XABIER EGILUZ 3KIA2

PRÁCTICA: TRANSFORMACIÓN

MULTICOLOR
INDICE

OBJETIVOS

MATERIALES Y REACTIVOS UTILIZADOS

PROCEDIMIENTO

RESULTADOS

CONCLUSIONES
DIA1
OBJETIVOS

*Disponemos de una campana de flujo laminar diseñada especialmente para equipos de

biotecnología. Esta campana dispone de un sistema de cierre mediante una compuerta que mantiene
el interior totalmente sellado.

• Saber trabajar en una campana de flujo laminar de las características anteriormente

descritas.
• Entender los diferentes tipos de cultivos y el porque se utilizan.
• Observar el proceso que ocurre en las bacterias e.coli al introducir unADN plásmido.
• Ver que ocurre lo que nos describe la teoría, sobre la transformación multicolor.

Materiales y reactivos a utilizar;

EQUIPOS REACTIVOS INSTRUMENTAL,PLACAS..

• Baño Maria • Agar LB ready Pour • Micropipetas
• Campana de flujo • Ampicilina • Puntas micropipetas
Laminar • Liquido IPTG • Asas acodadas
• Microondas • Caldo de liquido estéril • 4Placas Petri PCA
• Estufa • Bacto Bead • 20Placas Petri LB+Amp
• Centrifugadora • 10Placas Petri
• Termo bloque LB+AMP+IPTG
• Agitador de Tubos • Rociador etanol
Voltex

• Dispondremos del material a utilizar en nuestros experimentos dentro de la campana y

perfectamente limpio, para ello habremos limpiado a conciencia con etanol todo el
instrumental y por supuesto nuestras manos y guantes. Las mangas deben estar siempre
bajadas para que no haya ningún resto biológico en nuestro habitáculo de trabajo.
Micropipetas, boquillas, reactivos...así como un recipiente con lejía para deshacernos del
material desechable.
PROCEDIMIENTO

PREPARAR MEDIOS

• Preparar el Agar LB Ready Pour para introducir placas. El Agar nos viene en estado solido
y tenemos que romper primero manualmente y con el tapon cerrado para posteriormente y con el
tapon a ¼ de vuelta introducirlo en el microondas durante untiempo aproximado de 1
minuto,repitiendo el proceso en intervalos mas cortos hasta tener todo completamente disuelto.

• Posteriormente lo introduciremos a 60º en el baño Maria y seguidamente en las placas Petri.

Todo este proceso requiere una pulcritud máxima y utilizando en todo momento guantes y
trabajando siempre dentro de la cabina de flujo laminar. Así mismo pasaremos por etanol
todo el material que vayamos a introducir dentro de la cabina.
• Dentro de la cabina tendremos todo el material que vayamos a trabajar.
Micropipetas,puntas,los reactivos a utilizar.

PREPARACIÓN DEL MEDIO LB+AMPICILINA

• Disolveremos la ampicilina que nos viene en polvo. Para ello añadimos 20µl de caldo
liquido estéril
con una micropipeta y vamos disolviendolo poco a poco añadiendole en muy pocas
cantidades. Utilizamos el bombeo de la micropipeta para disolver la ampicilina. Una vez
disuelta lo introducimos en la botella de agar atemperado a 60º .
• Para introducir en 20 placas pequeñas utilizamos el medio general utilizado con las placas
grandes.

• Introducimos el medio LB+Ampicilina +IPTG.

El IPTG ya nos viene en estado liquido con lo cual mediante la micropipeta le añadiremos a
la botella de Agar+Ampicilina.
• Preparamos 10 alicuotas de 1,3ml de caldo de recuperación en tubos microcentrifugos, se
marcan y mantenemos a Tºambiente
• Pondremos los tubos de ADN plasmidico en hielo para su descongelacion.
• Marcaremos los11 tubos de microcentrifugar com MTM.
• Antes de dispensar golpearemos con los dedos suavemente los tubos del ADN plasmidico
hasta que los reactivos los veremos en el fondo conico de los tubos.
• Utilizando una micropipeta dispensaremos 12µl de la mezcla recién preparada sobre los 10
tubos de microcentrifugar marcados,cerramos los tubos y colocamos en hielo.
PREPARACION DEL CULTIVO E.COLI
•
• Utilizaremos placas grandes con agar PCA que teníamos ya preparadas de antes.
• Esta bacteria viene en perlas en un producto llamado Bactobead, mediante un asa de
inoculacion esteril obtendremos una de esas perlas y posteriormente lo transferimos a la
placa Petri cerca de uno de sus bordes cerrando posteriormente para evitar contaminaciones.
 • Con la micropipeta transferiremos 10µl de caldo liquido estéril , echandolo justo encima de
la perla para disolverla.
• Posteriormente haremos una siembra en estria sobre las placas PCA .

• Llevaremos estas placas a una estufa incubadora a 37ºC de 16 a 20 horas.

DIA2

Pondremos a calentar el termobloque a 42ºC y la estufa a 37ºC

• Prepararemos 10 alicuotas de 1 mlde cacl2 en tubos de microcentrifugas, se marcan los
mismos dejandolo en hielo.
• Se preparan 10 alicuotas de 1,3 ml de Luria Broth Medium (caldo de Recuperación) en
tubos de microcentrifugas, se marcan y dejamos a temperatura ambiente.
• Los tubos del ADN plasmidico de pChromoBlue, pChromoPink y ChromoPurple son
colocados en hielo para ser descongelados.
• A continuación se marcan 11 tubos de micro centrifuga como MTM(mezcla de
transformación multicolor).
• Antes de dispensar los ADN plasmidicos de pChromoBlue, pChromoPink y ChromoPurple
se les da un golpe de centrifugadora para los respectivos reactivosse encuentren en el fondo
cónico de los tubos antes de usarlos.
• Utilizando una micropipeta dispensamos 50µlde la mezcla recién preparada sobre los 10
tubos de microcentrifugadora marcados cerramos los tubos y colocamos en hielo.

PREPARACIÓN DE ADN + Y ADN-

• Marcaremos dos tubos para microcentrifugar uno de ADN+ y otro ADN-.

• Transferiremos 500µlde solucion CaCL2 usando pipèta esteril. Seguidamente transferimos
con un asa de siembra colonias desde la placa donde tendremos el cultivo de e.coli
preparada el día anterior. Haciendo girar el asa de siembra rápidamente para desprender los
cultivos en la solución. Posteriormente agitaremos el tubo hasta ver turbio todo el conjunto.
• Transferiremos 250µl del tubo ADN- al de ADN+.
• Al tubo ADN+ transferiremos 10µl de la mezcla rainbow (MTM) .
• Se mezclan las dos muestras de ADN- y ADN+ y se introducen en hielo.(10 minutos).
• Colocamos los tubos de transformacion en el termobloque a 42ºC durante 90 sg estrictos.
• Se retiran los tubos una vez pasado el tiempo exacto y se retiran al hielo durante 2 minutos.
• La siguiente etapa es introducir 250µl de caldo de recuperacion a cada uno de los tubos.
• Por ultimo se llevan los dos tubos, ADN- y ADN+a incubar a 37ºC durante 30 minutos.
Marcaremos en este intervalo de tiempo las placas pequeñas.
• 2 placas de (LB) con (ADN-)
• 2 placas de(LB+AMP)con (ADN-)
• 2 placas de (LB+AMP)con (ADN+)
• 2 placas de (LB+AMP+IPTG) con (ADN+)

• Colocaremos los tubos en una gradilla.

• Del tubo ADN- transferiremos 100µl a 2 placas(LB+AMP+IPTG) y se realiza la siembra del
modo idéntico a los anteriores
• Se cierran las placas una vez realizadas las siembras y se dan la vuelta. Las apilamos y las
llevamos a la incubadora quedando el medio hacia arriba.(evitar que el vapor de agua
precipite)
• La incubadora se se programa a 37º C y se mantiene en esa temperatura durante 24 horas
mas, bajando posteriormente a 4º C y permanecer así durante un tiempo infinito hasta sacar
las placas.

DIA 3

RESULTADOS

El medio de cultivo general LB lo utilizamos como control positivo en esta practica para saber de la
presencia de la bacteria en este caso e.coli .Si no hubiéramos tenido crecimiento, hubiéramos tenido
algún problema con el medio o bien la cepa de la bacteria estaría muerta. Para lo cual no
hubiéramos tenido ningún crecimiento en ninguna placa.
Los resultados nos indican que las bacterias tienen buena actividad y el medio estaba correcto .
Podemos observar claramente los diferentes resultados obtenidos en la realización de la prueba. Por
un lado podemos ver que el grupo con ADN-, tendría colonias en las placas con material genético y
medio de cultivo LB, en los cuales no se introdujo ampicilina, y sin colonias presentes en las que sí
tienen el antibiótico. De esta manera confirmamos la presencia de la bacteria y la utilización de la
ampicilina como método valido para anular la presencia de la bacteria E. Coli.
Por otro lado tendremos las placas con presencia de bacterias multicolores. En estas placas hemos
introducido material ADN+ ademas de la mezcla de material plasmidico y en una de ellas el agar
LB lleva añadido la ampicilina.
Podemos observar que en las dos placas existe la presencia de puntos de diferentes colores si bien
en una de ellas (la que contiene IPTG );esa cantidad diferente de colores es mayor asi como su
numero y la intensidad del color.
Cultivo general control positivo,con y sin antibiótico
LB+AMP LB+AMP+IPTG

Después de vistos y analizados los resultados obtenidos, podemos deducir de ellos, que el promotor
no es 100 % inducible. Por lo cual hay crecimiento y coloración en las placas que no tienen IPTG y
con ampicilina.
En el que tienen IPTG se multiplican mas y ademas sus colores son mas intensos. Ello de por si ya
tiene una expresión basal. En ese estado el promotor no esta silenciado al 100% o bien el promotor
no solo se activa con la T7.