ENSAYO DE FOLIN (basado en Kosar et al.

, Food Chemistry 91 (2005) 525-533)

Materiales:
- Reactivo Folin-Ciocalteau (Merk, ref. 1.09001.0500, 500 mL) #17
- Ácido gálico (Sigma, ref. G7384-100G) #10
- Carbonato de sodio (Sigma, ref. S7795, 500 g) #8

Preparación de disoluciones stock:

- Solución de carbonato de sodio 20% (m/v): disolver 20 g de carbonato sódico en 100 mL de
agua. No se disuelve bien, utilizar un poco de calor y agitación (ultrasonido) para disolver y
luego dejar enfriar.
La solución debe ser preparada con 24 h de anticipación al experimento y debe ser
almacenada en refrigeración en frasco ámbar hasta 1 semana.
Se requieren 450 µL por muestra y 3150 µL para curva estándar. Si fuera necesario un
volumen mayor o menor recalcular según la siguiente ecuación:
𝑚 20
𝐶 = ∴𝑚 =𝐶∗𝑉 ∴𝑚 = ∗ 250 𝑚𝐿 ∴ 𝒎 = 𝟓𝟎 𝒈
𝑉 100

- Solución de ácido gálico (2 mg/mL): Pesar 10 mg de GA (0.0100g) y disolver en 5 mL de agua

en un matraz aforado. Por cada curva estándar se requiere 2 ml. Si fuera necesario un
volumen mayor o menor recalcular según la siguiente ecuación:

𝑚 𝑚𝑔 1𝑔
𝐶= ∴𝑚 =𝐶∗𝑉 ∴𝑚 =2 ∗ 100 𝑚𝐿 ∗ [ 3 ] ∴ 𝒎 = 𝟎, 𝟐 𝒈
𝑉 𝑚𝐿 10 𝑚𝑔

Curva de calibración (disoluciones estándar de ácido gálico):

- Disoluciones de ácido gálico: Se prepara una curva de calibración en el rango 0.031-2 mg/mL
GA mediante diluciones a la mitad de las disoluciones estándar de ácido gálico:

Colocar en un eppendorf de 1.5ml, 1ml de la solución estándar de ácido gálico, en el siguiente

500 µL del anterior + 500 µL agua, así sucesivamente hasta conseguir las diluciones.

Disolución estándar Volumen de agua Volumen disolución a diluir

D1: 2 mg/mL GA - Disolución Stock
D2: 1 mg/mL GA 500 µL agua + 500 µL estándar 2 mg/mL GA
D3: 0.5 mg/mL GA 500 µL agua + 500 µL estándar 1 mg/mL GA
D4: 0.25 mg/mL GA 500 µL agua + 500 µL estándar 0.5 mg/mL GA
D5: 0.125 mg/mL GA 500 µL agua + 500 µL estándar 0.25 mg/mL GA
D6: 0.0625 mg/mL GA 500 µL agua + 500 µL estándar 0.125 mg/mL GA
D7: 0.031 mg/mL GA 500 µL agua + 500 µL estándar 0.0625 mg/mL GA

Procedimiento miniaturizado a 1 mL de reacción:

1. En tubos Eppendorf de 1.5 mL, añadir 600 µL de agua.
2. Adicionar 10 µL de disolución de ácido gálico.
3. Adicionar 50 µL de reactivo de Folin.
4. Agitar el eppendorf en un vortex y dejar en reposo 1 min.
5. Adicionar 150 µL de solución de 20% carbonato de sodio.
6. Adicionar 190 µL de agua para completar el volumen de 1 mL.
7. Incubar durante 2 h a temperatura ambiente y oscuridad (gradilla cubierta con papel de
aluminio)

1
8. Medir la absorción en espectrofotómetro calibrado con agua (o con el propio blanco) y
ajustado a 760 nm de longitud de onda.

Preparación de la muestra:
Disolver el extracto seco en el mismo solvente en el que fue extraído. Empezar con una
concentración de 10 mg extracto/ mL (0.01g/ml) y diluir hasta que la absorbancia dé un valor
dentro del rango lineal de la curva de calibrado.

Todas las muestras a ser analizadas pesar la misma cantidad.

Si no se consigue el valor exacto de esta masa, aumentar/disminuir el volumen para alcanzar el

% de dilución requerido pero anotar la masa usada porque este valor es usado en el cálculo
final.
𝑚 𝑚 0.015 𝑔
𝐶= ∴𝑉= = [ ] ∴ 𝑽 = 𝟏, 𝟓 𝒎𝒍
𝑉 𝐶 0.01 𝑔/𝑚𝐿

Se requieren 30 µl

Procedimiento miniaturizado a 1 mL de reacción:

1. En tubos Eppendorf de 1.5 mL, añadir 600 µL de agua.
2. Adicionar 10 µL de muestra, blanco (solvente en el que fue disuelta la muestra), según
corresponda, para la muestra realizar triplicata y para el blanco apenas una.
3. Añadir 50 µL de reactivo de Folin.
4. Agitar el eppendorf en un vortex y dejar en reposo 1 min.
5. Añadir 150 µL de disolución de 20% carbonato sódico.
6. Añadir 190 µL de agua para completar el volumen de 1 mL.
7. Incubar durante 2 h a temperatura ambiente y oscuridad (gradilla cubierta con papel de
aluminio)
8. Medir la absorción en espectrofotómetro calibrado con agua (o con el propio blanco) y
ajustado a 760 nm de longitud de onda.

Tabla 1: Preparación del medio de reacción para análisis del extracto

Pipetear
Tubo Folin- Solución de
Agua Muest Agua
eppendorf Ciocalteu carbonato
(μl) ra (μL) (μl)
(μL) de sódio (μL)
A1
Muestra 600 10 50 150 190
A2

2
 A3
Blanco B - 200

Cálculo del contenido total en polifenoles:

Se hace una recta de calibrado representando la absorbancia neta (restándole el
blanco del agua) a 760 nm de las diferentes disoluciones estándar frente a su correspondiente
concentración de ácido gálico.
A la absorbancia de las muestras se les resta el blanco del disolvente para calcular su
absorbancia neta. Luego se calcula la cantidad de extracto equivalente al ácido gálico para dar
la misma absorbancia interpolando el valor en la recta de calibrado, y se expresa como
equivalentes de ácido gálico (GAE): GAE = mg GA/ g extracto.

Las absorbancias resultantes de las diluciones del estándar deben ser graficadas en
función de la concentración de ácido gálico para la obtención de una recta del tipo y=ax+b,
donde y es la absorbancia y x la concentración de ácido gálico en mg GA/ ml. Mientras más
próximo sea el valor de ajuste a 1 mejor.
La absorbancia encontrada para las muestras debe ser descontado del blanco y
sustituida en la ecuación de la recta estándar.

𝑌𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 = 𝐴𝑏𝑠𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 − 𝐴𝑏𝑠𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜

𝑌𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 −𝑏
𝑋= 𝑎
[mg/ml]
con a,b parámetros de la recta estándar

El resultado final debe ser expresado en equivalentes de ácido gálico (EAG). A partir de
esa concentración de la muestra, el EAG es obtenido por la siguiente ecuación:
𝜇𝑔
𝑒𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟 𝑋 (𝑚𝐿)
= 𝜇𝑔
𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 𝐶
𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 (𝑚𝐿 )

𝜇𝑔
𝑒𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟 𝑋 (𝑚𝐿) 1000 𝑚𝑔
= ∗[ ]
𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 1000 𝜇𝑔 𝑔
𝑚𝐿

𝑋 𝑚𝑔 𝑑𝑒 á𝑐𝑖𝑑𝑜 𝑔á𝑙𝑖𝑐𝑜
𝐸𝐴𝐺 = 𝑔 𝑑𝑒 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜

1. Referências
SINGLENTON, V. L.; ORTHOFER, R.; LAMUELA-RAVENTÓS, R. M.. Analisys of total
phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent.
Methods in Enzymology, 299, 152-178, 1999.

KOSAR, M.; DORMAN, H. J. D.; HILTUNEN, R.. Effect of na acid treatment on the
phytochemical and antioxidante charactristics of extracts from selected Lamiaceae species.
Food Chemistry, 91, 525-533, 2005.