Tema 3.- Proteínas.

María Lizbeth Méndez

Itzel Montserrat Mercado Sánchez

Mario Iván Arenas López

12 de Mayo.
 Proteínas.

Objetivo:

Identificar las propiedades químicas de las proteínas para poder distinguirlas y

posteriormente utilizar dichas propiedades para determinar su concentración y
realizar algún método de extracción y purificación, como la separación
electroforética de proteínas que nos permite ver la migración diferencial de las
proteínas según su peso molecular. Finalizar con el efecto de enzimas y sustratos
en una reacción enzimática.

Resumen

El análisis de proteínas se realizo en forma extensa, primeramente mediante la

determinación de la concentración de proteínas en una muestra problema, en
donde obtuvimos un promedio de 6.95 µg / µL, esto se realizo mediante el método
de Bradford. La extracción y purificación se realizó mediante una columna de
intercambio iónico (anionico), donde lo determinante fue la carga negativa de
las proteínas. Se realizaron 27 mediciones de absorbancia y en base a ellos se
determino que tanta proteína se pegó.

La electroforesis de proteínas se realizo mediante un gel de poliacrilamida, donde

el propósito principal era determinar el peso molecular de proteínas, se eligieron
dos muestras, obteniendo un peso de 90157.1137 y 78944.304.

Una de las aplicaciones principales de las proteínas es en enzimas por ello se

realizo el análisis de actividad enzimática, nuevamente en un gel, donde se pudo
ver la degradación del mismo por acción de proteasas.

Determinación de proteínas.

Es importante la cuantificación de las proteínas cuando se quiere conocer la

actividad específica de una preparación enzimática, para el diagnóstico de
enfermedades, así como para otros muchos propósitos.

Se tenían varias opciones para realizar la determinación de proteínas, en nuestro

caso se realizo mediante el método de Bradford.

Metodología.

 En tubos Ependorf se realizaron soluciones mediante el uso de albumina y

el reactivo de Bradford, por triplicado y en diferentes proporciones, las
cuales se indican en la tabla 1.
  Primero se agrego la albumina y la solución problema, posteriormente a
cada tubo se añadió agua según correspondiera.
 Posteriormente se añadió el reactivo de Bradford en la misma cantidad
para cada uno de los tubos Ependorf.
 Se dejo incubar las soluciones 10 minutos, dicho tiempo se extendió ya que
no se observaba cambio de color en las soluciones, una vez que se dio
dicho cambio, se paso el contenido de los tubos Ependorf a una placa de
ELISA.
 El último paso fue medir la absorbencia a 595 nm.

Tabla 1.- Distribución de las soluciones preparadas.

Solución Patrón Agua destilada ( Reactivo de

Pozo
(1 mg/ mL) µL) Bradford ( µL)
1 0 12 200
2 1 11 200
3 2 10 200
4 4 8 200
5 8 4 200
6 12 0 200
5 (solución
7(problema) 7 200
problema)

Resultados obtenidos.

Tabla 2.- Resultados obtenidos de las mediciones de Absorbancia.

Cantidad de Primer Segundo Tercer pozo Absorbancia

proteína (1 mg/ pozo pozo promedio
mL)
0 0 0 0 0
1 0.011 0.018 0.017 0.0153
2 0.013 0.016 0.015 0.01466
4 0.062 0.053 0.058 0.0576
6 0.212 0.24 0.29 0.2473
8 0.203 0.21 0.26 0.22
10 0.245 0.241 0.3 0.264
12 0.221 0.233 0.251 0.23
 Absorbancia
0.35

0.3

0.25

0.2
Absorbancia.

0.15

0.1
y = 0.0245x - 0.0006
0.05

0
0 2 4 6 8 10 12 14
-0.05
Cantidad de proteina.

Al graficar los datos es posible obtener la ecuación de la recta, y es con ésta con
la que obtendremos la concentración de las 3 muestras problema.

Teniendo:

Y=0.0245x - 0.0006 (ecuación de la recta en la gráfica)

Y teniendo los valores de la cantidad de proteína de la muestra problema y sus
absorbancias (valores de Y), despejando X encontraremos los valores de
concentración de cada una de ellas.

Primer valor de Absorbancia.

Y= 0.186

𝑌 + 0.0006
𝑥=
0.0245
0.186 + 0.0006
𝑥=
0.0245

𝑥 = 7.616 µ𝑔.
Segundo valor de Absorbancia.

Y= 0.153

𝑌 + 0.0006
𝑥=
0.0245
0.153 + 0.0006
𝑥=
0.0245

𝑥 = 6.269 µ𝑔.

Tercer valor de Absorbancia.

Y= 0.144

𝑌 + 0.0006
𝑥=
0.0245
0.144 + 0.0006
𝑥=
0.0245

𝑥 = 5.9 µ𝑔.

Al tener tres datos de la concentración de proteína, se hace un promedio. Lo cual

da un valor de 6.595 µg/µL
 Intercambio iónico

Un método común para poder purificar alguna proteína en específico, es la de

intercambio iónico, en la que el factor que determinara la purificación será la
carga que tenga cada proteína.

Metodología

 Se colocó la resina de intercambio iónico en la columna de plástico hasta

que el volumen de la resina compactada alcanzó 1 cm de altura, y se
mantuvo al menos 1 ml de agua por arriba del nivel de la resina para que
no se secara. Ésta fue de intercambio anionico, las cuales contienen
normalmente el grupo haluro de amonio, -N(CH3)3+Cl- .
 Se lavo la resina de intercambio aniónico con 6 volúmenes de
amortiguador de equilibrio, Tris-HCl 50 mM pH 8.0, para mantener un pH
estable y mantener la ionización del intercambiador continúa sin cambios
bruscos.
 Luego de haber completado los lavados y el amortiguador quedo casi al
ras de la resina, se procedió a colocar 200 µL de muestra problema en 800
µL del amortiguador de equilibrio en la parte superior de la resina. Se dejó
que la muestra se incluyera en el amortiguador.
 Se aplicó 8.5 mL del amortiguador en equilibrio por las paredes de la
columna. Y de este modo se colectó fracciones de 1 mL en diez
microtubos. El volumen mínimo o exacto para poder posteriormente leer su
absorbencia.
 Al término de esta recolección se agredo 8.5 mL de amortiguador de
elusión I (Tris-HCl 50 mM, NaCl 200 mM pH 8,0) para del mismo modo
anterior, se colectó fracciones de 1 mL en nueve microtubos.
 Se continúo agregando 8,5 mL de amortiguador de elusión II (conteniendo
500 mM de NaCl) y se colectó ocho fracciones de un mililitro.
 Cuando se término de colectar todas las fracciones, se pasó a leer su
absorbencia a 280nm en un espectrofotómetro con celdas de ImL.
 Se lavo la columna con 8 volúmenes de agua destilada y se colectó la
resina almacenándola a 4°C.
 Resultados y discusión

Los valores de la absorbencia obtenida son los siguientes:

Tabla 3.- Resultados obtenidos en la purificación de proteínas.

Tubo Absorbancia
1 0.228
2 0.244
3 0.354
4 0.17
5 0.11
6 0.09
7 0.085
8 0.138
9 0.093
10 0.137
11 0.439
12 0.283
13 0.252
14 0.267
15 0.226
16 0.21
17 0.219
18 0.214
19 0.23
20 0.048
21 0.031
22 0.094
23 0.284
24 0.078
25 0.066
26 0.026
27 0.012
 Absorbancia
0.5
0.45
0.4
0.35
0.3
0.25 Absorbancia
0.2 Linear (Absorbancia )
0.15
0.1
y = -0.0053x + 0.2456
0.05
0
0 5 10 15 20 25 30

En la primera etapa donde había una concentración de 50 mM de NaCl,

se observan dos picos. El primero fue en el tubo 3, donde la absorbencia es mayor
puesto que la proteína interacciono mucho con la resina que en el segundo pico
donde la absorbencia decrece, también se debe a que la concentración de
NaCl de esta etapa ya era la última de la etapa.

En la segunda etapa, donde la concentración de NaCl es de 200 mM nos

encontramos la mayor observancia registrada en la lectura de las tres etapas, se
da en el tubo 11 lo que nos indica que en esta parte se encuentra la proteína que
se pego. Así mismo hay un segundo pico en el tubo 14, el cual es muy pequeño,
muestra que se adhirió a la resina en menor proporción que el primer pico.

Por último en la concentración de 500 mM de NaCl, se observa un pico en el tubo

23 indicando la adherencia de la proteína al casi inicio de la colección, y que va
decreciendo hasta casi desaparecer o encontrarse en mínima cantidad.

Para determinar la cantidad de proteína que se adhiere a la resina se suma sus

absorbencias de acuerdo a como se coloco las concentraciones, o sea se
dividió en tres etapas:

En total de la suma de todas las absorbencias es de 4.864.

 Primer etapa: concentración de 50mM de NaCl

Los primeros diez tubos suma 1.651

1.651
Para saber cuánta proteína se adhirió se divide: 4.864
= 0.339
  Segunda etapa: concentración de 200nM de NaCl

Del tubo 11 al 19 la suma de sus absorbencias da 2.340.

2.340
Para saber cuánta proteína se adhirió se divide: = 0.481
4.864

 Tercera etapa. Concentración de 500nM de NaCl

Del tubo 20 al tubo 27 la suma de las absorbencias nos da 0.873

0.873
Para saber cuánta proteína se adhirió se divide: 4.864
= 0.17
 Electroforesis de Proteínas

Se realizo en un gel de SDS-poliacrilamida ya que se trata del método mas

ampliamente usado para el análisis cuantitativo de proteínas. El punto principal
de dicho método es la separación de proteínas según su tamaño, lo que nos
permitió obtener el peso molecular de una proteína desconocida.

Metodología.

 Primero era necesario preparar el gel, lo cual por cuestión de tiempo, no se

hizo y el gel ya estaba hecho antes de iniciar la práctica.
 Se ajustó el gel, en lo que parecía ser una base metálica, y posteriormente
se adhirió a la cámara de electroforesis.
 Se utilizó un Buffer para revisar que la cámara de electroforesis no contaba
con ninguna fuga, una vez hecho esto, lo siguiente fue llenar los pozos.
 En el primer pozo se coloco un homogenado de marcadores de peso
molecular conocido, y en los siguientes nueve pozos se coloco un
homogenado de muestra problema.
 Una vez que los pozos estaban listos, la cámara de electroforesis se lleno
hasta la mitad con Tris, cerramos la cámara y la migración de proteínas se
dio primeramente a 80 volts durante 30 minutos y luego 1 110 volts por una
hora.
 Cuando el tiempo de corrida había terminado, se desmontó el gel, con
cuidado ya que se podía romper con facilidad y se sumergió en colorante
azul de Comassie durante 15 minutos.
 Posteriormente para desteñirlo se utilizó una mezcla de metanol al 40 % y
ácido acético al 10 % durante una hora. Y después en una mezcla de
metanol al 5% y ácido acético al 7% durante todo un día.
 Al día siguiente se midieron las distancias de corrida, para realizar los
cálculos correspondientes.

Resultados.

Tabla 4.- Resultados obtenidos en la electroforesis de proteínas.

Marcador Peso Log del peso Distancia Rf

molecular molecular recorrida
(mm)
Miosina 200 000 5.301 12 0.206
B- 116 500 5.066 22 0.38
galactosidasa
Fosforilasa b 97 400 4.988 32 0.55
Albúmina de 66 200 4.82 41 0.706
suero bovino
Ovoalbúmina 45 000 4.65 55 0.95

log P.M. vs Rf
5.4
5.3
5.2
y = -0.8484x + 5.4386
log Peso Molecular

5.1
5
4.9
4.8
4.7
4.6
4.5
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1
Rf

Teniendo la ecuación de la recta, y = -0.8484x + 5.4386 se puede calcular el peso

molecular de una muestra problema.

y = log P.M

x = Rf (mm), de las muestras medidas.

Para la primera banda.

Distancia recorrida = 33 mm

33 𝑚𝑚
𝑅𝑓 =
58 𝑚𝑚

𝑅𝑓 = 0.5689

𝑦 = −0.8484 (0.5689) + 5.4386

𝑦 = 4.955

Pero como lo definimos anteriormente y = log P.M. por lo tanto es necesario

calcular el antilogaritmo para conocer el peso molecular.

𝑃. 𝑀. = 𝑎𝑛𝑡𝑖𝑙𝑜𝑔 4.955

𝑷. 𝑴. = 𝟗𝟎𝟏𝟓𝟕. 𝟏𝟏𝟑𝟕
Para la segunda banda.

Distancia recorrida = 37 mm

37 𝑚𝑚
𝑅𝑓 =
58 𝑚𝑚

𝑅𝑓 = 0.638

𝑦 = −0.8484 (0.638) + 5.4386

𝑦 = 4.8973

Pero como lo definimos anteriormente y = log P.M. por lo tanto es necesario

calcular el antilogaritmo para conocer el peso molecular.

𝑃. 𝑀. = 𝑎𝑛𝑡𝑖𝑙𝑜𝑔 4.8973

𝑷. 𝑴. = 𝟕𝟖 𝟗𝟒𝟒. 𝟑𝟎𝟒
 Actividad enzimática en geles.

Quizá la aplicación más importante de las proteínas es como enzimas, la

actividad enzimática puede ser determinada de diferentes formas, una de ellas
es mediante geles.

 Metodología.
 Para empezar preparamos la cámara de electroforesis siguiendo los pasos
ya realizados en la práctica anterior.
 Al posicionar el gel en la base sufrió una pequeña rotura que nosotros
consideramos que podrían causar alguna anomalía en el resultado final.
 La mezcla a añadir ya estaba preparada y la colocamos en la cámara
con una pipeta Pasteur y un bulbo de plástico.
 Agitamos y vaciamos la solución en la cámara.
 Retiramos el peine y enjuagamos los pozos con agua desionizada.
 Colocamos en cada pozo 5 a 10 µL de la solución de proteínas ya
preparada en amortiguadora de carga que nos fue proporcionada.
 Dejamos una hora las proteínas en su proceso de migración a 110 volts,
manteniendo la cámara en hielo .
 Posteriormente desmontamos el gel con mucho cuidado y la sumergimos
en una solución de Tritón X-100 al 2,5% V/V, en agua durante 45 min a 4 °C.
 Lo lavamos dos veces con agua e incubamos en el amortiguador de
reacción (30 ml de PBS LX con 50 µL de ɞ-mercaptoetanol) a 37 °C durante
30 min.
 Lo lavamos dos veces con agua y teñimos con azul de Cromassie durante
15 min.
 Desteñimos en una sol de metanol al 40% V/V y ácido acético al 10% V/V
durante 15 min.
 Colectamos los residuos en frascos.

Observaciones:

Pudimos ver que dependiendo del volumen colocado en cada uno de los
pocitos, se formó una línea sin tintura. Un espacio de blanco en medio del gel.