Richard J.

Miron Anton potencial osteoinductivo de una novela de injerto de

Sculean Yang Shuang
hueso de fosfato de calcio bifásico en comparación
Dieter D. Bosshardt con autógrafos, xenoinjertos, y DFDBA
Reinhard Gruber Daniel
Buser Fatiha Chandad
Yufeng Zhang

afiliaciones de los autores: palabras clave: injertos óseos, mineral del hueso natural, osteoinducción, el potencial osteoinductivo
Richard J. Miron, Fatiha Chandad, Facult correo de Médecine Dentaire, Pavillon
de M Edecine Dentaire, Universit e Laval, Qu EBEC City, QC, Canadá
Resumen Objetivos: Desde la descripción original de osteoinducción en el siglo 20, ha surgido el estudio y desarrollo de biomateriales
Richard J. Miron, Anton Sculean, Dieter D. Bosshardt, Reinhard innovadores. Recientemente, nuevos injertos óseos sintéticos han sido reportados con potencial para formar hueso ectópico en vivo. Sin
Gruber, Departamento de Periodontología, Escuela de Medicina
embargo, su caracterización completa en comparación con otros injertos óseos principales no se ha investigado. El objetivo de este estudio
Dental de la Universidad de Berna, Berna, Suiza
fue determinar el potencial osteoinductivo de los injertos de hueso mediante la comparación de los injertos de hueso autógeno,
Richard J. Miron, D. Dieter Bosshardt, Reinhard Gruber, Daniel Buser, Departamento desmineralizada aloinjertos óseos liofilizados (DFDBA), un comúnmente utilizado minerales hueso natural (NBM) de origen bovino (Bio-Oss),
de Cirugía Oral y Estomatología, Facultad de Medicina Dental de la
y una fosfato de nuevo desarrollo de calcio bifásico (BCP).
Universidad de Berna, Berna, Suiza

Yang Shuang Zhang Yufeng, La cría Base Laboratorio Estatal de Ciencias

Básicas de la estomatología (Hubei-MOST), clave Laboratorio de Oral
Materiales y métodos: Se compararon los injertos in vitro por su capacidad para estimular las células del estroma de médula ósea (BMSC) la
Ministerio de Educación, Escuela y el Hospital de Estomatología, Universidad
de Wuhan, Wuhan, China de Biomedicina migración, proliferación y diferenciación como se evalúa por cuantitativa en tiempo real PCR para los genes que codifican para los marcadores

óseos incluyendo Runx2, colágeno I, y la osteocalcina. Además, los injertos óseos fueron implantados en el músculo de la pantorrilla de 12 perros

Beagle para determinar su potencial para formar hueso ectópico en vivo.

Autor correspondiente:
Richard J. Miron
resultados: los in vitro resultados demuestran que tanto los autoinjertos y DFDBA muestran potencial para el reclutamiento de células,
Universit e de Laval
2420, rue de la Terrasse, 1716 Quebec, QC mientras que sólo los autoinjertos y BCP demostraron la capacidad para diferenciar BMSCs hacia el linaje de osteoblastos. los en vivo modelo
G1V 0A6 Canadá de hueso ectópico demostró que mientras que las partículas NBM no eran osteoinductiva y los injertos de hueso autólogo se reabsorben

rápidamente en vivo,
Tel .: +1 418 656 2131 Fax: +1
418 656 2720 la formación de hueso ectópico se informó en DFDBA y en los injertos BCP sintéticos.
e-mail: richard.miron.1@ulaval.ca Conclusión: Las modificaciones en nanotopografía y la composición química del hueso BCP recientemente desarrollado injertos

significativamente promovió la formación de hueso ectópico confirmando su potencial osteoinductivo. En conclusión, los resultados de este

estudio proporcionan pruebas de que los injertos de hueso sintético no sólo sirven como un andamio tridimensional pero también son capaces

de promover la osteoinducción.

materiales de injerto de hueso han sido ampliamente utilizado en el en filtración, (2) demostrar el potencial osteoinductivo por el

campo de la odontología para defectos óseos fi ll causados ​por reclutamiento y la inducción de células mesenquimatosas para

trauma, enfermedad periodontal, la infección, y una variedad de diferenciarse en osteoblastos maduros boneforming, y (3) contienen

trastornos bioquímicos y esqueléticos. Con los años, el papel de los células progenitoras osteogénicas dentro del andamio injerto óseo

biomateriales ha cambiado de una red de apoyo pasivo, estructural a capaz de formar una matriz de hueso nuevo.

uno que puede proporcionar y organizar el proceso de migración

celular y / o diferenciación hacia un linaje formadora de hueso En consecuencia, el estándar de oro de materiales de injerto

(Langer y Tirrell 2004; Miron y Zhang 2012 ). Por lo general, el óseo es hueso autógeno debido a su excelente combinación de las

potencial regenerativo de injertos óseos se divide en tres categorías. tres propiedades biológicas importantes de osteoconducción,
Fecha:
Aceptado 18 de de mayo de el año 2015 El material de injerto ideal debe (1) proporcionar una matriz osteoinducción, y células osteogénicas (Miron et al. 2011). A pesar

Para citar este artículo:
Miron RJ, Sculean A, Shuang Y, Bosshardt DD, Gruber R, Buser D, Chandad F, potencial
Zhang Y. osteoinductivo de una novela de injerto de hueso de fosfato de calcio bifásico en
comparación con autógrafos, xenoinjertos y DFDBA.
osteoconductora, que permite la invasión vascular y celular de los numerosos bene fi cios asociados con el uso de hueso
autógeno, las limitaciones incluyendo el tiempo y los costos
extrasurgical clínico así como el sitio donante adicional

Clin. Impl Oral. Res. 27, 2016, 668 - Doi: 10.1111 675 /
clr.12647

668 © 2015 John Wiley & Sons A / S. Publicado por John Wiley & Sons Ltd
 Miron et al Un novedoso aloplástico con potencial osteoinductivo

morbilidad han motivado la búsqueda de alternativas. Estas aprobado por el comité de ética siguiendo las directrices para el y filtros de policarbonato Fi (Transwell Costar, Corning, Acton, MA,

aloinjertos incluir desmineralizadas liofilizado de hueso (DFDBA) de tratamiento de animales de laboratorio en la Universidad de Wuhan EE.UU.) con un tamaño de poro de 8 l metro. Cien miligramos (100

donantes humanos, xenoinjertos de animales, y una serie de (China). El contenido de médula ósea se recogieron de la mg) de cada injerto de hueso se transfirieron en el compartimiento

aloplásticos sintéticos incluyendo hidroxiapatita, segundo- fosfatos humorística usando una 10 jeringa heparinizada ml y fue primera inferior de los pocillos. Después de humectación previa con medio

tricálcico, fosfatos de calcio bifásico, polímeros y vidrio bioactivo capa sobre gradiente de densidad (Histopaque -1077 densidad 1,077 de cultivo durante la noche, 10 4 BMSCs se suspendieron en 50 l l

(Bender et al 2005;. Jensen et al 2009;. Emerton et al 2011;. Park et g / ml) y después se centrifugó a 400 9 sol durante 30 min. Se DMEM y se sembraron en el compartimiento superior de la transwell.

al 2012;.. Buser et al 2013). Aunque la mayoría de estos materiales utilizaron las células mononucleares en la interfase entre cada una Las células se dejaron migrar al compartimiento inferior durante un

son osteoconductive, sólo un número limitado de materiales de las capas de aspirado de médula ósea. Ocasionalmente, glóbulos periodo de 24 h a 37 ° C en un humidi fi ed 5% de CO 2 atmósfera.

osteoinductivos están disponibles con aprobación de la FDA y la rojos restantes se mezclaron y se incubaron con un volumen igual de Después de 24 h, las células nonmigrated en el compartimiento

gran mayoría de ellos incluyen factores de crecimiento tampón de lisis de glóbulos rojos durante 5 min. Después, la mezcla superior se retiraron y las restantes células migradas en el lado

recombinantes con potencial osteoinductivo (Miron y Zhang 2012). se centrifugó y se resuspendió con 1 ml de medio de cultivo. células inferior del filtro se contaron usando un ensayo MTS como se

de médula ósea mesenquimales se sembraron en T-25 fl pide que describe previamente (Miron et al. 2013a). Todos los análisis se

contiene medio DMEM suplementado con suero de 15% de bovino realizaron por triplicado y dentro de tres experimentos

fetal (FBS) y antibióticos. Una vez confluentes, BMSCs se independientes. Para la prueba estadística, por triplicado se

subcultivaron usando una solución de tripsina [0,25% de tripsina promediaron y compararon para varianza estadística usando un

Para optimizar el potencial osteoinductivo de materiales de injerto (Gibco, Zug, Suiza), 0,1% de glucosa, citrato - tampón de solución análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) con la prueba de

óseo, se ha propuesto recientemente que el fenómeno salina (pH 7,8)] hasta la siembra experimental. Se utilizaron todas Bonferroni ( P < 0,05).

osteoinducción se divide en tres principios (Miron y Zhang 2012). las células entre los pasajes 2 y 4.

Estos incluyen la capacidad para un material osteoinductivo (1) para

reclutar células mesenquimales osteoprogenitoras, (2) para inducir

una célula mesenquimal indiferenciada en una osteoblastos

formadora de hueso maduro, y (3) para inducir hueso ectópico

Ensayo de proliferación celular

cuando la formación células del estroma de médula ósea se ed fi cuanti utilizando el

implantado en lugares extraesqueléticas. La combinación propuesta selección de injerto de hueso ensayo CellTiter 96 Una solución de células (MTS) (Promega,

de estos tres principios lo ideal sería maximizar el potencial El hueso autógeno fue cosechada de perros beagle utilizando una Madison, WI, EE.UU.) como se describe previamente (Miron et al.

fresa de trépano y el molino de hueso como se describió 2013b). Las células se sembraron en 100 mg de injerto de hueso por
osteoinductivo los injertos y la capacidad de contribuir a la formación
pocillo en placas de 24 pocillos a una densidad de 10 4
de hueso nuevo (Miron y Zhang 2012). previamente (Miron et al. 2011).

Desmineralizada liofilizada aloinjerto óseo (Straumann AG,

Se sugirió recientemente que los injertos de hueso sintéticamente Basilea, Suiza) se usó como nuestros laboratorios manipulación células por pocillo. A los 1, 3, y 5 días postseeding, las células se

fabricados sinterizadas a bajas temperaturas hacen poseer potencial anterior (Miron et al 2013A;. Wei et al 2015.). lavaron con PBS y se incubaron con 80 l l de solución acuosa

osteoinductivo (Fellah et al 2008;. Yuan et al 2010.). A pesar de los CellTiter 96 disolvió en 400 l l de PBS. Después de 4 h de

enfoques técnicos novedosas para el desarrollo de injertos óseos Un injerto de mineral óseo natural (NBM, BioOss® , Se seleccionó incubación, el número de células se determinó midiendo la

sintéticos, la capacidad de la cerámica de fosfato de calcio para Geistlich AG, Wolhusen, Suiza) como representante de xenoinjerto absorbancia a 490 nm en un lector de placa de 96 pocillos. Los

inducir la formación de hueso en comparación con otros materiales utiliza en gran medida en el campo dental. experimentos se realizaron por triplicado con tres experimentos

de injerto de hueso todavía no se ha investigado. Por lo tanto, el independientes realizados para cada condición. Para la prueba

objetivo de este estudio fue comparar el potencial osteoinductivo de Por último, un fosfato de calcio bifásico recientemente estadística, por triplicado se promediaron y compararon para

los cuatro materiales de injerto de hueso usados ​comúnmente desarrollado (Straumann AG, Basilea, Suiza) se utilizó como el varianza estadística usando un análisis unidireccional de la varianza

incluyendo láminas de hueso autólogo cosechadas con una fresa de material aloplástico. (ANOVA) con la prueba de Bonferroni ( P < 0,05).

trépano y procesados ​por un molino de hueso, DFDBA, un

xenoinjerto comúnmente empleado (un mineral de hueso natural, Microscopía electrónica de barrido

NBM) y un injerto de hueso sintético desarrollado recientemente partículas de hueso se fija en 1% de glutaraldehído y 1% de

fabricado a partir de fosfato de calcio bifásico (BCP). in vitro reclutamientoformaldehído durante 2 días para SEM. Después de la

de células, la proliferación y diferenciación, así como la formación de deshidratación en serie con etanol, las muestras fueron punto crítico

hueso ectópico en un modelo animal. se secaron (Tipo M.9202 y Puntos Críticos de secadora, Roth & Co. Quantitative Real-Time PCR análisis (QRT-PCR)
Hatfield, PA, EE.UU.), seguido de secado durante la noche. El día qRT-PCR se utilizó para cuantificar el ARNm total de marcadores de

siguiente, las muestras se revistieron por pulverización catódica diferenciación de los osteoblastos. El ARN total se aisló usando

usando un dispositivo de pulverización Balzers Unión (DCM-010, reactivo TRIzol y RNAeasy Mini kit (QIAGEN, Basilea, Suiza) a los 3

Balzers, Liechtenstein) con 10 nm de oro y analizada y 14 días postseeding para determinar los marcadores de

microscópicamente usando un microscopio electrónico de barrido diferenciación de los osteoblastos. Los cebadores y las sondas para

Philips XL30 FEG (Philips, Amsterdam, Países Bajos) para los genes que codifican Runx2, collagen1 una 1, la osteocalcina, y

determinar variaciones de la superficie entre los injertos de hueso. GAPDH se adquirieron como genes prediseñado expresión ensayos

(Taqman, Applied Biosystems, Rotkreuz, Suiza). QRT-PCR se

Material y métodos realizó usando 20 l l fi volumen de reacción final de Un paso kit

Master Mix, como se describe previamente (Miron et al. 2010). RNA

Aislamiento de células estromales de médula ósea cuanti fi-

células del estroma de médula ósea (BMSC) aspirados se ensayo de migración celular

obtuvieron de perros Beagle sanos (utilizado en conjunción con el El ensayo de migración de BMSCs se realizó con una cámara de

modelo animal de estudio) Boyden usando una placa de 24 pocillos

© 2015 John Wiley & Sons A / S. Publicado por John Wiley & Sons Ltd 669 | Clin. Impl Oral. Res. 27, 2016 / 668-675
Miron et al Un novedoso aloplástico con potencial osteoinductivo

catiónico se realizó usando un 2000c Nanodrop y 100 ng de ARN en cada animal en sus respectivas bolsas (2 bolsas / hueso injertos Puntos) para un total de 12 muestras por grupo). Después de 30 y

total por pocillo de muestra. Todas las muestras se ensayaron por por músculo) y se sellan con suturas de seda. Después de la cirugía, 60 días después de la implantación, las muestras se retiraron y se

triplicado, y se realizaron tres experimentos independientes. los ΔΔ Ct cada perro recibió penicilina por vía intramuscular durante tres días prepararon para el análisis histológico.

método se utilizó para calcular los niveles de expresión de genes consecutivos para prevenir la infección. Seis perros eran sacrificado

normalizados a valores de GAPDH como control interno para la con la inyección de sodio sobredosis de pentobarbital en cada

expresión génica. Los datos fueron log-transformados antes del período de tiempo de 60 días y se examinaron para la formación de El análisis histológico

análisis mediante ANOVA de una vía con la prueba de Bonferroni hueso ectópico tras fi jación en solución tamponada de formaldehído Las muestras fueron descalcificación ed fi en EDTA al 10% que fue

utilizando GraphPad Software v. 4 (La Jolla, CA, EE.UU.). 4% (pH 7,4). sustituido dos veces por semana durante 3 semanas a temperatura

ambiente. Entonces, las muestras se deshidrataron en una serie de

concentraciones graduadas de etanol de 30% a 100%, seguido de

Todos los animales fueron sometidos a un tratamiento con hueso empotrar en parafina n como se ha descrito previamente (Zhang et

autógeno, DFDBA, NBM, y CaP ( n = 6 réplicas por punto de tiempo al. 2012). De serie

Rojo de alizarina catión fi cuanti (dos veces

Alizarina tinción con rojo se realizó para determinar la presencia de

mineralización de la matriz extracelular después de 14 días como se

describió previamente (Miron et al. 2011). Los osteoblastos se

sembraron a una densidad de 10 4 células por 24 pocillos placa de

cultivo sobre 100 mg de material de injerto óseo. Después de 14

días, las células se fija en 96% de etanol durante 15 min y se tiñeron

con solución de color rojo 0,2% de alizarina en agua (pH

6.4) a temperatura ambiente durante 1 h. Alizarina rojo se disolvió

con una solución de metanol al 20% y ácido acético al 10% en agua

durante 15 min. entonces líquido se transfirió a cubetas y se leyeron

en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 450 nm. Las

muestras se normalizaron al contenido de ADN, así como 100 mg de

injerto óseo de ejecución de material en placas paralelas sin células.

Para la prueba estadística, por triplicado se promediaron y

compararon para varianza estadística usando un análisis

unidireccional de la varianza (ANOVA) con la prueba de Bonferroni ( P

< 0,05).

Los animales y los procedimientos quirúrgicos

experimentos de formación de hueso ectópico se realizaron de

acuerdo con las directrices del comité de manejo de animales de la

Universidad de Wuhan (China), así como las Directrices de llegar.

En total, 12 perros beagle maduros (varón, 10 - 15 kg) se utilizaron

para estos experimentos. Un modelo de perro fue elegido debido a la

comparación experimental anterior de modelos animales que

demuestran resultados superiores en un modelo de perro (Yuan et

al. 2006a, b). Después de anestesiar a los perros por una inyección

intra-abdominal de pentobarbital sódico (30 mg / kg peso corporal;

con inyecciones posteriores dados como se requiere), la cara lateral

del fémur se afeitó y limpió la piel con yodo. Después, se hizo una

incisión longitudinal, y los músculos femorales fueron expuestos por

separación romo. incisiones músculo longitudinal se hicieron

posteriormente por bisturí, y dos bolsas musculares con la distancia

de más de 2 cm fueron creados por la separación romo como se

describió previamente (Yuan et al. 2006a, b). injertos de hueso

autógeno, DFDBA, se insertaron entonces los injertos óseos NBM, y

la tapa

Figura 1. Microscopía electrónica de barrido de cuatro materiales de injerto óseo comúnmente utilizados en odontología incluyendo hueso autógeno cosechado con
un molino de hueso, un desmineralizada aloinjerto de hueso liofilizado (DFDBA), un xenoinjerto empleado comúnmente de origen bovino (mineral ósea natural,
NBM), y un sintéticamente fabricado de fosfato de calcio bifásico.

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 Miron et al Un novedoso aloplástico con potencial osteoinductivo

secciones de 5 l m se cortaron y montaron en portaobjetos de tanto NBM y BCP demostraron ningún potencial de reclutamiento de en comparación con DFDBA y NBM (Fig. 3a). Análisis de colágeno 1

microscopio de polilisina-revestido y se tiñeron con H & E (Sigma # células. Análisis de la proliferación celular demostró la capacidad de la expresión de genes demostró más de un aumento de 10 veces en

S2255; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) de acuerdo con el BMSC a proliferar en todos los injertos de hueso con una preferencia los andamios de BCP en comparación con las otras modalidades y

protocolo del fabricante. Se observaron todas las muestras para la por la proliferación de células en el hueso autógeno en comparación significativamente mayor expresión en el grupo DFDBA (Fig. 3b). Un

evidencia de la formación de hueso ectópico y partículas de hueso con todas las otras modalidades a los 3 y 5 días postseeding (Fig. aumento de 3 veces en la expresión génica de osteocalcina, un

de injerto restante. Además, la capacidad de las muestras para 2b). marcador tarde para la diferenciación de osteoblastos, también se

inducir nueva formación ósea ectópica fue evaluado por dos observó en los andamios de BCP en comparación con todas las

observadores independientes cegado al tratamiento y clasificar qRT-PCR se utilizó para determinar los genes que codifican otras modalidades (Fig. 3C). Los resultados a los 14 días

según un esquema previamente publicado semi-cualitativamente marcadores de diferenciación ósea incluyendo Runx2, collagen1, y postseeding además confirmado la capacidad para andamios BCP

(Boyan et al 1999, 2006;. Schwartz et al., 2000). Como se ha la osteocalcina a los 3 y 14 días postseeding. Los cambios para inducir genes que codifican marcadores de diferenciación de

descrito anteriormente, una puntuación de 1 indica la presencia de tempranos en Runx2 fueron observados en BMSCs sembradas en células de osteoblastos por demos-

partículas sin ningún hueso; 2 indica la producción de hueso nuevo hueso autógeno y los injertos de hueso BCP cuando

en un sitio dentro de la sección y que cubre menos del 40% de la

superficie examinada; 3 indica la producción de hueso nuevo en más

de un sitio, que cubre más de 40% pero menos del 70%, de la

superficie examinada; y 4 indica la producción de hueso nuevo en (una) (segundo) Autógeno Bone DFDBA
más de un sitio, que cubre más del 70% de la superficie examinada. 100 6 BioOss® Vivoss
El grado global de cada implante se obtuvo promediando las *
puntuaciones de todos los especímenes en el grupo.
80 * *
Number of migrated cells

Relative cell numbers

60
*
40
2

20

0 0

y y y
da da da
1 3 5

Figura 2. ( a) ensayo de migración usando una cámara Boyden de células estromales de médula ósea (BMSC) sembró en presencia de (1) hueso autógeno

resultados
topografía de la superficie de diversas partículas de hueso injerto
cosechado con un molino de hueso, (2) aloinjertos óseos liofilizados desmineralizado (DFDBA), (3) el hueso natural mineral (NBM), y (4) de fosfato de calcio bifásico
(BCP). (B) Ensayo de proliferación de BMSCs sembradas sobre cada hueso del material y cuantificada de injerto para el número de células después de 1, 3, y 5 días
postseeding. Los datos que se muestra es el valor medio de tres experimentos independientes (tres repeticiones por experimento)
SE. (* P < 0,05).

Las micrografías electrónicas de barrido se utilizaron para visualizar

las variaciones de la superficie de partículas de injerto óseo en

ambos 40 y 1600 9 fi caciones Magni (Fig. 1). partículas de hueso (una) (segundo)

autógeno recolectadas con un molino de hueso demostraron 1.5 15

partículas grandes con superficie rugosa que contiene la adsorción

*
de proteínas visible y las células en la superficie del andamio (Fig.
* **
Runx2 - relative mRNA

COL1 - relative mRNA

1.0 10
1a, b). En contraste, las partículas de DFDBA demuestran tejidos no
expression

expression

mineralizado lisas desprovistas de todas las células y proteínas (Fig.

1C, D). partículas de hueso injerto NBM demostraron una superficie

0.5 5
*
microrrugosa con muchas topografías macrorough y microrrugosa se

asemeja hueso nativo (Fig. 1e, f). La superficie era completamente

carente de proteínas (Fig. 1f). fosfato de calcio bifásico injerto 0.0 0

partículas compuestas de hidroxiapatita y beta-fosfato tricálcico

demostró tanto a gran escala, micro y nanotopographies (Fig. 1 g, h).

(do)

4
Autoinjerto (molino de hueso)
**
3 aloplástico (DFDBA) NBM
OC - relative mRNA

(BioOss®) BCP (Vivoss)

expression

In vitro comportamiento de BMSCs siembra con partículas de hueso #

injerto
0
En primer lugar, cada injerto de hueso se ensayó por su capacidad

para reclutar BMSC en cámaras de Boyden (Fig. 2A). Los resultados
demostraron que tanto el hueso autógeno y DFDBA pudieron
significativamente fi inducen el reclutamiento de células mientras
Fig. 3. los niveles de ARNm relativos de Runx2, collagen1, fosfatasa alcalina (ALP), y la osteocalcina (OC) para células estromales de la médula ósea (BMSC)
sembradas en (1) hueso autógeno cosechado con un molino de hueso, (2) aloinjertos óseos liofilizados desmineralizados ( DFDBA), (3) mineral óseo natural (NBM),
y (4) de fosfato de calcio bifásico (BCP) a los 3 días postseeding. Los datos mostrados es el valor medio de tres experimentos independientes (tres repeticiones por
experimento) SE. (* P < 0,05, ** P < 0,05; grupo más alto que todos los demás grupos, # P < 0,05; grupo más bajo que todos los otros grupos).

© 2015 John Wiley & Sons A / S. Publicado por John Wiley & Sons Ltd 671 | Clin. Impl Oral. Res. 27, 2016 / 668-675
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(una) 5 (segundo)25 Aunque el hueso ectópico se mantuvo presente dentro de los sitios
* * de defecto (Fig. 6d). La implantación de un NBM de origen bovino
4
* 20
demostró ningún signo de formación ectópica de hueso en
Runx2 - relative mRNA

COL1 - relative mRNA

3 15 cualquiera de 30 o 60 días después de la implantación (6b figuras, e
expression

expression
y 7). Poca o ninguna resorción de estos andamios era visible dentro
2 10
de los sitios de defecto (Fig. 6B, e). La implantación de andamios

1 sintéticos BCP demostró la capacidad para la formación de hueso

5
ectópico en los seis muestras (6f Figs y 8). Curiosamente, a los 30
0
0 días, se observó la formación de hueso poco en la superficie del

andamio Aunque se encontraron un gran número de células en

ltrating fi en la superficie del material (Fig. 6c). A los 60 días, todas

(do) 15
las muestras demostraron signos de la formación de hueso ectópico

Autoinjerto (molino de hueso) adyacentes a la superficie del material (Fig. 6f).

* *
aloplástico (DFDBA) NBM
OC - relative mRNA

10
expression

(BioOss®) BCP (Vivoss)

0 Discusión

Fig. 4. los niveles de ARNm relativos de Runx2, collagen1, fosfatasa alcalina (ALP), y la osteocalcina (OC) para células estromales de la médula ósea (BMSC)
En el presente estudio, el potencial osteoinductivo del autoinjerto,
sembradas en (1) hueso autógeno cosechado con un molino de hueso, (2) aloinjertos óseos liofilizados desmineralizados ( DFDBA), (3) mineral óseo natural (NBM),
y (4) de fosfato de calcio bifásico (BCP) a los 14 días postseeding. Los datos mostrados es el valor medio de tres experimentos independientes (tres repeticiones por DFDBA, NBM, y BCP se comparó tanto in vitro por su capacidad
experimento) SE. (* P < 0,05). para inducir la migración celular, proliferación y diferenciación, así

como en vivo por su capacidad para formar hueso ectópico. No es

sorprendente, se observó la capacidad de los injertos para apoyar la

migración de células sólo en los autoinjertos y DFDBA. Dado que

tanto se sabe que contienen factores de crecimiento dentro de su

matriz (Li et al 2000;.. Miron et al 2013b), la capacidad de reclutar

1.5
células demuestra que ambos derivan algunos de su potencial

osteoinductivo de la liberación de factores de crecimiento para su

14 day alizarin red normalized

** entorno.
1.0
*
absorption (450 nm)

0.5
Los resultados de los experimentos de proliferación de células

demuestran que el hueso autógeno exhibe una tasa más rápida de

crecimiento de las células en comparación con todos los otros

materiales de injerto óseo utilizados en el presente estudio (Fig. 2b).

0.0
Nuestro laboratorio ha demostrado previamente que los autoinjertos
P
M
A

son capaces de liberar un widearray de factores de crecimiento de

C
t

B
af

B
N
FD
gr
o

su matriz con el tiempo incluyendo las proteínas morfogenéticas

ut
A

óseas, factores de crecimiento transformantes,

Fig. 5. alizarina Normalizado tinción con rojo de absorbancia a los 14 días postseeding. (tres repeticiones por experimento) SE.

(* P < 0,05, ** P < 0,05; grupo más alto que todos los demás grupos).
similar a la insulina

factores de crecimiento, y factores de crecimiento endotelial vascular

onstrating significativamente mayor expresión de genes que la formación de hueso ectópico a los 30 y 60 días (Fig. 6). Todos los
codifican para Runx2, collagen1, y OC cuando se compara con animales curados normalmente, sin signos de infección. La
DFDBA y NBM (Fig. 4). Además, se utilizó la tinción con rojo de implantación de hueso autólogo condujo a una rápida resorción del
alizarina para cuantificar la cantidad de tejido recién mineralizada. material de injerto sin signos de cualquiera de las partículas de
Se encontró que tanto el hueso autógeno y BCP realizaron hueso o la formación de hueso ectópico se encuentran en 30 ó 60
significativamente mejor en comparación con DFDBA y NBM (Fig. 5). días (datos no mostrados). Mientras que el hueso autógeno
reabsorbe rápidamente, las partículas DFDBA implantados en
músculos de la pantorrilla demostraron signos de nueva formación
(Miron et al. 2013b). Además, se ha demostrado recientemente que
los autoinjertos también son capaces de liberar osteocytespeci fi
factores tales como c esclerostina y FGF-23 que puede contribuir
aún más al crecimiento celular (Brolese et al. 2014). Sin embargo, la
causa directa responsable de los números de células superiores en
las células sembradas sobre autoinjertos, en comparación con
DFDBA, NBM, y BCP, queda por investigar.

de hueso ectópico en 30 días cerca de la superficie de las partículas

en todas las muestras (Fig. 6a). Después de 60 días, la mayor parte

En vivo modelo para la formación de hueso ectópico de las partículas DFDBA habían sido totalmente reabsorbido Análisis de diferenciaciones de células reveló una fi ventaja
Los injertos óseos se implantaron en músculo de la pantorrilla de perros significativa para BMSCs sembradas sobre andamios BCP cuando
sabuesos y se examinan para pruebas de se compara con NBM y

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DFDBA (Fig. 3). Además, BMSCs sembradas sobre BCP exhibió

más de un aumento de tres veces no puede signi fi en la expresión

(una) (segundo) (do)
génica de la osteocalcina, un marcador tarde para la diferenciación

de osteoblastos a los 3 días postseeding (Fig. 3c). Por lo tanto, es

razonable suponer que en ausencia de medio de diferenciación de

osteoblastos, las células sembradas en los andamios de BCP con

específico y altamente de fi micro- Ned y nanotopographies son

capaces de estimular la diferenciación espontánea de células

(re) (mi) (F)

progenitoras mesenquimales hacia el linaje de osteoblastos. Muchas

investigaciones se han realizado sobre este tema en los últimos

años (Li et al 2007;. Barbieri et al 2010;. Yuan et al 2010;. Chan et al

2012;. Davison et al 2014;. Idowu et al 2014.; Luo et al.

Fig. 6. H & E tinción de figuras representativas fi de aloplásticos (DFDBA), minerales hueso natural (NBM), y un fosfato de calcio bifásico sintética (BCP) implantados
en los músculos de la pantorrilla de perros Beagle a los 30 y 60 días para analizar la formación de hueso ectópico en vivo. = MA Materiales, MU = Muscle, NB = new
2014). Se ha propuesto que la formación de hueso ectópico de

hueso, bar = 100 l metro. aloplásticos sintéticos podría ser un resultado de la acumulación de

factores de crecimiento tales como BMPs a la superficie de los

injertos de hueso que entonces son capaces de inducir la

Autoinjerto diferenciación mesenquimal a osteoblastos. En el presente estudio,
4 DFDBA NBM hemos demostrado que las células progenitoras completamente

desprovisto de cualquier factores de crecimiento osteoinductivos son

BCP
capaces de aumentar de forma espontánea la expresión de
3
* marcadores óseos incluyendo el colágeno 1 y la osteocalcina lo que
Osteoinduction score

sugiere que la auto-inducción está probablemente gobernada por un

* *
2 * proceso de recepción de la mayor parte de sus señales de las

características topográficas de la superficie y posibles señales

químicas de la disolución del material de andamio.

1

#
0
Los injertos óseos fueron luego implantados en las bolsas

musculares de perros beagle para examinar su capacidad para

ys

ys
da

da

formar hueso ectópico. Mientras que los autoinjertos se reabsorben

30

60

rápidamente en vivo y NBM no demostró potencial para formar la

Fig. 7. El efecto de diferentes injertos óseos en osteoinductividad usando un sistema de puntuación cualitativa: 0 = No hay evidencia de cualquier injerto de hueso; 1 = solamenteformación de hueso ectópico, ambos injertos DFDBA y BCP fueron
injerto presente hueso original; 2 = un sitio con formación de hueso ectópico visible; 3 = dos o más sitios de formación de hueso ectópico; 4 = > 70% de campo en 9 10
capaces de inducir la formación de hueso ectópico (Fig. 6).
cubierto por hueso nuevo (* P < 0,05, # P < 0,05; grupo más bajo que todos los otros grupos).
Curiosamente, los injertos BCP formaron hueso ectópico en todas

las muestras mientras que las muestras DFDBA exhibieron la

formación de hueso nuevo en diversos grados, con algunas

muestras incapaz de inducir la osteoinducción. Previamente se ha

informado de que la variabilidad en el potencial osteoinductivo existe

entre las muestras, técnica de esterilización y la edad del donante

(Schwartz et al 1998;. Boyan et al 2006;. Yang et al 2014;. Wei et al

2015.). Contrariamente a esto, el biomaterial BCP se sintéticamente

fabricado y una topografía andamio más homogénea Se obtiene así

probable que contribuye a la reproducibilidad de los resultados entre

las muestras.

En conclusión, los resultados del presente estudio ilustran aún

más el potencial osteoinductivo de varios injertos óseos. Aunque los

autoinjertos no se formaron hueso ectópico en vivo

Fig. 8. Mason tinción que demuestra la formación de hueso ectópico para andamios de fosfato de calcio bifásico cuando se implanta en el músculo de perros beagle En este modelo, probablemente debido a la presencia de células

en 60 días (barra representa 100 l metro). viables de señalización de su mala colocación en

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tejidos circundantes, demuestran tasas más altas de la migración topografías de andamio para dictar la diferenciación hacia el linaje andamios a otros injertos óseos para la curación de defectos óseos

celular y la proliferación en comparación con las categorías de injerto de osteoblastos. Además, su capacidad para formar hueso ectópico en los ensayos clínicos es ahora necesario caracterizar plenamente

óseo. Además, su potencial de diferenciarse BMSCs a osteoblastos en todas las muestras más confirma su potencial osteoinductivo y su potencial uso futuro en procedimientos dentales regenerativas.

es significativamente upregulated en comparación con DFDBA y capacidad para actuar como un injerto de hueso con un potencial

NBM. Dentro de los límites del presente estudio, se demuestra que osteoinductivo con una gran previsibilidad como los materiales se

los nuevos andamios BCP sintéticos fueron capaces de fabrican sintéticamente y no requieren donantes humanos. La

significativamente y rápidamente regular positivamente la expresión investigación reciente más confirma la capacidad del injerto para Expresiones de gratitud: Este estudio fue financiado por el
de genes que codifican para los marcadores óseos-específico c inducir la formación de hueso en defectos óseos creados en Equipo Internacional de Implantología número de concesión (ITI)

como la osteocalcina a los 3 días postseeding, sugiriendo así en animales (Dahlin et al 2015;. Yip et al 2015.). Las investigaciones Fundación (1000_2014). Todos los autores declaran no tener ningún

gran medida la capacidad de estos futuras comparando el potencial de estos nuevos BCP conflicto de intereses.

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