Alta incidencia de cánceres epiteliales en ratones

deficientes para el ADN corrección de pruebas de

la polimerasa
Robert E. Goldsby * † ‡, Laura E. Hays * §, Chen Xin * †, Elise A. Olmsted *, William B. † Slayton, Gerry J.
Spangrude§, y Bradley D. Preston * ¶ **
* Eccles Instituto de Genética Humana y Departamentos de Pediatría † (División de Hematología Pediátrica Oncología), Ciencias
§Oncological y ¶Biochemistry, Universidad de la Escuela de Medicina de Utah, Salt Lake City, UT 84112; y el Departamento de
Patología y Instituto Nacional del Medio Ambiente Ciencias de la Salud comparativo Ratón Centro de Genómica de la
Universidad de Washington, Seattle, WA 98195
Editado por Allan H. Conney, Rutgers, la Universidad Estatal de Nueva Jersey, New Brunswick, Piscataway, NJ, y Aprobada el
23 de septiembre de 2002 (recibido por opinión 6 junio, 2002)
Las mutaciones son una característica del cáncer. Las células normales minimizar mutaciones OU spontane- a través de
las acciones combinadas de selectividad base de la polimerasa, 3 3 5 corrección exonucleolítica, de corrección de falta de
coincidencia, y el daño del ADN de reparación. Para determinar las consecuencias de corrección de pruebas defectuoso en
los mamíferos, hemos creado ratones con una mutación puntual (D400A) en el dominio corrección de pruebas de la DNA
polimerasa (pol, codificada por el gen POLD1). Se demuestra que esta mutación inactiva la exonucleasa 3 3 5 de pol y
causa un fenotipo mutador y el cáncer de una manera recesiva. A los 18 meses de edad, 94% de los ratones Pold1D400A /
D400A homocigotos desarrolló cáncer y murió (me- supervivencia dian 10 meses). En contraste, sólo 3- 4% ofPold1 /
D400Aand POLD1 / ratones desarrollaron cáncer en este marco de tiempo. De los 66 tumores que surgen en 49 ratones
Pold1D400A / D400A, 40 eran de origen epitelial (car- cinomas), 24 eran mesenquimales (linfomas y sarcomas), y dos eran
compuesta (teratomas); un tercio de estos animales desarrollaron tumores en más de un tejido. carcinoma de células
escamosas de la piel era el tipo de tumor más común, que se producen en el 60% de todos los ratones Pold1D400A /
D400A y en el 90% de los que sobreviven más allá de 8 meses de edad. Estos datos muestran que la corrección de pruebas
pol suprime el desarrollo de tumores espontáneo y sugieren fuertemente que los errores de la polimerasa de ADN no
reparados contribuyen a la carcinogénesis. Los ratones deficientes en pol corrección de pruebas ing proporcionar un
modelo manejable para estudiar los mecanismos de tumorigénesis epitelial iniciado por un fenotipo mutador. que ocurre
en el 60% de todos los ratones Pold1D400A / D400A y en el 90% de los que sobreviven más allá de 8 meses de edad. Estos
datos muestran que la corrección de pruebas pol suprime el desarrollo de tumores espontáneo y sugieren fuertemente que
los errores de la polimerasa de ADN no reparados contribuyen a la carcinogénesis. Los ratones deficientes en pol
corrección de pruebas ing proporcionar un modelo manejable para estudiar los mecanismos de tumorigénesis epitelial
iniciado por un fenotipo mutador. que ocurre en el 60% de todos los ratones Pold1D400A / D400A y en el 90% de los que
sobreviven más allá de 8 meses de edad. Estos datos muestran que la corrección de pruebas pol suprime el desarrollo de
tumores espontáneo y sugieren fuertemente que los errores de la polimerasa de ADN no reparados contribuyen a la
carcinogénesis. Los ratones deficientes en pol corrección de pruebas ing proporcionar un modelo manejable para estudiar
los mecanismos de tumorigénesis epitelial iniciado por un fenotipo mutador.
genes de cáncer es que caracterizaron regulan somática por una homeostasis acumulación de células de (1). Las
mutaciones en el multi-
titude de mutaciones requeridas para neoplásicas ex Ceeds de transformación el número previsto para una célula normal, lo que
sugiere que una tasa de mutación acelerada ( '' mutator fenotipo '') puede ser un evento temprano en la tumorigénesis (2).
Consistente con esta hipótesis, al menos dos síndromes de predisposición al cáncer en seres humanos son el resultado de defectos
en las vías de reparación del ADN que afectan la mutagénesis: xeroderma pigmentoso (causada por el procesamiento defectuoso
de daños en el ADN UV; ref. 3) y el cáncer de colon sin poliposis hereditario [a consecuencia de defectuosa desajuste de
reparación de ADN (MMR); árbitro. 4]. funciones MMR, junto con la corrección de pruebas exonucleolítica y la selección de
base de la polimerasa, para asegurar que la replicación del ADN procede con alta fidelidad (5). Aunque defectuoso MMR
conduce al cáncer en seres humanos (4) y ratones (6, 7), el papel de corrección de pruebas exonucleolítica en la prevención del
cáncer es desconocido.
ADN polimerasa (pol) posee actividad corrección intrínseca y es esencial para la replicación del ADN nuclear (8). La
polimerasa y 3 3 5 sitios activos de corrección de pruebas exonucleolíticas de pol residen en la subunidad p125 de esta proteína
multimérica y son codificadas por el gen POLD1 (9). El sitio activo de exonucleasa se compone de tres motivos altamente
conservados (Exos I, II, y III) que incluyen cuatro residuos de carboxilato absolutamente conservadas que coordinan catálisis
exonucleolítica (Fig 1A;.. Refs 10 y 11). Las mutaciones de estos residuos en Saccharomyces cerevisiae reducen corrección y
causan un fuerte fenotipo mutador (12, 13). Como se predijo a partir de alineaciones de homología (10), sustituciones de
aminoácidos equivalentes en el fago y polimerasas bacterianas interrumpen 3 3 5 actividad de exonucleasa con poco impacto en
la ADN polimerasa
actividad (10, 11). Por lo tanto, también se espera que estas sustituciones en pol de mamífero para interrumpir selectivamente
corrección de pruebas.
En una breve carta, que se informó anteriormente que los ratones homocigotos para la pol II Exo D400A mutación desarrollan
linfomas primeros años de vida (14). Aquí demostramos que esta mutación elimina eficazmente la actividad de pol exonucleasa
in vitro y aumenta la tasa de mutación espontánea de las células de ratón en cultivo. Además, se muestra que los ratones
Pold1D400A / D400A exhiben una alta incidencia de cánceres epiteliales más tarde en la vida. Estos datos indican que unre-
errores ADN polimerasa pareadas contribuyen a la carcinogénesis.
Procedimientos experimentales
Generación y Vivienda de ratones mutantes. A Fix II biblioteca de fagos 129 SvJ (Stratagene) se proyectó mediante el uso de
sondas de oligonucleótidos, y se aislaron tres clones que abarcan toda la secuencia de codificación de ratón POLD1 (ref 15;.
GenBank nº de acceso AF024570.). Para generar el vector de direccionamiento (Fig. 1B), POLD1 fragmentos genómicos de
clones secuencia verificada se digirieron con XbaI y se subclonó. El fragmento XbaI 5, que se extiende desde el exón 3 al intrón
entre los exones 11 y 12, se subclonó en pALTER (Promega), y el fragmento de 3 XbaI se subclonó en pBlue- guión II SK
(Stratagene). Se introdujo una mutación para cambiar el codón de D400 a un codón de alanina utilizando el oligonucleótido 5 -
GAGGTATGGGAGGGCAAAGTTCTGAATGTTGTA- GCC-3 (anticodón alanina está subrayado) y el Sistema de Mutagénesis
Altered Sitios II (Promega). La resultante mutado 5 fragmento POLD1 XbaI se ligó al fragmento genómico 3 XbaI para generar
un clon POLD1 contigua que se extiende desde el exón 3 hasta el final del gen. Un marcador de selección de neomicina
(proporcionado por Kirk Thomas, Universidad de Utah) se introdujo en el sitio XbaI intrónica entre los exones 11 y 12. Este
constructo se subclona en un vector de direccionamiento (TK1-TK2C, también proporcionada por Kirk Thomas), que era
entonces linealizado mediante el corte entre los genes TK1 y TK2 (Fig. 1B) y electroporación en R1 madre embrionarias (ES) de
las células (16). Candidatos clones recombinantes se aislaron por crecimiento en presencia de G418 y ganciclovir (17).
transferencia de Southern, PCR, y secuenciación de ADN confirmó la orientación de genes (véase Materiales y Métodos de
apoyo, que se publican como el apoyo a informa- ción en el sitio web PNAS, www.pnas.org, para más detalles). ratones machos
quiméricos se generaron mediante la agregación de estos clones de células ES recombinantes con C57BL 6J mórulas (18). Las
quimeras se cruzaron con ratones C57BL 6J, y la transmisión de la línea germinal del alelo mutante se verificó mediante PCR y
secuenciación de ADN.
Los ratones se cuidaron de acuerdo con las directrices institucionales de Cuidado de Animales y el uso de jaulas de plástico
con tapas de filtro croisolator mi- y ropa de cama de mazorca de maíz (GreenTru, Verde
Los ratones de cada genotipo fueron en jaulas distribuidas en bastidores de niveles múltiples en una habitación libre de patógenos
específicos con 12-h en 12-h de iluminación de techo convencional lámparas rescent fluo-. Alimentos (dieta Capecchi 7080,
Harlan Teklad, Ison MAD-, WI) y el agua se proporcionaron ad libitum.
Histología y del fenotipo inmune. Las muestras de tumor se fijaron en formalina tamponada, se incluyeron en parafina, se
seccionaron, se tiñeron con hematoxilina y eosina, y se examinaron mediante microscopía óptica. Las lesiones se calificaron
como tumores sólo si eran visibles macroscópicamente en la necropsia y confirmados por histología. mas linfo tímicos de
animales moribundos fueron asesinados immunophenotyped por tres colores citometría de flujo como se describe (19).
Determinación de la mutación Rates.Mouse fibroblastos embrionarios se cultivaron a partir de día 14-16 embriones y se dejó
inmortalizar espontáneamente por el paso continuo en MEM (GIBCO Invitrogen). líneas celulares de fibrosarcoma
inmortalizadas se obtuvieron de manera similar a partir de dos sarcomas espontáneas (confirmado por histología): uno
procedentes de un POLD1 / ratón y el otro en un ratón Pold1D400A / D400A. genotipos POLD1 fueron confirmadas por PCRy la
secuenciación para cada línea celular después de la inmortalización. Las tasas de mutación espontánea a la resistencia a la
ouabaína se determinaron por análisis de fluctuación (20) utilizando el método de la media (21). Para cada análisis, se iniciaron
10-18 culturas de réplica con 300-1,000 células, y cada réplica se amplió a 1-3 106 células. Las células fueron entonces
cultivadas en placa en ouabaína 2 mM (Fisher Scientific). Después de 10-14 días de crecimiento, las colonias resistentes (50
células) se tiñeron con met- ileno azul y se contaron. eficiencias Plating se determinaron anotando colonias que crecieron en
ausencia de ouabaína después de la siembra un número conocido de células. Se analizaron dos o tres líneas celulares policlonales
derivadas independientemente de cada genotipo.
La polimerasa y el sistema de baculovirus exonucleasa Assays.A (Invitro- generación Life Technologies, Grand Island, NY) se
utilizó para expresar y purificar parcialmente (80%) proteínas pol P125 WT y D400A recombinantes. actividades de la
polimerasa se determinó por incorporación suring medi- de [3H] dTTP en poli activado (dA-dT) utilizando un procedimiento
adaptado de Lee et al. (22). Una unidad de actividad de la polimerasa es la cantidad de enzima requerida para incor- porado 1
pmol de dNTP por min en este ensayo.
actividades de exonucleasa se determinaron en un solo y de doble ADN varados. Actividades sobre el ADN de una sola hebra se
medido según la cuantificación de la liberación de radiactividad a partir de una 5 - (dT) DNA 33were [3H] dTdeterminado
sustrato 1-3-3. Actividades en doble cadena mediante un ensayo de gel utilizando un ADN 20-mer 5 marcado con 32P (5 -
TGATAGCACTGATATACCGA-3) hibridado a un molde de ADN 40-mer (5 -TCATGGGTCGTCGGTATAT-
CAGTGCTATCACATTAGTGTA-3) como sustrato (subrayado indica el residuo de base se combina con la 3 terminal de la 20-
mer); productos se visualizaron mediante Fósforo después de electroforesis a través de 7 M de urea 12% de poliacrilamida
gels.See Apoyando Materiales y Métodos para detalles acerca de la purificación re- combinant pol p125 y de la polimerasa y
ensayos de Clease exonu-.
resultados
Generación de ratones Pold1D400A. Una mutación puntual (D400A) fue creado en el dominio exonucleasa codifica de ratón
POLD1 (Fig. 1A), y el alelo mutante se introdujo en células SvJ-129 ES de ratón mediante el uso de la recombinación homóloga
dirigida (Fig. 1 B y C). RT-PCR y secuenciación de transcripciones de células ES heterocigotos POLD1 / D400A mostraron que
los alelos mutantes y WT se expresaron en niveles similares (Fig. 1D). Ambos alelos fueron evidentes en el producto no
fraccionada RT-PCR (Fig 1D medio.), Y la subclonación revelaron una cerca de la distribución igual de las secuencias WT y
Pold1D400A (seis y cuatro de 10 subclones, respectivamente; la Fig. 1D Topand inferior). Western blot análisis de fibroblastos
cultivados de Pold1D400A / D400A, POLD1 / D400A, y POLD1 / embriones también demostró niveles similares de proteína
total pol p125 (14), más el apoyo a la conclusión de que el WT y alelos mutantes se expresan igualmente. Dos quimeras machos
se cruzaron con hembras C57BL 6J para obtener heterocigóticos POLD1 F1ratones. Once F1 POLD1 / D400A se se generaron
luego utiliza dos cohortes de cría / D400A de los animales pares para evaluar crear F fenotipos animales. conferidos POLD1 / por
el alelo Pold1D400A: 180 ratones agouti F1 (100 ratones (53 WT y POLD1 / 80 heterocigotos POLD1 / D400A) y 199 WT, 97
POLD1 heterocigotos / D400A, y F49 2 Pold1D400A / D400A mutantes homocigotos). Se observó una distribución mendeliana
normal de genotipos, lo que indica que el alelo mutante no afecta experimentos ING embriones mostraron que la viabilidad. tanto
F2 homocigóticos subsiguiente y hembra macho breed- ratones mutantes son fértiles.
La supervivencia de los ratones Pold1D400A. ratones Pold1D400A / D400A homocigóticas de anormalidades. la F2 generación
Sin embargo, se desarrolló después en la edad adulta de 3 meses de edad sin visible exhibieron mortalidad significativamente
mayor que POLD1 / y ratones POLD1 / D400A (Fig. 2A). A los 18 meses, los 49 de la Pold1D400A / ratones D400A

El aumento de la incidencia de tumores en ratones Pold1D400A / D400A. La mayoría Pold1D400A / ratones D400A (94%)
albergaba una o más formas de
cáncer en la muerte (Tabla 1). Dieciséis animales (33%) tenían dos o tres tumores primarios diferentes. La mayoría de los
tumores eran de origen epitelial. En contraste, los ratones relativamente pocos POLD1 / y POLD1 / D400A desarrollaron tumores
(cinco tumores entre los 150 animales en la generación), y todos eran lesiones primarias solitarias. Por lo tanto, la mutación
homocigótica del dominio corrección de pruebas pol acelera sustancialmente la tumorigénesis, los tumores ithelial
particularmente EP-, en ratones.
Los tumores que surgen en ratones / D400A Pold1D400A se derivaron de múltiples linajes de células (Tabla 1) y se
desarrollan en un orden temporal distinta (Fig. 2A). Inicialmente, los linfomas tímicos predomi- inated, el desarrollo de entre 3 y
14 meses de edad (mediana de edad de 4,5 meses). Estos tumores a menudo llenos de la cavidad del pecho, desplazando y
constreñir los pulmones y el corazón, y fueron fatales (Fig. 3A izquierdo). Todos estaban compuestos de una población
homogénea de células con alta relación nuclear a citoplásmica, cromatina fina, nucleolos prominentes y frecuentes mitosis,
consistente con una clasificación morfológica de linfoma linfoblástico (Fig. 3A derecha). El inmunofenotipo de tres linfomas
tímicos demostró que eran todos de origen de células T que expresan CD8, pero no CD4 o CD3, en la superficie celular.
Tumores de la piel empezaron a surgir a los 7 meses de edad (Fig. 3B) y continuaron desarrollando hasta el final del estudio.
Estos fueron los tumores más frecuentes observados en los ratones Pold1D400A / D400A, en desarrollo en 30 de los 34 animales
(88%) que sobrevivieron más allá de 8 meses de edad. Que se produjeron en las zonas expuestas de la piel, sobre todo en la cola,
sino también de vez en cuando en las orejas y las patas traseras. Pold1D400A / ratones D400A exhibió una serie de cambios
observables en la piel. Inicialmente, la piel de la cola se convirtió seca y escamosa en toda su longitud. Esto fue seguido por el
desarrollo de aisladosnódulos pequeños (3 mm) con progresión a nódulos grandes (hasta 10 mm) sobre un fondo de lesiones que
afectan a la mayor parte de la cola (Fig. 3B izquierda). papilomas pedunculados clásicos por lo general no se observaron como
parte de esta progresión. El examen histológico de los pequeños nódulos reveló características de carcinoma in situ. Los nódulos
más grandes demostraron marcada hiperplasia epitelial, numerosas figuras mitóticas, puentes intercelulares, y la queratosis con
perlas de queratina típicos de SCC (Fig. 3B derecha). Estas lesiones parecían restringidos a la dermis sin evidencia de ses
metasta-. La mayoría de los animales desarrollaron tumores múltiples de la cola antes de cumbing Suc- a un segundo tumor
primario en un órgano interno. Esta última ola de tumores se produjo a 9-18 meses de edad (mediana de 14 meses) e incluyó
adenomas y adenocarcinomas (pre- pulmón dominantemente; Fig. 3C),
El aumento espontáneo tasa de mutación de Cultured Pold1D400A / Células D400A. Para evaluar si el alelo Pold1D400A causa
un fenotipo mutador, líneas celulares de fibroblastos derivados de WT, heterocigotos, y los embriones mutantes homocigotos se
ensayaron para determinar las tasas de mutación espontánea a la resistencia a la ouabaína (Tabla 2). Las tasas de mutación de las
líneas celulares heterocigóticos WT y estaban en o por debajo del nivel de fondo de la detección. En contraste, las células
Pold1D400A / D400A mostraron consistentemente una tasa que era alrededor de 10 veces por encima del fondo. Las células
derivadas de un fibrosarcoma Pold1D400A / D400A mostraron un incremento similar en la tasa de mutación cuando se compara
con células de fibrosarcoma WT. Así, la expresión homocigotos de cativamente el alelo Pold1D400A signifi- aumenta la tasa de
mutación espontánea de las células de ratón en cultivo.
D400A mutación altera Pol p125 actividad exonucleasa. Para deter- minar el efecto de la mutación D400A en pol 3 actividad
exonucleasa 35, nosotros, parcialmente purificadas subunidades recombinantes WT y mutantes catalíticos (P125) de pol y se
ensayó su actividad polimerasa y exonucleasa in vitro (Fig. 4). En una monocatenario 5 - (dT) 3-terminal 33sustrato [3H] dT
[3H] dTMP 1-3-3, la enzima WT catalizada liberación de residuos en proporción a la cantidad de polimerasa añadido al ensayo
(Fig. 4A). En contraste, el mutante D400A mostró ninguna actividad exonucleasa de cadena sencilla significativa por encima del
fondo del ensayo incluso a altas concentraciones de polimerasa. Se observaron resultados similares en una de doble cadena [5
32P] 20-mer sustrato 40-mer (Fig. 4B). Cuando WT p125 pol se incubó con este dúplex en la presencia del siguiente nucleótido
correcto dCTP y Mg2 como activador de metal divalente, productos tanto más largas y más cortas que se observaron el cebador
20-mer (Fig. 4B, carril 2). Los resultados 1 de productos de la incorporación de plantilla de dCMP por la polimerasa, mientras
que los productos 1 y 2 reflejan 3 3 5 actividad de exonucleasa. Como se esperaba, incubaciones que carece de dCTP generan
sólo los productos 1 y 2 de exonucleasa (Fig. 4B, carriles 4 y 5). Sustituyendo Mn2 para Mg2 en estas reacciones aumentaron
tanto la actividad como la procesividad de la nucleasa exo, produciendo un '' escalera '' de bandas de producto hacia abajo a la
posición 4 (Fig. 4B, carriles 6 y 7). En contraste, el D400A polimerasa mutante no produjo productos de exonucleasa detectables
con Mg2 como activador de metal divalente (Fig. 4B, carriles 3, 8, y 9) y sólo una traza de producto en presencia de Mn2 (Fig.
4B, carriles 10 y 11). Juntos, estos datos muestran que la mutación D400A reduce sustancialmente pol p125 3 3 5 actividad de
exonucleasa en ambos sustratos de una y de doble cadena. produciendo un '' escalera '' de bandas de producto hacia abajo a la
posición 4 (Fig. 4B, carriles 6 y 7). En contraste, el D400A polimerasa mutante no produjo productos de exonucleasa detectables
con Mg2 como activador de metal divalente (Fig. 4B, carriles 3, 8, y 9) y sólo una traza de producto en presencia de Mn2 (Fig.
4B, carriles 10 y 11). Juntos, estos datos muestran que la mutación D400A reduce sustancialmente pol p125 3 3 5 actividad de
exonucleasa en ambos sustratos de una y de doble cadena. produciendo un '' escalera '' de bandas de producto hacia abajo a la
posición 4 (Fig. 4B, carriles 6 y 7). En contraste, el D400A polimerasa mutante no produjo productos de exonucleasa detectables
con Mg2 como activador de metal divalente (Fig. 4B, carriles 3, 8, y 9) y sólo una traza de producto en presencia de Mn2 (Fig.
4B, carriles 10 y 11). Juntos, estos datos muestran que la mutación D400A reduce sustancialmente pol p125 3 3 5 actividad de
exonucleasa en ambos sustratos de una y de doble cadena.
Discusión
ADN corrección de pruebas de la polimerasa es un mecanismo altamente conservado que corrige errores de replicación
espontáneas (5, 10, 11). Aquí nos muestran que los ratones homocigotos para una mutación puntual inactivadora en el dominio de
corrección de pruebas de pol (D400A; Fig. 1) son propensas al cáncer. Estos ratones desarrollaron linfomas a una edad temprana
y una alta incidencia de tumores epiteliales más tarde en la vida (Figs. 2 y 3 y en la Tabla 1). La mutación D400A abolió pol 3 3
5 actividad exonucleasa in vitro (Fig. 4) y confiere un fenotipo mutador en
homocigótica, pero no heterocigotos, las líneas celulares mutantes (Tabla 2). Correspondientemente, los ratones heterocigotos no
exhibió un fenotipo del cáncer (Fig. 2). Estos estudios demuestran la importancia de la corrección de pruebas pol para evitar
mutación en células de mamíferos y muestran que los tejidos epiteliales son particularmente susceptibles a la polimerasa cánceres
de error inducida en ratones.
errores ADN polimerasa se corrigen por tanto corrección de pruebas y MMR (13), y varios estudios muestran que la pérdida de
MMR también predispone ratones con el cáncer (revisado en refs. 6 y 7). Sin embargo, los fenotipos de cáncer de ratones MMR-
y corrección deficientes son significativamente diferentes (ver más abajo), y no está claro que los errores de replicación cuenta
solo para la susceptibilidad al cáncer de ratones MMR-deficiente (23), como proteínas MMR también funcionan en daño en el
ADN reconoci- miento y la apoptosis (24, 25). Por lo tanto, los cánceres en los ratones deficientes en MMR pueden resultar de
una combinación de eventos celulares que interrumpen homeostasis e impulsan la transformación oncogénica. Nuestros datos
indican que los errores pol son suficientes para acelerar la tumorigénesis como predecirse por el 'mutador '' hipótesis' de la
carcinogénesis (2).
15564 www.pnas.org cgi doi 10.1073 pnas.232340999 Goldsby et al.
Los fenotipos de cáncer de MMR- y ratones de corrección de pruebas deficientes son similares en algunos aspectos, pero
significativamente diferentes en otros. Ambos ratones mutantes desarrollan linfomas tímicos temprano en la vida. Sin embargo,
estos tumores parecen provenir de diferentes poblaciones celulares. citometría de flujo análisis de Pold1D400A / D400A
linfomas tímicos mostraron que eran de origen en células T con un patrón de expresión del antígeno de superficie CD3 CD4
CD8. En contraste, los linfomas CD3 predominan en ratones MMR-deficientes como se determina por inmunohistoquímica (26).
Aunque los antígenos de superficie no se evaluaron en los tumores MMR, estos datos sugieren que la pérdida de corrección de
pruebas pol y MMR afectar a diferentes vías de lymphomagenesis. Los linfomas tímicos en ratones / D400A Pold1D400A
pueden haberse originado a partir de un CD3 CD4 CD8 intermedia durante la maduración de las células T (27).
Alternativamente, estos linfomas pueden exhibir la expresión aberrante del antígeno CD8. Pol se ha implicado en V (D) J
recombinación durante la maduración de los linfocitos B de células (28), y la función exonucleasa pol puede afectar análogos
reordenamientos del receptor de células T. ratones de corrección de pruebas deficientes MMR- y pol también difieren en su
distribución de cánceres epiteliales: adenomas intestinales adenocarcinomas en ratones con deficiencia de MMR (6, 7) y SCC de
piel en ratones Pold1D400A / D400A (Fig 3 y en la Tabla 1.). Por lo tanto, MMR es limitante de la velocidad para la formación
de tumores en el epitelio intestinal, mientras que la corrección de pruebas pol es limitante de la velocidad en la epidermis de la
piel. Este hallazgo puede reflejar diferencias de tejido o específicos de células en los niveles de MMR o corrección de pruebas
pol, daño y reparación del ADN, bypass lesión, oncogén y la expresión supresor de tumores, tipos tación mu- y secuencias diana
disponibles, ING mutagénico proceso- de errores pol (29), y o la apoptosis mediada por MMR (24, 25). Se requieren estudios
adicionales para caracterizar la contribución de estos y otros procesos para génesis tumori- específica de tejido en los ratones
mutantes.
Los tumores desarrollados en homocigotos, pero no heterocigotos, ratones Pold1D400A (Fig. 2). Las susceptibilidades de baja
y alta de cáncer de POLD1 / D400A y animales Pold1D400A / D400A paralelos a los respectivos fenotipos de baja y alta de
mutador de cultivos de fibroblastos derivados de estos animales (Tabla 2). levadura heterocigota con mutaciones pol de
corrección de pruebas análogas también muestran un efecto mutador limitada (12, 13). Por lo tanto, los defectos en la corrección
de pruebas pol son recesivos en diversos eucariotas. La baja tasa de mutación de heterocigotos sugiere que otras vías tales como
MMR (13) y la corrección de pruebas o intermolecular (30, 31) corregir los errores introducidos por moléculas pol mutantes que
carecen de corrección de pruebas, pero exhiben actividad de polimerasa normal (Fig. 4) y por lo tanto presumiblemente participar
en la síntesis de ADN celular. Aunque los tumores pueden surgir en los heterocigotos por la pérdida del alelo WT, esto no se
observó en nuestros animales POLD1 / D400A (Fig. 2). Los ratones que llevan defectos heterocigotos en los genes MMR
también raramente desarrollan tumores (6, 7). Por lo tanto, la pérdida de heterozigosidad no es una vía común para la iniciación
del tumor en estos sistemas modelo de ratón. La razón de esto es desconocida. En el caso de POLD1, hemizygosity puede
conferir una desventaja de crecimiento si los niveles de pol en la célula se Rate- limitante para la síntesis de ADN normal (8).
Mantenimiento de alta fidelidad de replicación después de la pérdida de una corrección de pruebas o alelo MMR
presumiblemente beneficia el organismo, reduciendo al mínimo las mutaciones espontáneas y cánceres. En el caso de POLD1,
hemizygosity puede conferir una desventaja de crecimiento si los niveles de pol en la célula se Rate- limitante para la síntesis de
ADN normal (8). Mantenimiento de alta fidelidad de replicación después de la pérdida de una corrección de pruebas o alelo
MMR presumiblemente beneficia el organismo, reduciendo al mínimo las mutaciones espontáneas y cánceres. En el caso de
POLD1, hemizygosity puede conferir una desventaja de crecimiento si los niveles de pol en la célula se Rate- limitante para la
síntesis de ADN normal (8). Mantenimiento de alta fidelidad de replicación después de la pérdida de una corrección de pruebas o
alelo MMR presumiblemente beneficia el organismo, reduciendo al mínimo las mutaciones espontáneas y cánceres.
La alta incidencia de SCC de piel en ratones / D400A Pold1D400A es un fenotipo sorprendente e inusual (Fig. 3B). Estos
tumores fueron claramente carcinomas de origen de células escamosas y no se parecen a los queratoacantomas o tumores de la
glándula sebácea que de vez en cuando surgen en la piel de ratones MMR-deficiente (ref 32;. LEH y BDP, resultados no
publicados). tumores de la piel espontáneas son extremadamente raros en ambos 129 y C57BL 6 ratones (33, 34), indicando que
SCC tumorigénesis es controlada en gran parte por el alelo Pold1D400A y no fondo genético en este sistema modelo. Los SCC
en Pold1D400A ratones / D400A surgieron exclusivamente en la piel expuesta (predomi- inantly cola), lo que sugiere que los
factores ambientales, como el contacto con sustancias irritantes en la exposición jaula y o la luz UV, pueden contribuir a la
tumorigénesis. Los tumores no parecen ser el resultado de las heridas,dominio de la pol. Una de estas líneas celulares fue heridas
infligidas lucha posterior- son los más comunes. Tampoco hubo aso- observado consiguiente tener un defecto en la proteína
MMR MSH6, y el ciación entre tumor de la piel y el desarrollo de linfoma (fenotipo mutador linfo se corrigió en su mayoría por
la introducción de mas WT se observó sólo en el 10% de los ratones que llevan los CE ). La piel MSH6 en estas células (45).
También hemos demostrado que la pol lesiones mutaciones progresaron a través de una serie de cambios morfológicos
(engrosamiento inicial epidérmico y agrietamiento seguido por el crecimiento de las pequeñas y luego grandes nódulos) que
parecen similares a los CE humanos cutáneas (35), los cánceres de piel de ratón inducidos por UV ( 36), y los CE que surjan en
ratones transgénicos K14-HPV16 (37). En contraste, los carcinomas en Pold1D400A / ratones D400A difieren de tumores de la
piel inducido por productos químicos, que son predominantemente papilomas benignos (38). El espectro y el tiempo de
mutaciones en ras, p53 y otros genes diana deben ser determinados para caracterizar mejor los eventos moleculares que impulsan
el desarrollo del tumor epidérmico en ratones / D400A Pold1D400A. La alta incidencia de carcinomas en un tejido fácilmente
accesible hacen de este un modelo manejable para el estudio de los mecanismos genéticos y moleculares de la tumorigénesis
epitelial iniciado por un mutador.
Las células epiteliales sirven como la primera línea de defensa contra agentes exógenos, incluyendo carcinógenos que generan
lesiones del ADN mutagénicos y polimerasa de bloqueo. Por lo tanto, el daño del ADN, la reparación,homólogas a las
observadas por da Costa et al. (42) en los seres humanos no otorgan un efecto mutador en levadura (M. Singh, N. Lawrence, y
BDP, resultados no publicados). Los fenotipos de otras variantes pol son desconocidos. En resumen, mostramos que una sola
mutación puntual en el dominio exonucleasa altamente conservada de pol ratón menoscabo de la actividad cleolytic exonu- y
resulta en un mutador y el cáncer de fenotipo recesivo. Estos ratones, junto con los ratones MMR-defectuoso, demos- trar la
importancia de la fidelidad de replicación del ADN en el cáncer de ING prevenibles. Hay numerosas alteraciones genéticas que
conducen a mutator fenotipos en bacterias y levaduras (46), sugiriendo que un gran número de genes mutadores, individualmente
o en combinación, pueden contribuir a la carcinogénesis (47). Es probable que las proteínas mutantes que afectan a ADN
fidelidad de replicación también interactuar con daño del ADN y de reparación de vías, en particular en la piel y otros tejidos
epiteliales que están expuestos a agentes exógenos. y bypass lesión puede influir en el fenotipo de cáncer en ratones / D400A
Pold1D400A. Tal vez similar a los ratones Pold1D400A / D400A, los seres humanos con defectos en la reparación por escisión
de nucleótidos (NER) o el bypass lesión de la polimerasa (pol) también desarrollar cáncer de piel (3). Pol
(Estamos en deuda con Cheng-Keat Tan y Antero Así
que para ayuda y reactivos utilizados para la purificación y análisis de pol ratón y Aym Berges para la preparación de
oligonucleótidos purificados en gel. Agradecemos a Jamie Bugni, Robert Smith, Mark Meuth, Mario Capecchi, William Carroll,
George Klarmann, Jim Kushner, Kirk Thomas y David Virshup valiosa para los debates y lectura crítica del manuscrito, Diana
Lim para obtener ayuda con el diseño gráfico, Aurelia Meloni-Ehrig del Fondo para Citogenética Core para dantes ciones de
estas vías con corrección pol y cómo

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