima examinare.

LUCRAREA PRACTICĂ 12

12. 1. Norme privind recoltarea şi transportul produselor patologice în vederea efectuării diagnosticului
de laborator în viroze.

Să fie efectuată de către personalul instruit în acest scop.

- Să fie realizată cât mai precoce în raport cu debutul bolii.

- Să ofere un eşantion reprezentativ, în cantitate suficientă, din produsul patologic în care este cel mai plauzibil să
fie depistat agentul etiologic viral.

- Să fie făcută cu instrumentar steril, în recipiente sterile, respectând cu stricteţe normele de asepsie.

- Cu unele excepţii spre exemplu LCR, unde probele sunt prelucrate imediat după recoltare.

Probele se introduc în recipient cu mediuconservant, tamponat (ex. mediul Hanks cu albumină bovină 2-4%,
penicilină, streptomicină, nistatin, griseofulvină). Recipientele cu probe se etichetează corespunzător şi cu excepţia
sângelui, sunt congelate,preferabil la -70oC.
- Proba este însoţită de buletinul de analize corespunzător, completat.

- Timpul de la recoltare până la efectuarea examenului virusologic va fi scurtat la maximum. Recipientele cu probe

se transportă în casolete metalice, închise ermetic.

- Pe perioada transportului şi până la examinare, probele vor fi congelate.

- Produse patologice: secreţiile faringiene şi nazofaringiene se prelevează cu tampoane prin spălare naso-

faringiană are valoare şi pentru virusul rujeolic.

-Secreţia salivară este importantă pentru Citomegalovirus, Virusul urlian imediat după debutul bolii.

-Sputa, aspiratul traheobronşicîn cazul virusurilor gripale, paragripale şi rhinovirusurilor.

- Secreţia conjunctivală pentru adenovirusuri, v. coxsakie, v.rujeolic.

- LCRîn meningite, meningoencefalite; se recolteaza prin puncţie în zona lombară pentru v.rubeolei, rujeolei,

EBV, Herpes Simplex Virus, Citomegalovirus.

- Sângele sau ser pentru punerea în valoare a anticorpilor anti virusurile infectante.

- Materiile fecale recoltarea în coprocultoare pentru enterovirusuri (când boala se manifestă)şi rotaro virusuri,

recoltarea se face cu sonde şi tampoane care se decarcăîn soluţie nutritivă sau de transport.

- Crustele şi lichidul din vezicule şi pustule prin puncţie sterilăcu seringa, pipeta Pasteur sau tampoane pentru

herpes virus, varicella zoster, vaccina.

- Urina se recoltează din emisia spontană după igiena riguroasă a zonei, sau cu sonde iar transportul în

urocultoare, pentru virusul urlian la sfârşitul bolii.

- Secreţiile uretrale cu tampoane sterile sau pipete Pasteur şi secreţiile de col uterin recoltatea cu tampoane

sterile pentru papiloma virus şi v. herpetice

- Probe biopsice din ggl. limfatici, maduva osoasă, ficat, recoltarea se face prin puncţie sterilă de către persoanele

calificate pentru a pune în evidenţă agentul viral implicat.

- Probe necroptice fragmente de organ ficat, splină, pulmon, ganglion, rinichi se introducîn recipiente de

Conservare, transportul se face cât mai rapid la 40C sau se păstrează la -700C.

12. 2. Metode de cultivare a virusurilor.Virusurile se replicănumai în celula vie, cele trei sisteme care permit
replicarea virusurilor sunt culturile celulare, oualele embrionate şi animalele de laborator.

A. Izolarea virusurilor pe Culturi Celulare.Culturile celulare sunt reprezentate de celule dispersate obţinute cu
ajutorul unor enzime proteolitice şi care sunt plasate într-un mediu nutritive sunt capabile să supravieţuiascăşi să se
multiplice.

Elementele esenţiale ale unei culturi celulare sunt celulele vii şi mediul nutritiv.

Celulele vii -se obţin din ţesuturi umane adulte normale, ţesuturi embrionare şi neoplazice.

-Ţesutul adult dă culturi de tip epitelial, cu celule poligonale care formează de obicei placarde;

-Tesutul embrionar care dă de obicei culturi de tip fibroblastic – cu celule alungite, fusiforme, paralele,regulat
orientate.

- Tesutul neoplazic dă culturi celulare de tip epitelial cresc cu uşurinţăşi nu formează placarde.

Metoda prin care celulele sunt disociate dintr-un ţesut se face cu ajutorul unor enzime proteolitice (tripsina) şi
care în asociere cu agitarea mecanică se numeste tripsinizare. Tripsina rupe legăturile intercelulare, eliberând
celulele vii ca unităţi separate. Celulele sunt suspendate într-un mediu. Mediul nutritiv conţine în general aceleaşi
elemente de bază: soluţie salină tamponată (sol. Hanks), soluţie izotonă cu pH constant (7,4), săruri minerale,
aport proteic asigurat prin serurile animale în special ser de viţel 5-6 % (reprezentând un factor de creştere)şi
amino acizi esenţiali (din care nu trebuie să lipsească glutamina). Aminoacizii esenţiali sunt fie ca atare sau ca
hidrolizat proteicşi vitamine în special cele din grupul B.

Mediile cele mai obişnuite sunt:HANKS, EAGLE, IC-16, IC-65, celulele se incubează pe aceste medii la 24-48 ore, la
370C conducând la dublarea numărului.

Aceste celule pe un mediu adecvat din punct de vedere al nutrienţilor, pH-lui, t0 rămân viabile şi continuă să se
înmulţească.

Clasificarea mediilor de culturăîn funcţie de provenienţa materialului biologic.

1. CULTURI DE ORGAN

Constituite din fragmente mici de : trahee, bronhii, intestin subţire proximal, trompe uterine etc. menţinute în
mediu adecvat îşi păstrează structura şi funcţia timp de câteva zile.

- Acestea au rol în studiul mecanismelor patogenice ale unor:virusuri enterice (rota virusuri), virusuri respiratorii
(corona virusurile)

2. CULTURI (PRIMARE) DE CELULE

Se obţin prin dispersia enzimatică (tripsină) urmată de dispersia mecanică cu ajutorul agitatorului
electromagnetic. Suspensia celulară ajustată la 150 000-200 000 celule/ml, se pune în mediu de creştere şi se
repartizezăîn tuburi sau plăci sterile.Celulele aderă de sticlă, se înmulţesc, formează un film continuu de celule în
monostrat, după care multiplicarea încetează datorită inhibiţiei de contact. Urmată apoi de infectarea cu virusuri, pot
fi subcultivate de 5-6 ori.

3. CULTURI DE CELULE DIPLOIDE

Reprezintă culturi de celule omogene(unsingur tip de celule)cele mai utilizate sunt cele obţinute din fibroblastele
stabilizate pornind de la embrionul uman. Pot fi subcultivate între 20-50 de pasaje. Caracteristic prezintă cariotip
cromozomial diploid propriu ţesutului de origine. Exemplu cultura de celule WI-38, aceasta este obţinută din pulmon
de embrion uman.

4. LINII DE CELULE(PERMANENTE, HETEROPLOIDE)

Reprezintă o populaţia celulară care derivă direct din ţesuturile tumorale sau din celulele diploide infectate cu
virusuri oncogene. Pot fi cultivate serial sau un număr indefinit de pasaje. Aceste celule nu mai seamănă cu cele din
care au provenit. În general garnitura cromozomială este poliploidă. Ex. HeLa obţinută din carcinom epitelial, VERO-
rinichi de maimuţă verde africană, KB - carcinom epidermoid. Pot fi şi conservate un timp îndelungat prin congelare.

Inocularea şi identificarea virusurilor în culturi celulare

Se aleg culturile celulare adecvate cu susceptibilitatea cea mai mare la virusul presupus ca fiind în probă.
Cultura trebuie să fie proaspătă, confluentă, fiecare cultură se examineazămacroscopic şi microscopic.
Produsul patologic înainte de inoculare este prelucrat pentru îndepărtarea debriurilor şi bacteriilor prin
centrifugare diferenţialăşi tratat cu antibiotic.Produsul patologic se inoculeză direct pe celulele aflate în monostrat
după ce mediul de creştere a fost îndepărtat. Se lasă 1 ora la 370C pentru absorţia virusurilor pe celule, se adaugă
mediu de întreţinere şi se incubează la 370C. În orice experiment se păstrează cultura martor neinoculată.

Urmărirea replicării virale

1. Efect citopatic (ecp) reprezintă ansamblul modificărilor mofologice celulare induse de prezenţa virusurilor în
culturile celulare. Se observă la microscop, acest efect variazăîn funcţie de tipul de virus şi tipul de celulă pe care
este cultivat virusul astfel :

-degenerscenţă celularăşi liză, celulele sunt rotunjite, refringente, cu desprindere de pe sticlăla enterovirusuri.

-formarea de sinciţii la Paramixovirusuri şi Herpesvirusuri

-agregarea celulelor şi leziuni ale nucleului la Adenovirusuri

Grad de manifestare a efectului citopatic se notează cu (+)

-+ 24% din monostrat efect citopatic

-++ 50% din monostrat efect citopatic

-+++75% din monostrat efect citopatic

-++++100%din monostrat efect citopatic

2.Fenomenul de hemadsorbţie constăîn fixarea hematiilor pe celulele infectate cu virusuri, este un fenomen
caracteristic mixo şi paramixovirusurilor, acestea sunt virusuri care nu produc modificări caracteristice în culturile
celulare.

3. Apariţia hemaglutininelor în supernatant, aglutinarea hematiilor în supernatant ca urmare a acţiunii de aglutinare


a aglutininelor virale. Ex. V. Gripale, V. Paragripale şi Arbo virusurile.

4. Interferenţa viralăapare la virusurile care asemenea virusurilor hemadsorbite nu produc modificări morfologice
caracteristice în culturile celulare, însă au capacitatea de a interfera cu replicarea unui al 2-lea virus, inoculate în
aceeaşi cultura şi pe care îl inhibăîn multiplicare.

Ex. Virusul Rubeolic, nu produce efect citopatic în linia VERO astfel că la 10 zile de la inoculare se adaugă un
enterovirus ECHO11 care în mod normal ar trebui să producă efect citopatic dar acesta este inhibat de prezenţa
virusului rubeolic (apare degenerescenţa apoi liza celulară).

5.Incluziunile virale sunt acumulularea paracristalină de virioni şi componente virale în aria de replicare şi
asamblare a virionilor se colorează Giemsa sau hemalaun-eozină.

Localizarea, forma, afinitatea tinctorialăsunt criteriide diagnosticpentru infecţiile cu virusuri

Ex.- Herpes virus: Incluziuni intranucleare, celulele infectate formează sinciţii.

-Reo virusurile: Incluziuni intracitoplasmatice acidofile perinuclear.

- virusul Rujeolic: Incluziuni intracitoplasmatice şi intranucleare, celulele infectate formează sinciţii.

6. ColorareaImunofluorescentă se depistează Ag Viralîn celulele infectate.

7. Transformarea celulelor normale în celule canceroase (transformaremalignă) prin virusuri Oncogene (SV40, V.
Sarcom Rous): pierderea inhibării de contact, focare de aglomerări celulare.

B. Embrionii de găină (oua embrionate de găină-OEG)


Unele virusuri se multiplicăşi se izolează preferenţial în ouă embrionate, o serie de virusuri produc leziuni
patognomonice (leziuni specifice pentru anumite virusuri). Ouălele embrionate se folosesc pentru izolarea şi
identificarea virusurilor dar şi pentru prepararea de vaccinuri şi reagenţi de diagnostic.

Oualele trebuie să fie de la găini specific pathogen free(SPF) care sunt crescute în condiţii de sterilitate pentru a nu
influenţa reacţii fals pozitive. Ouălele sunt puse la incubat6-14 zile după cere sunt controlate la ovoscop, care prin
transluminare se poate observaviabilitatea embrionului.

Căile de inoculare:

- Membranachorioalantoidă, ziua 11-12: v. vaccinia, v. herpetice, v. oncogene, pox v.;

- Cavitatea alantoidiană: v. gripale, ziua 9-12;

- Cavitatea amniotică: v. gripale, ziua 9-10, v. urlian, ziua 5-7;

- Saculvitelin (ataşat embrionului, rezervă nutritivă): rickeții, chlamidii, v. herpetice (ziua 5).

Incubare : -350C, 3-5 zile,

- 40C, peste noapte a doua zi se recoltează: lichide, membrane, ţesuturi

Efecte observate :

- Moartea embrionului la v. urlian, herpes v.

- Acumularea Ha în lichidul alantoid şi amniotic (v. Gripale)

- Pustule (pocks virusuri) pe membrana chorio-alantoidă.

C. Animale de experienţă -Când receptivitatea celorlalte gazde este nesatisfacătoareîn cazul v. Rabic, Arbo v., v.
Coxsackie A, HIV

-Replicarea viralăeste demonstrată prin:- boala manifestăcu sau absența decesului

- Urmărirea virusuluiîn organul ţintă se face prin:- hemaglutinare: arbo v.

- infecţiozitatea omogenatelor: v.coxsackie

- examen histo–patologic:- leziuni inflamatorii

- leziuni degenerative

- incluzii virale (ex. Corpusculii Babeş-Negri în neuronii infectaţi

cu v. Rabic)

Animalele de laborator se folosesc în :

-diagosticul Virozelor;

-obţinere reagenţi biologici;

- în prepararea vaccinurilor (ex. V. Antirabic pe creier de şoarece);

- studii de patogenezăşi imunitate antivirală.

Surse de animale – specii folosite experimental:

- Mamifere mici (şoareci, şobolani, hamsteri, cobai, iepuri, maimuţe, dihori) →în experienţele curente;
- Mamifere mari (capre, oi, cai, viţei) → pentrupreparate biologice;

- Păsări : găini, prepeliţe, porumbei, raţe, curcani.

Selecţionare în funcţie de:

- susceptibilitatea la virusuri (şoarece - v. Coriomeningitei limfocitare;cimpanzeu- HIV; maimuţă- v. Rujeolic, VHB)

- vârstă

- stare de sănătate

- omogenitatea lotului experimental

Dezavantaje- cost crescut

- receptivitatea variazăîn funcţie de: specie, linia genetică, vârsta animalului

- existenşa virusuri latente careinterferază cu cel inoculat sau se pot reactiva.

1. Animale SPF (specific pathogen-free) - fără floră patogenă

- crescute în regim de barieră sanitară: condiţii de mediu (hrană, aer) ce previn contaminarea cu germeni patogeni

2. Animale germ-free (fară floră asociată contaminantă)

- hranite în condiţii de creştere restrictive în izolatoare speciale (aer + hrană sterilă)

3.Animale inbred, izogene

- se obţin prin înmulţiri consangvina(după 20 de generaţii)

- identice din punct de vedere genetic cu perechea de strămoşi comuni

- împerecheri controlate soră – frate (minimum 20 generaţii)

- în studii de - imunitate antivirală, transplant,oncogeneză.

4. Animale trangenice

- au în genom o genă transfectă (straină) ce se va exprimă fenotipic(injectarea unei gene în pronucleul unui ou
fecundat provenit de la parentalii izogeni urmată de implantarea oului în oviduct)

5. Şoarecii nuzi- absenţa congenitală a timusului

Cultivarea pe animale de laborator

1.Pregătirea animalelor pentru inoculare

2. Inocularea: alegerea căii optime de acces la ţesuturile şi organele pentru care virusul are afinitate (subcutan,
intramuscular, intravenos, intraperitoneal, intracerebral, digestiva etc.)

-Virusurile Neurotrope (v. Rabic, arbo v.) →intracerebral

-Virusurile Respiratorii (v. Gripal) → intranazal

-VirusurileDermotrope (v. Vaccinia) →intradermic


3. Supravegherea animalelor inoculate : temperatura corpului, stare generală (anorexie, blană zburlită), pierderi în
greutate, semne clinice caracteristice (paralizii, tremurături).

4. Recoltarea produselor patologice

-Animale moarte: - ex. Macroscopic se preleveazăţesuturi, organe.

- ex. Microscopic frotiuri din amprente (histopatologic)

- Animale fără semne de boală,se fac3 pasaje oarbe la alte animale

12.3. Metode de diagnostic virusologic și serologic.

Diagnosticul propriu-zis:

Examen direct prin microscopie electronică sau imunofluorescenţă.

Examenul indirect prin cultivarea, izolare şi identificarea virusului.Pentru diagnosticul indirect se utilizează culturi de
provenienţă diferită aproape de la toate speciile de vertebrate şi unele nevertebrate, insecte, artropode.

Oul embrionat pentru virusul gripal, animalele de laborator servesc pentru izolarea unor virusuri cu afinitate
specifică pentru unele specii de şoareci nou-născuţipentru virusul Coxsackie.

Identificarea virusurilor se face în urma unor modificări morfologice, exemplu culturile celulare efectul citopatogen
etc., incluzii celulare agregate intracelulare de virusuri.Pe oualele embrionate leziuni tip pox, pe membrana
corioalantoidă la Virusurile vaccina şi variolic.

Detectarea antigenelor virale prezente în lichidul de cultură, lichidele alantoidiene, amniotice. Testarea se face cu
seruri imunospecificeşi se folosesc reacţii de: neutralizare, hemoaglutinoinhibarea, RFC, ELISA.

Diagnosticul serologic detectează răspunsul imun specific faţă de infecţiile virale prin evidenţierea anticorpilor din
serul bolnavilor, acestea se realizeaza cu Ag standard.

Se testeaza tipul de răspuns imun; primar, secundarexprimat prin preponderenţa unui anumit tip de Ig. IgM precoce
la 2-3 zile de la debutul bolii scade după 2-3 săptămâni urmată de apariţia IgG la o săptămâna de la debut cu un
maxim la 3-4 săptămânişi care se menţine. Răspunsul secundar însoţit numai de prezenţa IgG. Diferenţierea se face
prin tratarea serului cu mercaptoetanol, detectarea cu conjugatul antiIgM.

Anticorpii care blochează activitatea specifică virală sunt anticorpi seroneutralizatori cu rol de a bloca infecțiozitatea,
anticorpii hematinoinhibanţi şi anticorpii fixatori de complement.

12.4. Diagnosticul de laborator în infecția produsă de virusurile gripale.

II. Diagnosticul direct de laborator

1. Recoltarea produselor patologice

Se pot preleva:
- secreţii nazale
- lichid de spălătură nazofaringiană
- aspirat traheal, lichid de spălătură bronşică, piese necroptice.

2. Examenul direct al produsului patologic


Pot fi detectate direct în produsul patologic:
- Virionul, cu ajutorul microscopiei electronice.
- Antigenele virale, cu ajutorul:
• IFD - realizată pe amprente de mucoasă nazală şi frotiuri efectuate din secreţii nazale.
• ELISA - folosită în special pentru identificarea antigenelor de tip.
- Acidul nucleic viral poate fi detectat prin:
• hibridizare cu sonde nucleotidice.
• PCR, aplicată după obţinerea ADN-ului complementar ARN-ul viral prin reverstranscriere
RT-PCR (reverstranscriere-PCR).
3. Izolareavirusului
Produsele patologice sunt prelucrate şi sunt inoculate pe:
-Ouă embrionate de găină
Izolarea pe ouăle embrionate este metoda de elecţie şi este accesibilă tuturor laboratoarelor de virusologie.
Produsele patologice sunt inoculate pe ouăle de găină fecundate, cu embrioni de 8-12 zile.
Examinând oul în poziţie orizontală la ovoscop se stabileşte locul inoculării în regiunea unde distanţa dintre
cochilie şi embrion este cea mai mică, iar după badijonarea cu tinctură de iod, se realizează un orificiu de dimensiuni
mici în cochilie, fără să se perforeze membrana proprie a oului. La acest nivel, se pătrunde cu un ac cu bizou scurt,
ataşat la o seringă de 1ml, prin membrana proprie a oului şi membrana corioalantoidiană.
În momentul când se întâmpină o rezistenţă prin atingerea embrionului, se retrage foarte uşor acul şi se
inoculează o cantitate de 0,1ml din produsul patologic. Apoi, se retrage acul brusc şi se obturează orificiul cu o
picătură de parafină topită, sterilă.
Ouăle inoculate sunt incubate la temperatura optimă de cultivare a virusurilor gripale, respectiv 33-34oC.
Ouăle se deschid după omorârea embrionului prin refrigerare, respectând normelede lucru aseptic. Se recoltează
lichidul amniotic şi lichidul alantoidian, ce urmează a fi inoculate pe alte ouă embrionate, în vederea obţinerii
virusului gripal în cantitate mare, în urma a 2-5 treceri succesive.
-Culturi de celule
Virusurile gripale cultivă mai greu în culturi celulare. Cel mai bine cultivă virusul gripal de tip B, urmat de tipul
A, în timp ce cel de tip C cultivă extrem de dificil sau deloc. Produsele patologice tratate cu antibiotice pot fi
inoculate în culturi primare de rinichi de maimuţă sau linii celulare de rinichi de câine (MDCK).
-Animale de laborator
Şoarecele alb şi dihorul sunt foarte sensibili la infecţia cu virusurile gripale, iar inocularea se practică în general
intranazal. Şoarecii dezvoltă o pneumonie letală. Din trituratul pulmonar obţinut după sacrificarea acestora, în urma
inoculării altui lot de şoareci pe cale nazală, se poate obţine adaptarea virusului la organismul animalului, după 3-8
astfel de pasaje oarbe.
4. Identificarea virusurilor gripale cultivate în sistemele biologice
-După cultivarea pe ouăle embrionate de găină, acestea sunt deschise aseptic, recoltându-se lichidul amniotic
şi alantoidian. Pentru identificarea antigenelor virale se recurge la reactiile de hemaglutinare (HA),
hemaglutinoinhibare(HAI) şi reactia de fixare a complementului (RFC). Printre aplicaţiile HA se numără şi detectarea
şi titrarea virusurilor gripale.
Principiul HA: în contact cu o suspensie de hematii, virusurile hemaglutinante, precum virusurile gripale,
provoacă aglutinarea hematiilor.
Virusurile gripale se adsorb pe suprafaţa hematiilor prin intermediul hemaglutininei şi se desprind de pe acest
substrat cu ajutorul neuraminidazei.
- În cazul culturilor celulare, identificarea se bazează pe evidenţierea efect citopatic (ECP). Leziunile citologice
în cazul virusului gripal de tip A sunt de tip vacuolar, fiind însoţite de desprinderea celulelor din monostrat. Virusul
gripal de tip B produce ECP de tip granular, cu fragmentarea celulelor, picnoză şi distrugerea monostratului celular.
- În cazul animalelor de laborator, trituratul din plămâni conţine cantităţi mari de virus gripal, ce poate fi
identificat prin: HA, HAI şi RFC.
II. DIAGNOSTICUL SEROLOGIC
Se investighează dinamica anticorpilor specifici pe perechi de seruri, prima probă fiind recoltată cât mai
precoce de la debutul bolii, iar cea de-a doua după aproximativ 10-14 zile, în convalescenţă. Diagnosticul de gripă
este susţinut indirect, prin detectarea seroconversiei sau a unei creşteri semnificative, de cel puţin 4 ori a titrului de
anticorpi în proba a doua de ser, comparativ cu prima.
Ca tehnici sunt utilizate în mod curent HAI şi RFC, recomandându-se şi ELISA atunci când este posibil, datorită
sensibilităţii crescute a acestei metode.

HAI – reacţia de hemaglutinoinhibare

Prin HAI se investighează apariţia şi creşterea titrului anticorpilor hemaglutinoinhibanţi. HAI este o reacţie de
seroneutralizare, având ca principiu inhibarea aglutinării hematiilor de către hemaglutininele virusurilor gripale,
atunci când acestea s-au unit cu anticorpii complementari.
Materiale necesare
-cele două probe de ser de cercetat, tratate pentru îndepărtarea inhibitorilor specifici, inactivate la 56oC, timp de 30’
şi diluate 1/7 cu soluţie salină izotonă;
-suspensiile de antigen gripal cu o concentraţie de 8 ori mai mare decât titrul hemaglutinant stabilit prin HA;
-soluţie salină izotonă;
-o suspensie de hematii de cocoş 0,5%;
-microplăci cu godeuri;
-pipete automate şi conuri adecvate etc.
Tehnica de lucru
Se execută diluţii binare din serurile de cercetat, începând cu diluţia 1/7, în plăci sau microplăci de plastic cu
godeuri, peste care se pipetează un volum egal din suspensia de antigen ce conţine 8 UA. Plăcile se agită, se
acoperă cu un capac şi se lasă la temperatura camerei timp de 30’. După aceea se adaugă un volum egal din
suspensia de hematii de cocoş 0,5% şi se lasă plăcile la temperatura camerei timp de 30-45’. Concomitent cu
probele de cercetat, se lucrează şi martorul antigen, martorul hematii, martorul ser sigur pozitiv şi martorul ser
sigur negativ.
Schema reactia HAI:
-Ac (ser pacient) + HA (hemaglutinine)= Ac-HA + Hematii bănuţ de hematii R(+)
-0 (absent Ac din ser) + HA= HA (libere) + H HA-H aglutinarea =umbreluţă de hematii R(-)

Citirea şi interpretarea rezultatelor


Titrul de anticorpi hemaglutinoinhibanţi este dat de cea mai mare diluţie de ser de cercetat la care mai apare o
inhibare completă a HA. Diagnosticul de gripă este susţinut de detectarea unei creşteri în dinamică de cel puţin 4 ori
a titrului de anticorpi HAI.

LUCRAREA PRACTICĂ 13
13. 1. Diagnosticul de laborator în hepatita B.

Diagnosticul de laborator în infecţiile cu virusul hepatitic B

I. Diagnosticul virusologic

1. Recoltarea produselor patologice: sânge, plasmă, ser etc.

2. Examenul direct al produsului patologic

Virion: microscopie electronică

Antigenele virale: agHBs şi agHBe, în ser, prin ELISA; agHBc în nucleul hepatocitelor

DNA-polimeraza HBV

DNA-HBV

II. Diagnosticul serologic

ELISA: Anticorpii anti-HBs, anti-HBc (IgM) , anti-HBe

13.2. Diagnosticul de laborator în infecția produsă de virusul imunodeficienței imune/SIDA.

Diagnosticul de laborator în infecţia cu HIV

I. Diagnosticul virusologic

1. Recoltarea produselor patologice: sânge, plasma, LCR, secreţie vaginală, spermă, lacrimi, lapte, urină.

2. Evidenţierea directă a unor componente ale virionului în produsul patologic:

- Antigene virale: p24 apar la 2 săptămâni după infecţie şi este confirmată pânăîn a 3-a lună de la infecţie dispar

proteinele corespunzătoare momentului când genomul viral este integrat în genomul umancel T4H

- RNA-HIV, DNA proviral, Reverstranscriptaza

3. Inocularea pe sisteme biologice şi izolarea tulpinii virale

Izolarea HIV în urma cultivării celulelor mononucleare din sângele periferic sau secreţiile vaginale. Tehnica cea
mai sensibilă este de cocultivare a probelor cu celule mononucleare şi sângele periferic stimulat mitogenic. După
incubarea supernatantelor culturile celulare sunt evaluate pentru activităţile revers transcriptazei şi prezenţei Ag P24

4. Identificarea HIV

În cultura de celule infectate cu HIV, ECP de tip sinciţial sau apar celule balonizate.

Detectarea: antigenului p24 şi DNA proviral

I. Diagnosticul indirect - Serodiagnostic

Teste screening: ELISApentruanticorpii anti-HIV

Teste de confirmare:Western Blot

ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)se bazează pe faptul că elementul cunoscut este imobilizat pe
suportul solid, iar elementul necunoscut este depistat cu ajutorul reactantul marcat enzimatic (conjugatul), reacţia
fiind vizualizată prin adăugarea substratului corespunzător enzimei folosite, prin dezvoltarea unei reacţii de culoare.

Tehnica de lucru în cazul serodiagnosticului prin ELISA indirectă:


Etapa I: Se introduce serul de testat în godeul ce conţine Ag cunoscut (acesta este fixat pe godeu).

- Incubare urmată de spălare cu soluție tampon

Etapa II:

- Se adaugă conjugatul (anticorpi anti-anticorpi umani marcaţi cu o enzimă)

- Incubare urmată de spălare cu soluție tampon.

Etapa III:

- Se adaugă substratul pentru enzima respectivă.

- Incubarea apoiStoparea reacţiei.

Martorul + (realizat cu un ser ce sigur conţine elementul pe care îl căutam) trebuie să fie colorat.

Martorul - (realizat cu un ser ce sigur nu conţine elementul pe care îl căutam) trebuie să fie incolor.

Dacă martorii sunt buni, se citeşte şi se interpretează proba propriu-zisă (serul de cercetat).

Citire: Aspect macroscopic: lichid colorat (galben), proba este pozitivă şi deci, în serul de cercetat există elementul
căutat (ex. Ac. anti-HBs, dacă s-au folosit plăci cu AgHBs fixat pe godeu).

Aspect macroscopic: incolor, proba este negativăşi în serul de cercetat nu există elementul căutat(Fig. 13.1).
*

Fig. 13.1 Schema reacţiei ELISA

13.4. Diagnosticul de laborator în candidoza bucală.

Candidoza este dată de Candida albicans, care poate face parte din flora normal, produce pseudohife
prezente atât în produse patologice cât şi în cultură.Diagnosticul poate fi micologic (direct) sau imunologic (indirect)

Diagnosticul direct de laborator

1. Recoltarea şi transportul produsului patologic

Se recolteaza cu tamponul steril -de pe limbă,

- de pe mucoase,

- de pe pilieri,

- din şantul gingival cu ajutorul vârfurilor de hârtie,

2. Examenul direct de laborator

Macroscopic tamponul -în special cel recoltat de pe limbă poate să fie ceva mai încărcat cu o masăalbă.

Microscopic: Frotiul colorat Gram prezintă formaţiuni rotunde uşor ovalare G(+)(blastoconidii)(vezi Fig.13.2.) hife de
lungimi diferite, sau stadii diferite ale formării tubilor germinativi din blastoconidii. Se potface şi frotiuri AM şinative
lamă- lamelă.
Fig.13.4. Candida frotiu din produs patologic colorat gram,

blastoconidii G (+) (foto C. Defta)

3. Insămânţarea

Se face pe mediu Sabouraud (cu cloranfenicol, gentamicina şi


ciclohexidina) fie în placă sau pe mediu în plan înclinat. Incubarea se
face la 28 de grade între 48-96 de ore

4. Identificarea se face prin examinarea caracterelor:

- Macroscopice colonii de tip S rotunde, bombate, netede, albe, cu miros caracteristi de lapte acru;

- Microscopic hife G(+)lungi care se întrepătrund;

- Biochimic fermentează glucoza, maltoza, zaharoza, trehaloza, galactoza;

- Teste antigenice: aglutinarea pe lamă, latex-aglutinarea.

5. Antifungigramă.

LUCRAREA PRACTICĂ 14

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR ÎN AFECȚIUNILE ORALE – PARODONTOPATII, INFECȚII


DE CANAL etc

1. Recoltarea și transportul produselor patologice:

Se face de la pacienții examinați clinic și care nu urmează nici un tratament medicamentos sau chirurgical în
sfera orală. Prelevările se efectuează ținând cont de anumite norme de recoltare a probelor, care încălcate pot
influența celelalte etape ale examenului microbiologic.

1.1. Recoltarea probelor din leziuni de pe suprafaţa gingiei și din pungile parodontale:

a) Recoltarea cu tamponul steril, astfel se îndepărtează debriurile alimentare urmată de izolarea zonei cu rulouri și
aspiratorul de salivă, se dezinfectează zona din jurul leziunii. Cu tamponul steril se şterge zona lezată prin rotirea
tamponului, în finalacesta este introdus într-un tub steril care se notează.

Dacă leziunea este profundă, se recoltează două probe, în acelaşi mod, una pentru identificare bacteriilor aerobe,
alta pentru identificare bacteriilor anaerobe.

Tuburile sunt însoțite de o fișă de identificare care cuprinde date despre pacient: nume, prenume, vârstă, sex,
regiunea de recoltare a probei, elemente legate de istoricul bolii. Transportul la laborator se face în interval de
maxim 1/2 oră.

b) Recoltarea cu conuri de hârtie de filtru sau meșe foarte subțiri. Etapa preliminară de igienizare și izolare a zonei
este identică cu cea prezentata anterior.Apoi se scoate, cu o pensă sterilă, conul de hârtie de filtru sau meșa foarte
subțire din tubul Eppendorf steril, se introduc în pungile parodontale, având grijă să se evite contaminarea
suplimentară prin atingerea fie de dinte, fie de peretele gingival al pungii parodontale, cu vârful ascuţit, în regiunea
incriminată pentru recoltarea probei patologice, se menține un minut pentru o bună îmbibare cu produs
patologic.Apoi conul de hârtie/meșa se introduce într-un tub cu soluție Ringer. Obligatoriu se recoltează două probe.
Se noteaza tubul iar transportul se face în interval de maxim 1/2 orăla laborator.

1.2. Recoltarea probelor din canalul radicular

- Se deschide camera pulpară cu ajutorul unei freze sterile. Se introduc succesiv conuri de hârtie sterile în canal
până la nivelul regiunii apicale; se lasă fiecare con pe loc timp de 30 de secunde. Se pompează 3 - 4 picături de ser
fiziologic cu ajutorul unei seringi pe canal în absența puroiului sau exudatului și se absoarbe maximum de lichid cu
ajutorul conurilor de hârtie. Sau se introduc conurile de hartie în șanțul gingival se lasă 30 de secunde pentru
încărcare cu produs patologic.Se introduc aceste conuri de hârtie într-un tub cu mediu de transport, de obicei mediu
Ringer, transportul se face rapid la laborator maxim ½ oră.

2. Examenul direct de laborator

Macroscopic – în cazul leziunilor conice se constată prezența urmelor purulente și de cele mai multe ori
sanghinolente însoțite și de miros neplăcut

Microscopic – se efectueazăfrotiuri colorate Gram, pe care se vor observa numeroase aspect morfologice de la coci G
+ la coci G- dar și bacili G+ și G- de mărimi și dimensiuni diferite. Preponderența unora sau altora va fi dată de tipul
și stadiul bolii parodontale. Astfel,în formele profunde a parodontopatiilor cornice se vor observa frecvente forme
spiralate alături de flora preponderant gram negativă. De asemenea,pe frotiuri vor fi prezente și leucocite de tipul
PMN-relor dar și celule epiteliale.

3. Însămânţarea

Se face pe mediile speciale și medii selectiveTSA (triptic soy agar) cu ser, vancomicina si bacitracina, Columbia cu
5% sănge de berbec și Schaedler cu 5% sânge de berbec suplimentat cu menadionă, Sabouraud, MacConkey și
mediu Chocolate. Tehnica de însămânțare folosită este cea a pentagonului cu arderea și răcirea ansei înainte de
începerea sectorului următor cu scopul de a obtine colonii izolate.

Plăcile cu mediu Columbia și MacConkey se incubează aerob la termostat,mediu Chocolate și Columbiasunt


incubate în jar în atmosferă îmbogățită cu 5% C02,jarul închis ermetic este introdus la termostattimp de 24-48 ore
la 37°C. Plăcile cu Schaedler și cu TSA se incubează în atmosferă anaerobă obținută cu amestecuri reducătoare care
se introduc în jar înainte de închiderea ermetică, incubarea se facela 37°C, timp de 2-7 zile la
termostat.MediulSabouraud se introduce la termostatul de 420C în condiții de aerobioza, timp de 2-7 zile.

4. Izolarea și Identificarea se face prin examinarea caracterelor:

-Izolarea: creșterea bacteriană se studiază cu ochiul liber și cu lupa, la 24 ore și 48 ore în cazul plăcilor cu mediu
Columbia, MacConkey, iar pentru Schaedler, la 48 ore și la 7 zile, estimându-se toate tipurile de colonii ce apar.
Subculturile se vor efectua în dubluastfel: de pe Columbia, MacConkey, Chocolate se vor repica câte 2-3 colonii din
fiecare tip, pe câte 2 plăci Columbia în sectorcele două vor fi incubate una aerob și a doua anaerob, la 37°C, timp de
24-48 ore. De pe mediul Schaedlerse vor repica câte 1-3 colonii din fiecare tip, în sector, pe câte 2 plăci Columbia,
una fiind incubată în atmosferă îmbogățită cu 5% CO2, iar a doua anaerob, la 37°C, timp de 48 ore.

-Identificarea: se urmăresc trei caracteristici și anume macroscopice, microscopice și biochimice.

Macroscopic saucaracterele de cultură,se urmărește aspectul coloniilor și mirosul culturii pe mediile însămânțate, în
cele trei condiții de incubare, clasificându-se în aerobe, anaerobe și facultative anaerobe. Se face descrierea
coloniilor după: dimensiune, formă, margini, suprafață, relief, consistență, miros, culoarea coloniilor și aspectul
eventualei zone de hemoliză.

Exemplu: Coloniile de Aggregatibacter actinomycetemcomitans (fostul Actinobacillul actinomycetemcomitans)


prezinta colonii translucide, netede, nehemolitice,cresc foarte bine pe TSA cu vancomicinăși bacitracină.

Bacteroides fragilis crește greu da colonii gri sau translucide, Prevotella și Porphyromonas acestea au colonii
pigmentate cu negru. Fusobacteriile au colonii medii cu pigment negru și miros puternic de sulf similar halenei
bucale.Coloniile de streptococci sunt mici cu hemoliză de tip alfa în jur, mai rar beta în funcție de specie.

Speciile de Actinomyces dau colonii mici alb-cremoase, aderente pe mediile cu sânge.

Speciile de streptococci orali (grupul mutans, salivarius, anginosua, mitis) dau hemoliză de tip alfa dar sunt și
tulpini nehemolitice și puține beta hemolitice, coloniile sunt mici și plate.Unele dintre ele cu mirosuri caracteristice.

Wolinella prezintă colonii uscate difuze sau ce corodeazămediul de cultură. Genul Capnocytophaga pot fi colonii
cu margini neregulate de culoare: roze,galbene sau albe. Eikenella corodens dă colonii ce corodează mediul de unde
și numele

Stafilococii au colonii mari de culoare galbenă sau aurie, cresc în aerobioză, cu hemoliză de tip beta.

Exemple de imagini microscopice: Streptococi orali sunt în lanțuri G(+).Peptostreptococii coci G (+) anaerobi
frecvent izolați din plăcile subgingivale, parodontopatii și abcesele dentoalveolare. Lactobacilii sunt bacilli G(+)
izolați din plăci supragingivale. Propionibacteriile bacilli G (+) numiți “difteroizi” datorită asemănării, se pot izolași
din plăcile dentare. Actinomyces sunt bacili filamentoși ramificați G(+)imobili, nesporulați izolați din gingivite în
număr mare și din cariile rădăcinii.Aggregatibacter actinomycetemcomitansprezintă bacili mici scurți, drepți sau
curbați cu capete rotunjite. Eikenellacorodens izolata din parodontopatii, este un cocobacil scurt G(-). Prevotella
spp.bacilli imobili G (-) iar Porphyromonas bacilli pleomorfi scurti G (-), Fusobacteriile forma de “trabuc” cu capetele
ascutite G (-)

Biochimic: Identificarea se face cu ajutorul sistemului Rapid ID32 Strep (pentru grupul Streptococilor) și sistemului
rapid ID 32 A (pentru anaerobi) (Bio-Merieux)respectând tehnica de lucru recomandată de producător astfel:

Pregătirea inoculului:Cu ajutorul unui tampon de vată steril, se prelevează colonii de pe plăcile cu colonii izolate,
realizându-se o suspensie într-un tub cu 3 ml de apa distilată turbiditate corespunzătoare din tub trebuie sa fie
conformă etalonului de 4 McFarland.

Inocularea godeurilor aparținând galeriei:Seiaucu o pipetă automată câte 55µl de suspensie bacterienă
careintroduce în cele 32 godeuri ale galeriei, iar după acoperirea cu capacul corespunzător, aceasta va fi incubată în
aerobioza,timp de 4h, la 37°C.

Citirea reacțiilor:Citirea galeriei se face cu ochiul liber, respectând indicațiile din tabelul de interpretare a reacțiilor.
Pentru unele dintre teste sunt necesari reactivi suplimentari, citirea se efectuează dupa 5' de la adăugarea acestora.
Astfel, testul VP producerea de acetoină se va pune o picătură de reactiv VP A (KOH 20%) și una de reactiv VP B (α-
naftol 12%). Se adaugat apoicâte o picătură de reactiv FB (Fast Blue BB 0,35%) cu scopul puneri în evidență a
eliberarii de: alanil-fenilalanil-prolin arilamidază -testul APPA, β-galactozidază -testul βGAL, acid piroglutamic
arilamidaza - testul PyrA, N-acetil-β-glucozaminidază - testul βNAG și respectiv glicil-triptofan arilamidaza -testul
GTA. În final, reactivul NIN (ninhidrină 7%) câte o picătură pentru hidroliza hipuratului (testul HIP).

Interpretarea reacțiilor: Producătorul furnizează formulare pentru notarea rezultatelor reacțiilor, cele 32 de teste
sunt grupate câte 3, cu excepția ultimilor 2, care reprezintă un ultim grup. Dacă testul a fost negativ, indiferent de
poziția lui în cadrul grupului, a fost notat cu 0, iar daca a fost pozitiv și totodata primul din grup s-a notat cu 1. În
caz că era pozitiv, dar era al 2-lea test din grup, a primit valoarea 2, iar dacă a fost al treilea din grup s-a notat cu
4. Așa încât, valoarea oricărui grup a fost conferită de suma valorilor celor 3 teste, iar în cazul grupului final, de
suma valorilor celor 2 teste. Se obține în finalun număr din 11 cifre (reprezentând valorile grupelor) decodificarea se
face cu programul APILAB Plus, identificându-se specia.

5. Antibiogramă se efectueaza pe mediul Müller -Hinton in conditii de anerobioza.

Bibliografiea:

1. Dumitru Buiuc, Marian Neguţ, 1999, Tratat de microbiologie clinică, Editura Medicală, Bucureşti

2. Gheorghe Dimache, Dan Panaitescu, 1994, Microbiologie şi parazitologie medicală, editura Uranus, Bucureşti

3. A. Ivanof, M. Ciupe, C. Sască, Diona Vancea , 1982, Microbiologie, Editura didacticăşi pedagogică, Bucureşti

4. Mihai Sefer, 1998, Examinarea microscopicăîn Diagnosticul bolilor microbiene, Editura Viaţa medicală
Romănească, Bucureşti

5. Dumitru Buiuc 1992, Microbiologie Medicală, Editura Didacticăşi Pedagogică, Bucureşti

6. Dumitru Buiuc 2003, Microbiologie Medicală; Ghid pentru studiul şi practica medicinei, editia a VI-a, Editura “Gr.
T. Popa” Iaşi

7. Stewart M. Brooks, 1973, A programmed introduction to MICROBIOLOGY/second edition, the C.V. Mosby
Company , Saint Louis

8. Simona Rădulescu, Ernest A. Meyer,1994, Parazitologie Medicală, Editura All, Bucureşti

9. Gabriela Loredana Popa, 2008, Carte de lucrări practice microbiologie, Editura Renaissance, Bucureşti

10.Gabriela Loredana Popa, 2007, Parazitologie medicală, Editura Renaissance, Bucuresti

11.Ionescu-Dorohoi Tudor, Maria Titeica, 1986, Practica diagnosticului imunochimic, Editura Medicală, Bucureşti

12.Georgescu Mărăşel, 1983, Diagnosticul microbiologic şi imunologic; Lucrări practice, Litografia IMF”Carol Davila”,
Bucureşti

13.Junie M, 2003, Curs de Microbiologie, Editura Medicală Universitară “Iuliu Haţieganu”, Cluj-Napoca

14.Diana Gheţeu, 2011, Virusologie, Microbiologie, Parazitologie; Suport de curs pentru Medicină Dentară, uz
intern, Iaşi

15.L.P. Samaranayake, 2002, Essential microbiology for Dentistry, Ed. Churchill Livingstone, second edition,
Edinburg