Universidad del Atlántico.

Laboratorio de Microbiología
UNIVERSIDAD DEL ATLÁNTICO
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA EDUCACIÓN
PROGRAMA DE LICENCIATURA EN
BIOLOGÍA Y QUÍMICA
PROFESOR: MARLON MAURICIO ARDILA
CHÁVEZ

PRÁCTICA 2: CONOCIMIENTO Y MANEJO DEL MICROSCOPIO

1. Introducción

Los microscopios son equipos (aparatos) que por la acción de lentes convergentes, permiten la observación de
muestras o de detalles de ellas, que a simple vista no se pueden percibir. Sin ayuda, el ojo humano no puede ver
objetos menores a 0,1 mm de diámetro. La invención del microscopio aceleró el desarrollo de las ciencias
biológicas que hasta mediados de la edad moderna, se habían fundado en las observaciones directas.

En la actualidad existen diversas clases de microscopios, según la naturaleza de los sistemas de luz y los
accesorios utilizados para obtener las imágenes Entre los microscopios que utilizan luz visible y lentes de vidrio
están:

Microscopio compuesto u óptico: en el cual la luz atraviesa la preparación (lámina portaobjetos con una
muestra) directamente desde la fuente de luz (se utiliza en este laboratorio y describe detalladamente más
adelante).

Microscopio estereoscópico: en el cual dos sistemas ópticos, uno para cada ojo, permiten ver imágenes en tres
dimensiones (se utiliza en este laboratorio y se describe en detalle más adelante).

Microscopio de campo oscuro: en el cual la luz atraviesa oblicuamente la preparación y los objetos aparecen
como puntos luminosos sobre un fondo oscuro.

Microscopio de fluorescencia: en el cual las preparaciones se tratan con fluorocromos y brillan al incidirles la
luz.

Microscopio de contraste de fases: en el cual la trayectoria de la luz es desviada mediante dispositivos

especiales, produciendo contrastes notables entre elementos de diferente densidad o grosor en la preparación.

El aumento obtenido con estos microscopios es reducido, debido a que la longitud de onda de la luz visible
impone limitaciones en la magnificación y resolución de las imágenes (no pueden diferenciarse estructuras cuyo
diámetro sea menor que la longitud de la onda). El microscopio electrónico, en cambio, utiliza un haz de
electrones para formar una imagen ampliada de un objeto. Debido a que los electrones tienen una longitud de
onda mucho menor que la luz visible, el microscopio electrónico permite observar estructuras mucho más
pequeñas que aquellas observables con los microscopios ópticos. Como los electrones no impresionan la retina
del ojo humano, la imagen debe recogerse en una pantalla fluorescente.

1.1 Microscopio óptico o compuesto

El microscopio óptico es el más común. Su desarrollo suele asociarse con los trabajos de Anton van
Leeuwenhoek. Los microscopios de Leeuwenhoek constaban de un sólo lente pequeño y convexo (microscopio
simple), montado sobre una plancha con un mecanismo para sujetar la preparación. El microscopio óptico actual
es un instrumento que contiene varias lentes y por ello se denomina microscopio compuesto.

El microscopio óptico común está formado por tres sistemas: el mecánico, el óptico y el de iluminación (Figura
1).

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Mecanismo de ajuste de la
distancia interpupilar

Oculares Cabezal
Brazo

Revólver
Carro y pinzas

Objetivos Tornillos para mover

el carro
Platina Tornillo
macrométrico
Diafragma
Tornillo
micrométrico
Condensador
Base
Lámpara

 Sistema mecánico constituido por:

 Base: sobre la cual se apoya el microscopio y tiene forma de V o rectangular.
 Brazo o asa: es una pieza colocada en la parte posterior del microscopio. Se apoya en la base y sostiene otras
piezas.
 Tubo: presente en los microscopios antiguos (poco común en los actuales), era una pieza cilíndrica que
sujetaba, en la parte superior, a los portaoculares y en la inferior al revólver. En la mayoría de los microscopios
actuales se ha dividido en varias piezas con formas diversas.
 Cabezal: es la pieza que sostiene los portaoculares y puede ser mono o binocular. Está colocado en la parte
superior del brazo y puede girar.
 Mecanismo para ajustar la distancia interpupilar: es una placa movible colocada en el cabezal que permite
separar o acercar los oculares y ajustar la distancia interpupilar.
 Anillo de ajuste de las dioptrías: colocado alrededor del ocular izquierdo, permite corregir la diferencia de
enfoque entre ambos ojos (anisometropía).
 Revólver: es una pieza giratoria en la cual se enroscan los objetivos. Permite cambiar el objetivo y colocarlo en
posición de observación, la cual se distingue por el sonido (“clic”) de un piñón que lo mantiene fijo.
 Platina: es una pieza metálica plana en la que se coloca la preparación a observar. Presenta un orificio que
permite el paso de la luz hacia la preparación.
 Carro: es un dispositivo colocado sobre la platina que permite deslizar la preparación en dos direcciones (de
adelante hacia atrás y de derecha a izquierda). Generalmente posee dos reglas o escalas que se utilizan para
determinar la posición del campo que se observa. Esto puede ser útil cuando, habiendo movido el campo, se
desea regresar a una zona particular de la preparación, p. ej., una estructura particular.
 Tornillo macrométrico: al girarlo asciende o desciende el tubo o la platina. Estos movimientos largos
permiten el enfoque grueso de la preparación.
 Tornillo micrométrico: mediante un movimiento casi imperceptible del tubo o la platina, permite el enfoque
exacto y nítido de la preparación.

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 Sistema óptico comprende el conjunto de lentes que producen la imagen aumentada de la preparación.
Está formado por oculares y objetivos.

 Oculares: están constituidos generalmente por dos lentes dispuestas en un tubo corto. La lente inferior recoge
la imagen que proviene del objetivo y la limita al campo visual disponible y la superior forma la imagen
aumentada que es observada. El ocular actúa básicamente como una lupa y su aumento está grabado en el tubo
portaocular.
 Objetivos: son los lentes que proporcionan la mayor parte del aumento y Rosca
producen imágenes invertidas de las preparaciones. Cada objetivo lleva
grabadas varias cifras en la superficie externa de su tubo. Por ejemplo, en la
Figura 2 aparecen 40 / 0,65 y 160 / 0,17, siendo 40 el aumento del objetivo, 0,65 40/ 0,65
la abertura numérica, 160 la longitud del tubo en milímetros (este valor 160/ 0,17
representa la distancia entre los puntos focales del objetivo y el ocular) y 0,17 el
grosor del cubreobjetos (en milímetros) que debe utilizarse con ese objetivo. Lente
Figura 2. Cifras grabadas
Los objetivos utilizados corrientemente son de dos tipos: secos y de inmersión. en el tubo del objetivo
Los objetivos secos se utilizan sin colocar sustancia alguna entre ellos y la
preparación y generalmente su aumento es de 4X, 10X, 20X, 40X y 60X. El objetivo de inmersión se utiliza
colocando una gota de aceite de cedro o de inmersión entre el objetivo y la preparación, en contacto con ambos.
Estos objetivos se distinguen por uno o dos anillos de color negro alrededor del tubo. Su aumento generalmente
es 100X.

 Sistema de iluminación comprende las partes que producen, transmiten y regulan la cantidad de luz que
incide sobre la preparación:
 Lámpara: está colocada en la base del microscopio. Los microscopios antiguos poseían un espejo en el lugar
ocupado por la lámpara. La luz provenía de una fuente externa y era reflejada por el espejo hacia la preparación.
 Condensador: está formado por un sistema de lentes cuya finalidad es concentrar la luz sobre el plano de la
preparación. El condensador se halla debajo de la platina y puede acercarse o alejarse de ella mediante un
tornillo o sujetándolo con la mano, firme pero suavemente y haciéndolo girar.
 Diafragma: generalmente el condensador está provisto de un diafragma-iris que regula la cantidad de luz que
pasa a través de él.

1.2. AUMENTO DEL MICROSCOPIO

El aumento total del microscopio se calcula multiplicando el aumento del ocular por el del objetivo, siempre y
cuando la longitud del tubo corresponda con la establecida en el objetivo.
Ejemplo. Objetivo de 4X y ocular de 10X, entonces para saber el aumento real, se multiplican los dos valores
(4X.10X)= 40X.
Nota: X hace referencia al número de veces que se aumenta el tamaño real del objeto.

1.3 RESOLUCIÓN DEL MICROSCOPIO

La resolución se define como la capacidad de distinguir como separados dos objetos que estén muy próximos
entre sí. La resolución del ojo humano es 0,25 mm a 25 cm de los objetos. Esto significa que la distancia mínima
entre dos objetos que pueden ser percibidos como separados (límite de resolución) por el ojo humano, sin ayuda
de algún instrumento, es 0,25 mm.
La resolución de un microscopio depende de la longitud de onda de la luz utilizada () y de la abertura numérica
del objetivo (AN). Así, el límite de resolución se expresa como:
d =  / 2 AN
La abertura numérica del objetivo depende, a su vez, del índice de refracción del medio que está entre el objeto
y la lente. Tomado en cuenta lo anterior, la resolución de un objetivo puede mejorarse aumentando el índice de

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refracción del medio (p. ej., colocando aceite de inmersión entre el objetivo y la preparación) o disminuyendo la
longitud de onda de la luz empleada.

1.4. CAMPO DEL MICROSCOPIO

Se denomina "campo" al círculo visible que se observa a través del microscopio. Cuanto mayor es el aumento,
menor es el área de la preparación incluida en el campo.

1.5. USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO

Los microscopios son instrumentos costosos y delicados. Al utilizarlos debe observar las siguientes normas:

1. Antes de transportar el microscopio o al disponerse a guardarlo, debe girar el cabezal de modo que los
oculares queden sobre el brazo. También debe cerciorarse que el objetivo de menor aumento esté en posición
(sobre el orificio de la platina).
2. Transporte el microscopio sujetándolo con ambas manos, una en el asa o brazo y otra debajo de la base.
3. Coloque el microscopio lejos del borde del mesón de trabajo. Deje sobre el mesón sólo lo estrictamente
necesario.
4. No incline o desplace el microscopio mientras la lámpara esté enchufada.
5. Nunca toque las lentes con las manos. Si se ensucian, debe limpiarlas muy suavemente con un papel de
óptica.
6. Si utiliza anteojos, no realice las observaciones con los anteojos puestos.
7. Antes de iniciar una observación, gire el cabezal hasta que los oculares queden en posición de observación
(Figura 1). Baje la platina y cerciórese que esté colocado el objetivo de menor aumento.
8. Coloque la preparación sobre la platina, entre las pinzas metálicas.
9. Comience la observación con el objetivo de menor aumento. Para realizar el enfoque:
a. Acerque al máximo el objetivo a la preparación, empleando el tornillo macrométrico.
b. Mirando a través de los oculares, ajuste la distancia interpupilar hasta que observe un campo circular.
c. Separe lentamente el objetivo de la preparación girando el tornillo macrométrico. Cuando observe algo
nítida la imagen, gire el tornillo micrométrico hasta obtener un enfoque fino. En este momento debe
realizar la corrección de la anisometropía (diferencia de enfoque entre el ojo derecho y el izquierdo). Para
ello debe cerrar el ojo izquierdo y observar sólo con el ojo derecho a través del ocular derecho. Ajuste el
enfoque con el tornillo micrométrico hasta lograr una imagen nítida. Luego, cierre el ojo derecho y observe
con el ojo izquierdo a través del ocular izquierdo. Gire el anillo de ajuste de las dioptrías (colocado en el
ocular izquierdo) hasta observar una imagen nítida. Una vez realizado este ajuste, no debe volver a tocar el
anillo de ajuste de las dioptrías durante la sesión de trabajo, aunque cambie la preparación o los objetivos.
d. Si es necesario, ajuste la cantidad de luz que incide sobre la preparación (abriendo o cerrando el
diafragma) y el área iluminada en la preparación (moviendo el condensador).
e. Cambie a un aumento mayor. Al colocar en posición un objetivo de mayor aumento, la imagen debe estar
casi enfocada y sólo hará falta mover un poco el tornillo micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al
cambiar de objetivo se perdió el enfoque debe volver a enfocar con el objetivo anterior. Los objetivos de
mayor aumento enfocan a muy poca distancia de la preparación y por ello es fácil que ocurran accidentes
(p. ej., rayar o romper la preparación o la lente) si no se observa esta precaución.

1.6 EMPLEO DEL OBJETIVO DE INMERSIÓN:

a. Suba totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que indica la zona que se va a observar
y sobre la cual se colocará el aceite.
b. Gire el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre éste y el de aumento
inmediatamente inferior.
c. Coloque una gota pequeña de aceite sobre el círculo de luz.
d. Termine de girar suavemente el revólver y coloque el objetivo de inmersión en la posición de observación.

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e. Enfoque cuidadosamente girando el tornillo micrométrico. No gire el tornillo macrométrico. No mueva el
campo. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersión y la preparación es mínima y existe el riesgo
de dañarlos.
f. Una vez que se haya puesto el aceite sobre la preparación no puede volver a usar el objetivo de menor
aumento sobre esa zona, porque se mancharía de aceite. Si desea enfocar otro campo con otro aumento, debe
bajar la platina, limpiar la preparación y volver a enfocar.
g. Una vez finalizada la observación, baje la platina y coloque el objetivo de menor aumento. Entonces puede
retirar la preparación de la platina: nunca debe retirarla con el objetivo de inmersión en posición de
observación porque puede dañar la lente.
h. Elimine el exceso de aceite de la preparación con el dedo o con papel absorbente. Luego límpiela
suavemente con papel de óptica humedecido con unas gotas de alcohol o líquido limpiavidrios.
i. Limpie el objetivo de inmersión con papel de óptica o un paño de algodón limpio humedecido con alcohol.
Pase el papel sobre la lente con suavidad en un sólo sentido. No se exceda en la limpieza porque este
solvente, aplicado en exceso, puede dañar la lente.
Al finalizar el trabajo deje el objetivo de menor aumento en posición. Asegúrese de no dejar una
preparación sobre la platina. Revise que la platina esté seca y limpia. Gire el cabezal de modo que los
oculares queden sobre el brazo.

2. OBJETIVOS

 Aprender a utilizar correctamente el microscopio.

 Identificar las partes del microscopio e indicar las funciones de cada una de ellas.
 Observar muestras en el microscopio, haciendo énfasis en la preparación del material a observar y en los
procesos de ajuste y enfoque correctos.
 Determinar el diámetro del campo visual del microscopio.
 Adquirir destreza en las formas de calcular las medidas de las estructuras celulares, células y organismos
microscópicos.

3. METODOLOGÍA

3.1. MATERIALES
 Microscopio • Papel milimetrado
 Portaobjetos • Papel con letras impresas
 Cubreobjetos
 Goteros
 Fibras de cabello e hilos

3.2 MÉTODOS

3.2.1 IDENTIFICAR LAS PARTES DEL MICROSCOPIO.

Con ayuda de la Figura 1 identifique y memorice las partes del microscopio.
Indique el aumento de los oculares de su microscopio:
Indique el aumento de los objetivos de su microscopio:

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3.2.2. PREPARACIÓN DE UNA MUESTRA Y OBSERVACIÓN AL MICROSCOPIO.

 Tome un portaobjetos y un cubreobjetos. Verifique que estén limpios.

 Coloque el portaobjetos sobre la mesa y deje caer una gota de agua en el centro de la lámina.
 Recorte una o dos letras del papel suministrado, procurando que una de ellas sea la letra e, y colóquelo sobre
la gota.
 Coloque el cubreobjetos sobre el portaobjetos formando un ángulo de 45 grados entre el portaobjetos y el
cubreobjetos. Déjelo caer lentamente para evitar la formación de burbujas en la lámina.
 Coloque la preparación sobre la Platina de tal manera que quede bien ajustada por las Pinzas que hay en la
platina. Enfoque la letra “e” con el Objetivo de 4X utilizando el Tornillo macrométrico. Abra el
Diafragma hasta que obtenga una buena iluminación de la muestra. Utilice el Tornillo micrométrico para
obtener mayor nitidez. Es importante resaltar que siempre que se haga una observación al microscopio se
debe usar en primer lugar el objetivo de menor aumento.
 Describa la posición de la letra e. ¿Cómo es la imagen o su orientación? Mueva la platina de derecha a
izquierda, hacia delante o hacia atrás. ¿En cuál dirección se mueve la imagen?
 Gire lentamente el revólver para colocar el objetivo 10X. Utilice el tornillo micrométrico para obtener una
imagen nítida. No utilice el tornillo macrométrico; éste no es necesario si usted enfocó correctamente con el
objetivo de 4X. Si es necesario, abra un poco el diafragma para aumentar la entrada de luz. ¿Ha cambiado la
posición de la imagen con respecto a la observada con el objetivo de 10X? ¿El campo de observación es
mayor o menor? Describa lo observado y compare con lo visto con el objetivo de menor aumento.
 Gire lentamente el revólver para colocar el objetivo 40X. Y compárelo con los dos objetivos observados
anteriormente. Al terminar su observación gire lentamente el revólver y coloque el objetivo de 4X y retire la
preparación de la platina.
 Realice un montaje similar a la letra “e”, pero use fibras de cabello e hilo y haga sus observaciones con los
objetivos de 4X, 10X y 40X

3.2.3. Cálculo del poder de aumento del microscopio. El poder de aumento es la capacidad que posee el
microscopio para dar una imagen aumentada de un objeto. El microscopio óptico compuesto consta de dos
lentes que aumentan la imagen, los oculares y los objetivos. El poder de aumento del microscopio se
calcula multiplicando el aumento del ocular por el aumento del objetivo utilizado. El ocular de los
microscopios que se utilizan en el laboratorio es de 10X.

 Calcule el poder de aumento cuando se estén utilizando los objetivos de 4X, 10X, 40X y 100X.

3.2.4. Determinación del diámetro del campo visual del microscopio. La información del diámetro del campo
visual se utiliza para estimar el tamaño de las estructuras o de los organismos que se estén observando con
el microscopio. Es importante tener las medidas correspondientes para cada uno de los objetivos.
 Coloque un pedazo de papel milimetrado sobre un portaobjetos. Enfoque con el objetivo de 4X. Mida el
diámetro del campo visual, correspondiente a este objetivo, en mm y en fracciones de mm. Anote el dato y
haga la conversión a μm.
 Repita el ejercicio anterior con el objetivo de 10X y 40X. ¿A cuántos mm o fracciones de mm corresponde
el diámetro del campo visual? ¿La relación entre el diámetro del campo visual y el poder de aumento es
directa o inversa?
 Calcule el diámetro del campo visual cuando se utilice el objetivo de 100X.

3.3. Ejercicios

 Estime el tamaño aproximado, en mm y en μm, de la letra e observada anteriormente.

 El diámetro del campo visual de un microscopio es de 1500 μm cuando se observa con un ocular de 10X y
un objetivo de 10X. ¿Cuál será el diámetro del campo visual si se observa con un objetivo de 40X y el
mismo ocular?

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 Coloque sobre un portaobjetos un pedazo de una imagen de una revista. ¿Puede observar la separación entre
puntos de la imagen con el objetivo de menor aumento? ¿Cuál es la distancia promedio entre cada dos
puntos? ¿A qué tipo de poder del microscopio se puede hacer referencia con este ejercicio?
 ¿Cuál es la función del aceite de inmersión?
 ¿Cuál es la función de los objetivos?
 Realice los siguientes ejercicios:
o Una bacteria mide 1.4 µ de diámetro: calcule su tamaño en mm y Å
o Un microorganismo A mide 130 µ y una B mide 1200 A. ¿Cuál es mayor?
o Una bacteria llamada Staphylococcus aureus es una célula esférica alrededor de 2 µm de
diámetro. ¿Cuál es el área de una célula S. aureus expresada en µm2, nm2, y mm2?, ¿Cuál es el
volumen de una célula de S. aureus expresado en µm3, nm3, y mm3?
 Mida el diámetro de 10 células del epitelio bucal humano y determine el volumen promedio de una célula del
epitelio bucal humano, asumiendo una forma esférica para dichas células.
 Las células de la mejilla de los humando son en realidad aplanadas y apiladas una encima de la otra, en lo que
se llama epitelio escamoso simple. Suponiendo que el grosor de una célula promedio mejilla humana es de 5
µm, ¿Cuál es el volumen medio de una célula de la mejilla humana medido en µm3?
 Realice los mismos cálculos que la pregunta anterior, para las células de cebolla, asumiendo una forma
cúbica.

4. Conteo de células
En Biología Celular es común trabajar en situaciones donde es necesario conocer el número de células presentes
en un volumen dado; por ejemplo, cuando se realizan cultivos celulares se precisa saber cuántas células se
encuentran en un momento x (t1) con respecto al número de células que inicialmente se sembraron (t0), o cuando
se requiere que un determinado número de células sean expuestas a tratamientos distintos y ver su efecto. Otro
ejemplo es cuando se aplica en reproducción de animales y se desea saber cuantos espermatozoides hay en los
eyaculados. En tales casos se requiere de un instrumento que permita contar directamente, o bien, calcular la
concentración celular de un medio.
El hemocitómetro (cámara de Neubauer) tiene la apariencia de un portaobjetos grueso, que en una cara se
encuentra grabada con un par de cuadriculas muy finas y de medidas definidas. Esta cámara cuenta también con
un par de muescas que permiten colocar la muestra a analizar en dos compartimientos. Por último, la cámara de
Neubauer se complementa con un cubreobjetos cuyo grosor es mayor, también, que el de los cubreobjetos
convencionales.

Método: Diluir en 100 mL de agua destilada en un gramo de levadura seca comercial. Agitar hasta que la muestra
se vea homogénea.
Pipetear 100 µL de la muestra celular con una micropipeta y colocar en una muesca de la cámara de Neubauer y
permitir que la suspensión ingrese a la cámara por capilaridad. Evitar que se formen burbujas.
Colocar la cámara en la platina del microscopio y utilizar el objetivo de 10X para localizar el cuadro central de la
cámara. La cuadricula que se utiliza como guía para el conteo es la de 0,2 x 0,2 mm. Tener cuidado de no contar
dos veces la misma célula.
Para conocer el número de células en la muestra original realizar el siguiente cálculo: A x B x C

Donde A= Células en la Cámara

B= Factor de dilución
C = Factor de corrección (proporcionando por el fabricante de la cámara)

Considerar:
Que el área central de la cámara es de 1mm2. Esta área esta subdividida en 25 cuadrados pequeños (1/25 mm2);
cada uno de los cuales está delimitado por líneas triples y con una subdivisión de 16 (1/400 mm2 ).
Que generalmente la cámara tiene una profundidad de 0,1 mm.
El factor de corrección de 104 convierte 0,1 mm3 a 1 mL (0,1 mm3 = 1 mm2 x 0,1)
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5. Bibliografía y trabajo en la Web

 Pelczar, M. y R. D. Reid. 1996. Microbiología. Mc Graw Hill. Bogotá. 664p

 Junqueira, L y J, Carneiro.1998. Biología celular y molecular. Sexta edición. Mc Graw Hill. Bogotá.
324p.
 Microscopio virtual. En esta página se puede aprender sobre las partes del microscopio óptico
compuesto y la estimación del diámetro del campo microscópico.
http://bio.rutgers.edu/~gb101/virtuallabs_101.html
 Microscopio virtual. En esta página se puede aprender sobre las partes del microscopio óptico
compuesto y su principio de funcionamiento. http://www.udel.edu/Biology/ketcham/microscope/
 Microscopía. En esta página se puede complementar sobre los principios básicos de la microscopía,
tipos de microscopios y microfotografía.
http://micro.magnet.fsu.edu/primer/java/electronmicroscopy/magnify1/index.html
 Microscopía. En esta página se pueden encontrar diversos recursos relacionados con este tema.
http://homepages.gac.edu/~cellab/index-1.html