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¿Cómo se logró llevar esto a cabo? Se utilizaron dos líneas de Drosophila melanogaster
llamadas 298 y 299 donde cada una se encuentra transgenizada con una cierta construcción
siendo estas las siguientes:
Entonces, las líneas mencionadas anteriormente poseen, además de los elementos transgénicos,
los siguientes cromosomas balanceadores:
La línea 298 posee en el par cromosómico sexual X el locus White mutado de manera que poseen
ojos blancos mientras que en otro cromosoma posee
un locus sin interés en su versión salvaje. No
obstante, en el cromosoma 3 hay presencia del
elemento transgénico ChaT – Gal4 en heterocigosis
junto con un cromosoma balanceador TM6 que posee las mutaciones en los genes Humeral
(quetas supernumerarias en las patas delanteras) y Tubby (larva y pupa corta).
Mientras tanto la línea 299 posee en el par cromosómico sexual X el locus White salvaje de
manera que las moscas poseen ojos rojos mientras
que en el par cromosómico 2 posee al elemento
transgénico UAS – dTRPA1 en homocigosis. No
obstante, en el cromosoma 3 hay presencia de un
cromosoma balanceador TM6B que aporta la mutación en el gen Humeral en heterocigosis
mientras que el cromosoma 3 presenta una mutación en el gen Stubble (quetas cortas).
Al llevar a cabo los cruzamientos recíprocos para ambas líneas transgénicas se observa que un 50%
de la F1 (aquellas que están marcadas con un círculo lleno negro) poseerán ambos elementos
genéticos en su genoma.
Estos individuos podrán ser identificados mediante su fenotipo diferencial dado que la mitad
tendrán sólo la mutación en el locus Humeral (quetas supra numerarias en las patas delanteras) y
la mitad restante tendrá sólo la mutación en Stubble (quetas cortas).
No obstante, hay una complicación a la hora de identificar a las moscas con fenotipo mutante para
Humeral debido a que dos tipos de individuos lo tendrán siendo estos aquellos que efectivamente
posean los elementos transgénicos de interés (fenotipo sólo Humeral mutante) y aquellos que no
los posean (fenotipo mutante para Humeral y Tubby). Estos último también son mutantes para
Tubby pero este no es posible ser reconocido durante la adultez por lo que en este estadío del
ciclo de vida de las moscas no sería posible diferenciarlos. Con el objeto de discernir entre ellos
sería necesario analizar las pupas y descartar a todas aquellas que sean mutantes para Tubby. Sin
embargo, esto no fue necesario dado que se observó que todos aquellos individuos que tenían el
fenotipo mutante para Humeral y Tubby murieron. Una posible explicación ante esto es que los
cromosomas balanceadores TM6 y TM6B posean la misma mutación letal recesiva.
¿Cómo son los cruzamientos? Se cruzaron hembras vírgenes de la línea 298 junto a machos de
la línea 299 y también se llevó a cabo el
cruzamiento recíproco, es decir, hembras
vírgenes 299 juntos a machos de la línea
298. Estos cruzamientos recíprocos
fueron realizados con el propósito de
verificar que se obtenían F1’s idénticas de
manera de poder descartar que haya ocurrencia de algún fenómenos de herencia epigenética o
imprinting dado que en estos casos no se obtienen resultados de cruzamientos iguales.
¿Por qué se utilizan hembras vírgenes? Las hembras adultas de Drosophila melanogaster
poseen una estructura denominada espermateca en la cual almacenan el esperma de los machos
que las fecundan. De esta manera, al utilizar una hembra no virgen en los cruzamientos corro el
riesgo de que la F1 resultante no sea del macho que me interesa sino de algún otro macho que la
haya fecundado antes.
¿Cómo se obtienen las hembras vírgenes? Una vez que se haya llevado a cabo el cruzamiento
espero a que las pupas se encuentren a punto de eclosionar para quitar a todos los adultos del
frasco. Luego, espero aproximadamente 4 horas siendo este un tiempo menor al de maduración
sexual de las hembras para sexar a los individuos. De esta manera, identifico a las hembras
vírgenes mediante características distintivas.
La ventana de fertilidad de las moscas hembras no se mantiene constante en el tiempo así que por
más que se trate de hembras vírgenes, estas no serán tan fértiles al día 1 en comparación al día
10. De esta manera, hay que asegurarse de la edad de las moscas con el objeto de utilizar a
aquellas que tengan un buen grado de fertilidad. En esta práctica se usaron hembras de una
semana de edad.
Repiques A medida que iban pasando los días el medio de cultivo en el cual vivían las moscas se
iba llenando de desechos de manera que era necesario cambiar a las moscas a otro tubo de
ensayo con medio de cultivo fresco. Esto era llevado a cabo anestesiando a las moscas en primer
lugar. Adicionalmente, los repiques representan una manera de establecer un t=0 al poner
individuos de una misma línea en un tubo donde se reproducirán. Llevo a cabo esto con las líneas
transgénicas y controles para asegurarme que todas las crías emerjan al mismo tiempo
(nacimiento sincronizado) y tengan la misma edad.
Clasificación de la F1 Una vez emergida la F1 (y antes de que tengan posibilidad de reproducirse
dando origen a una F2) hay que seleccionar a aquellos individuos que posean los elementos
genéticos GAL4-UAS en su genoma. Para ello se tienen en cuenta los fenotipos Stubble y Humeral
teniendo en cuenta que no todos aquellos que tengan este último fenotipo tendrán aquellos
elementos.
Testeo de fenotipo Con el objeto de testear el fenotipo de locomoción de las moscas se colocó
a cada tipo de estas en frascos distintos y se los sumergió en un baño térmico de 30°C para luego
medir el tiempo en el cual todas las moscas caían al fondo del frasco. Se observó que la totalidad
de las moscas con fenotipo Stubble y todas las de fenotipo Humeral caían al fondo del frasco. Por
lo tanto, se confirma nuestra hipótesis planteada acerca de que aquellas moscas con fenotipo
Humeral que tenían presencia de ambos cromosomas balanceadores TM6 y TM6B eran en
realidad letales dado que sino estas moscas Humeral no deberían haber caído al fondo del frasco.
Cuestionario
Pregunta 1
Pregunta 2
Este fenómeno se debe a que los machos van a sobre expresar la proteína de fusión de la kinasa y
GFP debido a la compensación de dosis ya que sólo tienen un cromosoma X mientras que las
hembras tienen dos cromosomas X.
Pregunta 3
Las moscas wild type no presentarán fluorescencia dado que no tienen los elementos genéticos
necesarios. Mientras tanto aquellos individuos que tengan la versión mutante de GAL4 de baja
afinidad por el promotor UAS presentarán una fluorescencia intermedia y, por último las moscas
que tengan la versión de GAL4 wild type presentarán la mayor fluorescencia.
Pregunta 4
Para realizar esto necesitaría transgenizar moscas con dos sistemas GAL4-UAS donde uno de ellas
posea la secuencia de GFP regulada por el promotor UAS mientras que la secuencia de GAL4 debe
estar regulada por un promotor específico de neuronas colinérgicas. Mientras tanto, el sistema
restante debe tener la secuencia del canal iónico regulado por el promotor UAS mientras que la
secuencia de GAL4 tiene que estar regulada por el promotor específico de neuronas colinérgicas.
Con el objeto de visualizar tanto neuronas colinérgicas como neuronas sensoriales debería generar
un genotipo que posea un elemento UAS bajo la secuencia de GFP pero dos elementos GAL4
donde cada uno estará regulado por promotores distintos: uno estará regulado por un promotor
específico de neuronas colinérgicas mientras que el otro estará regulado por un promotor
específico de neuronas sensoriales.
Pregunta 5
Pregunta 6
Pregunta 7
No es eficiente dado que no tengo en cuenta a aquellas moscas que tienen a ambos elementos
genéticos con fenotipo Humeral debido a que no puedo distinguir fenotípicamente a estas de
aquellas Humeral que no tienen presencia de aquellos elementos. Podría elegir también a todas
aquellas que tengan fenotipo Humeral para luego distinguir a aquellas que tengan los elementos
de aquellas que no los tengan mediante el testeo del fenotipo.
Pregunta 8
El fenotipo Stubble de la F1 contiene a ambos elementos genéticos por lo que me sirve y, además
puedo distinguirlos de los parentales dado que estos tienen fenotipos Humeral y Tubby y, Humeral
y Stubble. El primer fenotipo de los parentales nombrados no puede ser distinguido de uno de los
fenotipos de la F1.
Pregunta 9
En la introducción teórica
Pregunta 10
Disminuir la temperatura