Cultura intensivă a speciilor de cereale ca şi folosirea în ameliorare şi selecţie a unor

metode convenţionale bazate în principal pe hibridarea intraspecifică a sărăcit îngrijorator

potenţialul genetic de variabilitate utilă, impunând găsirea unor noi resurse de gene valoroase
în lupta continuă cu factorii de stres abiotici şi biotici din ce în ce mai agresivi (Börner și
colab., 2015).
Folosirea biodiversităţii naturale pentru obţinerea de noi genotipuri de plante de cultură a
devenit în ultimii ani un domeniu prioritar al cercetărilor de genetică şi de ameliorare.
Speciile sălbatice înrudite cu grâul s-au dovedit a fi surse valoroase de gene pentru
importante trăsături. Una dintre aceste specii este Aegilops tauschii (DD) considerat și
genitorul genomului D de la grâul comun. Genele de la nivelul diferitelor biotipuri de Ae.
tauschii sunt transferate la grâu prin obținerea hexa-amfiploizilor sintetici (Triticum durum x
Ae. tauschii) și backcross cu soiuri de grâu adaptate, rezultând linii sintetice (Giura A., 2010).
Studiile efectuate de mai multe echipe de cercetători au demonstrat implicarea cromozomului
5D în duritatea bobului, în modul de formare a endospermului (Moriss C. și Beecher B.,
2012), în masa a o mie boabe (MMB) (Wang și colab. 2015). Astfel, această echipă
demonstrează că regiunea markerilor SSR cfd67, cfd40 și cfd78 este asociată cu masa a o mie
boabe. Având în vedere aceste rezultate dar și caracterizarea amfiploizilor sintetici A2, A3 și
A4 ca având MMB mare, 53,1g, 49,9g, respectiv 51,1g (Giura A., 2010), am inițiat studiul
variabilității genetice utilizând markeri SSR dar și markeri ISSR.

4.1. Diversitatea genetică la nivelul locusului Xcfd40-5D.

Analiza moleculară efectuată cu markerul SSR - cfd40, cu localizare pe cromozomul
5D, a generat polimorfism pentru materialul studiat (fig. 4.1). Din această figură se observă că
cei patru amfiploizi luați în studiu se diferențiază clar de celelalte soiuri de grâu analizate.
Totodată, se remarcă amfiploidul A4, al cărui profil electroforetic prezintă trei benzi foarte
clare, acest lucru sugerează fie o multiplă localizare pe același cromozom fie pe cromozomi
diferiți. Prin urmare se poate spune că s-a obținut o nouă variabilitate genetică la nivelul
cromozomului 5D pentru cei patru amfiploizi sintetici.
Pentru o mai bună evidențiere a polimorfismului de la nivelul celor patru amfiploizi este
necesar o electroforeză pe verticală în gel de poliacrilamidă. De asemenea, pentru a asocia
acest polimorfism cu caracterul MMB mare trebuie să se studieze polimorfismul de la nivelul
unor descendențe ale acestor amfiploizi.
 Fig.4.1. Profilul electroforetic obținut cu markerul SSR-CFD40.M-ladder ADN 50pb (GeneDirex).

1. CS, 2. Faur, 3.A1, 4.A2, 5.A3, 6. A4, 7. Glosa, 8. Miranda, 9. Ursita.

4.2.Variabilitatea genetică la nivelul a patru amfiploizi sinteti utilizând markeri ISSR

Primerii ISSR folosiți în acest studiu au fost alcătuiți din repetiții di-, tri- și penta-
nucleotide. Rezultatele analizelor sunt prezentate în figurile 4.2, 4.3……4.8. și în tabelul nr.
1. Dintre cei zece primeri ISSR utilizați, UBC811 a generat cel mai mare număr de benzi (11)
dar nu s-a evidențiat polimorfism special la nivelul amfiploizilor sintetici luați în studiu, în
schimb s-a observat polimorfism la nivelul soiurilor de grâu analizate (fig. 4.2, săgeata roșie).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Fig. 4.2. Profilul electroforetic obținut cu markerul ISSR-UBC811.

1. Glosa, 2. Miranda, 3. Ursita, 4. Pitar, 5. Fundulea 29, 6. A1, 7. A2, 8. A3, 9. A4, 10. Nu ADN
Utilizarea markerului UBC818 a evidențiat un produs distinct (polimorfism) la nivelul
amfiploidului sintetic A4 (fig.4.3, săgeata verde).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Fig. 4.3 Profilul electroforetic obținut cu markerul ISSR-UBC818.

1. Glosa, 2. Miranda, 3. Ursita, 4. Pitar, 5. Fundulea 29, 6. A1, 7. A2, 8. A3, 9. A4, 10. Nu ADN

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Fig. 4.4. Profilul electroforetic obținut cu markerul ISSR-UBC842.

1. Glosa, 2. Miranda, 3. Ursita, 4. Pitar, 5. Fundulea 29, 6. A1, 7. A2, 8. A3, 9. A4.

Dar cel mai clar și distinct polimorfism la nivelul amfiploizilor sintetici s-a obținut cu
UBC844 (fig. 4.5, săgeata verde). Astfel, pentru amfiploidul sintetic A4 s-a observat doi
produși polimorfici (unul absent și un produs distinct prezent atât în A4 cât și în amfiploidul
A2).
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Fig. 4.5. Profilul electroforetic obținut cu markerul ISSR-UBC844.

1. Glosa, 2. Miranda, 3. Ursita, 4. Pitar, 5. Fundulea 29, 6. A1, 7. A2, 8. A3, 9. A4. 10. Nu ADN

Dintre toți markeii ISSR testați cel mai mic număr de benzi a fost observat în cazul
markerului UBC850 (fig.4.6).

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Fig. 4.6. Profilul electroforetic obținut cu markerul ISSR-UBC850.

1. Glosa, 2. Miranda, 3. Ursita, 4. Pitar, 5. Fundulea 29, 6. A1, 7. A2, 8. A3, 9. A4.
 Utilizarea primerului UBC866 format din șase repetiții tri-nucleotidice (CTC) a
evidențiat polimorfism distinct la nivelul amfiploizilor sintetici A1 și A3 (fig. 4.7, săgeata
verde). Deoarece profilul electroforetic nu este foarte clar se recomandă optimizarea
protocolului de amplificare ADN.

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Fig. 4.7. Profilul electroforetic obținut cu markerul ISSR-UBC866.

1. Glosa, 2. Miranda, 3. Ursita, 4. Pitar, 5. Fundulea 29, 6. A1, 7. A2, 8. A3, 9. A4.

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Fig. 4.8. Profilul electroforetic obținut cu markerul ISSR-UBC881.

1. Glosa, 2. Miranda, 3. Ursita, 4. Pitar, 5. Fundulea 29, 6. A1, 7. A2, 8. A3, 9. A4.

Markerul UBC881 a evidențiat polimorfism atât la nivelul soiurilor de grâu (fig. 4.8, săgeata
roșie) cât și la nivelul amfiploidului sintetic A4 (fig. 4.8, săgeata verde).

Totuși din cei 10 markeri testați, UBC833 a fost singurul care nu a dat amplificare.
Pentru confirmarea acestor rezultate se vor repeta acele reacții PCR care au generat
polimorfism. Iar după confirmarea polimorfismului se va trece la asocierea polimorfismului
cu caracterele de interes cât și localizarea acestui polimorfism prin analize cu nuli-tetrasomi
pentru cromozomul 5D.

Tabel 4.1. Sinteza rezultatelor obținute cu markerii ISSR

Nr. crt. Marker ISSR Secvența primerului T °C Polimorfism la

Ann. nivelul
amfiploizilor
1 UBC811 (GA)8 C 52
2 UBC818 (CA)8 G 52 *
3 UBC833 (AT)8 YG 52 Nu amplificare
4 UBC842 (CT)8 YG 52
5 UBC844 (CT8) RC 52 ***
6 UBC845 (CT)8 RG 52
7 UBC850 (GT)8 YC 52 *
8 UBC866 (CTC)6 55 *
9 UBC879 CTT CAC TTC ACT TCA 50
10 UBC881 GGG TGGB GGT GGG 55
GTG
R=A/T, Y = G/C, B=T/G/C. *- polimorfism scăzut, *** polimorfism ridicat
 Concluzii

- Markerul SSR-cfd40 cu localizare pe cromozomul 5D a generat polimorfism la nivelul

amfiploizilor sintetici;
- Polimorfism clar și distinct la nivelul amfiploizilor sintetici s-a obținut utilizând
UBC844.

Giura Aurel. (2010). Development of new genetic stocks for alien introgressions in wheat.
JOURNAL of Horticulture, Forestry and Biotechnology. Vol. 14(1), pag. 325-331.
Morris, C.F. & Beecher, B.S. (2012). The distal portion of the short arm of wheat (Triticum
aestivum L.) chromosome 5D controls endosperm vitreosity and grain hardness. Theor Appl
Genet (2012) 125: 247. doi:10.1007/s00122-012-1830-x
Wang Y, Hao C, Zheng J, Ge H, Zhou Y, Ma Z, Zhang X (2015). A haplotype block
associated with thousand-kernel weight onchromosome 5DS in common wheat (Triticum
aestivum L.). J Integr Plant Biol 57: 662–672. doi: 10.1111/jipb.12294.
Börner A., Ogbonnaya F.C., Röder M., Rasheed A., Periyannan S., Lagudah E. 2015. Alien
Introgression in Wheat. Aegilops tauschii Introgressions in Wheat. pp 245-271. ISBN • 978-
3-319-23493-9, Springer International Publishing.

Obiectiv
Evidențierea polimorfismului ADN la nivelul unor amfiploizi sintetici utilizând markeri
moleculari ISSR și SSR.