Espirotecas

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BIOQUIMICA [ANALISIS CLINICO
ESPIROQUETAS
Las espiroquetas (Spirochaetes o Spirochaetae) son un filo de bacterias

Gram-negativas que tienen células alargadas y enrolladas helicoidalmente.
Tienen una longitud comprendida entre 5 y 500 µm y un diámetro de alrededor
de 0,1-0,6 µm. Casi todas son unicelulares, si bien se sospecha que Spirochaeta
plicatis pudiera ser pluricelular. Poseen una membrana externa formada por
múltiples capas llamada "envoltura celular" o "vaina externa" que rodea
completamente el cilindro protoplasmático. (1)
Las espiroquetas se distingue de las demás bacterias por la presencia de unos

flagelos especializados denominados filamentos axiales situados entre la
envoltura celular externa y el cilindro protoplasmático (en el espacio
periplasmático) que producen un movimiento giratorio que permite a la bacteria
entera desplazarse hacia delante, como si fuese un sacacorchos. Pueden tener
(según la especie) de dos a 100 flagelos por célula, uno de cuyos extremos se
inserta cerca de un polo de la célula, quedando el otro extremo libre. Los flagelos
son de estructura y composición similar al resto de las bacterias, diferenciándose
en que son completamente intracelulares. (1)
La movilidad de las espiroquetas es diferente al resto de las bacterias móviles.

Pueden emplear tres tipos de movimiento, en medio líquido, rotación alrededor
de su eje, contracciones flexulosas y movimiento helicoidal. También pueden
desplazarse en ambientes altamente viscosos, incluso en medios sólidos con un
1% de agar. Son organismos quimioheterótrofos, la mayoría anaerobios que
viven libremente, pero hay numerosas excepciones de parásitos. (1)
El filo Spirochaetes se divide en familias, todas incluidas en un único orden,

Spirochaetales. Miembros de importancia médica de este filo son:
 Leptospira, que causa leptospirosis o enfermedad de Weil.

 Borrelia burgdorferi, que causa la enfermedad de Lyme.
 Borrelia recurrentis, que causa la fiebre recurrente.
 Treponema pallidum, que causa la sífilis.
 Brachyspira, que causa la espiroquetosis intestinal.
UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO 1
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El genoma es muy inusual y consta tanto de cromosomas lineales como de

plásmidos. Cavalier-Smith y otros autores han postulado que Spirochaetae forma
parte de un clado mayor denominado Gracilicutes. (1)
Los micoplasmas (Mycoplasma) son bacterias que carecen de pared celular.

Pertenece a la clase Mollicutes, tienen genomas pequeños,y tienen un bajo
contenido de GC (18-40%). Existen más de 100 especies reconocidas del género
Mycoplasma. (2)
Debido a la ausencia de pared celular, los micoplasmas no son sensibles a los

antibióticos que bloquean la síntesis de la pared celular, como la penicilina u
otros antibióticos betalactámicos. (2)
Características
El ADN de los micoplasmas oscila entre 580 - 1380 kpb (kilopares de bases).
Son parásitos o comensales de vertebrados; varias especies son patógenos de
los seres humanos, como Mycoplasma pneumoniae, agente causal de una
importante neumonía atípica y otros trastornos respiratorios, y que se cree que
está involucrado en las enfermedades inflamatorias pélvicas. Algunos pueden
causar o contribuir a algunos cánceres. (2)
El colesterol es necesario para la multiplicación de las especies de micoplasmas,

así como de algunos otros géneros de Mollicutes. La temperatura óptima de
multiplicación es a menudo la temperatura de su hospedador (por ejemplo, 37 °C
en el humano). Análisis de 16S ARN ribosomal sugieren fuertemente que
Mollicutes, incluidos los micoplasmas, están estrechamente relacionadas, ya sea
a Lactobacillus o Clostridium del clado Firmicutes (stricto sensu). (2)
Los micoplasmas se encuentran frecuentemente en los laboratorios de

investigación como contaminantes de cultivos celulares. La contaminación se
produce a través de personas portadoras o debido a medios de cultivo
contaminados. (2)

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La célula de un micoplasmas mide generalmente menos de 1 μm y son, por lo

tanto, difíciles de detectar con un microscopio convencional. Los micoplasmas
pueden inducir cambios celulares, como cambios en el metabolismo y el
crecimiento celular, e infecciones graves pueden destruir una línea celular. (2)
Estructura celular
Las bacterias del género Mycoplasma se caracterizan en gran medida por la falta
de pared celular. A pesar de ello, las formas de estas células a menudo se
ajustan a una de las varias posibilidades con distintos grados de complejidad.
Por ejemplo, los miembros del género Spiroplasma tienen una forma helicoidal
alargada sin la ayuda de una rígida estructura de células sobre. Estas formas
presumiblemente pueden contribuir a la capacidad de los micoplasmas a
prosperar en sus respectivos entornos. Las células de Mycoplasma pneumoniae
tienen forma redondeada y poseen una extensión puntiaguda sobresaliente, que
está involucrada en la adhesión a la célula huésped, en el movimiento a lo largo
de las superficies sólidas y en la división celular. Las células de M. pneumoniae
son de pequeño tamaño y pleomórficas. (2)
Los micoplasmas requieren esteroles para la estabilidad de su membrana

plasmática, lo cual es muy inusual en las bacterias. Los esteroles los adquieren
del entorno, por lo general como colesterol a partir de los animales que parasita.
En general, poseen un pequeño genoma de 0,58-1,38 megapares de bases, que
conlleva una drástica disminución de su capacidad de biosíntesis, lo que explica
su dependencia de un hospedador. Además utilizan un código genético
alternativo, donde el codón UGA codifica el aminoácido triptófano en lugar de la
habitual señal de parada "ópalo". (2)
Chlamydia es un género de bacterias gramnegativas perteneciente a la familia

Chlamydiaceae, orden Chlamydiales, filo Chlamydiae. (3)
Es la enfermedad bacteriológica más común y se transmite a través del sexo

vaginal, anal y oral; así como al compartir juguetes sexuales. Se cura con un
antibiótico y la mejor prevención es el preservativo. (3)

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Castellanizado como "clamidia", y genéricamente entendido como plural ("las

clamidias") para hacer referencia a Chlamydia spp., la taxonomía y nomenclatura
de este grupo es un tema controvertido sobre el cual no existe un total acuerdo
entre los expertos (ver sección Taxonomía más adelante), así como tampoco la
forma de contagio. Con la información disponible en la actualidad, taxonómica y
sistemáticamente, el género Chlamydia incluye tres especies: C. trachomatis, C.
muridarum y C. suis. (3)
Clínicamente, se reconocen actualmente —para el ser humano— cuatro

especies patogénicas importantes: C. trachomatis, C. pneumoniae, C. psittaci y
C. pecorum. Las dos primeras se consideran parásitos estrictos del ser humano
y de transmisión interhumana (productoras de enfermedad infectocontagiosa).
En cambio, C. psittaci y C. pecorum son patógenos primarios de aves y
mamíferos (ovejas, cabras, cerdos y koalas), y las personas se infectan
accidentalmente por contacto con animales infectados (productoras de
enfermedad zoonótica). (3)
RICKETTSIAS
La rickettsia es un género de bacterias perteneciente a la familia Riketssiaceae.

Son parásitos que se encuentran dentro de la célula por lo que son pequeños.
CARACTERÍSTICAS: Gram negativo.
Bacteria Pleomórfica: forma de cocos, bacilos o hilos.
Las rickettsias se pueden transmitir por aerosoles (ejemplo estornudos),

picaduras, mordeduras, agua contaminada, alimento contaminado y raspaduras.
Las enfermedades por rickettsias son muy comunes en perros pero raras en
gatos (excepto la hemobartonelosis) y la mayoría de estas enfermedades son
causadas por garrapatas y en algunos casos porque el perro comió salmón crudo
o peces relacionados contaminados con la metacercaria de la
fasciola Nanophyetus salmincola infectada con Neorickettsia helminthoeca o por
la FasciolaElokomin

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Algunas Rickettsias causan zoonosis, es decir, son transmitidas al hombre.(1)
RICKETTSIOSIS
DESCRIPCION
La Rickettsiosis es una enfermedad de distribución global, causada por bacterias

del género Rickettsia, constituyen un grave problema salud pública de gran
impacto a nivel mundial ya que normalmente viven en parásitos como
garrapatas, pulgas, piojos y acararos, y se transmiten a los humanos a través de
las picaduras de estos insectos, cursa con cuadros febriles y algunas veces es
asintomático, lo que dificulta su diagnóstico, pues comparte la misma
sintomatología de otros cuadros febriles. El periodo de incubación varía entre 1
a 14 días.
SE TRANSMITE POR:
Por picadura de algún artrópodo infectado (garrapata principalmente). Las

garrapatas inoculan las Rickettsias dentro de la dermis (piel), de donde se
distribuye y coloniza el citoplasma de las células endoteliales de los vasos
pequeños y medianos generando vasculitis y daño orgánico.
La transmisión ocurre principalmente por deficientes condiciones sanitarias,

ambientales, tenencia inadecuada de animales y desconocimiento del evento
SINTOMAS
 Fiebre
 Dolor de cabeza intenso
 Escalofríos
 Agotamiento y dolor muscular
 Malestar general
 Erupción cutánea que va desde un color rojo claro hasta morado intenso al
cuarto día de
 iniciada la fiebre

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 Los síntomas comienzan de improviso entre 3 y 12 días después de la

picadura del insecto.
Con frecuencia se observan síntomas nerviosos (agitación, insomnio, delirio y

coma).Se presentan complicaciones vasculares y pulmonares.
Es de recordar que la población susceptible es aquella que vive en zonas

apartadas, población rural (trabajadores rurales, campesinos), fuerzas militares
y población con baja resistencia inmune.
Técnicas diagnósticas
Tinción de Giménez
Las muestras de tejidos pueden examinarse microscópicamente mediante esta

tinción, que permite visualizar las Rickettsias, pero no diferencia en cuanto a
especie ni tampoco otros microorganismos, por lo que su detección suele ser
dudosa.
Serología
La serología está limitada por las reacciones cruzadas entre el GFM y el GFT.
La IFI es una de las técnicas más sensibles y la más ampliamente utilizada en la
actualidad para el diagnóstico de las Rickettsiosis exantemáticas. Los antígenos
están comercializados, estandarizados y prefijados en los portaobjetos sobre los
que se añaden diluciones se-riadas del suero del paciente. La confirmación del
diagnóstico requiere detectar una seroconversión, que se produce en la fase de
convalecencia, entre la tercera y cuarta semanas. Para una correcta
interpretación de los resultados de serología, se deben tener en cuenta los datos
de reactividad ba-sal de la población en zonas endémicas. Como técnicas
experimentales, para evitar la reactividad cruzada, en algunos casos se utilizan
ensayos deinmunobloting con sueros sometidos a absorciones con antígenos
heterólogos. Este método da como resultado un considerable aumento de la
especificidad, si bien tiene una baja sensibilidad.(1)
Cultivo

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Para el cultivo de las rickettsias del GFM se requiere Minimum Esencial Medium
(medio MEM) sin antibiótico suplementado con suero bovino fetal (SBF) al 10%
(concentración final [CF]), 2 mM de glutamina CF y el 0,2% (CF) de aminoácidos
no esenciales. La incubación de los cultivos se lleva a cabo a 33-35 °C en
ausencia de CO2. Para R. typhi se requiere el mismo medio suplementado con
SBF al 2% (CF). El diagnóstico definitivo de las rickettsiosis requiere el
aislamiento e identificación de la especie a partir del cultivo 9,11,13. El cultivo se
lleva a cabo en células VERO E6 o fibroblastos L92. El efecto citopático
producido no es muy característico ni específico de especie y, aunque puede
aparecer a las 24-48 h postinoculación, generalmente se necesitan 5-7 días para
su desarrollo. El cultivo se puede acelerar si se inocula la muestra sobre una
monocapa de las células susceptibles previamente crecidas sobre un
portaobjetos circular (shell vial, SV), seguida de una centrifugación. Después de
5-7 días de incubación se procede a detectar la presencia de la bacteria
mediante tinción de Giménez, IFI con anticuerpos específicos o PCR. Este
procedimiento resulta muy laborioso, requiere personal especializado e
instalaciones con nivel de seguridad 3. Su principal limitación es su baja
sensibilidad, por lo que se no se recomienda en el caso de que el paciente haya
comenzado con la antibioterapia. Sin embargo, es la técnica diagnóstica más
específica, fundamental para la obtención de antígenos, para el estudio de la
sensibilidad a antibióticos y la determinación de las especies
de Rickettsia presentes en un área.(1)
Detección molecular
Las técnicas moleculares, como la PCR, permiten un diagnóstico rápido y

específico al detectar ADN de rickettsia en tejidos infectados, cultivos y
garrapatas. Por el momento, la mayor parte de las técnicas descritas son de
desarrollo propio, y no están comercializadas. Los genes más comúnmente
analizados son los que codifican dos proteínas de la membrana
externa: rOmpA(presente en todas las especies excepto R. helvetica, R.
australis, R. bellii y R. canadensis) y rOmp B(presente en todas las especies
excepto R. helvetica, R. bellii y R. massiliae). También se utiliza el gen gltA, que
codifica la citrato sintetasa (válido para todas la rickettsias), el gen que codifica

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la proteína de 17-kDa (válido para todas las rickettsias del GFM) y el gen D
(válido para la mayoría de las especies). Recientemente, se ha desarrollado una
PCR-RLB (reverse line blotting) que utiliza como diana el espacio intergénico
23S-5S ARNr16 que, junto con una hibridación en fase reversa utilizando sondas
espe-cie-específicas, permite la identificación de la especie implicada sin
necesidad de secuenciación. Este método es altamente sensible y específico,
tanto para muestras clínicas como ambientales. Cuando se busque una mayor
sensibilidad, hay que recurrir a PCR anidadas y posterior hibridación en fase
reversa. La PCR a tiempo real permite obtener resultados en muy poco tiempo
(menos de 1 h). Todas estas ventajas hacen que la PCR se presente como la
prueba ideal para el diagnóstico de estas infecciones, aunque existen algunas
desventajas, como son la limitación para realizar pruebas de sensibilidad a los
antibióticos y la imposibilidad de coleccionar los aislados para futuras
investigaciones.(2)
PREVENCION
 Higiene personal: Baño diario y cambio de ropa frecuentemente.

 Usar ropa de colores claros que permite ver los parásitos que se posan
sobre la misma.
 Aplicar repelentes en piel y ropa (si se tiene la posibilidad). Hay que tener
precaución con la aplicación de estos repelentes en menores de edad.
 Practicar monitoreo permanente y minucioso del cuerpo luego de regresar
de áreas que están potencialmente infestadas de garrapatas de ser posible
utilizando un espejo de cuerpo entero para ver todas las partes del cuerpo
y retirar todos los ectoparásitos que se encuentren. Examinar los menores
de edad por todo el cuerpo sobre todo en la áreas donde se mimetizan mejor
las garrapatas como en la cabeza, la zona inguinal y la axilas.
 Examinar los animales domésticos luego de regresar al peri-domicilio de las
zonas probablemente infestadas por garrapatas.
 Promover la Tenencia Responsable de animales de compañía
 Mejoramiento de la vivienda y del saneamiento básico:
 Correcto manejo y disposición final de residuos sólidos, no arrojando basura
o desperdicios cerca de la casa ni en áreas publicas

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 Mantenimiento y corte de césped en domicilio, peri domicilio y espacios

públicos
 Programa integral de control de plagas (ratones, ratas, vectores como
garrapatas), de las viviendas y sus alrededores(3)
MEDIOS REQUERIDOS EN MICROORGANISMOS DE

IMPORTANCIA CLINICA
1.-ESPIROQUETAS
La familia Spirochetaceae incluye tres géneros de interés en patología humana,

Treponema, Borrelia y Leptospira.
1.1. T. Pallidum
Para el diagnóstico de la sífilis, tradicionalmente, se cuenta con tres grupos de

pruebas. Por examen directo mediante microscopía en campo oscuro y por
fluorescencia directa, mediante serología y por cultivo en células epiteliales de
conejo. Por serología se tienen dos tipos de pruebas, las pruebas no
treponémicas como VDRL y RPR (Rapid plasma reagin) y las pruebas
treponémicas como FTAABS (Fluorescent treponemal antibody absorption) o
como MHA-TP (Microhemaglutinación para T pallidum)1.
Las nuevas pruebas diagnósticas para la sífilis, incluyen enzimo inmunoensayo

(ELISA), Western bloty Reacción en cadena a la polimerasa (PCR).
a.-OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS
Para la microscopia en campo oscuro, la muestra debe ser fluido seroso libre de
eritrocitos y residuos de tejidos o puede ser materia obtenido por aspiración de
ganglio; se limpia la lesión con solución salina, sólo si estuviera contaminada.
Puede ser necesario realizar una abrasión leve de la lesión, para obtener fluido
seroso, el cual se coloca directamente en una lámina, la que debe examinarse
antes de transcurridos 20 minutos, ya que el Treponema pallidum es muy
sensible al oxígeno, calor, cambios de pH y desecación. Nunca se debe tomar

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para campo oscuro muestras de cavidad oral, o anal debido a la contaminación

con espiroquetas no patógenas.
Para la fluorescencia directa se obtiene la muestra de manera similar que la

descrita para el campo oscuro, pero se deja secar al medio ambiente. También
se puede trabajar esta técnica con muestras parafinadas de cualquier tejido,
siendo las más frecuentes del cerebro, placenta, cordón umbilical y piel2.
Para Western blot se trabaja con suero; y para la PCR con muestras sanguíneas,
exudados y tejidos, para algunos el uso de suero o LCR es controversial. Al
realizar la PCR el mayor problema, y lo que debe evitarse, es la contaminación
de las muestras con ADN extraño.
b.-MICROSCOPIA DE CAMPO OSCURO
La microscopía de campo oscuro es la prueba de elección para la sífilis primaria

sintomática. Los treponemas, morfológicamente, son espiroquetas muy
delgadas y helicoidales, que miden 0,1 por 5 a 15 mm; estos gérmenes son tan
delgados, que no pueden ser observadas en un microscopio de luz a campo
normal, y es necesario un microscopio que tenga campo oscuro. El T. pallidum
se diferencia de otros microorganismos espiralados porque son más delgados,
sus espirales son muy regulares y presentan un movimiento característico en
tirabuzón. Cuando se obtiene hallazgos positivos al campo oscuro, se debe
reportar como organismos con morfología y características de T pallidum,
debiéndose realizar obligatoriamente pruebas serológicas confirmatorias. Se
debe tener en cuenta que el campo oscuro puede ser positivo antes que las
pruebas serológicas.
Un examen de campo oscuro negativo no descarta la sífilis, ya que, podrían

haber muy pocos gérmenes en la lesión o haberse producido alteraciones debido
a algún tratamiento recibido ya sea tópico o sistémico, y, por último, se debe
considerar otra enfermedad de transmisión sexual2-4.
c.-INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA

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Mediante este examen, se puede detectar la presencia de subespecies de T

pallidum en tejidos, fluidos corporales, secreciones y exudados de lesiones. Se
necesita un microscopio de fluorescencia, equipado con condensador de campo
oscuro y con lámpara para iluminación de fluorescencia. La prueba permite
diferenciar treponemas patógenas de no patógenos, por una reacción de
antígeno-anticuerpo.
La muestra debe ser secada al aire y fijada con acetona, metano o calor, luego
es marcada con anticuerpos humanos o de conejo o monoclonales conjugados
con el colorante fluorescente isotiocianato de fluoresceína (FITC). Las muestras
de tejidos se trabajan de manera similar, pero deben ser fijadas por dos horas
con formol neutro, luego deben ser parafinadas.
Un hallazgo positivo se reporta como treponemas inmunológicamente

específicos para T pallidum, observados por inmunofluorescencia directa. Esta
prueba es comparable en sensibilidad con la microscopia de campo oscuro, pero
de mayor especificidad.
d-INOCULACIÓN DE ANIMALES
A este método, se le denomina RIT (Rabbit infectivity test) y consiste en la

inoculación del T pallidum en los testículos de un conejo. Esta prueba es el
estándar de oro, que determina la sensibilidad y especificidad de las otras
pruebas para el diagnóstico de sífilis. Además es el método más antiguo para
detectar una infección por T. pallidum. Este método no se utiliza de rutina porque
es costoso y representa una dificultad técnica mayor3.
e.-CULTIVO
El cultivo de T pallidum sólo se ha logrado en células epiteliales de conejo, La

multiplicación de los gérmenes es muy lenta, siendo el tiempo promedio de
duplicación de 30 a 33 horas2, aunque algunos autores comunican que a
temperatura de 33° C, el crecimiento es más rápido. El T pallidum se ha tratado
de cultivar en medios acelulares microaerofílicos con poco éxito. Este método no

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es adecuado para el trabajo de rutina del laboratorio pero sí se realiza en los

laboratorios de referencia.
f.-PRUEBAS SEROLÓGICAS
Las pruebas serológicas son de dos tipos: no-treponémicas y treponémicas. Las

pruebas no treponémicas son usadas para despistaje, son económicas y,
también, sirven para evaluar la eficacia del tratamiento. Sus limitaciones
consisten en baja sensibilidad en sífilis primaria temprana, con prueba de campo
oscuro positiva, en sífilis tardía y la posibilidad de fenómeno de prozona o de
resultados falsos positivos. Las pruebas treponémicas emplean como antígeno
al T. pallidum subespecie pallidum y detectan anticuerpos específicos
antitreponémicos. Se le utiliza para verificar cuando las pruebas no-
treponémicas son reactivas o como pruebas confirmatorias cuando el cuadro
clínico es sugestivo, pero la serología es negativa, como ocurre en la sífilis tardía.
En el 85% de los pacientes con sífilis con tratamiento exitoso, estas pruebas se
mantienen reactivas por varios años2.
g.-PRUEBAS NO TREPONÉMICAS
Las pruebas no-treponémicas incluyen el VDRL (Venereal Disease Research

Laboratory, RPR (Rapid plasma reagin), USR (Unheated-serum reagin) y
TRUST (Toluidine red unheated-serum test), de estas las más usadas son RPR
y VDRL.
Todas estas pruebas están basadas en antígenos en solución alcohólica, que

contienen cardiolipina, colesterol y lecitina purificada en cantidad adecuada para
producir reacciones estándares.
Se denomina reagina a una proteína similar a un anticuerpo, que se une a un

antígeno, como pueden ser la cardiolipina y la lecitina en las pruebas no-
treponémicas, y se denomina anticuerpos reagínicos a anticuerpos no-
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treponémicos, producidos por un individuo infectado con T pallidum, contra sus

propios tejidos o contra células de mamíferos. Estos anticuerpos reagínicos, no
son exclusivos de la sífilis y también son producidos en otras enfermedades
infecciosas como son el sarampión, varicela, hepatitis, mononucleosis
infecciosa, lepra, tuberculosis, malaria, leptospirosis, tripanosomiasis,
linfogranuloma venéreo, o por personas con enfermedades autoinmunes,
drogadictos, individuos que han recibido alguna inmunización recientemente,
embarazo y en edad avanzada3.
VDRL
En la prueba de VDRL, el suero del paciente es inactivado a 56° C por 30

minutos, si se usa líquido cefalorraquídeo (LCR) sólo se debe centrifugar Luego
la muestra se mezcla con un antígeno, que es una solución buffer salina de
cardiolipina y lecitina adosadas a partículas de colesterol. Esta prueba se puede
realizar en lámina y ser observada al microscopio como un precipitado de
partículas finas (floculación), o se puede realizar en un tubo de ensayo y ser leída
macroscópicamente.
Los resultados de VDRL en lámina son comunicados como no reactivos (no hay
floculación, débilmente reactivos (ligera floculación, y reactivos floculación
definitiva. Todos los sueros reactivos se diluyen seriadamente, a cada dilución
se le realiza la prueba de VDRL y se registra el titulo máximo obtenido. Rara vez
se tiene un paciente con título elevado en las diluciones y con VDRL no reactivo
en la muestra sin diluir (fenómeno de prozona), si ocurriera es más frecuente en
la sífilis secundaria.
Se obtiene falsos negativos en ciertas condiciones, tales como fenómeno de

prozona, bajo título de anticuerpos, presencia de sustancias inhibidoras en el
suero del paciente, VIH, la temperatura ambiental fuera del rango de 23-29° C o
error técnico. Los falsos positivos pueden llegar a 10 a 30%, y han sido
reportados en casos de síndrome de anticuerpos antifosfolípidos, lupus
eritematoso sistémico (LES), fiebre reumática, neumonía vira, neumonía
neumocócica, mononucleosis infecciosa, hepatitis infecciosa, lepra, malaria,

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artritis reumatoide, infecciones por otros treponemas, embarazo, ancianos, y

muestras hemolisadas o contaminadas3.
RPR
El RPR es una prueba diseñada para detectar reagina en el suero de manera

rápida, no requiere inactivación por calor La muestra se mezcla con una
suspensión que posee cardiolipina, lecitina y colesterol en partículas de carbón.
Si la muestra es positiva se observa pequeños grumos negros (floculación). El
resultado se reporta como reactivo o no reactivo; todos aquellos reactivos deben
ser diluidos seriadamente para realizar la titulación, y se reporta la dilución más
alta que exhibe reacción.
Los falsos negativos se pueden producir por errores técnicos y los falsos
positivos son los mismos que para la prueba de VDRL.
Se ha desarrollado variantes de esta prueba en las que la muestra puede ser

plasma sin que se pierda su sensibilidad y especificidad.
TRUST Y USR
Estas pruebas son menos usadas que el VDRL y la RPR. El TRUST (Toulidine
red unheated serum test) es una prueba desarrollada para el despistaje de la
sífilis, el principio es similar al del VDRL, pero no es necesario inactivar el suero
y el rojo de toluidina se encarga de dar color a la reacción. La sensibilidad y
especificidad son similares a la prueba de RPR.
La USR (Unheated serum reagin) tiene la ventaja que es poco costosa, tampoco
requiere de inactivación de suero por calor y, al igual que otras pruebas no
treponémicas, tiene buena sensibilidad y especificidad14-15.
h.-PRUEBAS TREPONÉMICAS
Las pruebas treponémicas comprenden FTA-ABS (Fluorescent treponemal

antibody absorption), y sus variantes FTA-ABS-DS (FTA-double staining), 19S-

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IgM-FTA-ABS; MHA-TP (Microhemaglutinación para T. pallidum), y TPI (T

pallidum immobilization), de los cuales el último es obsoleto por su baja
sensibilidad en la sífilis primaria3.
FTA-ABS
La FTA-ABS es un método de observación directo, que se utiliza como

confirmación cuando una de las pruebas no-treponémicas es positiva. Es el
método de elección para el diagnóstico de la sífilis primaria a partir de las dos
semanas después del contagio.
Se utiliza suero inactivado por calor, el que se coloca sobre una lámina donde
se encuentra el Treponema pallidum es suspensión (por lo menos 30
microorganismos por campo). El conjugado consiste en antiglobulina humana
(IgG o IgM) con isotiocianato de fluoresceína, el que se diluye seriadamente
hasta 1/800 o más. Luego de un tiempo de incubación, se observa al microscopio
de fluorescencia en una habitación oscura. La reacción se reporta en cruces de
1+ a 4+.
La 19S-IgM-FTA-ABS es una variante de la FTA-ABS que usa IgM de 19S que

es obtenida por ultra centrifugación y tiene como ventaja una mayor
especificidad. La 19S-IgM permanece por corto tiempo en la sangre después del
tratamiento y su reaparición determina una reinfección, en cambio, la IgM total
se puede detectar hasta un año después16-18. La 19S-IgM-FTA-ABS es de gran
utilidad en los siguientes casos: confirmación de la sífilis muy temprana,
determinar el éxito terapéutico y diagnosticar una reinfección; no es de utilidad
en la sífilis terciaria, porque da falsos negativos
La FTA-ABS-DS tiene una sensibilidad de 100% para la sífilis secundaria y la

sífilis latente, y 95% para la sífilis tardía21-24 porque utiliza en su proceso doble
conjugado fluorescente; el primero anti-IgG humana conjugada con rodamina y
el segundo fluoresceína antitreponémicos que tiene función de contracolor y
facilita la visualización.
i.-NUEVAS PRUEBAS EN El DIAGNÓSTICO DE LA SÍFILIS

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ELISA (Enzyme-Linked lmmunoabsorbent Assay)
Durante la infección por Treponema pallidum se producen anticuerpos

inespecíficos, contra antígenos comunes a todas las espiroquetas y anticuerpos
específicos contra Treponema pallidum. En la enfermedad temprana los
anticuerpos son IgM, luego rápidamente aparecen anticuerpos IgG que son los
predominantes durante el tiempo.
La técnica de ELISA es un método de cuantificación inmunológica que evalúa la

reacción antígeno-anticuerpo mediante una reacción enzimática, de acuerdo al
diseño de la prueba se puede detectar una o más inmunoglobulinas o se puede
detectar antígenos específicos- para lo cual se utiliza un conjugado, formado por
un antianticuerpo o un antígeno, el cual se ha marcado con una enzima
(peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, glucosa oxidasa, etc.). El antígeno o
anticuerpo que se utiliza, es inmovilizado sobre un soporte sólido, que es
generalmente una placa de poliestireno, por lo que la reacción antígeno-
anticuerpo que se produce también queda inmovilizada en el soporte sólido. A
esto se ¡e adiciona un sustrato (enzima) marcado con un cromógeno que
produce una reacción de color, que es directamente proporcional a¡ analito
(antígeno o anticuerpo a ser detectado) y que es cuantificado con un lector de
ELISA que es un espectrofotómetro modificado.
Los ELISA para sífilis que se introdujeron en la década de los ochenta, usaban
extracto treponémico como antígeno32-36, y no estaban aprobadas para el
diagnóstico de sífilis, en los noventa se introdujeron pruebas que utilizaban
antígenos recombinantes de las proteínas de membrana del Treponema
pallidum y otras que utilizaban anticuerpos monoclonales, las cuales detectan
tanto IgM como IgG o ambas37-39 con una sensibilidad del 99-100% y con una
especificidad de 94-99%. La sensibilidad para IgM disminuye en sífilis avanzada,
En la actualidad tienen aceptación clínica las pruebas de ELISA marca Captia-
G, Immune-Capture y BIO-ELISA Sífilis
Western blot

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El Western Blot, también denominado inmunoblot, es una técnica que detecta

anticuerpos para epítopes específicos en antígenos, previamente separados por
electroforesis de alta resolución. La electroforesis separa los componentes
antigénicos por sus diferentes pesos moleculares. Luego estos son transferidos
a una membrana de nitrocelulosa reteniendo su posición electroforética y
reaccionan con el suero del paciente, si los anticuerpos específicos estuviesen
presentes, estos son revelados usando un antianticuerpo conjugado con una
enzima a la que se le agrega un sustrato cromogénico, dando como resultado
bandas coloreadas en la tira de nitrocelulosa. Esta técnica se utiliza para
confirmar los anticuerpos detectados previamente por alguna otra prueba
serológica de despistaje3.
Recientemente se ha secuenciado el genoma del Treponema pallidum, también

se ha identificado mediante electroforesis de alta resolución que sus factores de
virulencia radican en un grupo de 12 proteínas de la membrana externa de
diferentes pesos moleculares45-47.
De estas proteínas se ha estudiado un grupo de cinco proteínas que poseen

determinantes antigénicos comunes, conocidas como TROMPs, de 17, 28, 31,
45 y 65 Kd. Las proteínas de 17 y 45 Kd. son lipoproteínas y se encuentran
también en grandes cantidades en la membrana interna del Treponema pallidum.
Las otras proteínas se encuentran exclusivamente en la membrana externa, a la
de 31 Kd. se le denomina Tromp1 y tiene actividad de porina, la de 28 Kd. se
denomina Tromp2 y se le encuentra también en la membrana externa de E. coli,
y a la de 65 Kd. se le denomina Tromp3.
También está en estudio una proteína de 26 Kd., se ha identificado que en su

porción N-terminal, constituida por 25 aminoácidos, posee una región
polipeptídica denominada TpLRR (Treponema pallidum leucine-rich repeat
protein) que tiene poca capacidad antigénica y cuya función aún es
desconocida48-49.
En el Western Blot para Treponema pallidum, los antígenos pueden reaccionar

con IgG, IgM o IgA presentes en el suero de pacientes con sífilis, la IgG reacciona

FARMACIA Y
fuertemente con una proteína de membrana de 47 Kd., pero es menos sensible

y específica que la prueba de FTA-ABS. En cambio, cuando la prueba detecta
IgM, es de gran utilidad en el diagnóstico de la sífilis secundaria y congénita, con
una sensibilidad del 83%. Esto se reduce cuando el Western blot detecta IgA,
donde la sensibilidad disminuye al 67%2,50-53.
El conocimiento del genoma completo, el estudio de las proteínas de membrana

del Treponema pallidum y especialmente del grupo TROMPs, en un futuro
cercano, nos permitirán el desarrollo de nuevas pruebas para el diagnóstico de
la sífilis.
Reacción en Cadena a la Polimerasa (PCR)
La técnica de reacción en cadena a la polimerasa (PCR), amplifica o replica

varias veces secuencias específicas de ADN de una muestra, Se utiliza dos
porciones cortas de ADN denominados cebadores o iniciadores o "primers",
estos son oligonucleótidos sintéticos de ADN o ARN cuya secuencia es
conocida, que luego de fusionarse (hibridarse) a un ADN complementario,
actúan como una plantilla para sintetizar nuevo ADN, esto es un proceso
enzimático repetido en varios ciclos térmicos. El proceso se inicia con la
separación del ADN de doble cadena mediante calor (desnaturalización), al bajar
la temperatura se produce recombinación o emparejamiento de los primers con
el ADN original de una sola cadena, se prolongan las secuencias de ADN cebado
y por medio de una incubación con la polimerasa de ADN se sintetiza una nueva
cadena complementaria de ADN. Cada proceso denominado ciclo va duplicando
la cantidad de ADN de manera exponencial y por lo general se llevan a cabo
unos 30 o 40 ciclos. Al final del proceso se habrán obtenido 230 o 240 moléculas
del producto deseado, según el numero de ciclos realizados. Esta técnica tiene
diferentes variantes, dependiendo del ADN a amplificar, que consiste en
modificaciones de alguno de los pasos del proceso básico3.
La prueba de PCR que detecta ADN de Treponema pallidum tiene 785 de

sensibilidad y 100% de especificidad, es de gran utilidad en el diagnóstico de
aquellas sífilis cuyo diagnóstico representa dificultad como son sífilis congénita,

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la sífilis tardía2,54-55 y en detectar infección persistente en individuos que han

recibido tratamiento ineficaz56.
La ventaja del PCR es que al amplificar ADN específico de Treponema pallidum,

se elimina la posibilidad de detectar falsos positivos, además que puede
realizarse en gestación temprana, mediante el estudio del líquido amniótico57.
Otros
Existen dos pruebas rápidas de látex para el diagnóstico de sífilis, la primera
denominada FAST que usa tres antígenos recombinantes y tiene una
sensibilidad mayor al 99%58; y la otra prueba denominada MCA-TP
(Microcapsule agglutination for Treponema pallidum), utiliza micro cápsulas
sensibilizadas con antígeno de Treponema pallidum y es muy sensible para
detectar sífilis primaria59. También se desarrolló una prueba de
Radioinmunoensayos (RIA) para la detección de Treponema pallidum. Ninguna
de estas pruebas logró amplia difusión.
1.2 Borrelia burgdorferi
El género Borrelia comprende las espiroquetas transmitidas por artrópodos.

Además de los procesos de interés veterinario, estos microorganismos son
responsables de dos enfermedades: la de Lyme o borreliosis de Lyme, que se
transmite por garrapatas duras de la familia Ixodidae , y la fiebre recurrente,
transmitida por garrapatas blandas de la familia Argasidae , y la forma epidémica
de esta enfermedad, transmitida por el piojo del cuerpo (Pediculus humanus
humanus) .
La borreliosis de Lyme producida por B. burgdorferi sensu lato (B. burgdorferi en

sentido lato o amplio, s.l.) es una enfermedad multisistémico en la que
predominan las manifestaciones dermatológicas, reumáticas, neurológicas y
cardíacas. Su característica principal es una lesión cutánea denominada eritema
migratorio1
Diagnóstico de laboratorio de la borreliosis de Lyme

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Excepto en los casos que presentan la manifestación patognomónica de la

borreliosis de Lyme, el eritema migratorio, el diagnóstico de esta infección
requiere la confirmación mediante métodos microbiológicos. En términos
generales, el cultivo presenta una sensibilidad muy baja (alrededor del 30%)
debido, entre otros factores, al bajo número de organismos presentes en las
muestras, por lo que no se considera un método diagnóstico eficaz. Por otra
parte, la amplificación del ADN mediante reacción en cadena de la polimerasa
(PCR), si bien tiene una eficacia probada en el diagnóstico de otras
enfermedades, no la tiene en la borreliosis de Lyme. Varias han sido las dianas
elegidas para su amplificación, como los genes plasmídicos ospA y ospB, el gen
cromosómico que codifica la proteína flagelar, o los genes que codifican el 16S
ARNr y el espacio intergénico 5S-23S ARNr31. En el caso de líquido sinovial en
pacientes con artritis, la PCR tiene una buena sensibilidad (hasta el 70%, tabla
3). Las muestras de orina o sangre no se consideran recomendables en el
diagnóstico por PCR de la borreliosis de Lyme.
La detección de anticuerpos es, por lo tanto, esencial para el diagnóstico

microbiológico de la enfermedad. El esquema aceptado hasta la fecha, tanto por
los CDC (Centers for Disease Control and Prevention, 1995) como por la
Sociedad Alemana de Higiene y Microbiología (SAHM)
(www.dghm.org/red/index.html?cname = MIQ), incluye un cribado mediante
métodos con una buena sensibilidad y confirmación mediante immunoblot (IB).
Cabe destacar que sólo entre el 30 y el 40% de los pacientes con eritema
migratorio son seropositivos en la fase aguda, y hasta el 70% serán positivos en
la fase convaleciente, de 2 a 4 semanas más tarde. En la neuroborreliosis se

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produce una síntesis intratecal de anticuerpos. B. burgdorferi posee numerosos

antígenos inmunodominantes y los anticuerpos que primero aparecen en el
curso de la enfermedad van dirigidos a la proteína flagelar de 41 kDa, así como
a OspC. Más tarde, como norma general, en el estadio II se dirigirán contra p39
y p58, OspA y OspB. Finalmente, en el estadio III, el repertorio de anticuerpos
afecta a una gran variedad de proteínas (p83/100, p58, p43, p39, p30, p21,
Osp17 y p14). En este estadio es rara la detección de anticuerpos IgG contra
OspC. Sin embargo, sí pueden persistir anticuerpos de tipo inmunoglobulina M
(IgM) contra esta proteína durante meses, incluso después de la recuperación
del paciente.
ELISA
La variedad de métodos de enzimo absorción ligada a enzimas (ELISA)

disponibles actualmente en el mercado hace muy difícil su estandarización. Sin
embargo, en principio un ELISA es válido si se trata de una prueba de segunda
generación, es decir, si usa un extracto antigénico purificado o enriquecido de la
bacteria31. Sin embargo, incluso en estos casos la heterogeneidad de las cepas
circulantes en una determinada zona geográfica debe ser tenida en cuenta a la
hora de elegir la mejor prueba de ELISA, por lo que la combinación de antígenos
derivados de dos o más cepas puede ser una buena alternativa para obtener una
buena sensibilidad. Recientemente se han descrito estudios de ELISA en los que
se utilizan antígenos recombinantes (p. ej., VlsE) o péptidos sintéticos (p. ej., el
C6 derivado del VlsE) con buenos resultados, sobre todo en casos con
neuroborreliosis, y que están diseñados para eliminar la necesidad de una
segunda prueba de confirmación.
Immunoblot. El IB es la técnica de elección en la confirmación del diagnóstico de

borreliosis de Lyme. Es imprescindible que el antígeno utilizado en caso de
extractos lisados exprese los antígenos inmunodominantes OspC y Osp17.
Diversos estudios demuestran que las recomendaciones dadas por los CDC
para la interpretación del IB no son aplicables en Europa. Además existen

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grandes discordancias entre los resultados obtenidos en distintos laboratorios

debidas, entre otras razones, a la cepa utilizada en las técnicas serológicas. Los
criterios adoptados por la SAHM recomiendan la utilización de la cepa PKo de B.
afzelii, ya que ésta aporta al IB igual sensibilidad que la utilización de B.
burgdorferi s.s. (PKa2) y B. garinii (PBi) y permite un criterio "dos bandas" para
la IgG, es decir, al menos dos bandas positivas de entre las siguientes: p83/100,
p58, p43, p39, p30, OspC, p21, Osp17 y p14 (tabla 4), requisito fundamental
recomendado por la SAHM. En el caso IgM, para considerar un suero positivo
debe aparecer reactividad frente, al menos, una banda de entre p41 (en este
caso con gran intensidad), p39, OspC y Osp17. Recientemente se han
desarrollado métodos de IB en los que se utiliza VlsE recombinante y homólogos
de Osp17 que aumentan la sensibilidad del 52 al 86% en los casos de
neuroborreliosis. Por lo tanto, los nuevos IB recombinantes son prometedores
para la estandarización y para lograr una mayor sensibilidad de la técnicas
serológicas en el diagnóstico de la borreliosis de Lyme.
1.3 Leptospira interrogans
Diagnóstico microbiológico
Durante el periodo febril de leptospiremia se puede aislar el microorganismo del
líquido cefalorraquídeo; después de la primera semana puede incluso cultivarse
a partir de la orina. Al término de la primera semana se detectan los anticuerpos
en el suero del enfermo, constituyendo el método diagnóstico de elección.
Examen microscópico
Si bien el método para la observación de Leptospira es la microscopia de campo
oscuro, no es frecuente observar la

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Leptospira en los productos patológicos (sangre, orina, líquido cefalorraquídeo),

por la escasa concentración de microorganismos en los mismos. En los tejidos
se pueden demostrar mediante técnicas de impregnación argéntica.
Cultivo
Las Leptospira se cultivan en medios artificiales constituidos por una solución de
sales minerales y aminoácidos a los que se añade suero de conejo (medios de
Fletcher y Stuart), o albúmina bovina con Tween 80 (medio de Ellinghausen,
McCullogh,
Harris y Johnson o EMJH). La incubación se realiza a 28-30°C. Debido a su lento
desarrollo, sólo se observa crecimiento después de transcurrida una semana; sin
embargo, no debe considerarse el cultivo como negativo sino hasta transcurrido
un mes. El crecimiento en medios líquidos se manifiesta por enturbiamiento; y
en los medios semisólidos, el desarrollo se inicia a 1-2 cm de la superficie, pero
la morfología colonial no es característica.
La identificación de la cepa aislada se efectúa mediante técnica de aglutinación
microscópica con anticuerpos específicos de serogrupos y serotipo.
En los laboratorios de referencia hay anticuerpos monoclonales muy específicos.
La identificación se completa con el método molecular de “huellas digitales”
(finger-print) y con el análisis de restricción del ADN y uso de las endonucleasa.
Métodos serológicos (diagnóstico indirecto)
La técnica de referencia es la reacción de micro aglutinación con suspensiones
vivas de Leptospira y lectura microscópica en fondo oscuro (aglutinación
microscópica) (figuras 9 y 10).

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Presenta una gran sensibilidad y especificidad, y se debe practicar la reacción

frente a una batería de cepas de los principales serogrupos. La prueba se
considera específica de leptospirosis cuando se detecta seroconversión, es
decir, aumento significativo del título de anticuerpos entre dos muestras de
suero; la primera obtenida durante los primeros días de la enfermedad y la
segunda muestra 10 a 15 días después, o bien cuando se obtienen títulos
elevados en una sola muestra (< I: 800). Sin embargo, puede haber reacciones
serológicas cruzadas con sífilis, borrelosis recurrente, espiroquetos de Lyme y
legionelosis.
Como prueba serológica rápida, en algunos laboratorios clínicos se utiliza la
técnica de enzimoinmunoensayo (ELISA), especialmente para detección de IgM.
La metodología que debe seguirse en el laboratorio clínico se muestra en la
(figura 11).
2.-MYCOPLASMA
2.1.-Mycoplasma pneumoniae
Diagnóstico

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El diagnóstico microbiológico en la práctica habitual se ha basado,

generalmente, en la demostración de anticuerpos específicos. Varios factores
contribuyen a esta situación. En primer lugar, las técnicas de cultivo son caras,
laboriosas, lentas (entre 4 días y varias semanas), relativamente poco sensibles
(10 5 unidades formadoras de colonias [UFC]/ml) y, a menudo, no son
abordables para la mayoría de los laboratorios de diagnóstico clínico. En los
cultivos de muestras respiratorias, bien sean aspirados nasofaríngeos, exudados
faríngeos o esputos, la presencia de otras especies de Micoplasmas comensales
obligan a realizar pruebas de identificación para M. pneumoniae. Las técnicas
rápidas para detección de antígeno tampoco han tenido gran aceptación debido
a su baja sensibilidad y especificidad.
La aplicación de técnicas de PCR, bien por técnicas convencionales, bien en

sistemas de PCR en tiempo real (RT-PCR), ha cambiado algunos de los
conceptos epidemiológicos y clínicos que se tenían acerca de Mycoplasma. Las
principales ventajas de estas técnicas radican en su sensibilidad (en función del
método se pueden detectar entre 10 y 100 bacterias) 4, su rapidez, en la
posibilidad de obtener resultados en un día, así como su posible aplicación sobre
muestras con elevado inóculo de bacterias acompañantes, en las cuales es muy
difícil aislar Mycoplasma por cultivo . Los mejores rendimientos de la PCR se
obtienen en muestras de esputo, pero en general se realizan en exudado
faríngeo, debido a la escasa productividad de la tos que acompaña a la
neumonía de esta etiología. Aunque algunos autores prefieren el exudado
faríngeo al aspirado nasofaríngeo por la mayor frecuencia de inhibiciones de la
PCR en estas muestras, no existen datos concluyentes que demuestren el
superior rendimiento de ninguna muestra en concreto. El estudio combinado de
diferentes muestras, como siempre ocurre, permite un mayor número de
detecciones. La persistencia de micoplasma en las muestras respiratorias ha
sugerido la necesidad de cuantificar el número de copias/ml que permita
diferenciar la infección clínica de la colonización residual. Actualmente, el
desarrollo de técnicas de PCR múltiple, que permite detectar Mycoplasma junto
con otros patógenos respiratorios, como Chlamydophila pneumoniae, puede ser
de utilidad en la práctica habitual de los laboratorios de diagnóstico clínico.

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En la actualidad, la serología continúa siendo el método diagnóstico más

ampliamente aplicado para el diagnóstico de las infecciones por M. pneumoniae.
Diagnóstico serológico
Técnicas serológicas disponibles
Las primeras determinaciones de respuesta inmunológica específica frente a M.

pneumoniae se realizaron por técnica de fijación del complemento (FC),
utilizando como antígenos bien un extracto lipídico de M. pneumoniae, bien una
suspensión de lisado bacteriano. La complejidad antigénica de este
microorganismo, en comparación con los virus, condiciona un mayor número de
inespecificidades. También se observan reacciones cruzadas con los antígenos
glucolipídicos de otros Mycoplasma. La técnica de FC determina principalmente
IgM y, en menor medida, IgG. La demostración de un incremento de 4 veces el
título entre una muestra de la fase aguda y una de la fase de convalecencia, o
bien títulos superiores o iguales a 1/32 ofrece una sensibilidad del 90% y una
especificidad del 88%. La complejidad y las múltiples variables a controlar con
esta técnica han contribuido a que la mayoría de los laboratorios busquen otras
alternativas de diagnóstico serológico1.
Las técnicas de inmunofluorescencia (IF) son relativamente fáciles de realizar y

permiten un resultado cuantitativo. Sus principales limitaciones son la
subjetividad de la interpretación de los resultados obtenidos y la reactividad
cruzada con el factor reumatoide.
Las técnicas de aglutinación pasiva utilizan un soporte como el látex o la gelatina

para una mezcla de antígenos específicos de M. pneumoniae. Detectan
conjuntamente IgG e IgM, y permiten también su cuantificación. La aglutinación
de partículas de gelatina es de muy fácil realización y considerable especificidad,
si bien para conseguir una máxima sensibilidad se recomienda realizar la
determinación en 2 muestras seriadas. En un estudio comparativo con técnicas
de PCR, Templeton et al observaron que una muestra de suero de la fase inicial
permite detectar el 50% de las infecciones, y que la sensibilidad alcanza el 66%

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si se dispone de una muestra de la fase de convalecencia, siempre que se

valoren aglutinaciones a títulos iguales o superiores a 1/320.
Las técnicas de enzimoinmunoanálisis (EIA) se han impuesto en la mayoría de

los laboratorios clínicos. Para la preparación de los reactivos necesarios se utiliza
una gran diversidad de preparados antigénicos (proteínas purificadas, péptidos
sintéticos, mezcla de antígenos crudos, glucolípidos purificados), que permiten
la detección de IgG o de IgM y en diferentes presentaciones (técnicas de captura-
m, micro placas, en soporte de membrana). Las pruebas de EIA parecen muy
sensibles para la detección de anticuerpos específicos, presentando como
siempre la ventaja de ser automatizables y de necesitar un volumen de suero
reducido. Las presentaciones en soporte de membrana permiten
determinaciones cualitativas de IgM, generalmente en presentaciones unitarias
de fácil realización y que permiten obtener resultados de manera muy rápida.
También existen presentaciones en soporte de membrana que permiten detectar
tanto IgG como IgM y que han demostrado tener una sensibilidad y una
especificidad buenas. En cualquier caso, para alcanzar una buena sensibilidad
diagnóstica con las técnicas de EIA, sigue siendo necesario disponer de una
muestra de suero del período de convalecencia.
La detección de IgA se considera el mejor indicador de infección aguda; sin

embargo, Csángó et al, utilizando reactivos comercializados, encuentran un
68,5% de positividad para esta inmunoglobulina en donantes de sangre.
3.-CHLAMYDIA
Chlamydia es un género de bacterias gramnegativas. Actualmente se

reconocen clínicamente para el ser humano cuatro especies patogénicas
importantes: C. trachomatis, C. pneumoniae, C. psittaci y C. pecorum. Las dos
primeras se consideran parásitos estrictos del hombre y de transmisión
interhumana (productoras de enfermedad infectocontagiosa). En cambio, C.
psittaci y C. pecorum son patógenos primarios de aves y mamíferos (ovejas,
cabras, cerdos y koalas), y el hombre se infecta accidentalmente por contacto
con animales infectados (productoras de enfermedad zoonótica).

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Los principales antígenos de las clamidias están presentes en la membrana

externa, la cual contiene el lipopolisacáridos (LPS), la proteína mayor de la
membrana externa (MOMP, del inglés "Major Outter Membrane Protein") y otras
dos proteínas ricas en cisteína: una proteína de envoltura (62Kd) y una
lipoproteína (12Kd). Tanto la MOMP
Diagnóstico
Un vez se puso en evidencia el papel etiológico de Chlamydia trachomatis en las

diferentes patologías, su importancia ha hecho que en los últimos años haya
aumentado el interés por parte de los médicos especialistas como ginecólogos,
pediatras, urólogos e infectó logos en obtener un diagnóstico útil para una
prescripción más acertada y precisa.
El método tradicional es el cultivo celular de Chlamydia trachomatis en la
línea celular de McCoy el cual es un método laborioso costoso y que requiere
por lo tanto una infraestructura adecuada con personal técnicamente bien
capacitado para realizar el diagnóstico (Arango 1998).
Las nuevas técnicas de detección de antígenos ya sea por Inmunofluorescencia
Directa (IFD) o ELISA han facilitado enormemente el trabajo de diagnóstico. Al
respecto la IFD es una técnica que depende del antígeno que se emplee. Así
existen los antígenos
LPS o las OMP (proteínas de membrana externa), siendo esta últimas las más
específicas. La técnica requiere de personal especializado en microbiología para
poder interpretar correctamente los cuerpos de inclusión, y además un
microscopio de fluorescencia que no tienen todos los hospitales. La sensibilidad
del IFD está alrededor del 70% y la especificidad del 90%.
Las pruebas de ELISA utilizan un antígeno de LPS requieren un lector de ELISA
algunas veces costoso, tiene una sensibilidad del 67% en muestras
endocervicales, y de un 89% en pacientes de alto riesgo. Presenta algunos
resultados falsos positivos (Verkooyen et al 1996).
Las técnicas de inmunoensayo en fase sólida tipo sándwich con anticuerpos
monoclonales que detectan antígenos (Clearview™chlamydia, Unipath
Basinstoke U.K) es sin duda las más adecuadas para los países en vías de

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desarrollo. El “test” de claerview posee una alta sensibilidad, especificidad y

sencillez, ya que no necesita personal altamente calificado por su fácil
realización, la lectura e interpretación es sencilla lo que hacen de esta técnica
una de las más útiles en el mercado (Arango 1998).
El diagnóstico molecular de las infecciones por Chlamydia pneumoniae es
sin duda el más adecuado por su alta sensibilidad y especificidad. Amplificación
de los ácidos nucleicos basados en las técnicas de PCR y LCR (ligase chain
reaction) están ahora disponibles comercialmente (Verkooyen et al 1996).
La precisión de la hibridación de los ácidos nucleicos y la rápida tecnología de la
amplificación del gen “target” facilita el diagnóstico. La técnica de PCR tiene
límites de detección tan bajos de apenas 1 – 10 cuerpos elementales por lo que
alcanza una sensibilidad de casi el 99%. Otra de las ventajas de los métodos
moleculares es la ausencia de cultivos, requerimientos especiales de transporte
y rapidez en la obtención de resultados en 6 horas. Incluso actualmente existen
“test” dúplex que pueden detectar simultáneamente ADN de N. gonorrheae y
Chlamydia trachomatis a partir de un sólo espécimen clínic (Amplicor™, Roche
Basle Switzerland) (Verkooyen et al 1996 y Woods et al 1989). PCR y LCR ofrece
sensibilidades entre el 89% al 100% de especímenes cervicales, uretrales y
orinas de hombres como mujeres con UNG sintomática (Woods et al 1989).
No obstante, la excelente sensibilidad del PCR y LCR el diagnóstico molecular
de laboratorio tiene algunos problemas como los resultados falsos-positivos que
se presentan debido a la contaminación cruzada entre los especímenes, ya que
para cada microorganismo que se trabaje se necesita un área específica. Los
falsos-negativos que existen en las técnicas moleculares de PCR y LCR se
deben a algunas enzimas, iones fosfatos, grupos heme, detergentes y cristales
presentes en las muestras de orinas (Verkooyen et al 1996, Morré et al 1996).
PCR y LCR a pesar de ser más costosos son más eficaces por los beneficios
que otorga en el diagnóstico de infecciones por chlamydia en mujeres
asintomáticas por las consabidas secuelas de infertilidad, EPI y embarazo
ectópico. No obstante, parece estar todavía muy lejos de nuestro alcance que en
los países en vías de desarrollo se puedan implementar rutinariamente las
metodologías moleculares por su alto costo de infraestructura y reactivos 2.

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4.-RICKETTSIAS
El género Rickettsias está constituido por especies de pequeños cocobacilos

gramnegativos pleomórficos, inmóviles y aerobios que se comportan como
patógenos intracelulares obligados y están relacionados serológicamente. Se
tiñen razonablemente bien con los métodos de Giemsa, Castañeda y Giménez y
débilmente con la tinción de Gram.
Técnicas diagnósticas
El diagnóstico microbiológico se basa en técnicas serológicas, de PCR y el

cultivo. En la tabla 6 se recogen las muestras necesarias para la mayoría de las
técnicas de diagnóstico que actualmente se llevan a cabo en los laboratorios de
microbiología.
Tinción de Giménez
Las muestras de tejidos pueden examinarse microscópicamente mediante esta

tinción, que permite visualizar las rickettsias, pero no diferencia en cuanto a
FARMACIA Y
especie ni tampoco otros microorganismos, por lo que su detección suele ser

dudosa.
Serología
La serología está limitada por las reacciones cruzadas entre el GFM y el GFT 9,11.
La IFI es una de las técnicas más sensibles y la más ampliamente utilizada en la
actualidad para el diagnóstico de las rickettsiosis exantemáticas. Los antígenos
están comercializados, estandarizados y prefijados en los portaobjetos sobre los
que se añaden diluciones se-riadas del suero del paciente. La confirmación del
diagnóstico requiere detectar una seroconversión, que se produce en la fase de
convalecencia, entre la tercera y cuarta semanas. Para una correcta
interpretación de los resultados de serología, se deben tener en cuenta los datos
de reactividad basal de la población en zonas endémicas. Como técnicas
experimentales, para evitar la reactividad cruzada, en algunos casos se utilizan
ensayos de inmunobloting con sueros sometidos a absorciones con antígenos
heterólogos. Este método da como resultado un considerable aumento de la
especificidad, si bien tiene una baja sensibilidad.
Cultivo
Para el cultivo de las rickettsias del GFM se requiere Minimum Esencial Medium
(medio MEM) sin antibiótico suplementado con suero bovino fetal (SBF) al 10%
(concentración final [CF]), 2 mM de glutamina CF y el 0,2% (CF) de aminoácidos
no esenciales. La incubación de los cultivos se lleva a cabo a 33-35 °C en
ausencia de CO2. Para R. typhi se requiere el mismo medio suplementado con
SBF al 2% (CF). El diagnóstico definitivo de las rickettsiosis requiere el
aislamiento e identificación de la especie a partir del cultivo9 El cultivo se lleva a
cabo en células VERO E6 o fibroblastos L92. El efecto citopático producido no
es muy característico ni específico de especie y, aunque puede aparecer a las
24-48 h postinoculación, generalmente se necesitan 5-7 días para su desarrollo.
El cultivo se puede acelerar si se inocula la muestra sobre una monocapa de las
células susceptibles previamente crecidas sobre un portaobjetos circular (shell
vial, SV), seguida de una centrifugación. Después de 5-7 días de incubación se

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procede a detectar la presencia de la bacteria mediante tinción de Giménez, IFI

con anticuerpos específicos o PCR. Este procedimiento resulta muy laborioso,
requiere personal especializado e instalaciones con nivel de seguridad 3. Su
principal limitación es su baja sensibilidad, por lo que se no se recomienda en el
caso de que el paciente haya comenzado con la antibioterapia. Sin embargo, es
la técnica diagnóstica más específica, fundamental para la obtención de
antígenos, para el estudio de la sensibilidad a antibióticos y la determinación de
las especies de Rickettsia presentes en un área2.
Detección molecular
Las técnicas moleculares, como la PCR, permiten un diagnóstico rápido y

específico al detectar ADN de Rickettsias en tejidos infectados, cultivos y
garrapatas. Por el momento, la mayor parte de las técnicas descritas son de
desarrollo propio (in house), y no están comercializadas. Los genes más
comúnmente analizados son los que codifican dos proteínas de la membrana
externa: rOmpA (presente en todas las especies excepto R. helvetica, R.
australis, R. bellii y R. canadensis) y rOmp B (presente en todas las especies
excepto R. helvetica, R. bellii y R. massiliae) También se utiliza el gen gltA, que
codifica la citrato sintetasa (válido para todas la rickettsias), el gen que codifica
la proteína de 17-kDa (válido para todas las rickettsias del GFM) y el gen D
(válido para la mayoría de las especies). Recientemente, se ha desarrollado una
PCR-RLB (reverse line blotting) que utiliza como diana el espacio intergénico
23S-5S ARNr que, junto con una hibridación en fase reversa utilizando sondas
especie-específicas, permite la identificación de la especie implicada sin
necesidad de secuenciación. Este método es altamente sensible y específico,
tanto para muestras clínicas como ambientales. Cuando se busque una mayor
sensibilidad, hay que recurrir a PCR anidadas y posterior hibridación en fase
reversa. La PCR a tiempo real permite obtener resultados en muy poco tiempo
(menos de 1 h). Todas estas ventajas hacen que la PCR se presente como la
prueba ideal para el diagnóstico de estas infecciones, aunque existen algunas
desventajas, como son la limitación para realizar pruebas de sensibilidad a los

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antibióticos y la imposibilidad de coleccionar los aislados para futuras

investigaciones3.
Las rickettsiosis se previenen evitando la picadura de los artrópodos vectores. El

tratamiento de las rickettsiosis debe iniciarse sobre la base proporcionada por
datos clínico-epidemiológicos. El tratamiento de elección para la infección por
Rickettsias es la doxiciclina. En niños puede utilizarse en algunos casos la
azitromicina5.
HONGOS FILAMENTOSOS
Los hongos filamentos son microorganismo eucarióticos, anaerobios facultativos

que se reproducen de manera natural por esporas, sexual o asexualmente. Los
hongos tienen como característica común la usenia de clorofila, por tanto no
pueden realizar fotosíntesis y deben unirse a partir de materia organica ya
elaboarada. Asi mismo, tiene una pared celular formada por quitina el cual es un
compuesto polisacárido fueretemente rigido, por lo anterior, este tipo de
miroorganismo deben absorber los nutrientes simples y solubles, al contrario de
fagocitar los alimentos.
La estructura fúngica consta de un complejo llamado talo o micelio, que a su vez

esta contituido por multiples filamentos o hifas, la mayor reproductoras móviles.
Las esporas son cuerpos resistentes que forman los hongos en estado latente o
de reposo, que se producen de dos maneras diferentes sexual ya sexual. Las
sexuales tiene nucleo derivado de las células progenitoras, y su esporas son
haploides; dos nucleos de las células antecesoras se funden para formar un
nucleo diploide y las esrtuctura que producen las esporas sexuales son, casi
siempre, morfológicamente diferencias de las esporas asexuales
IDENTIFICACION DE HONGOS FILAMENTOSOS

FARMACIA Y
El crecimiento de hongos puede producir en sus habitantes determinadas

patologías entre las que cabe destacar asma y alveolitis alérgicas. La
contaminación ambiental por hongos en el interior de edificios, es debida
básicamente a hongos filamentosos y levaduras (9).
Muchas especies de hongos se pueden diferenciar, identificar y clasificar según

su morfología, estructura, mecanismo de formación y elementos formadores de
las esporas. El conocimiento de estas características puede ser suficiente para
identificar especies que pertenecen al grupo de los hongos filamentosos; sin
embargo, cuando se trata de identificar especies pertenecientes al grupo de las
levaduras es imprescindible la aplicación de pruebas bioquímicas (9).
La mayoría de los hongos, sin embargo, son pluricelulares o filamentosos y se
caracterizan por estar constituidos por filamentos ramificados o hifas que se
desarrollan y entrelazan formando el micelio.
Existe un micelio vegetativo adosado a la superficie del sustrato (suelo, plantas,
alimentos) y un micelio aéreo o reproductor, donde se forman las esporas
(asexuales y sexuales) (9).
Los hongos filamentosos y levaduras son en su mayoría saprófitos, hallándose
libres en la naturaleza, especialmente en la materia orgánica en descomposición.
(5)
Principales Métodos De Identificación De Hongos Filamentosos
La identificación de los hongos filamentosos se basa en el examen macroscópico

de la colonia y en sus características microscópicas. Semejanzas macroscópicas
como la forma de la colonia, el color de la superficie, la textura y la producción
de pigmentos son muy útiles para la identificación (9).
En general, la morfología microscópica de los hongos es estable y presenta

pocas variaciones. La identificación definitiva se basa en la forma característica,
método de producción y ordenamiento de las esporas, siendo también
importante conocer el tamaño y la disposición de las hifas (9).

FARMACIA Y
La preparación del material para la observación microscópica puede realizarse

en fresco, con cinta de celofán adhesiva o mediante cultivo sobre portaobjetos
(9).
 Preparación en fresco
Se realiza empleando el procedimiento descrito a continuación:
1. Seleccionar una colonia aislada.

2. Calentar a la llama el alambre de un asa de siembra, y doblar de forma que
se convierta en un objeto cortante.
3. Con la ayuda del asa, extraer un fragmento triangular de la colonia que
contenga además un poco de agar en la parte inferior.
4. Depositar el fragmento extraído sobre un portaobjetos en el cual,

previamente, se ha depositado una gota de azul de lactofenol.
5. Cubrir con un portaobjetos y presionar suavemente para dispersar la colonia
y el agar; de esta forma, la muestra está disponible para su observación al
microscopio.
Este procedimiento es el que utilizan la mayoría de los laboratorios, ya que las
muestras se preparan con facilidad y rapidez y además permite identificar
muchas de las especies de hongos más habituales. El mayor inconveniente de
la observación en fresco es que se puede alterar el ordenamiento característico
de las esporas al presionar con el cubreobjetos, por lo que este procedimiento
no es válido en los casos en que es necesario conocer la disposición de las
esporas (9).
 Preparación con cinta de celofán adhesiva
El procedimiento se lleva a cabo como sigue:
1. Apoyar el lado engomado de un trozo de cinta adhesiva transparente sobre

la superficie de una colonia.

FARMACIA Y
2. Colocar la cinta bien extendida sobre una gota de azul de lactofenol o azul de
anilina colocada, a su vez, sobre un portaobjetos.
3. Observar al microscopio para conocer la forma y ordenamiento característico
de las esporas.
Este método puede considerarse como el más simple, económico y adecuado

para la identificación de hongos, recomendable para los laboratorios
microbiológicos de cualquier nivel.
La preparación de la cinta transparente permite observar al microscopio como

se desarrolla el microorganismo en el cultivo. Generalmente las esporas se
mantienen intactas y la identificación se realiza con facilidad (9).
Una de las desventajas de este método es que si la cinta transparente no se

presiona con suficiente firmeza sobre la superficie de la colonia, la muestra no
es adecuada, ya que al no quedar bien adherida la cinta, las esporas o las hifas
no se pueden identificar (9).
En los casos en que mediante este método no se observen esporas deberá
realizarse la preparación en fresco (9).
 Cultivo sobre portaobjetos
Se realiza empleando el procedimiento descrito a continuación:
1. Cortar un bloque pequeño de un medio sólido adecuado (agar), que ha sido

vertido en una cápsula de Petri, hasta una altura de 2 cm. El bloque puede
cortarse con la ayuda de un bisturí estéril o con un tubo de ensayo estéril sin
reborde (lo que permite obtener un taco redondo) (9).
2. Colocar un portaobjetos estéril sobre una capa de agar al 2% contenida en
una cápsula de Petri.
3. Colocar el bloque de agar sobre el portaobjetos.
4. Con un asa de siembra cuyo alambre ha sido doblado en ángulo recto,
inocular los cuatro cuadrantes del taco con el microorganismo a identificar.

FARMACIA Y
5. Colocar un cubreobjetos estéril sobre la superficie del bloque de agar.

6. Tapar la cápsula de Petri que contiene el cultivo e incubar a 30o C.
7. Finalizado el período de incubación, retirar el cubreobjetos (este proceso
debe realizarse en una cabina de seguridad biológica), y colocarlo en un
portaobjetos que contenga azul de lactofenol o azul de anilina.
8. La observación al microscopio permite distinguir la forma y disposición de las
esporas.
9. Si con este proceso no ha sido posible la identificación, el resto del cultivo
puede ser usado más adelante si se continúa incubando. Entonces se retira
el bloque de agar y se agrega una gota de azul de lactofenol o azul de anilina
sobre la zona del cultivo y se coloca un cubreobjetos sobre ella. Es
recomendable realizar dos cultivos sobre el mismo portaobjetos de modo que
si en uno no se pueden observar las características microscópicas puede
disponerse del segundo después de un período adicional de incubación (9).
Este método permite la observación microscópica del hongo mientras se

desarrolla directamente debajo del cubreobjetos, de forma que las
características microscópicas se distinguen con facilidad, las estructuras se
mantienen intactas y puede observarse un gran número de áreas representativas
(9).
No deben realizarse cultivos en portaobjetos de hongos de crecimiento lento que

pueden ser patógenos dimorfos, como Histoplasma capsulatum, Blastomyces
derma titidis, Coccidioides immitis, Paracoccidioides brasilien sis o Sporothrix
schenckii (9).

FARMACIA Y
IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS DE IMPORTANCIA CLÍNICA
La identificación de la especie de toda levadura aislada en sangre o en cualquier

otro líquido corporal estéril está plenamente justificada. Sin embargo, debido a
que los organismos levaduriformes forman parte de la flora normal de piel y
mucosas, el aislamiento de levaduras a partir de hisopos nasofaríngeos, esputo,
lavados bronquiales, orina, raspados de uñas, muestras vaginales o heces
puede cuestionar su significado clínico. No obstante, el aislamiento reiterado de
levaduras en diferentes muestras clínicas del mismo paciente es sugestivo de
infección por el microorganismo aislado y requiere la identificación de la especie
causal.
La identificación de las levaduras se puede llevar a cabo atendiendo a criterios

diferentes: morfológicos, bioquímicos.
1. Identificación mediante criterios morfológicos
Los criterios morfológicos pueden ser, a su vez, macro o microscópicos.
1.1. Criterios macroscópicos
Estos criterios tienen en cuenta el aspecto de las colonias de levaduras al crecer

en los diferentes medios de cultivo.

FARMACIA Y
La mayoría de los organismos levaduriformes crecen fácilmente en un gran

número de medios de cultivo usados rutinariamente en el laboratorio de
Microbiología (agar sangre, agar chocolate, agar Cled, etc.). Sin embargo, el
agar glucosado de Sabouraud (SDA), con o sin antibióticos añadidos, es el medio
de aislamiento por excelencia para la identificación de levaduras.
En el medio SDA las colonias de levaduras suelen ser completas, ligeramente

abombadas o planas, de consistencia mantecosa, lisas (Figura 11.1) o rugosas
(Figura 11.2) , con olor dulzón agradable, volviéndose más pastosas a medida
que envejecen.
Por lo general las colonias de levaduras no desarrollan micelio aéreo, aunque en

ocasiones pueden aparecer prolongaciones aracneiformes en la periferia de las
colonias. Si se observa un micelio aéreo definido, debe considerarse la
posibilidad de que se trate de un hongo dimórfico o de ciertas especies de
levaduras que pueden formar micelio verdadero como Geotrichum (Figura 11.3)
, Galactomyces, Trichosporon (Figura 11.4) o Blastoschizomyce s (su teleomorfo
Dipodascus ).

FARMACIA Y
Una colonia de aspecto y consistencia mucoide sugiere la formación de cápsulas

y puede ser el paso inicial para la identificación de Cryptococcus neoformans
(Figura 11.5) .
Las colonias de color rojo-anaranjado o naranja, de aspecto cremoso o rugoso,

son características de las especies del género Rhodotorula (del gr. rhodo , rojo)
(Figura 11.6) y Sporobolomyces (anaranjado), color que manifiestan estas
levaduras por su riqueza en carotenoides.
Pero no todas las colonias blancas y cremosas son levaduras; las especies de
algas aclorofílicas del género Prototheca, tras incubación a 28 °C durante 3-4
días, desarrollan unas colonias blancas cremosas muy parecidas a las
producidas por el género Candida (Figura 11.7)
1.2. Criterios microscópicos
Ciertas características microscópicas son muy útiles para la identificación de

algunas especies de levaduras. Las más utilizadas en la práctica son las
siguientes:
Prueba del tubo germinal o filamentación precoz
El tubo germinal es una extensión filamentosa de la levadura, sin estrechamiento

en su origen, cuyo ancho suele ser la mitad de la célula progenitora y su longitud
tres o cuatro veces mayor que la célula madre (Figura 11.8) .
Sólo C. albicans es capaz de producir verdaderos tubos germinales; sin

embargo, otras especies como C. tropicalis pueden producir pseudohifas
precoces de aspecto similar a los tubos germinales pero con una zona de
constricción característica adyacente a la célula madre, por lo que esta prueba

FARMACIA Y
es útil para diferenciar C. albicans del resto de las especies de Candida, aunque
no está exenta de falsos negativos.
Falsos negativos
•Aproximadamente un 5% de cepas de C. albicans son negativas para tubos

germinales.
•Si se utiliza un inóculo demasiado abundante de levaduras, también pueden

obtenerse falsos resultados negativos.
Metodología
1. Emulsionar una porción de la colonia aislada en 0,5 ml de suero humano 2.

Incubar a 35 °C durante 2 h. 3. Depositar una gota de la emulsión sobre un por-
taobjetos limpio y desengrasado, colocar un cubre-objetos y visualizar a x100,
x400 ó x1.000.
Interpretación
La prueba es positiva si se visualizan tubos germinales (Figura 11.8).
Variantes
Además de la técnica con suero, el test de filamentación puede realizarse

utilizando otros medios de cultivo:

FARMACIA Y
a) Medio de cultivo sólido Oxgall-Tween-ácido cafeico (TOC): [Oxgall 10 g, agar

20 g, Tween 80 (solución al 10%) 10 ml, ácido cafeico 0,3 g, agua destilada 1.000
ml]. La utilización de este medio permite la visualización del tubo germinal y
también de clamidosporas . Para su realización se estría una pequeña porción
de la colonia sobre al agar TOC y a continuación se coloca con suavidad un
cubre-objetos estéril (flameándolo suavemente) sobre la superficie inoculada
(para evitar la acumulación de humedad es preciso no presionar el cubre-objeto
sobre la superficie del agar). Se incuba a 35 °C, en 10% de CO2, durante 2 h,
manteniendo la tapa de la placa ligeramente abierta para que todo el cultivo sea
alcanzado por el CO2. La prueba es positiva si se visualizan los tubos germinales
en la zona de inoculación a bajo aumento (x100- x400).
Formación de hifas, blastoconidias, clamidosporas y artrosporas
La formación de hifas, blastoconidias, clamidosporas o artrosporas por parte de

las levaduras constituye una característica morfológica de gran importancia para
la identificación de algunas especies de levaduras.
Ante la presencia de estructuras con aspecto de hifas, lo primero que hay que
determinar es si se trata de pseudohifas (resultantes del proceso de formación
de blastoconidias y, por tanto, con puntos regulares de estrechamiento) o, por el
contrario, son verdaderas hifas que se fragmentan en artroconidias. Si el
desarrollo en medios especiales (ver más adelante) revela la presencia de
pseudohifas y blastoconidias, la levadura a identificar pertenece a alguna
especie del género Candida. Si por el contrario, revela verdaderas hifas y
artroconidias, lo más probable es que se trate de especies de Trichosporon,
Geotrichum, Galactomyces o Blastoschizomyces.
Trichosporon y Blastoschizomyces producen tanto artroconidias como

blastoconidias; estas últimas nacen en brotes de los ángulos de las artro-
conidias adquiriendo la forma característica de “oreja de conejo” (Figura 11.9).
Las especies Galactomyces geotrichum (Geotrichum candidum) y
Blastoschizomyces capitatus (Geotrichum capitatus) también producen
blastoconidias a partir del ángulo de la artroconidia, pero, en este caso, forman
una estructura denominada “palo de hockey” (Figura 11.10). C. tropicalis produce

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pequeñas cantidades de blastoconidias, muy esparcidas o en pequeños grupos

a lo largo de las hifas. Sin embargo, C. parapsilosis, C. kefyr y C. krusei se
ordenan a lo largo de una corriente de blastoconidias, siendo esta la
característica que permite su identificación; además, algunas cepas pueden
producir hifas gigantes.
Las clamidosporas son formas de resistencia, redondas u ovales, de 6-12 µm de

diámetro y pared gruesa, con aspecto de esporas laterales o ter- minales. Su
producción es característica y diagnóstica de C. albicans (Figura 11.11).
También puede hacerse una identificación presuntiva de esta especie si se
observa la formación de grupos compactos de blastoconidias, a intervalos
regulares, a lo largo de la pseudohifa.
Metodología
Agar harina de maíz A este medio comercializado (Oxoid) debe agregarse Tween
80 (polisorbato) a una concentración final de 0,02% para reducir la tensión
superficial y aumentar la formación de hifas y blastoconidias .
Agar harina de maíz
Procedimiento
1. La inoculación se debe realizar, según la técnica de Dalmau , haciendo tres

cortes paralelos en el agar (separados 1 cm) manteniendo el asa en un ángulo
aproximado de 45°. 2. Colocar un cubre-objeto sobre la superficie de agar
cubriendo una parte de las estrías de siembra. 3. Incubar las placas sembradas

FARMACIA Y
a 30 °C durante 24- 48 h y luego examinar al microscopio a través del cubre-

objetos a x100, x400 ó x1.000 (Figura 11.11).
TOC
Este medio confirma la determinación de tubo germinal y clamidosporas en agar.

Si no se observan tubos germinales una vez realizada la primera lectura a las 2
h de incubación, a 35 °C y en atmósfera de O 2, la placa puede incubarse durante
24-48 h más para visualizar el desarrollo de clami dosporas .
Leche diluida
Procedimiento
1. Emulsionar una colonia joven en 3-4 ml del medio. 2. Incubar a 28-30 °C

durante 24-48 h. 3. Observar una gota de la emulsión al microscopio (x100 ó
x400).
Interpretación
•C . albicans desarrolla abundantes pseudomicelios y clamidosporas (Figura

11.11) .
el medio de leche diluida es excelente para la investigación de clamidosporas,

blastoconidias, hifas, pseudohifas y artrosporas. Estas características unidas a
su fácil obtención y bajo coste le convierten en un medio muy recomendable en

FARMACIA Y
la rutina de un laboratorio de Micología para la detección de estas formaciones

microscópicas .
Tinciones
El estudio microscópico de los organismos levaduriformes o microorganismos

relacionados (género Prototheca ) se puede llevar a cabo mediante tinciones, ya
sea tinción simple (Figuras 11.12 y 11.13) o tinción de Gram (Figura 11.14) ; con
esta tinción, las levaduras suelen comportarse como Gram positivas .
Mediante estas tinciones también se puede observar la formación de

blastosporas, artrosporas, hifas, pseudohifas o endosporas (autoesporas esféri-
cas de 4-11 µm de diámetro incluidas en una teca, que puede visualizarse
también vacía); estas últimas son típicas de las especies del género Prototheca
(Figura 11.15) .
2. Identificación mediante criterios bioquímicos

FARMACIA Y
2.1. Criterios bioquímicos enzimáticos
Medios cromogénicos
Estos medios están diseñados para el aislamiento e identificación de algunas

especies del género Candida tras su incubación a 30-37 °C durante 24 a 48 h.
El fundamento de los mismos se basa en la detección de determinadas

actividades enzimáticas por parte de las levaduras mediante la hidrólisis
específica de un sustrato cromogénico en presencia de un indicador de la
enzima. Una de las principales ventajas de estos medios es permitir diferenciar
fácilmente los cultivos mixtos.
Estos medios pueden ser utilizados como medios de aislamientos primarios o

con fines de identificación, después del aislamiento de los organismos
levaduriformes en los medios convencionales. Aunque, según nuestra
experiencia, sólo debería utilizarse como medio de aislamiento primario en
aquellas muestras con alta sospecha de micosis por levaduras.
CHROMagar Candida®
El medio para identificar las especies clínicamente importantes del género

Candida . CHROMagar Candida permite diferenciar C. albicans, C. tropicalis,
C. krusei, y C. glabrata en función de los colores que desarrollan en este medio.
La siembra se realiza según las técnicas tradicionales y las placas se incuban a

30-37 °C durante 48 h para que las levaduras desarrollen completamente el
color. Al cabo de este tiempo, las colonias de C. albicans son lisas y de color
verde esmeralda, a diferencia de C. dubliniensis que desarrolla un color verde
oscuro y que, además, es inca- paz de crecer a 45 °C [7]. C. tropicalis produce
colonias azul oscuro con un halo púrpura-marrón en el agar que la rodea. C.
krusei forma colonias rugosas con el centro rosado y el borde blanco. C. gla-
brata manifiesta un color violeta morado. Las demás especies desarrollan
colores y tonalidades diversas que no permiten su identificación por este medio
(Figuras 11.16 y 11.17) .

FARMACIA Y
Cromogen Albicans®
Cromogen Albicans (Biomedics) es un medio diferencial y selectivo utilizado para

el aislamiento e identificación de C. albicans en muestras vaginales, rectales,
escamas, orina, pus, escobillonados bucales, etc.
La siembra se realiza según las técnicas habituales y las placas se incuban a 30-
37 °C, según el origen de las muestras, durante 24-48 h.
Las colonias de C. albicans adquieren un color azul verdoso característico,

dependiendo del periodo de incubación y la temperatura, con formas
redondeadas, lisas y ligeramente elevadas. Las otras especies de levaduras
aparecen de color blanco cremoso y necesitan una identificación bioquímica
posterior.
Candida ID®
El medio Candida ID (bioMérieux) es un medio cromogénico que permite el

aislamiento de organismos levaduriformes, la identificación presuntiva de C.
albicans y cierta orientación para la identificación de otras especies no albicans.
La inoculación e incubación son similares a las descritas para otros medios

cromogénicos. En Candida ID, las colonias de C. albicans son redondeadas,
ligeramente convexas, lisas, de bordes netos y de color azul (cuya intensidad
varía en función del tiempo de incubación). Las colonias de C. tropicalis, C.
lusitaniae, C. guilliermondii y C. kefyr desarrollan un color rosa a las 48 h de incu-
FARMACIA Y
bación. Otras especies, como C. famata, C. humicola, y Cryptococcus

neoformans, pueden originar colonias rosas más o menos intensas. El resto de
las especies desarrolla un color blanco-crema, requiriendo una identificación
bioquímica posterior (Figura 11.18).
CandiSelect®
El medio CandiSelect (Bio-Rad) es un medio selectivo que permite la

identificación de C. albicans mediante la hidrólisis del sustrato cromogénico
presente lo que origina el desarrollo de un color azul por las colonias de esta
especie.
La inoculación e incubación son similares a los otros medios cromogénicos. C.

albicans se identifica por la presencia de colonias lisas azules y el resto de las
levaduras manifiesta un color blanco en sus colonias. A las 48 h de incubación,
algunas cepas de C. tropicalis y Trichosporon spp. pueden también desarrollar
colonias azules, pero morfológicamente son diferentes a C. albicans.
Sistemas enzimáticos que utilizan un sustrato cromogénico
Detección de ureasa

FARMACIA Y
Una levadura con reacción positiva a la prueba de la ureasa es sugestiva de

pertenecer al género Cryptococcus. Concretamente, las cepas de C. neo-
formans que son grandes productores de ureasa, comienzan a provocar cambio
de color a las 2 h de incubación a 35 °C.
Ureasa
Procedimiento
1. Pasar la punta de un aplicador de algodón, impregnado con agar base ureasa

de Christensen, sobre la superficie de dos o tres colonias aisladas del
microorganismo a estudiar, de un cultivo de 48 a 72 h en cualquiera de los
medios habituales. 2. Colocar el aplicador inoculado en un tubo con 3 gotas de
cloruro de benzalconio al 1% (ajustar el pH a 4,8). 3. Presionar con fuerza la
punta del hisopo contra el fondo del tubo para que se desprendan los micro-
organismos contenidos en las fibras de algodón. 4. Tapar el tubo e incubar a 45
°C. 5. Examinar el tubo a los 10, 15, 20 y 30 min.
Interpretación
•El desarrollo de un color rojo-púrpura, indica el resultado positivo de la prueba

(Figura 11.22).
Esta prueba también puede utilizarse para diferenciar Trichosporon de

Geotrichum; la mayoría de las especies de Trichosporon son ureasa (+) mientras
que las de Geotrichum son ureasa (-).
Prueba de la enzima Nitrato-reductasa
La capacidad de C. neoformans de reducir nitratos a nitritos es una prueba de

utilidad cuando se pretende identificar esta levadura (Figura 11.23).
Procedimiento
1. Pasar la punta de un aplicador por la superficie de 2-3 colonias aisladas de un

cultivo de 48-72 h de crecimiento en cualquiera de los medios habituales. El
hisopo inoculado se presiona con firmeza contra el fondo de un tubo vacío para
que se desprendan los microorganismos contenidos en la fibra de algodón. 2.

FARMACIA Y
Incubar el tubo con el hisopo a 45 °C durante 10 min. 3. Sacar el hisopo y agregar

al tubo 2 gotas de alfa- naftlamida y 2 gotas de ácido sulfanílico. 4. Reintroducir
el hisopo en el tubo para que absorba los reactivos.
Interpretación
•El desarrollo inmediato de un color rojo indica una reacción positiva (Figura
11.23).
Prueba de la Fenol-Oxidasa
C. neoformans produce fenol-oxidasa, una enzima necesaria para el

metabolismo de la 3,4- dihidroxifenilanina (DOPA) y otros compuestos fenólicos
en la síntesis de la melanina. Esto se evidencia por la producción de un pigmento
marrón oscuro o negro alrededor de la colonia de C. neoformans en el medio de
TOC (Apartado 11.2.2).
Procedimiento
1. Sembrar 2-3 colonias de un cultivo joven en el medio de TOC. 2. Incubar a 37

°C durante 3-5 días.
Interpretación

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•El desarrollo de una pigmentación marrón oscura alrededor del crecimiento es

característico de C . neoformans . (Figura 11.24).
2.2. Identificación basada en métodos de asimilación de nutrientes
Auxonograma convencional
Se fundamenta en la aplicación por separado de diferentes nutrientes,

hidrocarbonados o nitrogenados, sobre un medio sintético base para apreciar el
crecimiento selectivo de una levadura en la cerca- nía de los nutrientes
necesarios para su desarrollo.
Para su realización pueden emplearse soluciones acuosas esterilizadas por

filtración, cilindros de Oxford en pocillos hechos en el agar o bien discos de papel
absorbente empapados con el nutriente. Sin embargo, las pruebas de
asimilación en medios líquidos no ofrecen ninguna ventaja adicional sobre los
medios sólidos, resultando mucho más laboriosas y costosas.
Medios de cultivo base. Se prepararan según la técnica habitual y no necesitan

ajustar el pH. Se expenden deshidratados como medios base de levaduras. Los
más utilizados son los siguientes:

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1. Medio sin carbono. Sulfato amónico (5 g/l), Fosfato monopotásico (1 g/l),

Sulfato de magnesio (0,5 g/l), Agar (20 g/l). 2. Medio sin nitrógeno. Glucosa (20
g/l), Fosfato monopotásico (1 g/l), Sulfato de magnesio (0,5 g/l), Agar (20 g/l).
Como fuente de carbono se puede ensayar todos los azúcares y alcoholes

conocidos. Como substrato de nitrógeno se suele emplear peptona, asparagina,
urea, sulfato amónico, nitrato de potasio y aminoácidos diversos.
Auxonograma
Procedimiento
1. La levadura en estudio se siembra previamente en caldo glucosado de

Sabouraud más cloranfenicol a 28 °C durante 48 h.
2. Agitar para mezclar el cultivo y tomar 1 ml como inóculo del medio sintético
fundido. Enfriar a 50 °C, mezclar y verter en placa.
3. Preparar las soluciones estériles de los nutrientes, los azúcares al 10% y las
sustancias nitrogenadas al 1%. 4. Una vez solidificado el agar, y con la ayuda de
un tubo de cristal, agujerear 5-6 pocillos por placa. Sobre cada pocillo se vierten
dos gotas de los dis tintos nutrientes en estudio.
4. bisSi se utilizan discos de papel absorbente, deben confeccionarse de distintos

colores o rotularse previamente. Una vez esterilizados, y antes de su empleo, se
empapan con dos gotas de las soluciones acuosas los nutrientes (al 20% para
losazúcares y al 2% para los substratos nitrogenados). Se secan en estufa y se
aplican sobre el medio con pinzas estériles.
5. Incubar a 28 °C. (2-4 días).
Interpretación
• En la zona circulante a los pocillos o los discos, crecen abundantes colonias de

levaduras si utilizan el nutriente correspondiente; por el contrario, no aparecen
en los contornos de los no utilizados.
• La intensidad del cultivo periférico se expresa mediante cruces: 5 mm de radio

(+), 5-10 mm (++), >10 mm (+++).
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FUNGIGRAMA , ANTIFUNGIGRAMA
Mide la susceptibilidad de las levaduras a distintos agentes antifúngicos.
Muestra: Cepa aislada

Transporte: Deberán ser enviadas en su medio de cultivo y selladas con papel
parafilm en sus bordes. Estas muestras no tienen un tiempo límite o crítico de
viabilidad, sin embargo se recomienda su pronto envío para evitar la desecación
del medio de cultivo
Es de gran utilidad al permitir confirmar la sensibilidad esperada de los hongos

aislados en clínica o poder detectar la adquisición de resistencias en el curso de
tratamientos prolongados con algunos antifungicos.
Los tratamientos respectivos deben hacerse en forma eficaz y conciente, no se

puede en esta era seguir medicamentos a ciegas, nosotros proponemos para
ello un cultivo con 100 % de recuperación fúngica, con medios de cultivo de
fórmula propia y posteriormente realización del test de susceptibilidad a agentes
Antifungicos - Fungigramas, con lo que se obtendría un éxito asegurado en el
tratamiento.
Cultivo en Medio de fórmula propia:
Trichophyton verrucosum Penicillium Sp

FARMACIA Y
El mismo debe chequearse después de 3 meses de tratamiento si es que llegara

a observarse un detenimiento en la evolución del mismo, pues podría deberse a
formas resistentes ó a la presencia de una especie ya coexistente de menor
velocidad de crecimiento, es decir una 2° especie en la lesión que pasó
inadvertida frente al desarrollo rápido e invasivo de la 1° especie detectada,
sobre la cual el fungigrama realizado podría no tener cobertura.
Fungigrama

FARMACIA Y
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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10. Panizo, m. m, reviákina, v. revista de la sociedad venezolana de

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patógeno sobre las mucosas. departamento de micología, instituto
nacional de higiene "rafael rangel", caracas, venezuela. (citado 17 abril
FARMACIA Y
2014).disponible en :http://www.scielo.org.ve/scielo.php?pid=s1315-
25562001000200011&script=sci_arttext.

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FARMACIA Y

BIOQUIMICA [ANALISIS CLINICO

Las espiroquetas (Spirochaetes o Spirochaetae) son un filo de bacterias

Las espiroquetas se distingue de las demás bacterias por la presencia de unos

La movilidad de las espiroquetas es diferente al resto de las bacterias móviles.

El filo Spirochaetes se divide en familias, todas incluidas en un único orden,

 Leptospira, que causa leptospirosis o enfermedad de Weil.

El genoma es muy inusual y consta tanto de cromosomas lineales como de

Los micoplasmas (Mycoplasma) son bacterias que carecen de pared celular.

Debido a la ausencia de pared celular, los micoplasmas no son sensibles a los

El colesterol es necesario para la multiplicación de las especies de micoplasmas,

Los micoplasmas se encuentran frecuentemente en los laboratorios de

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO 2

La célula de un micoplasmas mide generalmente menos de 1 μm y son, por lo

Los micoplasmas requieren esteroles para la estabilidad de su membrana

Chlamydia es un género de bacterias gramnegativas perteneciente a la familia

Es la enfermedad bacteriológica más común y se transmite a través del sexo

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Castellanizado como "clamidia", y genéricamente entendido como plural ("las

Clínicamente, se reconocen actualmente —para el ser humano— cuatro

La rickettsia es un género de bacterias perteneciente a la familia Riketssiaceae.

CARACTERÍSTICAS: Gram negativo.

Bacteria Pleomórfica: forma de cocos, bacilos o hilos.

Las rickettsias se pueden transmitir por aerosoles (ejemplo estornudos),

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Algunas Rickettsias causan zoonosis, es decir, son transmitidas al hombre.(1)

La Rickettsiosis es una enfermedad de distribución global, causada por bacterias

Por picadura de algún artrópodo infectado (garrapata principalmente). Las

La transmisión ocurre principalmente por deficientes condiciones sanitarias,

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 Los síntomas comienzan de improviso entre 3 y 12 días después de la

Con frecuencia se observan síntomas nerviosos (agitación, insomnio, delirio y

Es de recordar que la población susceptible es aquella que vive en zonas

Las muestras de tejidos pueden examinarse microscópicamente mediante esta

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Las técnicas moleculares, como la PCR, permiten un diagnóstico rápido y

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 Higiene personal: Baño diario y cambio de ropa frecuentemente.

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 Mantenimiento y corte de césped en domicilio, peri domicilio y espacios

MEDIOS REQUERIDOS EN MICROORGANISMOS DE

La familia Spirochetaceae incluye tres géneros de interés en patología humana,

Para el diagnóstico de la sífilis, tradicionalmente, se cuenta con tres grupos de

Las nuevas pruebas diagnósticas para la sífilis, incluyen enzimo inmunoensayo

a.-OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS

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para campo oscuro muestras de cavidad oral, o anal debido a la contaminación

Para la fluorescencia directa se obtiene la muestra de manera similar que la

b.-MICROSCOPIA DE CAMPO OSCURO

La microscopía de campo oscuro es la prueba de elección para la sífilis primaria

Un examen de campo oscuro negativo no descarta la sífilis, ya que, podrían

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Mediante este examen, se puede detectar la presencia de subespecies de T

Un hallazgo positivo se reporta como treponemas inmunológicamente

A este método, se le denomina RIT (Rabbit infectivity test) y consiste en la

El cultivo de T pallidum sólo se ha logrado en células epiteliales de conejo, La

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es adecuado para el trabajo de rutina del laboratorio pero sí se realiza en los

Las pruebas serológicas son de dos tipos: no-treponémicas y treponémicas. Las

Las pruebas no-treponémicas incluyen el VDRL (Venereal Disease Research

Todas estas pruebas están basadas en antígenos en solución alcohólica, que

Se denomina reagina a una proteína similar a un anticuerpo, que se une a un

treponémicos, producidos por un individuo infectado con T pallidum, contra sus