C.

METODOS PARA IDENTIFICAR PLANTAS CARBONO 3 Y CARBONO 4

Introducción:

Al estudiar el intercambio neto de CO2 en plantas superiores pueden diferenciarse tres

tipos básicos de comportamientos. Dos grupos de plantas cuyo incremento diario en materia
orgánica se debe exclusivamente a la fijación diurna de CO2 y un tercer grupo que presenta
una ganancia neta de CO2 diurna y nocturna.

La fotorrespiración es un proceso oxidativo, que ocurre simultáneamente con la

fotosíntesis dependiente de ella y que hace perder hasta un 50 % del CO2 consumido para
fotosíntesis. Es un proceso que depende de la intensidad de luz, lo que indica que se trata de
un sustrato producido durante el metabolismo fotosintético y que además es muy sensible a la
temperatura.

Existen plantas con fotorrespiración (C3) y sin fotorrespiración aparente (C4), que
presentan características propias que permiten su diferenciación, a saber:

Características de las plantas C3 Características de las plantas C4

Estructura foliar con parénquima en Vaina vascular de células parenquimáticas

empalizada, sin vaina. envolviendo los haces vasculares.
Cloroplastos con grana y almidón. Cloroplastos de las células de la vaina sin
grana y presencia de almidón en los mismos.
Primer producto estable de la fijación del Primer producto estable de la fijación del
CO2: fosfoglicerato (PGA) y fosfoglicolato, de CO2: malato y/o aspartato, compuestos de
tres carbonos (C3). cuatro carbonos (C4).
Con fotorrespiración Sin fotorrespiración aparente o nula
Temperatura óptima de crecimiento 25-30 ºC. Temperatura óptima de crecimiento 35-40 ºC.
Punto de compensación del CO2 más de 50 Punto de compensación del CO2 menos de 5
ppm. ppm.
Aumento de la tasa fotosintética de fijación de No aumento de la tasa fotosintética de fijación
CO2 por remoción de O2. de CO2 por remoción de O2

Ejemplos de plantas C3: Triticum spp; Spinacea oleracea (espinaca); Avena sativa (avena);
Beta vulgaris (remolacha); Beta vulgaris var. cycla (acelga); Cucumis sativus (pepino); Dactylis
glomerata (pasto ovillo); Eucaliptus spp (eucalipto); Festuca spp (festuca); Glycine max (soja);
Lycopersicum esculentum (tomate); Medicago sativa (alfalfa); Oryza sativa (arroz); Phalaris
arundinacea (falaris); Phaseolus vulgaris (poroto).

Ejemplos de plantas C4: Cynodon dactylon (gramilla); Chloris gayana (grama rodes); Digitaria
sanguinalis (pasto cuaresma); Echinochola crus-galli (capín); Panicum elephantipes (canutillo);
Panicum milliaceum (mijo); Paspalum dilatatum (pasto miel); Paspalum repens (canutillo);
Saccharum officinarum (caña de azúcar); Salsola kali (cardo ruso); Setaria italica (moha);
Setaria geniculata (cola de zorro).

Ejemplos de plantas CAM: Especies de las familias: Bromeliaceas, Crasulaceas y

Euphorbiaceas, entre las que se destacan Bryophyllum, Crassula, Kalenchoe, Opuntia.

El objetivo de este trabajo práctico es diferenciar plantas C3 y C4, a través de la

anatomía foliar, la relación clorofila a/b y el punto de compensación del CO2.

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 El punto de compensación del CO2 puede ser cualitativamente diferenciado usando un
adecuado indicador de pH que exhibe un cambio de color basado en la concentración del CO2
ambiental. La relación de clorofila "a/b" se determina por la absorvancia de las clorofilas "a y b"
en acetona al 80%. Esta experiencia esboza algunas técnicas simples que pueden emplearse
para identificar plantas C3 y C4. El exámen al microscopio, también ayuda a desarrollar
capacidad para observar los detalles de anatomía foliar, y puede además extenderse a
registrar más detalles de la estructura de la hoja, tales como tamaño de las células del
mesófilo, espesor de la hoja, número de capas de células a través de la hoja, etc.

La técnica de observación del punto de compensación del CO2 es muy simple

pudiendo emplearse rutinariamente en cualquier laboratorio para demostrar visualmente la
clara diferencia que existe entre las plantas C3 y C4 en sus puntos de compensación de CO2
y, por supuesto en el campo.

Técnica operatoria:

C.1- Examen de la anatomía foliar:

Se preparan secciones de hojas de espinaca, avena, Paspalum repens y maíz, tan

delgadas como sea posible. Para ello, lavar y cortar las hojas en trocitos de 1x2 cm
colocándolas en una caja de Petri. Montar un trocito sobre una zanahoria o papa (tipo
micrótomo, como soporte) y tomar varias series de secciones transversales delgadas, con la
ayuda de una hojita de afeitar o bisturí. Hacer un exámen preliminar bajo el microscopio y
elegir la hoja de sección más delgada; montarla sobre un porta objetos en 10% de glicerol y
colocar un cubreobjeto sobre ella. Teñir otra sección delgada con solución de iodo (2% iodo en
15% IK) por aproximadamente 20-30 segundos y montarla en glicerol. Observe al microscopio
los siguientes detalles en la anatomía de la hoja:

a) Presencia o ausencia de células de la vaina del haz vascular.

b) Naturaleza de las células del mesófilo: estructura difusa o radiada.
c) Presencia o no de cloroplastos en las células de la vaina del haz.
d) Orientación de los cloroplastos (si estan presentes) en la vaina del haz.
e) Ubicación del almidón en los cloroplastos del mesófilo y de la vaina del haz.
f) Número de células del mesófilo y distancia entre los haces vasculares adyacentes.

Registre sus observaciones para el informe.

C.2- Determinación de clorofila a y b:

Las clorofilas "a y b" se extraen con acetona. En acetona al 80%, la clorofila "a" tiene
un pico de absorción de aproximadamente 665 nm y la clorofila "b" de 649 nm, la absorción
puede medirse en un espectrofotómetro y las cantidades actuales pueden calcularse con
ayuda de una fórmula desarrollada por Vernon.

Lavar las hojas y secarlas con papel secante; picar o moler 250 mgr de hojas con una
pizca de arena y CO3Ca en un mortero pequeño usando acetona al 80%. Homogeinizar a 25
ml y filtre. Leer la absorvancia de la solución clara a 649 nm clorofila b; y 665 nm clorofila a.

Cálculos: la absorbancia de la solución a 649 y 665 nm puede usarse para calcular la

concentración de clorofila a y b, de acuerdo a:

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 Clorofila a = (11,63 x absorbancia 665) - (2,39 x absorbancia 649) (ug/ml)
Clorofila b = (20,11 x absorbancia 649) - (5,18 x absorbancia 665) (ug/ml)
Clorofila a = (11,63 x A.665 - 2,39 x A.649) x 25 x 1000 (ug/g peso fresco)
250
Clorofila b = (20,11 x A.649 - 5,18 x A.665) x 25 x 1000 (ug/g peso fresco)
250

Donde:
25 = volumen total de solución de clorofila
1000 = mg a g de peso fresco
250 = peso en mg de muestra de hoja

Calcule el total de clorofila (a + b) y la relación clorofila a/clorofila b.

C.3- Demostración del punto de compensación de CO2:

Si en un recipiente se coloca una solución con bicarbonato, se establece entre ésta y el

aire circundante, un equilibrio donde el CO2 del aire en la atmósfera, está en equilibrio con el
CO2 disuelto como se presenta en el siguiente esquema:

Aire CO2
========================!=="=====================
Solución de bicarbonato H2O + CO2 Ö H2CO3 Ö HCO3 + H
H + OH Ö H2O

Cuando el contenido de CO2 del aire ha descendido, por fotosíntesis de las plantas, el
contenido de ácido carbónico del agua en equilibrio con el aire, ha disminuido mucho más,
aumentando así el pH. El descenso relativo en la [CO2] será proporcional al aumento relativo
en el pH del agua.

Si el CO2 del aire es muy bajo, un aumento en el pH en este sentido, puede visualizarse
con el uso de un adecuado indicador de pH, tal como el rojo cresol. Cuando el punto de
compensación del CO2 es muy bajo, como en el caso de las plantas C4, el color final del
indicador, se espera que sea rojo purpúreo o púrpura, indicando un pH alto. Si el punto de
compensación es más alto como en el caso de las plantas C3, el color será amarillo.

Cortar tallitos de distintas plantas bajo el agua; montarlos con las zonas de corte
colocadas en pequeños recipientes (capacidad 5-10 ml). Bajar el mismo con cuidado y la
ayuda de una hebra de alambre fino, dentro de un erlenmeyer de 500 ml conteniendo 10 ml de
solución de bicarbonato al 0,1 mM, 100 mM HCO3 (0,0084 g = 0,1 mM) con 3 a 5 gotas de
indicador rojo cresol. Cerrar el erlenmeyer herméticamente con una gruesa capa de polietileno.
Iluminar aproximadamente 1 hora y observar el color del indicador en el erlenmeyer.

Dispositivo experimental

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Repetir el experimento con diferentes materiales de plantas.

Registrar las observaciones y elaborar el correspondiente informe.

Lecturas complementarias:

- Barceló Coll et al. 1987. "Fisiología Vegetal". Cap.XV, p.317-333. Ed. Pirámide; 823 p.

- Deregibus, A. y A. Kropfl. 1982. "La cosecha de la Luz solar mediante el sistema

fotosintético C4". Gaceta Agronómica. 2(7) 407- 416. Bs. As.

- Kluge. M. Crassulacean acid metabolism (CAM): CO2 and water economy Serie de
traducciones Nº 1. Cátedra de Fisiología Vegetal.

- Medina, E.; T. De Bifano y M. Delgado. 1976. "Diferenciación fotosintética en plantas

superiores". Interciencia 1(2), pp 96-103.

-Guía de Trabajos Prácticos. "International Training Course in photosynthesis". 1979. CEFOBI,

Rosario. 18p.

-Guía de trabajos prácticos de fisiología vegetal. 1992. Facultad de Ciencias Agropecuarias,

UNER , 41 p.

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