Universidade do Estado do Pará

Centro de Ciências Biológicas e da Saúde

Curso de Biomedicina

EMANUELLA SARMENTO ALHO DE SOUSA

PESQUISA DE NOROVÍRUS DO GENOGRUPO

GIV EM INFECÇÕES PEDIÁTRICAS
OCORRIDAS EM BELÉM, PARÁ: UM ESTUDO
RETROSPECTIVO

Belém –PA
2018
 EMANUELLA SARMENTO ALHO DE SOUSA

PESQUISA DE NOROVÍRUS DO GENOGRUPO GIV

EM INFECÇÕES PEDIÁTRICAS OCORRIDAS EM
BELÉM, PARÁ: UM ESTUDO RETROSPECTIVO

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado

como requisito parcial para obtenção do grau de
Bacharel em Biomedicina, Universidade do
Estado do Pará.

Orientador: Prof. Dr. Jones Anderson Monteiro

Siqueira

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Belém – PA C
2018 o
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 EMANUELLA SARMENTO ALHO DE SOUSA

PESQUISA DE NOROVÍRUS DO GENOGRUPO GIV

EM INFECÇÕES PEDIÁTRICAS OCORRIDAS EM
BELÉM, PARÁ:UM ESTUDO RETROSPECTIVO

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado

como requisito parcial para obtenção do grau de
Bacharel em Biomedicina, Universidade do
Estado do Pará.

Orientador: Prof. Dr. Jones Anderson Monteiro

Siqueira
T
Data de aprovação: / / r
Nota: __________ a
b

Banca examinadora: a
l
h
_________________________________ - Orientador o
Prof. Dr. Jones Anderson Monteiro Siqueira
Doutor em Virologia – Instituto Evandro Chagas (IEC)
Instituto Evandro Chagas – IEC d
e

_________________________________ - Membro da Banca Examinadora

Msc. Dielle Monteiro Teixeira C
Mestre em Doenças tropicais – Universidade Federal do Pará (UFPA)
o
Instituto Evandro Chagas – IEC
n
c
_________________________________ - Membro da Banca Examinadora
l
Msc. Paula Cristina Rodrigues Frade
Mestre em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários – Universidade Federal do Pará (UFPA) u
Universidade do Estado do Pará – (UEPA) s
ã
_________________________________ - Membro Suplente da Banca o
Msc. Thayara Morais Portal
Mestre em Biologia Parasitária na Amazônia – Universidade do Estado do Pará (UEPA)
Instituto Evandro Chagas – IEC d
e

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s
o
Dedico esse trabalho aоs meus pais que, cоm
muito carinho е apoio, nãо mediram esforços para
quе еu chegasse a esta etapa dе minha vida.
 AGRADECIMENTOS

A Deus, que me deu força, ânimo e fé para não desistir e continuar lutando por
este sonho e objetivo de vida. A Ele eu devo minha gratidão.

A meus pais, que acreditaram em mim quando eu mesmo não acreditava.

Agradeço por todo o apoio que me deram durante esses anos, as palavras de incentivo e
os gestos e palavras de inspiração que me ajudaram a superar todas as dificuldades.

À minha família e amigos que nunca desistiram de mim e sempre me ofereceram

amor eu deixo uma palavra e uma promessa de gratidão eterna.

À minha orientadora, Dra. Yvone Gabbay, agradeço pela oportunidade e

confiança em mim depositada, que me permitiu crescer como profissional e pessoa.

Ao meu orientador, Dr. Jones Siqueira, por toda ajuda, pelo incentivo quando os
“tombos” me desanimavam, pelos conhecimentos repassados, dedicação, tranquilidade
e, principalmente pela amizade durante todo o percurso. Sempre serei grata pela
orientação e paciência durante esses anos.

A toda equipe do laboratório, obrigada pelo acolhimento e suporte que sempre

me deram. Agradeço a amizade e companheirismo, principalmente nos momentos de
desespero, nos quais vocês sempre me ajudaram.

Aos meus professores, obrigada por exigir de mim muito mais do que eu
imaginava ser capaz de fazer. Deixo aqui minha gratidão por compartilhar sua
sabedoria, o seu tempo e sua experiência.

A todas as pessoas que de alguma forma fizeram parte do meu percurso, eu

agradeço com todo meu coração.
 RESUMO
Os Norovírus (NoV) são considerados a principal causa de epidemias de gastroenterite
(GE) aguda e doenças transmitidas por alimentos em todo o mundo, também é
reconhecido como a segunda causa mais comum de diarreia viral em crianças. A
infecção é caracterizada por vômitos, diarréia e cólicas abdominais. O vírus é
transmitido pela via fecal-oral e, devido à resistência das partículas do vírus nas
superfícies expostas, surtos graves podem ocorrer em condições restritas, como
hospitais, instituições de longa permanência, escolas, acampamentos, e navios. Apesar
de pessoas de todas as faixas etárias estarem em risco de contrair NoV, aqueles nos
extremos de idade e imunocomprometidos correm maior risco de quadros graves. De
todas as faixas etárias, as crianças menores de cinco anos têm a maior incidência de
infecção por NoV. Portanto, o objetivo deste estudo é pesquisar NoV do genogrupo
GIV em casos de infecções pediátricas por GE em Belém, Pará entre os anos de 1990 e
2011. Foram analisados um total de 493 amostras fecais submetidas à reação em cadeia
mediada pela polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR) para detecção, e
quantificação. Foi encontrada uma positividade global de 1,2% (6/493) por qRT-PCR
dos espécimes fecais estudados. Destes, 16% (1/6) proveniente do estudo RIX-4414 foi
coletada no ano de 2002, de uma criança de nove meses de idade com quadro grave de
GE. Outras duas amostras positivas (2/6-33%) foram provenientes do estudo RRV-TV,
coletadas no período de 1990-1991, sendo uma delas também positiva para adenovírus
A. Três amostras (3/6-50%) foram provenientes do projeto Vigilância, coletadas em
2003, sendo todas positivas também para NoV do genótipo variante GII.4-Kaiso_2003.
Assim sendo, faz-se necessária uma vigilância contínua de NoV do genótipo GIV, visto
o pouco que sabe-se sobre sua circulação no meio urbano, contribuindo para um maior
conhecimento sobre o mesmo.

Palavras-chave: Norovírus; Gastroenterite; Criança; Diarreia.

 ABSTRACT
Norovirus (NoV) are considered the leading cause of epidemics of acute gastroenteritis
(AG) and foodborne illnesses worldwide, it is also recognized as the second most
common cause of viral diarrhea in children. The infection is characterized by vomiting,
diarrhea and abdominal cramps. The virus is transmitted by the fecal-oral route and, due
to the resistance of virus particles on exposed surfaces, severe outbreaks may occur in
restricted conditions such as hospitals, long-term institutions, schools, camps, and ships.
Although people of all age groups are at risk of contracting NoV, those at the extremes
of age and immunocompromised are at greater risk of severe disease. Of all age groups,
children under five years have the highest incidence of NoV. Therefore, the objective of
this study is to investigate NoV of the GIV genogroup in cases of pediatric infections by
AG in Belém, Pará between 1990 and 2011. A total of 493 fecal samples were analyzed,
submitted to Reverse transcription polymerase chain reaction quantitative real time
(qRT-PCR) for detection and quantification. A global positivity of 1.2% (6/493) was
found by qRT-PCR of the fecal specimens studied. Of these, 16% (1/6) from the RIX-
4414 study was collected in 2002 from a nine-month-old child with severe AG. Two
other positive samples (2/6-33%) were from the RRV-TV study, collected in the period
of 1990-1991, one of which was also positive for adenovirus A. Three samples (3/6-
50%) were obtained from Surveillance project, collected in 2003, all of them positive
for NoV of the genotype variant GII.4-Kaiso_2003. Thus, a continuous monitoring of
NoV of the GIV genotype is necessary, given the little that is known about its
circulation in the urban environment, contributing to a greater knowledge about the
same.

Keywords: Norovirus; Gastroenteritis; Child; Diarrhea.

 LISTA DE FIGURAS E GRÁFICOS

Figura 1. Ilustração dos reagentes utilizados no procedimento de ligação do inserto ao

vetor. ……………...………........................................................................................... 17

Figura 2. Placas encubando em estufa para crescimento das colônias de bactérias. .... 18

Figura 3. Placa demonstrando as colônias em branco contendo o inserto desejado. ... 18

Figura 4. Visualização, em gel de agarose, do material genético amplificado das 33

colônias. ......................................................................................................................... 20

Figura 5. Dataset do alinhamento e edição das sequencias de nucleotídeos provenientes

do sequenciamento genético das 33 colônias, em comparação ao protótipo e à amostra
de origem ambiental inoculada. ..................................................................................... 21

Figura 6. Reação de qRT-PCR mostrando os cinco pontos de curvas obtidos após

clonagem e diluição dos insertos de norovírus GIV. ..................................................... 22

Gráfico 01 - Análise da distribuição normal e dos valores extremos. .......................... 23

 LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Descrição dos iniciadores e da sonda utilizados na detecção de GIV.1..... 16

Quadro 2 - Reagentes utilizados na reação de qRT-PCR .............................................16

Quadro 3 - Reagentes utilizados na reação de PCR convencional e seminested PCR..19

 SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ..........................................................................................................11
1.1 Estrutura da partícula viral dos norovírus ...................................................... 13
1.2 Classificação ....................................................................................................... .13
1.3 Epidemiologia ..................................................................................................... 13
2 OBJETIVOS ...............................................................................................................14
2.1 Objetivo Geral .................................................................................................... 14
2.2 Objetivos Específicos .......................................................................................... 14
3 MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................................14
3.1 Tipo e local de pesquisa ...................................................................................... 14
3.2 Pacientes e Espécimes ......................................................................................... 14
3.3 Análise Estatística ............................................................................................... 15
3.4 Aspectos Éticos .................................................................................................... 15
3.5 Procedimento Laboratorial ............................................................................... 15
4 RESULTADOS ...........................................................................................................17
5 DISCUSSÃO ...............................................................................................................23
6 CONCLUSÃO.............................................................................................................26
REFERÊNCIAS ............................................................................................................27
ANEXO A – Procedimento Operacional Padrão – Clonagem de DNA ...................32
 11

1 INTRODUÇÃO
A diarreia é uma das principais causas de doença e morte em todo o mundo,
entre crianças menores de 5 anos. (TROEGER et al., 2018). Aproximadamente 2
milhões de casos de pessoas com doenças diarreicas são reportados todos os anos, dos
quais 1,9 milhões são crianças menores de 5 anos de idade, onde os casos evoluem para
a morte em países em desenvolvimento. No Brasil, o grupo mais afetado por doenças
diarreicas é o de crianças menores de um ano de idade. Entre 2000 e 2009, 80% dos 24
mil óbitos registrados no DATASUS foram dessa faixa etária. Na região Norte, a
diarreia é considerada a 8ª causa de mortalidade infantil (FONTOURA et al., 2018). A
infecção pode ser causada por diferentes patógenos como vírus, bactérias e parasitas.
Em relação aos vírus, mais de 20 tipos diferentes são reconhecidos como causadores de
doença diarreica aguda do mundo e provocam um grande impacto na saúde da
população (OKITSU-NEGISHI et al., 2004).
Os Norovírus (NoV) são considerados a principal causa de doenças diarreicas,
ocasionando surtos de gastroenterite (GE) viral em todas as faixas etárias que procuram
assistência médica em departamentos de emergência, clínicas ambulatoriais e
comunidade, constituindo-se como o principal agente etiológico de surtos de diarreia
não-bacteriana (HALL, 2012; TANG et al., 2013).
Globalmente, o papel do NoV como patógeno viral causador de surtos de GE,
sobretudo em locais fechados, bem como, sua participação nas internações hospitalares,
já foi largamente descrita (SALA et al., 2014; WIEGERING et al., 2011). No entanto, a
maioria das pesquisas envolvendo este vírus foca nas infecções causadas pelos
genogrupos GI e GII, ficando subestimados os dados referentes àquelas causadas pelo
genogrupo GIV (ROBILOTTI et al., 2015).
Pouco se sabe a respeito da origem deste genogrupo devido à falta de dados
moleculares mais acurados. Contudo, algumas inferências epidemiológicas já puderam
ser feitas. Sabe-se, por exemplo, que são raramente detectados em casos de surtos de
GE, sendo mais observados em episódios de infecção esporádica e em amostras
ambientais (PINTO et al., 2012).
A análise de seu genoma indica que GIV se apresenta altamente estável nas
regiões codificantes do capsídeo viral, como a região P2 da ORF2 (AO et al., 2014), o
que vai de encontro ao que é amplamente aceito em relação aos demais genogrupos de
NoV que infectam humanos (GI e GII), onde estas regiões são as mais utilizadas para a
 12

caracterização molecular deste agente, justamente, por ser o local mais hipervariado do
genoma, sofrendo maior pressão seletiva e consequentemente, mutação. Devido aos
poucos dados disponíveis envolvendo este tipo de análise molecular em GIV, mais
pesquisas de caracterização são necessárias, a fim de elucidar esta importante
característica voltada aos mecanismos de infecção deste genogrupo no hospedeiro.
Em Belém, no estado do Pará, o GIV já foi detectado entre 2009 e 2010 em
amostras de água superficiais provenientes do Rio Guamá, Baía do Guajará, Igarapé
Tucunduba e das estações de tratamento de esgoto da cidade, apresentando uma
prevalência geral de 9,4% (TEIXEIRA et al., 2015). Contudo, as características clínicas
e epidemiológicas deste genogrupo na cidade de Belém nunca foram antes investigadas,
o que reforça a necessidade de uma pesquisa voltada a saber o envolvimento deste
agente nas infecções entéricas nesta população. Vale ressaltar, que é consenso entre os
pesquisadores, que a presença de GIV em amostras ambientais tem correlação clara com
casos clínicos na população, podendo inclusive ser um indicador de predição de surtos
de GE (SINCLAIR et al., 2008).
Além do genótipo GIV.1, outro genótipo detectado exclusivamente em animais
domésticos (GIV.2) também pertence a este genogrupo. Devido à existência de um
ancestral comum, ambos são geneticamente e antigenicamente relacionados e sugerem
fortemente um potencial zoonótico de transmissão cruzada interespécies. A transmissão
entre diferentes espécies é, ainda, facilitada pela relação social próxima entre humanos e
animais de estimação, a qual poderia gerar novas cepas recombinantes que viriam a
gerar impacto na epidemiologia deste vírus (PINTO et al., 2012; SUMMA et al., 2012).
Estudos de soroprevalência já demonstraram a presença de anticorpos específicos para
GIV.2 (28,2%) em pessoas de um amplo espectro de faixas etárias, reforçando a
hipótese de que humanos podem ser constantemente expostos a NoV que infectam,
teoricamente, somente animais (DI MARTINO et al., 2014). Outra pesquisa
(MESQUITA et al., 2013) demonstrou que veterinários de pequenos animais são
possivelmente mais expostos a GIV.2 devido à alta prevalência de anticorpos
específicos neste grupo (22,3%), em comparação, ao observado no resto da população
(5,8%). Esta estreita relação entre GIV.1 e GIV.2, somada às evidências de infecção
cruzada, reforçam a necessidade de um contínuo monitoramento de ambos os genótipos,
a fim de buscar casos de zoonose na população humana e animal.
Diante do exposto, a presente pesquisa visa a investigação de NoV do genogrupo
GIV em crianças acometidas por GE entre os anos de 1990 e 2011 na cidade de Belém,
 13

Pará, compreendendo o período de 21 anos de investigação em um local onde ainda não

há disponível nenhum dado acerca da circulação deste genogrupo no contexto clínico.
Desta forma, acredita-se ser possível compreender melhor sua ocorrência, distribuição
temporal e escopo epidêmico-molecular, o qual certamente é subestimado em nossa
região.

1.1 Estrutura da partícula viral dos norovírus

Estes agentes pertencem a família Caliciviridae, apresentando genoma
constituído por RNA de fita simples, polaridade positiva (7,5 kb) dividido segundo três
Regiões de Leitura Aberta denominadas ORF (Open Reading Frame). As ORFs do
genoma de NoV são formadas por genes que codificam as proteínas virais.
Neste sentido, a ORF1 é traduzida como uma poliproteína grande, que é co- e
pós- translacionalmente clivada pela protease do vírus-codificado (NS6) para liberar
pelo menos seis proteínas não estruturais (NS) maduras, incluindo NS6
(SOSNOVTSEV et al., 2006). As outras proteínas NS incluem a RNA-dependente
RNA-polimerase (RdRp; NS7), VPg (NS5), a putativa NTPase / RNA helicase (NS3) e
NS1/2 e NS4, que foram ambos implicados na formação do complexo de replicação
(HYDE e MACKENZIE, 2010; HYDE et al., 2009). As ORF2 e ORF3 são traduzidas a
partir de um RNA subgenômico, e codificam as proteínas principais e menores do
capsídeo, VP1 e VP2, respectivamente (THORNE e GOODFELLOW, 2014).

1.2 Classificação
Devido à baixa carga viral nas fezes e à dificuldade de propagação em cultura de
células ou animais de laboratório, a classificação dos NoV só foi definida a partir de
1990 (MORILLO et al., 2011)
Estes vírus podem ser classificados em sete genogrupos compreendidos de GI a
GVII, que são compostos por múltiplos genótipos (VINJÉ, 2015). Entretanto, somente
os genogrupos GI, GII e GIV são infectantes para humanos (GREEN, 2013). O
genótipo GII.4 é o mais amplamente distribuído, sendo responsável por diversas
epidemias globais de GE (EDEN et al., 2013).

1.3 Epidemiologia
O NoV é a causa de GE epidêmica em populações adultas e pediátricas em
uma extensa gama de regiões geográficas (PAYNE et al., 2013). Com o avanço de
 14

métodos moleculares, este agente também tem sido cada vez mais implicado em casos
esporádicos. Uma revisão sistemática de todos os relatos de NoV detectados pela
técnica de RT-PCR atribuiu 5 a 31% dos casos de GE em pacientes hospitalizados e 5 a
36% dos casos adicionais em todos os pacientes que procuram avaliação ambulatorial
(ROBILOTTI et al., 2015).

2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Pesquisar NoV do genogrupo GIV em casos de infecções pediátricas por GE em
Belém, Pará entre os anos de 1990 e 2011.

2.2 Objetivos Específicos

• Padronizar a técnica de duplex RT-PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR) para a
detecção e quantificação dos genótipos GIV.1 de NoV;
• Detectar e quantificar o genoma de NoV-GIV em amostras fecais de crianças com GE;
• Observar casos de co-infecção de GIV com outros genogrupos (GI e GII) de NoV,
previamente identificados nestas amostras;
• Avaliar sinais e sintomas clínicos dos casos positivos, quando possível.

3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Tipo e local de pesquisa
Este estudo baseou-se em uma abordagem quantitativa de pesquisa, de caráter
transversal, com objetivo explicativo, de procedimento experimental (GERHARDT e
SILVEIRA, 2009). O mesmo foi conduzido no Instituto Evandro Chagas (Ananindeua-
PA), Seção de Virologia, Laboratório de Norovírus e Outros Vírus Gastroentéricos.

3.2 Pacientes e Espécimes

A presente pesquisa envolveu o produto de extração, já previamente obtido, de
amostras fecais coletadas de seis estudos (RRV-TV [1990-1992], Nosocomial [1992-
1994], Sentinela [1998-2000], RIX4414 [2001-2002], Vigilância [2003] e Efetividade
[2008-2011]), realizados em hospitais, ambulatórios ou na comunidade, sendo três de
caráter transversal, dois ensaios clínicos randomizados e um do tipo caso-controle. Estes
estudos foram conduzidos pelo Instituto Evandro Chagas (IEC) ao longo de 21 anos de
pesquisas (1990 a 2011) para o desenvolvimento de vacinas contra rotavírus (RV).
 15

A detecção de NoV dos genogrupos GI e GII já foi realizada em todos os 7

estudos (SIQUEIRA et al., 2017), contudo, a pesquisa de GIV nunca foi contemplada.
Em dois estudos (RRV-TV [n=139] e RIX4414 [n=247]) existe disponível para a
triagem deste genogrupo um total de 386 produtos de RNA. Nos demais, foram
analisadas apenas amostras previamente identificadas como positivas para NoV-GI e
GII, a fim de verificar a coinfecção com GIV em um total de 107 casos: Nosocomial
(n=12), Sentinela (n=32), Vigilância (n=30) e Efetividade (n=33). Desta maneira, o
universo amostral do presente estudo foi de 493 amostras testadas.

3.3 Análise Estatística

O universo amostral necessário para a pesquisa foi estimado com o auxílio da
calculadora on-line para cálculos amostrais (SANTOS, 2015), utilizando por base o
total coletado nos dois estudos (3.215 amostras) onde a presença de GIV não havia sido
triada. A um erro amostral de 5%, com intervalo de confiança de 95%, foi calculado
para a pesquisa dos NoV-GIV um total mínimo necessário de 344 amostras. Diante da
escassez de estudos clínicos envolvendo casos de coinfecção entre GIV e GI/GII que
pudessem servir de base para um cálculo amostral, o quantitativo total de espécimes
positivas para GI ou GII (n=107) foi selecionado por conveniência. As demais análises
estatísticas foram realizadas utilizando o programa BioEstat 5.0 (AYRES et al., 2007),
cujo valor de p ≤ 0.05 foi considerado como estatisticamente significante.

3.4 Aspectos Éticos

O estudo que engloba o plano de trabalho aqui apresentado foi aprovado pelo
Comitê de Ética em Pesquisa em Humanos do Instituto Evandro Chagas (CEP/IEC), sob
o no CAAE: 11988512.8.0000.0019 datado de 07 de março de 2013.

3.5 Procedimento Laboratorial

As amostras selecionadas para a detecção de GIV estavam estocadas em freezer
a -30ºC e já se encontravam com seu material fecal extraído pelo método da sílica,
conforme descrito por Boom e colaboradores (1990), a partir de suspensão fecal diluída
em tampão Tris/HCl/Ca++0,01M pH 7,2, a uma concentração de 10% peso/volume.
Posteriormente, foi padronizada a reação de qRT-PCR para a detecção e
quantificação dos genótipos GIV.1 de NoV. Para tal foi utilizado os iniciadores de
cadeia Mon4F/Mon4R (TRUJILLO et al., 2006) e a sonda Ring4TFh adaptada,
 16

conforme preconizado por Farkas et al. (2015) (Quadro 01). As condições de

termociclagem consistiram em uma etapa de transcrição reversa a 50°C por 30 minutos;
atividade enzimática a 95°C por 10 minutos; 40 ciclos de amplificação de 95 °C por 15
segundos (desnaturação) e 60°C por 1 minuto (anelamento e extensão).

Quadro 01. Descrição dos iniciadores e da sonda utilizados na detecção de GIV.1.

Primers/
Polaridade Sequência Referências
Sondas
5′ TTT GAG TCY ATR TAC AAG TGG Trujillo et al.
Mon4F +
ATG C 3′ (2006)
Trujillo et al.
Mon4R – 5′ TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA 3′
(2006)
FAM– CCA ACT TGA TGT TGA CGT Farkas et al.
Ring4TFh +
TGT AGG CG – ZEN/IBFQ (2015)

A reação de qRT-PCR foi realizada com adição de 5 µL do RNA a 15 µL

mistura de reagentes descritos no quadro 02.

Quadro 02- Reagentes utilizados na reação de qRT-PCR.

Reagentes Volume (1X/μL)
H2O 3,2
Master Mix 10,0
ROX (1:10) 0,4
Mon4F 0,3
Mon4R 0,3
Sonda 4TFh FAM/ZEN/IBFQ 0,3
RT SIII / Taq 0,5
Total 15 μL

Para a obtenção dos pontos de curva padrão que foram empregados na

quantificação dos testes, utilizou-se a técnica de clonagem de plasmídeo (pGEM-T Easy
Vector Systems, Promega®) recombinado com inserto de produtos de PCR positivos
para GIV provenientes de amostras ambientais de águas superficiais de Belém
 17

(TEIXEIRA et al., 2015), o qual foi replicado em bactérias competentes do tipo JM109
(JM109 Competent Cells, High Efficiency, Promega®). Posteriormente, os clones foram
submetidos à etapa de extração plasmidial (PureLinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit,
Invitrogen) e então quantificados em quantificador automático de ácido nucleico
(Qubit® dsDNA BR Assay Kit), sendo selecionado o plasmídeo de maior concentração
e melhor qualidade, o qual foi diluído serialmente, gerando cinco pontos de curva, as
quais foram utilizadas nos testes de detecção. As amostras que apresentaram curva
sigmoide e valor de CT até 37, foram consideradas positivas.
O procedimento de clonagem aqui mencionado seguiu de acordo com o descrito
no Procedimento Operacional Padrão (POP) de registro POP SAVIR 13.6 010, do
Laboratório de Norovírus, da Seção de Virologia, do Instituto Evandro Chagas (Anexo
A). As amostras que obtiveram sucesso na técnica de clonagem foram submetidas ao
sequenciamento de nucleotídeos, o qual foi conduzido em um sequenciador de DNA
ABI Prism 3130XL (Applied Biosystems, Foster City, CA) com reação utilizando o kit
Big Dye (v. 3.1; Applied Biosystems), conforme já descrito por Siqueira (2017). As
sequências obtidas foram alinhadas usando o Editor de Alinhamento de Sequências
BioEdit (v. 7.0.9.1) e analisadas no programa MEGA 6 (TAMURA et al, 2013).

4 RESULTADOS
A primeira etapa do procedimento de clonagem consistiu na ligação do inserto
(produto de PCR de NoV-GIV previamente amplificado) ao vetor (Plasmídio) (Figura
01) conforme recomendação do fabricante.

Figura 01- Ilustração dos reagentes utilizados no procedimento de ligação do inserto ao

vetor.

Fonte: Próprio autor.

 18

Para a transformação celular, foi aplicado choque térmico em termobloco a 42°C

por 45-50 segundos. O produto desta transformação foi plaqueado em placas LB
Ágar+Ampicilina+IPTG+Xgal com o auxílio de microesferas de vidro, sendo incubadas
overnight em estufa a 37°C (Figura 02).
Após o crescimento em cultura, as colônias brancas (que contém o inserto dentro
das bactérias) (Figura 03) foram retiradas com o auxílio de ponteira e depositadas,
individualmente, em tubos contendo meio de cultivo LB líquido+Ampicilina.

Figura 02- Placas encubando em estufa para crescimento das colônias de bactérias.

Fonte: Próprio autor.

Figura 03- Placa demonstrando as colônias em branco contendo o inserto desejado.

Fonte: Próprio autor.

 19

Após o crescimento em meio de cultivo líquido, as colônias selecionadas (que

apresentaram turbidez e formação de pellet no fundo do tubo) foram submetidas à PCR
convencional e em seguida à seminested PCR utilizando os mesmos oligonucleotídeos
descritos para a etapa de PCR, sob as mesmas condições de termociclagem nas duas
etapas: desnaturação a 94°C por 3 minutos; 40 ciclos (na PCR; e 35 ciclos na
seminested) de amplificação de 94°C por 30 segundos (desnaturação), anelamento a
50°C por 30 segundos e extensão a 72°C por 1 minuto; extensão final a 72°C por 7
minutos. A reação de PCR convencional foi realizada com adição de 5 µL das colônias
que cresceram no meio LB líquido a 20 µL da mistura de reagentes, e a etapa de
seminested utilizou 2 µL da PCR convencional a 23 µL da mistura de reagentes
descritos no quadro 03.

Quadro 03- Reagentes utilizados na reação de PCR convencional e de seminested PCR.

Reagentes PCR Convencional Seminested Volume
Volume (1X/μL) (1X/μL)
H2O 13,50 16,0
DNTP 2,0 2,0
10X Buffer 2,5 2,5
MgCl2 0,5 1,0
Primer COG4F 0,5 0,5
Primer G4SKR 0,5 0,5
Taq DNA polimerase 0,5 0,5
Total 20 μL 23μL

Posteriormente, os produtos da amplificação foram visualizados em gel de

agarose (Figura 04) e somente aqueles que apresentaram amplificação é que foram
purificados com o kit de extração do DNA plasmidial e, então, encaminhados para
sequenciamento de nucleotídeos.
 20

Figura 04- Visualização, em gel de agarose, do material genético amplificado das 33

colônias.

Fonte: Próprio autor.

As amostras purificadas foram, então, encaminhadas ao sequenciamento

nucleotídico, a fim de confirmar que o inserto ligado ao plasmídeo era o de interesse
(amostra GIV-1 de origem ambiental), a fim de ser utilizado na produção das curvas-
padrão. O resultado do sequenciamento confirmou que o inserto presente no plasmídeo
foi pertencente ao genótipo GIV de NoV, apresentando 99,62% de similaridade com a
amostra inoculada nas bactérias competentes (Figura 05).
 21

Figura 05- Dataset do alinhamento e edição das sequencias de nucleotídeos provenientes do sequenciamento genético das 33 colônias, em
comparação ao protótipo e à amostra de origem ambiental inoculada.

Fonte: Próprio autor.

 22

Após o sequenciamento, as amostras foram quantificadas, selecionando-se o

plasmídeo com a melhor concentração e qualidade de material genético (83,9 ng/µL) para a
confecção dos cinco pontos de curva, a partir de uma diluição seriada (2,3 x 107 a 103), sendo,
por fim, testados pela técnica de qRT-PCR (Figura 06).

Figura 06- Reação de qRT-PCR mostrando os cinco pontos de curvas obtidos após clonagem
e diluição dos insertos de norovírus GIV.

Fonte: Próprio autor.

Após a conclusão da padronização da técnica de qRT-PCR, as 493 amostras

selecionadas para este estudo foram triadas para NoV-GIV, obtendo-se uma positividade de
1,2% (6/493). A variação de CT foi de 22,99 a 37,79, apresentando média de 33,51, desvio
padrão de 5,39 e p-valor <0.05. A análise estatística revelou o CT de 22,99 como sendo um
valor extremo significante dentro da distribuição normal do conjunto de dados (ciclos de
detecção) analisados (Gráfico 01, a). Em relação às cópias genômicas, houve uma variação de
365,42 a 1,1x104 ng/µL, com média de 3915,4367, desvio padrão de 4442,9899 e com p-valor
sem significância estatística (Gráfico 01, b).
 23

Gráfico 01- Análise da distribuição normal e dos valores extremos correspondentes ao ciclo
de detecção (a) e de cópias genômicas (b), observados nos testes de RT-qPCR para a detecção
de NoV-GIV aplicados nas amostras positivas.

a) b)
CT ng/µL

CT 22,99
Valor extremo

Fonte: Próprio autor.

Das seis amostras positivas, uma, proveniente do estudo RIX-4414, foi coletada no
ano de 2002, de uma criança de nove meses de idade, com resultados negativos para
astrovírus, rotavírus e NoV. A criança apresentava sintomas associados a quadro diarreico há
13 dias, acompanhados de febre, três evacuações diárias, 25 episódios de vômitos, durante o
período de diarreia, com sinais clínicos de desidratação e doença respiratória, fazendo o uso
de hidratação, antibioticoterapia e medicação (Sulfametoxazol e Metoclopramida associada à
Trimetroprima). Outras duas amostras positivas foram provenientes do estudo RRV-TV,
coletadas no período de 1990-1991, sendo uma delas também positiva para adenovírus A,
evidenciando uma coinfecção viral. As demais três amostras foram provenientes do projeto
Vigilância, coletadas em 2003, sendo todas positivas também para NoV do genótipo variante
GII.4-Kaiso_2003.

5 DISCUSSÃO
O desenvolvimento de técnicas laboratoriais é essencial para a realização de testes de
detecção e genotipagem viral. Contudo, na ausência de kits comercialmente disponíveis para
 24

rápida detecção de amostras positivas, podem ocorrer discrepâncias acentuadas nos resultados
obtidos. O NoV GIV torna-se um genótipo pouco estudado devido à pouca oferta de testes
disponíveis. Técnicas moleculares como PCR quantitativa (qPCR) e PCR quantitativa a partir
de transcrição reversa (qRT-PCR) são frequentemente usadas para a detecção rápida e precisa
de ácidos nucléicos derivados de patógenos (FARKAS et al. 2017). Estes fatores, aliados à
necessidade de garantir a reprodutibilidade da técnica no Laboratório de Norovírus e outros
vírus gastroentéricos, da seção de Virologia, do Instituto Evandro Chagas, nos conduziram a
padronização da técnica de RT-qPCR para a detecção e quantificação dos genótipos GIV.1 de
NoV.
Para essa padronização, foi executado o procedimento de ligação do inserto ao vetor,
sendo este de difícil execução devido a uma contaminação por NoV GII.4, fazendo com que o
inserto ligado não fosse o de interesse. Então, realizou-se uma nova tentativa, porém não
houve crescimento bacteriano no meio de cultura. Enfrentamos tais dificuldades, mesmo
recorrendo a protocolos já bem definidos e testados. Contudo, ao fim, o sucesso na
padronização da técnica permitiu ao laboratório a detecção de NoV-GIV em amostras
ambientais e humanas de forma mais rápida e sensível.
Até o presente momento, o NoV GIV pouco é relatado em seres humanos. O genótipo
GIV.1 humano foi identificado, pela primeira vez, a partir de casos esporádicos de GE
(VINJÉ, et al. 2000). A partir de então, eles foram ocasionalmente identificados em exames
de rotina em amostras clínicas e ambientais (AO Y-Y, et al. 2014). No presente estudo, foram
identificadas seis amostras positivas para NoV de genótipo GIV.1, demonstrando uma baixa
prevalência comparado ao número de amostras testadas e a outros estudos no Brasil e no
mundo que já relataram sua prevalência. Uma pesquisa realizada por Fioretti et al., na cidade
do Rio de Janeiro, testou 316 amostras clínicas para GIV, obtendo uma prevalência de 0,9%.
Outro estudo, realizado por van Beek et al., com 16.635 amostras obtidas de investigações de
surtos de GE na União Européia, no período de 2005 a 2016, mostraram uma prevalência de
sete (<0·1%) de GIV.1. As prevalências encontradas nos dois estudos foram menores do que a
encontrada na presente pesquisa. No entanto, nossos achados indicam que existiu a circulação
destes agentes no meio urbano de Belém, o que remonta a uma necessidade de vigilância
epidemiológica mais atual, que possa determinar a circulação recente e o real impacto deste
genótipo no quadro das infecções agudas por diarreia.
Vale mencionar, que a análise da distribuição normal dos ciclos de detecção e de carga
viral, observados nas seis amostras positivas para GIV, demonstrou que o CT 22,99 da
amostra COD 011 (proveniente de criança inscrita no projeto RRV-TV), se revelou um valor
 25

extremo dentro do grupo analisado. Em estatística, valores extremos, também conhecidos

como outliers, desempenham importante função em certas conclusões de pesquisas, por
indicarem falha na coleta de dados ou registro das amostras, erros de equipamento,
discrepâncias na natureza amostral, ou mesmo para confirmar que este valor extremo está
correto (AYRES et al., 2007).
No presente caso, o CT de 22,99 apresenta o maior intervalo de detecção de GIV
quando comparados aos demais CTs (32,83; 35,5; 35,61; 36,57; e 37,59). Ademais, espera-se
que o menor ciclo de detecção sugira uma maior carga viral na amostra, o que não ocorreu
nos testes conduzidos na presente triagem, onde a maior carga viral foi detectada no CT
35,61. Devido a estes fatores, o valor extremo encontrado na análise estatística indica que os
testes de RT-qPCR devam ser repetidos em duplicata para fins de comparação entre si e com
os resultados previamente obtidos. Além disto, uma calibração do aparelho, ou mesmo, a
utilização de outro termociclador, seria uma proposta interessante para diminuir vieses de
análise que possam ser observados por este motivo.
Como um genogrupo dominante em todo o mundo, as cepas do GII contribuem para a
maioria das GE virais, em particular, as cepas GII.4, que causaram pelo menos 4 pandemias
desde o final dos anos 90 (HUANG et al. 2013). Das seis amostras positivas identificadas, três
apresentaram coinfecção com o genótipo GII.4-Kaiso_2003 e, em uma, foi identificada
infecção mista com o adenovírus, totalizando quatro amostras com múltiplas infecções virais,
sugerindo um papel secundário do genótipo GIV.1 em casos de GE.
No entanto, foi identificada uma amostra positiva para GIV proveniente de uma
criança de nove meses de idade, com quadro grave de GE. Este espécime fecal já havia sido
testado para todos os principais vírus causadores da doença, incluindo o NoV-GI e GII, porém
apresentou positividade somente para GIV fazendo com que se questione se este genogrupo
não pode estar relacionado a quadros graves da doença. Contudo, somente estudos mais
acurados nesta amostra, como aqueles envolvendo a metagenômica, é que poderão comprovar
se de fato o quadro clínico estabelecido nesta criança foi causado apenas pelo NoV-GIV.
Ainda em relação à criança com suspeita de infecção única por GIV, vale ressaltar que
a sua amostra apresentou a maior carga viral dentre todas as positivas no presente estudo
(1,1x104 ng/µL). De maneira semelhante, outros estudos, inclusive com crianças
hospitalizadas de Belém (FUMIAN et al., 2013; REYMÃO et al., 2018), já relataram que
altas cargas virais em fezes de pacientes com GE por NoV, podem estar associados a quadros
mais graves desta síndrome em menores de 5 anos.
 26

6 CONCLUSÃO
Os presentes dados demonstram a circulação de NoV pertencente ao genótipo GIV.1
em amostras humanas provenientes de Belém e região metropolitana, destacando a
importância de uma vigilância ativa deste genótipo, especialmente devido aos escassos dados
sobre a circulação desta linhagem viral em Belém, sendo esta, a primeira pesquisa deste
agente envolvendo amostras clínicas em nossa região. Assim, mais pesquisas envolvendo o
NoV GIV devem ser realizadas para obter informações a respeito deste genótipo, a fim de que
se estabeleça o real impacto que a circulação deste agente pode causar em termos de saúde
pública em nossa região.
 27

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ANEXO A – Procedimento Operacional Padrão – Clonagem de DNA

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