AMILASAS (Hidrolasas)

INTRODUCCIÓN

De acuerdo a Dixon y Webb, se puede decir que una enzima es “una

proteína dotada de actividad catalítica debida a su capacidad de
activación específica”. Actúan como catalizadores de reacciones
químicas especificas en los seres vivos o sistemas biológicos. Se
clasifican de acuerdo a su especificidad, las cuales se organizan en 6
grupos: 1. Oxidorreductasas; 2. Transferasas; 3. Hidrolasas; 4. Liasas;
5. Isomerasas; y 6. Ligasas. [1]

Las amilasas son enzimas que se clasifican en las hidrolasas, las cuales
tienen la función de hidrolisis en los sustratos que intervienen,
presentan la siguiente reacción:

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Dentro del grupo de las hidrolasas se tienen subdivisiones como 3.1.
hidrolizan enlaces éster, 3.2. glicosidasas, 3.3. péptido hidrolasas, 3.6
hidrolizan acil-anhidridos, entre otras; las amilasas pertenecen a las
glucosidadasas las cuales tienen acción en los enlaces de los
glucósidos, son importantes en la industria del almidón, de la celulosa
y otros productos naturales. Se clasifican en tres subgrupos: 3.2.1,
rompen O-glucósidos; 3.2.2 rompen N glucósidos; 3.2.3, rompen S-
glucósidos. El mecanismo de acción de todas ellas es similar,
presentando dos residuos de aminoácidos di carboxílicos (aspártico o
glutámico) en el centro activo. [1].
Las amilasas tienen gran importancia en el desarrollo biotecnológico,
en la producción de jarabes con contenido de maltosa y glucosa. En los
últimos años se está realizando la degradación enzimática del almidón
por acción de la amilasa reemplazando el proceso del a catálisis ácida.
Muchos productos son elaborados a través de procesos enzimáticos por
medio de α-amilasa, β-amilasa, como son los jarabes y la dextrosa.
Estas enzimas actúan sobre el almidón hidrolizando enlaces
glucosídicos α-(1,4) y/o α-(1,6) [4]
ALMIDON COMO SUSTRATO
El almidón es un polisacárido que se encuentra en vegetales y raíces,
en semillas de cereales y tubérculos como la papa y la yuca. El almidón
tiene estructura granular debido a las fuerzas de atracción entre largas
cadenas carbohidratos, se forma una malla molecular y evita que se
disuelva en agua fría. Los polímeros más cortos se disuelven cuan el
agua llega a 60°C y a temperaturas más altas se gelatinizan y pierde su
poder de birrefringencia, se desintegra y forma aun pasta de acuerdo la
origen y concentración del almidón. [4]
Los rompimientos de la estructura del almidón por acción de agua a
alta temperatura tienen tres etapas en las cuales la primera se refiere a
la absorción de agua, ligero hinchamiento de los gránulos, y no
aumenta la viscosidad retiene la birrefringencia; para la segunda etapa
se incrementa la viscosidad de la suspensión, los gránulos se alteran,
pierde estructura y la birrefringencia y por último en la tercera etapa
los gránulos se tornan en sacos deformados [4]
PRODUCCION DE AMILASAS
Para la obtención de las α-amilasas se puede realizar por medio
microbiano a través de hongos y bacterias, que tiene ventajas: fácil
disponibilidad, volumen de producción, estabilidad de operación,
modificación y optimización del proceso. Las α-amilasas bacterianas
del género Bacillus como B. subtilis, B. stearothermophilus, B.
licheniformis y B. amyloliquefaciens, han encontrado una extensa
aplicación en diversos procesos industriales debido a sus amplios
rangos de operación de temperatura (25-90°C), resistencia a pH
extremos (1.0-11.5) y altos niveles de expresión (Montor, Olvera
Caranza , & Reyes Duarte, 2014)
La producción de la α-amilasas se realiza por medio de fermentación
sumergida (SmF) y fermentación en estado sólido (SSF) se ha
investigado y depende de una variedad de factores fisicoquímicos. SmF
se ha utilizado tradicionalmente para la producción de enzimas de
importancia industrial debido a la facilidad de control de diferentes
parámetros como el pH, la temperatura, la aireación y la transferencia
de oxígeno y la humedad. [8]

Para los sistemas de SSF poseen muchas ventajas en las cuales tiene
una similitud al hábitat natural de los microorganismos por lo tanto se
producen mejores productos. Para el SmF se puede decir que no cumpa
con a las especificaciones sobre todo para los hongos. Para
microorganismos como los hongos es aconsejable usar SSF y las
bacterias no son muy recomendables, sin embargo, estudios realizados
se han obtenido buenos resultados.
En comparación entre SSF y SmF, el primero tiene una productividad
superior, su técnica es más sencilla de aplicar, menos costo, menor
consumo de energía, menor producción de agua, mejor recuperación
de producto, para la producción de las enzimas se ha encontrado que
el metido mejor es el SSF. [8]
La α-amilasa se puede obtener por medio de Aspergillus oryzae, las
enzimas que se obtienen por medio microbiano tienen ventajas en
ahorro de tiempo de generación, requerimiento de espacio menor, se
caracterizan por la actividad particular de la enzima deseada, por el
efecto del pH, temperatura, tiempo de reacción, concentraciones de la
enzima del sustrato y el efecto de los inhibidores o activadores , que
pueden presentarse en las aplicaciones industriales: por medio de la
fermentación del hongo. [2]
La amilasa (E.C. 3.2.1.1) de Bacillus amyloliquefaciens JJC33M
(AmiJ33) fue producida por fermentación sumergida. Se probó el
efecto de peptona, extracto de levadura, Ca+2 y glicina en la producción
de AmiJ33. El extracto de levadura y Ca+2 tuvieron un efecto positivo
sobre la síntesis de AmiJ33. La enzima fue recuperada mediante
precipitación a saturación al 60% con (NH4)2SO4. El peso molecular
aproximado de la enzima purificada fue de 50 kDa. Así mismo, se
evaluó el efecto del pH y la temperatura sobre la actividad enzimática,
concluyendo que los valores más altos de actividad se observaron a pH
6.0 y 80°C, respectivamente. En condiciones ligeramente ácidas (pH
4.0 y 5.0), AmiJ33 mantuvo el 72% de su actividad. AmiJ33 fue estable
por 3 h a 40°C, y por 30 min a 45 y 50°C, conservando el 88 y 82% de
actividad residual. A 60°C, la actividad disminuyó 40%. La actividad
de AmiJ33 se incrementó 50.27% con β-mercaptoetanol, no fue
inhibida por EDTA y se inhibió totalmente con SDS. [3]
Las a-amilasas producidas por diferentes especies de Bacillus varían
no solo en sus tipos sacarificante y en el rango de pH y temperatura
para su actividad óptima. La fuente bacteriana de la enzima suele ser
Bacillus amyloliquefaciens o Bacillus licheniformis, siendo esta última
de mayor importancia industrial.
Para la producción de las α-amilasas El medio de cultivo utilizado en
este trabajo para la producción de a-amilasa contenía (g / L):
NaH2PO4.2H2O-1.56, NH4Cl-5.35, KCl-0.745, Na2SO4.10H2O-
0.644, Ácido cítrico-0.42, MgCl2.6H2O-0.25, CaCl2-2.2x10-3, ZnO-
2.5x10-3, FeCl3.6H2O-2.7x10-2, MnCl2.4H2O-1.0x10-2,
CuCl2.2H2O-8.5x10-4, CoCl2.6H2O-2.4x10-3, NiCl3.6H2O-2.5x10-
4, H3BO3-3.0x10-4, Na2MoO4-1.0x10-3, Bacto-triptona-10.0,
Extracto de levadura-2.5 y Almidón soluble-5. El pH se ajustó a 6,9-
7,0 con NaOH 1,0 M y este medio basal se esterilizó mediante
autoclave a 121ºC durante 15 minutos. El extracto de levadura, bacto-
triptona y almidón soluble se esterilizaron por separado y se añadieron
asépticamente a los matraces que contenían el medio líquido, después
de enfriar. El medio anterior (50 ml en matraces Erlenmeyer de 250
ml) se inoculó con 1 ml de un cultivo de una noche y se incubó a 55ºC
con aireación vigorosa en un agitador rotatorio a 150 rpm durante 144
h. A intervalos de tiempo, la turbidez de los cultivos se determinó
midiendo la densidad óptica a 470 nm en un espectrofotómetro Hitachi
Modelo U-2000. Antes del ensayo, las células se separaron por
centrifugación a 13,000 rpm durante 15 min y el sobrenadante
transparente se usó como preparación enzimática bruta. [6]
De acuerdo al estudio realizado el pH optimo 7.5. La actividad de la
enzima a pH 5,5 y 10,0 fue del 73% y 55% de la de pH 7,5,
respectivamente. Después de incubar la solución de enzima bruta
durante 24 h a pH 5,0 - 10, se observó una disminución de
aproximadamente 5% de su actividad original a pH 7,5. A pH 10.0, la
disminución fue del 44%. Así, la -amilasa de Bacillus sp. la cepa
SMIA-2 parece ser activa en un rango de pH muy amplio. [6]
Otro estudio realizado se hizo la extracción de la enzima termoestable
por medio de la bacteria Geobacillus (K1C) , se aisló de las aguas
termales de Manikaran, India. La temperatura y el pH óptimos para la
actividad de la α-amilasa fueron 80ºC y pH 6,0. La actividad de amilasa
de la enzima purificada fue independiente de Ca2 +, mientras que la
inhibición completa de la actividad se observó en presencia de Cu 2 +,
Pb2 + y Hg2 +. La α-amilasa purificada era estable en presencia de
detergentes, disolventes orgánicos y Proteinasa K. Además, exhibía la
capacidad de hidrolizar almidones crudos (por ejemplo, arroz, trigo,
maíz, patata) de manera eficaz; por lo tanto, esta enzima tiene el
potencial de ser utilizada para aplicaciones industriales. [7]
DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA Y
CUANTIFICACION DE PROTEINAS
Para medir la actividad a-amilasa se utilizó el método de Nelson-
Somogyi (Determinación de azúcares reductores). La mezcla de
reacción contiene 1 mL de solución de almidón soluble al 1% (p/v),
200 mL de una dilución apropiada de la muestra que contiene la
enzima, y 800 mL de CaCl2 5mM. Luego de 20 min de reacción a 37
°C, se adicionan 500 mL del reactivo de Somogyi y se lleva la mezcla
a un baño María a temperatura de ebullición. Pasados 10 min, se retira
la mezcla del baño y se adicionan 500 m L del reactivo de Nelson, se
completa el volumen a 10 mL con agua destilada y se realiza la
determinación colorimétrica a 500nm. Una unidad de actividad
enzimática se define como la cantidad de enzima que libera 1mg de
glucosa por minuto bajo las condiciones del ensayo, 37 °C, pH 6,0. La
actividad específica se define como las unidades de actividad por
miligramo de proteína.
La concentración de proteínas fue determinada por el método
colorimétrico de Bradford, empleando albúmina sérica bovina como
proteína patrón. [9]
PURIFICACION DE LA ENZIMA
El extracto crudo fue sometido a precipitación fraccionada con sulfato
de amonio. La fracción con la proteína de interés precipitó entre 50 y
80% de saturación. Este precipitado se disolvió en el mínimo volumen
de agua destilada, se dializó 24 h contra agua destilada y se liofilizó.
Se disuelve en un buffer fosfato 50 mM, pH 6,0, y se aplicó a una
columna de un cromatógrafo de intercambio aniónico, la elusión se
realizó por medio de un gradiente discontinuo de fuerza iónica (NaCl
0,1 a 0,5 M). A cada fracción (5 ml) se le midió la absorbancia a 280
nm y la actividad enzimática. Las fracciones que contenían la proteína
de interés, se mezclaron en un pool (pool DEAE-pico II), que se dializó
con agua destilada y se liofilizó. El pool DEAE-pico II se disolvió en
NaCl al 1% y fue sometido a cromatografía de filtración por gel sobre
Sephadex G-75 (2,5 X 30,0 cm). La elusión de las proteínas se realizó
con NaCl al 1%. La velocidad de flujo fue de 27 mL/h. A cada fracción
(4,5 mL) se le midió la absorbancia a 280 nm y la actividad enzimática.
Las fracciones que mostraron mayor actividad enzimática, se
mezclaron en un pool (pool G-75-pico II) que se dializó contra agua
destilada y se concentró por liofilización.[9]
El pool G-75-pico II se disolvió en buffer fosfato 0,05M, pH 7,0 y fue
sometido a cromatografía de intercambio catiónico sobre CM
Sephadex C-50 (2,5 x 30,0 cm). La elusión se realizó por medio de un
gradiente discontinuo de fuerza iónica (NaCl 0,1 a 0,5 M). La velocidad
de flujo fue de 27 mL/h. A cada fracción (4,5 mL) se le midió la
absorbancia a 280 nm y la actividad enzimática. Las fracciones que
contenían la proteína de interés, se mezclaron en un pool (pool CM-
pico I) que se dializó contra agua destilada y se liofilizó. [9]
CARACTERIZACION DE LA ENZIMA
Se corrieron electroforesis con geles de poliacrilamida al 12%, los
cuales se tiñeron con azul de Coomassie. Los marcadores de peso
molecular empleados fueron de la marca Bio-Rad, con las siguientes
proteínas como estándares: fosforilasa B (104 kDa), albúmina de suero
bovino (83 kDa), ovoalbúmina (49 kDa), anhidrasa carbónica (37
kDa), inhibidor de la tripsina de soya (29 kDa) y lisozima (20 kDa). [9]
EFECTO DE LA TEMPERATURA
La temperatura a la cual se alcanza la máxima actividad y, por tanto,
corresponde a la temperatura óptima de reacción, es 70°C. Cuando se
sobrepasa este valor, la actividad disminuye rápidamente porque la
enzima se va desnaturalizando. [9]
EFECTO DEL INHIBIDOR
El análisis cinético (gráficos de Lineweaver-Burk y Dixon) indicó que
los diferentes inhibidores exhiben diferentes patrones de inhibición, ya
que el EDTA mostró una inhibición competitiva (11). Para investigar
el efecto de los inhibidores sobre la actividad enzimática, se preparó
ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) a una concentración de 1 mg
/ ml y se añadió en diferentes concentraciones (0,538 mM, 1,07 mM,
1,61 mM, 2,15 mM y 2,69 mM) al Ensayar la mezcla y medir la
actividad de amilasa, se observa que al incremento de la concentración
del inhibidor la actividad de la enzima decrece. [10]
EFECTO DEL pH
Las amilasas producidas por diferentes bacilos pueden tener
diferente perfil de pH, estudio realizados sobre diferentes
buffers, el ensayo enzimático determinación de azucares (DNS),
muestran un pH máximo de 7 y un aumento adicional de pH de
muestra una disminución de la actividad enzimática. [10]
Figura 2. Actividad enzimática vs pH [10]
En la industria del almidón este tipo de enzimas son utilizadas no
solamente para su hidrólisis sino como modificación de materia prima
con el fin de obtener glucosa, maltosa y oligosacáridos, que pueden ser
convertidos en jarabes de fructosa y dextrosa. La glucosa obtenida,
también puede ser fermentada para producir etanol, aminoácidos y
ácidos orgánicos. Para este tipo de procesos es necesario utilizar
enzimas termoestables, ya que son adicionadas después de la
gelatinización que requieres temperaturas entre 70 °C y 110 °C, su
objetivo es reducir la viscosidad de la solución mediante la hidrólisis
parcial del almidón. También pueden ser utilizadas como una
alternativa a la adición de malta en la industria cervecera, en el
mejoramiento de harinas en la industria panadera, la producción de
almidones para la industria del papel, la remoción del almidón en la
fabricación de textiles y como aditivos en detergentes. [11]
Las α-amilasas bacterianas, y pertenecientes a Bacillus como B.
subtilis, B. stearothermophilus, B. licheniformis y B.
amyloliquefaciens, tiene una gran aplicación en procesos debido a la
resistencia a altas temperaturas de 25 a 90°C y tolerancia a pH de 1 a
11,5. En especial la cepa nativa Bacillus sp. BMM1 productoras de este
tipo de enzimas termoestables. En el estudio realizado en la
Universidad de Medellín aislaron el microrganismo del suelo, su
caracterización molecular se realizó mediante la secuenciación del gen
ribosomal 16S, la aplicación de este gen se llevó mediante PCR con los
cebadores pA (5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’) y pC5B
(5’TACCTTGTTACGACTT 3’). [11]
Los microorganismos industriales pueden ser aislados de la naturaleza
o comprados como líneas puras, genéticamente estables y aptas para el
cultivo en gran escala, en Bancos y Colecciones de cultivos. Las
fuentes más importantes son los suelos, los lodos. El método clásico
involucra la selección de microorganismos en diversos medios de
enriquecimiento selectivos, con el objetivo de encontrar líneas
productoras de enzimas, metabolitos diversos, antibióticos, etc. [12]
CONCLUSIONES
Las amilasas son las enzimas utilizadas en la industria de las bebidas,
son capaces de hidrolizar moléculas complejas como el almidón hasta
unas más sencillas que son capaces por medio de la fermentación
producir alcohol.
En la actividad enzimática los factores más importantes son la
temperatura y el pH, cada vez se está en busca de organismos capaces
de producirlas con la resistencia a estos dos factores, por tal razón se
pueden llamar termoestables.
Hay na gran variedad de bacterias en especial Bacillus, aunque de los
hongos (especies fúngicas) también se puede producir de las cuales se
pueden producir las amilasas, los cuales pueden aislados de diferentes
sitios del medio ambiente.
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