UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA

FACULTAD DE INGENIERÍA PESQUERA

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE INGENIERÍA

PESQUERA

TRABAJO ENCARGADO:

“CROMATOGRAFIA”

CURSO:
ANÁLISIS DE ALIMENTOS

ALUMNA:

CASAVERDE SIALER MARIANA JAZMIN

DOCENTE:

ING. HUALTER LEYTON MASIAS, M. Sc

 “CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA” 2014

INDICE

Pag.

I. INTRODUCCION 3

II. OBJETIVOS 4

III. MARCO TEORICO 4

 LA CROMATOGRAFIA
4

i. DEFINICION 4
ii. APLICACION
DE LA MUESTRA 6
iii. OBTENCION DEL
CROMATOGRAMA 7
iv. INTERPRETACION:
FACTOR DE RETENCION Rf 10
v. FACTORES QUE INFLUYEN
EN LA SEPARACIÓN POR
CROMATOGRAFÍA 11
vi. APARATOS, MATERIALES
Y GENERALIDADES 12
vii. CROMATOGRAFIA
BIDIMENSIONAL EN
CAPA FINA 16

IV. CONCLUSIONES 17

V. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 18

ANEXOS

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I. INTRODUCCION

El botánico ruso Mikhail Tswett estableció las ventajas de la cromatografía y fue el

primero en utilizar este término. Es recordado como el Padre de la Cromatografía.
Ismailov y Scraiber utilizaron láminas de vidrio para colocar capas muy delgadas de
alúmina y luego aplicaron extractos vegetales, dando así la primera forma de
Cromatografía de Capa Fina. Egon Stahl (1956) dio el nombre de Cromatografía de
Capa Fina. Estandarizó los procedimientos, equipos y adsorbentes dando un auge a
la técnica simple, a bajo costo y eficiente.

La cromatografía es una técnica de separación extraordinariamente versátil que

presenta distintas variantes. En toda separación cromatografiar hay dos fases (sólida,
líquida o gas) una móvil y otra estacionaria, que se mueven una con respecto de la
otra manteniendo un contacto íntimo. La muestra se introduce en la fase móvil y los
componentes de la muestra se distribuyen entre la fase estacionaria y la móvil. Los
componentes de la mezcla a separar invierten un tiempo diferente en recorrer cada
una de las fases, con lo que se produce la separación.

Si un componente está la mayor parte del tiempo en la fase móvil el producto se

mueve rápidamente, mientras que si se encuentra la mayor parte en la fase
estacionaria, el producto queda retenido y su salida es mucho más lenta.

La cromatografía de capa fina, llamada, es un tipo de cromatografía donde la fase

estacionaria es una capa delgada de un material depositado sobre un soporte, a este
conjunto se le llama placa. La fase móvil es un disolvente o mezcla de disolventes,
llamada eluyente, que se mueve por la fase estacionaria por capilaridad.
Generalmente, las placas están formadas por una capa de gel de sílice u otro material
con propiedades adsorbentes.

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II. OBJETIVOS

 Conocer y aplicar la técnica de cromatografía en capa fina, c.c.f., sus

características y los factores que en ella intervienen.

 Deducir, a través del Rf la relación que existe entre la polaridad de las sustancias
que se analizan y la de los eluyentes utilizados.

 Aplicar la técnica de c.c.f. como criterio de pureza e identificación de las sustancias.

III. MARCO TEORICO

Es una técnica muy utilizada para la identificación y determinación de pureza de

compuestos, también puede utilizarse como técnica de separación (cromatografía de
capa fina TLC preparativa) a muy pequeña escala.

En esta técnica la fase estacionaria es una capa fina de gel de sílice u otro soporte
con propiedades adsorbentes dispuesta sobre un soporte de vidrio o aluminio que
denominaremos placa. El eluyente o fase móvil será la mezcla de disolventes
adecuada.

La cromatografía de capa fina es un procedimiento que se utiliza para separar

moléculas relativamente pequeñas. La separación de mezclas de moléculas
mediante la cromatografía de capa fina se basa en el principio del reparto entre dos
fases. Al igual que otras cromatografías, consiste de una fase estacionaria y una fase
móvil y el principio es el mismo: la sustancia de interés se adherirá a la fase
estacionaria o se moverá con la fase móvil, viajando una distancia que es
inversamente proporcional a la afinidad por la fase estacionaria. La fase estacionaria
puede ser variada. Puede ser de papel, de celulosa o de un gel de silicato (vidrio
molido bien fino) unido a una superficie sólida (una placa de vidrio, aluminio, plástico
o papel). Esta superficie sólida puede ser rígida o flexible. El tipo de fase estacionaria
que se utilice en un experimento dependerá del tipo de moléculas que se quieran
separar. Incluso vienen algunas placas con indicadores fluorescentes.

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La fase estacionaria consiste de un solvente que puede ser agua, un solvente

orgánico o una mezcla de ambos.

El procedimiento es sencillo: Se colocan las muestras a un centímetro del borde en

uno de los extremos de la placa, se deja secar, se coloca la placa en un envase
(tanque de desarrollo) que ya contiene una pequeña cantidad del solvente, se tapa y
se deja correr por un rato. El solvente subirá por capilaridad e irá arrastrando las
moléculas, las cuales se moverán según la afinidad que muestren por la fase
estacionaria. Si la mezcla de muestras que se está analizando presenta color, se
verán los distintos colores migrando a distintas velocidades. Si son incoloras hay que
someter la placa a algún tratamiento con una sustancia desarrolladora para poder
determinar la presencia de sustancias sobre el silicato. El tipo de desarrollador
dependerá del tipo de moléculas que se analizan.

La separación de mezclas complejas de productos y el aislamiento y purificación de

los componentes individuales es de gran importancia en la química orgánica. La
cromatografía constituye una importante herramienta en este sentido,
complementaria con las técnicas clásicas: cristalización, destilación, etc.

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Proceso de Adsorción: La muestra aplicada en la capa es adsorbida en la superficie

del material por la acción de fuerzas electrostáticas (fuerzas de Van der Waals,
puentes de Hidrógeno, efectos inductivos, etc.).

Luego, cuando la capa es expuesta a un flujo por acción capilar, se inicia una
competencia de enlaces entre los sitios activos del adsorbente y la sustancia con el
solvente. Los adsorbentes más utilizados en la Cromatografía de Capa Fina son:

 Sílica gel (se utiliza en el 80% de las separaciones)

 Óxido de Aluminio ó Alúmina (ácida, neutra ó básica)
 Tierra Silícea ó Kieselguhr
 Celulosa (Nativa o micro-cristalina)
 Poliamidas

Estos adsorbentes deber tener las siguientes características:

 Tamaño de Partícula
 Volumen de Poro
 Diámetro de Poro
 Área Superficial
 Homogeneidad
 Pureza

3.1 Aplicación de la muestra

La introducción de la muestra se realiza utilizando un tubo capilar. Para ello se ha de

disolver una pequeña cantidad de la muestra a analizar en un disolvente volátil. A
continuación, el extremo del tubo capilar se introduce en la disolución. La disolución
ascenderá por el tubo por capilaridad. En uno de los lados de la placa,
aproximadamente a 3 mm del borde, se ha de trazar a lápiz una línea recta, línea
base, y sobre ella unos puntos de referencia. Sobre dichos puntos se pincha con el
tubo capilar, de modo que una pequeña cantidad de la disolución pase a la placa. De
esta manera, la muestra queda adsorbida por el soporte sólido en la placa.

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3.2 Obtención del cromatograma

La muestra se disuelve en muy poca cantidad de un disolvente volátil. Si se va a

utilizar patrones de alguna sustancia se preparan de la misma manera. A
continuación se dibuja una línea base con lápiz y unos puntos de referencia
donde se pincharán las muestras con un capilar.

Se debe preparar la cubeta en la que se va a realizar la cromatografía. Esta

cubeta es un simple recipiente de vidrio en donde se añade el eluyente que se
va a utilizar, siempre en un nivel inferior a la línea base que se ha dibujado en la
placa.

En la cubeta se introduce una tira de papel de filtro para que el vapor del eluyente
esté por toda la cubeta.

En este momento se introduce con cuidado la placa en la cubeta y se tapa,

esperando a que el nivel del eluyente ascienda por la placa.

Cuando el nivel se encuentra casi en el borde superior, se extrae la placa y se

dibuja una nueva línea en este nivel.
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El disolvente al ser volátil se evapora en poco tiempo dejando la placa seca.

Ahora se debe buscar un método para visualizar el resultado del cromatograma

y ver la separación de los componentes pinchados en la placa.

En el caso de que la sustancia sea coloreada no habría ningún problema ya que

se verían los componentes.

Para otros compuestos, las placas comerciales suelen llevar una sustancia
fluorescente que si se irradia con luz UV, se pueden ver los componentes como
manchas oscuras circulares. Estas manchas se deben marcar sobre la placa con
lápiz.

Otro método puede ser hacer reaccionar los componentes con alguna sustancia
que coloree esos compuestos para dar una señal visual.

Factores que influyen en la elución

El factor que más influye en la separación de los componentes en este tipo de

cromatografía es la polaridad de estos componentes.

La placa está formada por una capa de gel de sílice, una sustancia muy polar, y
por lo tanto, atraerá en mayor medida a componentes más polares.

Al realizar el cromatograma, las sustancias más polares interaccionarán más con

el soporte y su velocidad de desplazamiento será menor, esto significa que al
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revelar la placa cromatográfica, el componente más polar se encontrará en un

lugar más cercano a la línea base que hemos dibujado, y por el contrario, el
componente menos polar se moverá más rápidamente y se encontrará más
alejado de la línea base.

La polaridad del eluyente es un factor que consigue que los componentes se

muevan más rápido o más lento en una cromatografía.

Es decir, para un eluyente con mayor polaridad, éste estará más atraído por el
soporte y los componentes serán más libres para moverse mejor, por lo que, al
revelar la placa, los componentes saldrán más alejados de la línea base.

Por la misma razón, con un eluyente menos polar, éste casi no interacciona con
el soporte polar, y los compuestos tendrán una mayor interacción con el soporte,
por lo que su velocidad será más pequeña y al terminar la cromatografía, se
habrán desplazado muy poco a partir de la línea base.

Por estos factores, es recomendable la elección de un buen eluyente para la

separación de los compuestos que queremos. Para cada experiencia será
distinto el tipo de eluyente que necesitemos, dependiendo de los componentes
a separar, por lo tanto, lo mejor será realizar varias pruebas con distintos tipos
de eluyentes para así considerar el más óptimo para nuestra cromatografía.

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Aplicaciones

La cromatografía de capa fina es un método muy útil, rápido y barato que se

puede utilizar principalmente para:

• Identificación de alguna sustancia conocida en una mezcla por su

comparación con un patrón de la sustancia pura.
• Medir el grado de pureza de una muestra, si existen varias manchas en el
cromatograma, es señal de que existen varios componentes en la muestra.
• Obtener una medida semicuantitativa de algún componente. Pichando la
misma cantidad en la placa cromatográfica, cuanto mayor sea la mancha
obtenida en el cromatograma, la concentración de esa sustancia será mayor.

3.3 Interpretación: factor de retención R f

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Una vez que la placa ha sido revelada nos encontramos con una serie de manchas
circulares. Si la separación ha sido buena cada una de ellas se corresponderá a un
único compuesto de la mezcla inicial.

Es importante tener en cuenta que un mismo compuesto corre siempre de la misma

forma en cromatogramas realizados en las mismas condiciones (mismo soporte y
mismo eluyente). Para describir las propiedades cromatográficas de cada compuesto
se define el factor de retención Rf.

El factor Rf es el cociente de la distancia recorrida por el compuesto (dc) entre la

distancia recorrida por el eluyente (de). Obviamente el Rf toma valores entre 0.0 y
1.0. Siempre ha de indicarse el eluyente y el soporte en el que se ha determinado.

dc
Rf 
de

3.4 FACTORES QUE INFLUYEN EN LA SEPARACIÓN POR CROMATOGRAFÍA:

Polaridad

La mayor o menor velocidad de desplazamiento a lo largo de la columna depende

directamente de la estructura de cada molécula así como de los grupos funcionales
que pueda poseer. El motivo principal es su diferente polaridad. Moléculas más
polares quedan más retenidas en la fase estacionaria, es decir "corren menos",
mientras que las moléculas menos polares se ven menos retenidas y avanzan a
mayor velocidad arrastradas por eluyente.

Elección del eluyente

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La polaridad de la mezcla de disolventes - eluyente - utilizado es clave para obtener

una buena separación.

Eluyentes más polares arrastran más fácilmente a los compuestos, es decir los
compuestos "corren más" en eluyentes más polares. Por el contrario, mezclas de
disolventes con poca polaridad desplazan los compuestos a través de la columna con
mayor lentitud.

La polaridad relativa de los disolventes más usuales se encuentra relacionada en una

tabla denominada "serie eluotrópica" (polaridad creciente de izquierda a derecha):
hexano, ciclohexano, tolueno, éter, cloroformo, diclorometano, THF, acetato de etilo,
acetona, etanol, metanol, agua.

De nuevo, es importante recordar que en la elección adecuada de la mezcla de

disolventes radica el éxito de la separación en la cromatografía de revelado.

Las placas de cromatografía comerciales portan un agente fluorescente inorgánico

en la fase estacionaria. Ello permite visualizar el cromatograma iluminando la placa
con una lámpara de luz ultravioleta UV. Los diferentes compuestos aparecen en la
placa como manchas circulares. Las distintas manchas

Por su simplicidad y rapidez, la cromatografía de capa fina es una herramienta muy

valiosa en el análisis en el laboratorio de química orgánica. Algunas de sus
aplicaciones son:

 La identificación de compuestos conocidos en una mezcla por comparación del

cromatograma de la mezcla con el del compuesto conocido.
 La determinación del final de una reacción química: la desaparición de la mancha
correspondiente al producto de partida indica la conclusión de la reacción.
 Criterio de pureza: la existencia de una o varias manchas en el cromatograma indica
la presencia de uno o varios productos.

3.5 Aparatos y materiales. Generalidades

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- Cubeta cromatográfica (con tapa hermética); la mayoría de las veces se trata

de la cubeta “Normal” (profundidad del espacio para el gas: 3mm)

- Placas de cromatografía: preparadas por uno mismo o ya fabricadas.

- Pipetas de microlitro
- Recipiente de vidrio con pulverizador
- Probeta o matraz Erlenmeyer con tapón (para preparar y mezclar la fase móvil)
- Secador
- Plantilla para TLC o regla
- En caso necesario: lámpara UV para comprobar la fluorescencia o la
disminución de la misma.

Placas cromatográficas y sorbentes

Las placas constan de un soporte liso, inerte (placas de vidrio, laminas de
aluminio o de fibra) sobre las que se dispone el sorbente formando un espesor
lo más homogéneo posible (por lo general 0,25 mm); dependiendo de la
separación a realizar, se tratar· de silicagel, Óxido de aluminio, poliamida,
celulosa, etc.
En tanto que en el HPLC se utilizan principalmente materiales de fase inversa,
en la cromatografía en capa fina predominan los materiales para fase normal,
como por ejemplo el silicagel.
Hay placas de TLC que tienen la denominada zona de concentración (zona de
carga). Se trata de una zona de unos 2 cm de anchura de barro de diatomeas o
de un gel de sílice de tamaño de poro muy grande, de manera que durante el
desarrollo de la placa de TLC en esa zona prácticamente no hay separación
cromatográfica. La ventaja específica es que los componentes cargados se
concentran en una estrecha banda en la línea de partida (línea divisoria entre la
zona de concentración y sorción). Así resulta posible cargar grandes volúmenes
y obtener una buena separación.

Los volúmenes recomendables dependen de la concentración de las

disoluciones. Por lo general, se cargan 1-10 microgramos de sustancia por

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mancha. Si la concentración de la sustancia a analizar fuera de un orden de

magnitud desconocido, la muestra debería cargarse varias veces en volúmenes
crecientes y claramente diferentes.

Los volúmenes mayores se cargan en varias veces, secando entre una y otra
(con aire frío o caliente, aire a presión o con nitrógeno), para evitar que las
manchas se extiendan.

Para realizar determinaciones cuantitativas con placas convencionales, se

cargan volúmenes aproximados de 0.5-1.0 microlitros por mancha. Los
volúmenes mayores de 5.0 microlitros deben evitarse salvo en casos
excepcionales, donde se cargaran en varias veces.

Desarrollo
El eluyente, cuya composición depende de cada problema concreto, se pone en
la cubeta cromatográfica por lo menos 30 minutos antes del principio de la
separación hasta una altura de 0.5 cm. La cubeta se cerrar· con su tapa para
que se sature con los vapores del disolvente y se coloca en un lugar adecuado.

Para que la saturación sea mejor, se recubre la cubeta con papel secante (se
indicar· en el protocolo en el caso que sea necesario).
Para desarrollar la placa, su extremo inferior se introduce en el diluyente y se
vuelve a cerrar la cubeta inmediatamente. Para evitar eluciones, las manchas
cargadas deberán estar completamente por encima del nivel de eluyente.

El eluyente se ve impelido hacia arriba por capilaridad a través del recubrimiento.

El recorrido ser·, dependiendo de la separación, de 5 a 15 cm máximo, y el
tiempo necesario depender· del sorbente, del espesor del mismo y de la
composición del eluyente. El recorrido óptimo es por lo general de 10 cm.

Cálculos

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Tras el desarrollo del cromatograma, se saca la placa de la cubeta y (después

de marcar el frente) se seca cuidadosamente al aire o con un secador. La
posición de las manchas se determina:
-por su color propio
-por su fluorescencia
-por la disminución o amortiguación de la fluorescencia
-por reacción química: la placa una vez seca se rocía parcial o totalmente con un
determinado reactivo, de manera que aparecerán coloraciones características o
una fluorescencia particular.

La identificación de cada una de las manchas se realiza de acuerdo con su color

y denominado valor rf (factor de retención, llamado también factor Rf o hRf (Rf x
100), es decir, el cociente entre el recorrido de la sustancia (ls) y el del eluyente
(lL).

rf = ls (cm)
lL (cm)

Para conseguir la identificación, los colores propios o consecuencia del revelado

y los rf se comparan con los de sustancias de referencia, obtenidos en las
mismas condiciones de desarrollo y tinción (si es posible en el mismo
cromatograma). Como control se realizan adicionalmente los denominados
cromatrogramas mixtos (la disolución problema y la de la sustancia de referencia
se cargan en una misma mancha).

3.6 Cromatografía bidimensional en capa fina

Para mejorar una separación incompleta, se combinan dos pasos de

cromatografía mono dimensional de la manera siguiente:
1º paso: cargar la muestra en una esquina de la placa y desarrollarla en sentido
ascendente.
2º paso: girar 90º la placa desarrollada y seca, de manera que la mezcla ya
separada parcialmente se encuentre en el borde inferior, a continuación se
desarrolla en sentido ascendente con un segundo eluyente.

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Aplicaciones
En la mayoría de los casos la TLC se realiza cuando se quieren hacer
evaluaciones cualitativas rápidas. Las determinaciones cuantitativas son
posibles por acoplamiento del equipamiento necesario (unidades de
carga,scanner); en estos casos, es mejor recurrir a las placas de HPTLC, porque
son más efectivas.

IV. CONCLUSIONES

 En este informe se logró conocer y como aplicar la cromatografía por capa

fina, sus características y los factores que influyen en la separación por
cromatografía

 Se aprendió a como calcular los valores del factor de retención de las

sustancias para poder deducir la relación que existe entre la polaridad de las
sustancias que se analizan con la de los eluyentes que se utilizan con ellas y
así mismo poder aplicar un criterio para identificar la pureza de sustancias de
acuerdo con la pigmentación (es) que estas presenten al realizar la
cromatografía.

V. REFERENCIA BIBLIOGRAFICAS

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LIBROS

Rojo Callejas F., Manual de Química Analítica Instrumental II, Anexo III,
Facultad de Química UNAM, México 2002
Principios de Análisis Instrumental. 5™ ed. (2001). Douglas A. Skoog, F.J.
Holler, T.A. Nieman. Mc Graw-Hill Interamericana.
Análisis Instrumental. (2001). K.A. Rubinson, J.F. Rubinson. Prentice Hall.
Análisis de los Alimentos. (1992). Matissek, Schnepel, Steiner. Ed.
Acribia, S.A.
Composición y Análisis de los Alimentos de Pearson. 2™ ed. (1996). R.S.
Kirk, R. Sawyer, H. Egan.
Química Analítica. 6™ ed. (1997). Skoog, West, Holler. Mc Graw-Hill.

PÁGINAS WEB

 www.dq.fct.unl.pt/qof/hplcts.html
 www.relaq.mx/RLQ/tutoriales/cromatografÌa/hplc.html
 www.merck.com.pe/MPSA%5csite%5cwmsp.nsg/contents/cromatografÍa
 www.hplc.co.uk/homeframe.htm
 www.shu.ac.uk/virtual_campus/courses/241/hplc.htm
 www.dicdoc.ucv.cl/lab_sibyl
 www.lafaw.com
 www.aldbot.com/HPLC-Analysis.htm
 www.richardscientific.com
 http://ull.chemistry.uakron.edu/chemsep/
 http://biologÌa.med.ub.es:8080/curso/curso.html

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