Determinación de estrógenos en la leche mediante extracción en fase

sólida mediada por fibra de polipirrol seguida de cromatografía

líquida de alto rendimiento

Lanlan Wei, a, # Yan Yan, b, # Jianjun Deng, c Yuqin Ma, c Yu Wang, d Xiaoxiao Wu e y

Xuejun Kang * , d

un laboratorio clave de medicina e ingeniería ambiental (Ministerio de Educación),

Escuela de Salud Pública, Universidad del Sureste, 210009 Nanjing, China

bJiangsu Producto calidad Evaluación e Instituto de Inspección, 210000 Nanjing,

China

c Suzhou Dongqi Biological Technology Co., Ltd., 215123 Suzhou, China

dLaboratorio clave de desarrollo infantil y ciencias del aprendizaje (Ministerio de

Educación),
Escuela de Ciencias Biológicas e Ingeniería Médica, Universidad del Sureste, 210096 Nanjing,
China

eCentro Nacional de Inspección de Inspección de Alimentos Procesados y Aditivos

Alimentarios de Calidad,
Instituto de inspección de calidad de productos de Nanjing, 210019 Nanjing, China

Se desarrolló un método de extracción en fase sólida (SPE) basado en

nanofibras conductoras de polipirrol (PPy) que se fabricaron mediante
electrospinning y polimerización in situ . Para la determinación de tres
estrógenos sintéticos, a saber, dietilestilbestrol (DES), dienestrol (DIS) o
hexestrol (HS) en la muestra de leche, se utilizó una mediada por nanofibras
PPy seguidas de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). Se
optimizaron las condiciones de extracción, incluidas las nanofibras de
extracción, el pH de la solución de donante y la concentración de sal. Los
compuestos diana se extrajeron de una muestra acuosa de 0,5 ml a pH 5,0 a
través de fibras de PPy, y luego se eluyeron con 0,1 ml de metanol. Después
de la extracción, el eluyente se inyectó directamente en un sistema de
HPLC para la detección. Bajo las condiciones de extracción optimizadas, se
logró un gran factor de enriquecimiento para tres estrógenos.El límite de
detección (LOD) en una relación señal / ruido (S / N) de 3 varió de 0.02 a 0.05
μg mL -1 para los estrógenos en la muestra de leche.

Ke ywords: productos lácteos líquidos, fibras empacadas, extracción en

fase sólida, alto rendimiento. cromatografía de líquidos, estrógenos

Introducción

Los estrógenos tienen b een considerado como uno de los grupos de analitos en cuestión en ciertas matrices
de alimentos, sobre todo en la leche y otros productos lácteos. 1 Los estrógenos sintéticos como el
dietilestilbestrol (DES), el dienestrol (DIS) y el hexestrol (HS) son factores reguladores potentes en la medicina
de respuesta fisiológica, y se han utilizado ampliamente como promotores del crecimiento en el ganado y como
tratamiento para los trastornos por deficiencia de estrógeno en la medicina veterinaria. .
Se han aplicado una variedad de técnicas para determinar los estrógenos. Se sabe que el abuso de
estrógenos es muy dañino para los humanos debido a sus posibles propiedades carcinogénicas. El uso de
estrógenos en la producción de alimentos.
la concentración de DES en matrices complejas suele ser extremadamente baja, se requiere una etapa de
preconcentración, como la extracción en fase sólida (SPE) y la microextracción en fase líquida (LPME). Sin
embargo, la falta de selectividad y la baja recuperación son los principales problemas en la determinación de
los estrógenos mediante el uso de muestras comunes de preconcentración. 12-15
La extracción en fase sólida, debido a sus ventajas como menor consumo de solventes orgánicos,
simplicidad, alta tasa de recuperación, fácil operación y automatización, ha sido

Ampliamente aplicado a la extracción de diferentes compuestos. 16 Recientemente, se ha desarrollado un nuevo

método de extracción en fase sólida basado en nanofibras de polímeros electrohilados como adsorbentes para
enriquecer los compuestos diana. 17Debido a su gran área de superficie a relación de volumen, las nanofibras
electrohiladas facilitan la miniaturización de la SPE cuando se empaquetan en una punta de pipeta como los
lechos de sorbente. Con esta plataforma de extracción en fase sólida de fibra empaquetada (PFSPE), la
capacidad de extracción podría mejorarse de manera eficiente y el volumen de disolvente de desorción se
podría reducir a niveles de microlitro. Por lo tanto, el paso de evaporación ya no es necesario. El PFSPE se ha
aplicado con éxito en análisis farmacéuticos y estudios farmacocinéticos de animales y humanos, análisis de
ingredientes funcionales en alimentos saludables y determinación de contaminantes ambientales en varias
matrices de muestras, etc. 18 PFSPE que utiliza nanofibras de poliestireno (PS) como agente de extracción junto
con un alto rendimiento La cromatografía líquida (HPLC) se utilizó espectrometría de masas en tándem (MS /
MS) para la determinación simultánea de tres estrógenos, incluyendo DES, HS y DIS en productos lácteos
líquidos 19 , pero los compuestos objetivo deben extraerse con acetonitrilo, y se realizó una etapa de
evaporación. Necesario para eliminar el solvente orgánico antes de PFSPE.

En los últimos años, los polímeros conductores han atraído un gran interés por la extracción de
compuestos polares debido a sus siguientes ventajas. Tienen una alta eficiencia de extracción para los
compuestos polares debido a su multifuncionalidad inherente e inusual, como las propiedades de
intercambio iónico, las interacciones π - π , los enlaces de hidrógeno, las propiedades ácido-base, los
grupos funcionales polares y la electroactividad. 20 Entre los polímeros conductores, el polipirrol (PPy) es
especialmente prometedor para aplicaciones comerciales debido a su mejor estabilidad ambiental
y síntesis fácil. 21 En este documento, desarrollamos un método SPE combinando las ventajas de PPy y
PFSPE. DES, DIS y HS en la leche se seleccionan como los analitos modelo para mostrar la aplicación
potencial de las fibras de PPy en el PFSPE de estas moléculas después de una simple precipitación de
proteínas en la leche. Las estructuras de DES, DIS y HS se muestran en la Figura 1. En condiciones de
extracción optimizadas, el método propuesto se calibra para el análisis cuantitativo de los compuestos
objetivo en muestras de leche.

Experimental

Reactivos y productos químicos.

Los estándares DES, DIS y HS se adquirieron de Sigma-Aldrich (EE. UU.). Las nanofibras PPy fueron de
Dongqi Bio-Technology Co., Ltd. (China). El metanol de calidad para HPLC fue de Sinopharm Chemical Reagent
(China). Cada estrógeno se disolvió en metanol para obtener una solución estándar con una concentración de 0.1 mg
mL -1 y se almacenó a 4 ° C. Las soluciones de trabajo con 0.16, 0.47, 1.42, 4.27 y 12.80 μg mL -1 de DIS; 0.49, 0.99,
1.97, 3.94 y 7.89 μg mL -1 de DES; y se obtuvieron 0.17, 0.51, 1.51, 4.62 y 13.85 μg mL -1de HS diluyendo
la solución de 0.1 mg mL -1 con agua ultrapura.

Caracterización de C

Las imágenes de morfología de las nanofibras PS y nanofibras PPy se obtuvieron utilizando un

microscopio electrónico de barrido (SEM, Hitachi S-3000N, Japón), a un voltaje de aceleración de 10 kV
y un analizador de superficie y porosidad específico (Micromeritics ASAP2020, EE. UU.).

Instrumentación

La centrífuga se compró a Ruijiang Corporation (China). El mezclador vortex XW-80A era de Vimins
(China). La columna de PFSPE (tipo de copolímero de estireno) y el dispositivo de extracción de matriz SPE se
adquirieron de Suzhou DongQi Biological Technology Co., Ltd. (China). El sistema de HPLC consistió en una
bomba LC-20A, un detector SPD-M20A, un inyector automático SIL-20AC y un horno CTO-20A comprado
en Shimadzu Corporation (Japón), equipado con una columna analítica (Shimadzu C18, 250 × 4.6 mm 2 , 5
µm) conectado a un detector de matriz de fotodiodos. La fase móvil consistió en 60% de metanol en 20 mmol
L -1 de hidrógeno fosfato de sodio (v / v), pH 6.0. La velocidad de flujo se mantuvo constante en 1,0 ml min -1 y
la longitud de onda para el detector UV se ajustó a 230 nm.

Preparación de muestras

La leche fue comprada en un supermercado en Nanjing, China. Muestras típicas sin estrógenos
detectables.

Se identificaron mediante un método de literatura como muestras en blanco. 22

La preparación de la muestra de leche empleó los siguientes pasos: ( i ) inserción de 1,8 ml de leche en un
tubo de centrífuga de 4 ml; ( ii ) adición de 0.2 mL de estrógenos (DIS, DES y HS) con la concentración
apropiada; ( iii ) adición de 1.0 mL de acetocaustin al 30%; ( iv ) sonicación de la mezcla durante 10 min y
centrifugación a 4000 rpm durante 10 min, luego separación del sobrenadante; ( v ) transferir el sobrenadante
total a un tubo limpio y modificar a pH 5 agregando 220 μL de solución de hidróxido de sodio 4,0 mol L -
1 antes del tratamiento de PFSPE.

La columna de PFSPE, como se muestra en la literatura, 23 fue precondicionada por 100 μL de metanol
y luego 200 μL de agua. El sobrenadante total se cargó y empujó a través del sorbente por la presión del
aire forzado por una jeringa de plástico hermética al gas. El objetivo retenido en el PFSPE se eluyó con
100 μL de metanol y se inyectaron 20 μL de elución en la HPLC mediante un muestreador automático.

Resultados y discusión

Morfología de las fibras de PPy.

La superficie de las nanofibras de PPy sintetizadas por ultrasonidos parece bastante suave a un bajo
aumento (Figura 2a). Las nanofibras tenían un diámetro exterior de aproximadamente 620 ± 410 nm. Se
generaron nanofibras PS con morfología uniforme y uniforme y orientación aleatoria con un diámetro
medio de 460 ± 100 nm (Figura 2b). Como se observa en las imágenes, la presencia de la nanoestructura
podría proporcionar un área de superficie específica alta y muchos sitios de interacción que podrían
ofrecer una mayor eficiencia de SPE.
Las propiedades texturales, que incluyen el área de la superficie de Brunauer-Emmett-Teller (BET), el
volumen de los poros y el tamaño de los poros se enumeran en la Tabla 1. Se puede observar que la superficie
de BET y el volumen de los poros de las nanofibras de PPy fueron las más bajas.

Tabla 1. Propiedades texturales de los materiales ensayados.

Área de superficie BET / Volumen de poros /

Material
(m 2 g -1 ) (cm 3 g -1 )
Nanofibras PPy 10.50 0.02
Nanofibras PS 42.31 0.26

BET: Brunauer-Emmett-Teller; PPy: polipirrol; PS: poliestireno.

Extracción en fase sólida de estrógenos.

Primero, se investigó el efecto de las características de las nanofibras sobre la eficiencia de la

extracción. En este trabajo, se evaluaron dos tipos de nanofibras preparadas con un marco diferente para sus
recuperaciones de extracción. Como se muestra en la Figura 3, las recuperaciones de extracción de nanofibras
PPy para DES, DIS, HS fueron 27.0, 35.0 y 38.0%, respectivamente.

.
Los cuales fueron más altos que los de las nanofibras PS. Sin embargo, el diámetro de las nanofibras de PPy era más
grueso (Figura 2) y el área de la superficie BET era más pequeña (Tabla 1). El resultado podría explicarse por el
mecanismo de interacción entre PPy y los analitos, porque la estructura π conjugada se encontró en el esqueleto de
PPy, que mostró una fuerte interacción con los analitos, y también podría existir una interacción de enlace de
hidrógeno entre el polímero y los analitos, como se muestra en la Figura 4.

La Figura 5 describió el método convencional de ión de extracto previamente informado para determinar
los estrógenos. En comparación con los métodos convencionales, el método PFSPE tenía ventajas como un
menor consumo de solventes orgánicos, simplicidad, alta tasa de recuperación, fácil operación y
automatización. Se observó un esquema en forma de V de la eficiencia de elución frente al pH de la
solución de donante. El área del pico mejoró con el aumento del pH hasta su punto más alto (pH 5),
después de eso, el área del pico se redujo. Por lo tanto, se seleccionó pH 5.0.

Para investigar el efecto del pH, el valor de pH de la solución de dono se ajustó a 3.0, 4.0, 5.0 y 6.0
con 4.0 mol de L- 1- NaOH. Como se muestra en la Figura 6, una invertida

Efecto de la concentración de sal. fue 0.02 μg mL -1 para DIS, 0.05 μg mL -1 para DES, y
0.02 μg mL -1 para HS.
El efecto de la concentración de sal en la fase donante.
También se investigó. NaCl se añade a concentraciones de Tabla 2. Desempeño del método.
0.01, 0.05, 0.15 y 0.35 g mL -1 . Como se muestra en la Figura
7,
La adición de NaCl mejoró la recuperación de los analitos. Linealidad
Sin embargo, la recuperación en 0,15 g mL -1 NaCl es menor Objetivo LOD / RSD /%
que compuesto distancia / R 2 (μg mL -1 ) (n = 3)
(μg mL -1 )
que en 0,05 g mL -1 NaCl. Dos procesos simultáneos.
DES 0.49-7.89 0.997 0.05 6.8
Podría explicar este fenómeno. Con la adición de sal,
Se generan esferas de hidratación alrededor de la sal iónica. DIS 0.16-12. 80 0.997 0.02 9.5
Moléculas en solución acuosa. Estas esferas de hidratación. HS 0.17-13.85 0.998 0.02 7.9
R 2 : coeficiente de correlación; LOD: límite de detección; RSD:
Reducir la cantidad de agua que disuelve el analito. estándar relativo
moléculas, resultando en analitos adicionales moviéndose cerca desviación; DES: dietilestilbestrol; DIS: dienestrol; HS: hexestrol.
el sorbente 24 Al mismo tiempo, las moléculas de estrógeno
pueden
Participar en interacciones electrostáticas con la sal en Aplicabilidad a la detección en muestra real.
solución, disminuyendo así su capacidad de moverse en el
Nanofibras de extracción. Inicialmente, el proceso
predominante. El método analítico propuesto se aplicó a la
Análisis de muestras de leche compradas en un
Sería la interacción de las moléculas de sal con el agua. supermercado de
moléculas; pero como la concentración de sal aumentó aún más, Nanjing, China, y no se detectaron analitos objetivo. los
Las moléculas de sal interactuarían con las moléculas de Las muestras fueron luego enriquecidas
analito. Eso con estándaresDES a 0.8 y
Parecía razonable agregar 0.05 g mL -1 NaCl al donante 1.6 μg mL -1 niveles, y DIE y HS a 0.3 y 0.9 μg mL -1
Niveles para evaluar los efectos de la matriz. Se
Fase, ya que contribuyó a la mejor eficiencia de extracción. detectaron estrógenos
en muestras de leche (como se muestra en la Figura
Sin embargo, en vista de la sal introducida en los pasos de 8 ) .Las recuperaciones
de la leche en blanco se presentan en la Tabla 3,
proteína precipitante y ajuste de pH, NaCl no fue indicando
añadido a la muestra en el análisis de las muestras. que la influencia de la matriz no fue significativa para
análisis de los
alimentos.
Figura 7. Efecto de la concentración de sal en la extracción.

Validación del método.

Se investigó la linealidad y el límite de detección (LOD) del método bajo las condiciones de extracción
óptimas (Tabla 2) para evaluar la aplicabilidad práctica del enfoque PPy. Se encontró una buena linealidad
dentro del rango de 0.49-7.89 μg mL -1 para DES, 0.17 - 13.85 μg mL -1 para HS y 0.16-12.80 μg mL -1 para
DIS. Se obtuvieron coeficientes de correlación (R 2 ) mejores que 0,99. Las desviaciones estándar relativas
(RSD) de DES, DIS y HS fueron 6.8, 9.5 y 7.9%, respectivamente. LOD

Conclusiones

En este documento se presentó un método de HPLC-UV rápido y sensible para la determinación de estrógenos en
la leche. Si bien nuestro grupo ya informó sobre nanofibras PS basadas en PFSPE junto con HPLC-MS / MS, se
requieren equipos especiales y costosos, incluso se requiere personal con un alto nivel de operación. Este manuscrito
proporciona

una método de determinación de costos con un pretratamiento simple para los tres estrógenos en los
alimentos - baja. El método de pretratamiento PFSPE ofreció una operación simple, rápida y de bajo
costo. La cantidad de microlitro de solvente eluyente podría mejorar el proceso de enriquecimiento
convencional, lo que obviamente ilustra el respeto al medio ambiente. Además, las recuperaciones de
extracción más altas y la buena reproducibilidad fueron especialmente adecuadas para el análisis de trazas
de las muestras.

Expresiones de gratitud

Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencia de China (No. 81673230, No. 21307086 y
No. 81172720); el Programa de Investigación de Desarrollo Social del departamento de Ciencia y Tecnología
de la provincia de Jiangsu

Figura 8. Espectros HPLC-UV de muestras reales. (A) Cromatograma de solución estándar después de la extracción; (B)
cromatograma de muestra de leche enriquecida con cada analito después de la extracción; y (C) cromatograma de la muestra de
leche después de la extracción. Analitos: (a) DES, (b) DIS, y (c) HS.

Tabla 3. Resultados del análisis de DIS, DES y HS en la leche

DIS / (μg DES / (μg HS / (μg mL -

Recuperación Recuperación Recuperación
Muestra mL -1 ) /% mL -1 ) /% 1 ) /%
1 - - -
2 - - - - - -
3 - - -
1 97.5 102.5 100.0
2 0.3 102.5 0.8 93.2 0.3 97.6
3 100.0 104.3 101.2
1 98.9 100.0 100.0
2 0.9 103.4 1.6 96.9 0.9 97.8
3 97.7 104.7 101.1

DES: dietilestilbestrol; DIS: dienestrol; HS: hexestrol.