8/31/14

Polymerase  Chain  Reac6on  PCR  

h7ps://www.youtube.com/watch?v=iQsu3Kz9NYo  

What  to  do  today?  

Spectrophotometric  quan6fica6on  of  genomic  DNA  

 
Electrophoresis  of  genomic  DNA  
 
 
 

 
 
 
SePng  up  PCR  reac6on  
 

1  
 8/31/14  

h7p://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html  

h7p://www.soi.wide.ad.jp/class/20070046/slides/06/32.html  

2  
 8/31/14  

What  are  the  components  in  the  PCR  tube?  

Template  DNA  
 
Forward  and  reverse  primers  
 
Polymerase  
 
dNTP  (dATP,  dTTP,  dCTP,  dGTP)  
 
Op6mal  buffers  for  op6mal  annealing  and  enzyme  ac6vity  
 (Tris,  Mg++,  Tween20,  BSA,  single  strand  DNA  binding  protein)  

Tm  (~>94C)    

Te  (~72C)     Ta  (~50C)    

Thermocycler  
 
 
 

1.  Three  water  baths  at  different  temperatures  and  manual  (robo6c)  transfer  from  one  
to  the  other    
2.  A  small  light  bulb  for  hea6ng  and  a  fan  rapidly  cooling  (~1C/s)  
3.  Pel6er  thermal  plate  for  temperature  changes  (~3C/s)  

 
-­‐  Now  a  new  movement  is  droplet  PCR  

3  
 8/31/14  

Annealing  temperature  is  one  of  the  most  important  variable  

and  there  are  several  tricky  techniques  developed  using  this  
trick  

Touchdown  PCR  
 
 
 
Thermal  asymmetric  PCR  
     

Primer  design:  Specific  and  efficient    

Efficient  denatura6on  of  template:  avoid  GC  rich  “region”  

Increasing  the  specificity:  avoid  GC/  AT  rich  primer  site  
Avoid  simplex  sequence  (AAAA..,  ATATAT…,  GGGCCC…)  
Avoid  primer-­‐dimer  
Avoid  hairpin  forma6on  
Avoid  non-­‐specific  binding  
Drosophila  
3’  end  matching  is  the  most  important   genome  size  

h7p://www.nature.com/nprot/journal/v1/n3/fig_tab/nprot.2006.247_F2.html  

4  
 8/31/14  

Degenerate  primer  design:    

1.  Find  the  conserved  amino  acid  sequence  in  your  
organism.    Protein  sequences  are  usually  highly  
conserved.  You  can  design  primers  based  on  the  
predicted  (conserved)  amino  acid  sequence.  

2.  Choose  low  degeneracy  amino  acids  

1.  M  or  W  (no  (1)  degeneracy)  
2.  F,  Y,  C,  H,  Q,  N,  K,  D,  E  (2  degeneracy)  
3.  I  (3  degeneracy)  
4.  A,  G,  P,  T,  V  (4  degeneracy)  
5.  S,  R,  L  (6?  Degeneracy)  

But,  avoid  some  AA  or  TT  codons,  at  the  end  of  the  primer  (i.e,  TTY  for  Y,  AAY  for  K)    
 
You  may  add  codon  usage  on  your  design  
(h7p://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-­‐bin/showcodon.cgi?species=7227)    

h7p://www.soi.wide.ad.jp/class/20070046/slides/06/32.html  

Convenient  to  know:  IUPAC  nota6on  

5  
 8/31/14  

Nested  or  semi-­‐nest  PCR  

1.  Design  two  pairs  of  primers  on  the  same  region.    
 
2.  One  round  of  PCR  with  outside  primers  will  be  followed  by  another  
round  of  PCR  by  using  the  template  of  the  1st  amplicon.  

h7p://wids18.blogspot.com/2012/06/techniques-­‐nested-­‐pcrs-­‐and-­‐finding_10.html  

Rule  of  thumb  in  PCR  

Do  not  do  anything  that  can  cause  contamina@on!!!  

PCR  product  itself  is  the  worst  contaminant  when  you  do  repeated  use  of  a  same  set  of  
primers  in  your  study.  

Uniden6fied  small  fragments  (likely  primer  dimer)  inhibits  specific  amplicon  

 
Always  include  template-­‐free  control  
 
Addi6onal  nega6ve  controls  always  helps  you  for  interpreta6on  
 Only  one  primer  controls  
 
PCR  product  should  be  stored  in  a  separate  refrigerator  or  in  a  separate  box  
 
A  separate  pipe7e  for  handling  PCR  product  helps  (gel  loading  pipe7e)  to  prevent  
contamina6ons.  

6  
 8/31/14  

FAQ  

7