MÉTODOS PARA DETERMINAR Kla

La medición del KLa en un cultivo microbiano aerobio dentro de un biorreactor se analiza la

transferencia de O2 de las burbujas de aire provenientes de un aireador a las células
bacterianas, además se estudia el balance de Oxígeno en el cultivo para mantener las
condiciones aptas para las células. La velocidad de transferencia de O2(rO2) desde el seno
de la fase gaseosa (burbujas) hasta la fase líquida (medio líquido) está determinada por la
siguiente ecuación:

rO2 = KLa (C*- C)

Donde:

KLa --> Coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno.

C --> Concentración de O2 disuelto en el seno del líquido
C --> Concentración de O2 disuelto en equilibrio con la presión parcial de oxígeno de la fase
gaseosa.

Existen diferentes métodos para determinar el coeficiente de transferencia de masa (Kla):

1. Método de balance de oxígeno

Se basa en un balance de materia en estado estacionario para el oxígeno en el cual se

mide el contenido de oxígeno de las corrientes gaseosas hacia o desde el fermentador.

Esta técnica se basa en la ecuación de transferencia de materia gas-líquido, se mide

desde el fermentador. De un balance de materia en estado estacionario, la diferencia entre
el flujo de oxígeno a la entrada y a la salida debe ser igual a la velocidad de transferencia
de oxígeno desde el gas hacia el líquido:

Donde:
- VL: Volumen del líquido en el fermentador
- Fg: Caudal volumétrico de gas.
- CAG: Concentración de oxígeno en fase de gas y
- Subíndices i y o se refieren a las corrientes de entrada y salida, respectivamente en
el primer término de la parte derecha de la ecuación representa la velocidad a la que
el oxígeno entra en el fermentador mientras que el segundo representa la velocidad
de salida.

La diferencia entre ellas es la velocidad a la que se transfiere oxígeno del gas al líquido,
NA. Dado que la concentración de gas se mide generalmente como presión parcial, puede
incorporarse la ley de los gases ideales con lo cual se obtiene la siguiente expresión:

Donde:

R--> constante universal de los gases.

PAG --> Presión parcial de oxígeno en el gas

T --> Temperatura absoluta.

Las presiones parciales de oxígeno en las corrientes de entrada y de salida no suelen ser
muy diferentes durante la operación por lo que es necesario medirlas con una gran
precisión, por ejemplo, utilizando un espectrómetro de masas. La temperatura y el caudal
de gases también dese ser medido con cuidado para asegurar un valor preciso de NA. Una
vez que se conoce NA se han encontrado los valores de CAL Y C*AL mediante los métodos
descritos anteriormente, el parámetro KLa puede calcularse a partir de la ecuación de
transferencia de materia gas-líquido.

Ventajas del método:

- El método de balance de oxígeno en estado estacionario es el procedimiento más

fiable para medir kLa.
- Permite su determinación con tan solo una medida.
- El método puede aplicarse a los fermentadores durante la operación.

-Desventajas del método:

- Depende de la precisión en la medida de la composición de gas, caudal, presión y

temperatura.
- Pueden cometerse errores de más o menos el 100% si las técnicas de medición no
son adecuadas.

2. Método dinámico

Se basa en un balance de materia en estado no estacionario para el oxígeno.

Existen varias versiones diferentes del método dinámico. Inicialmente, el fermentador

contiene células en un cultivo discontinuo. En un determinado instante el caldo es
desoxigenado bien por introducción de nitrógeno en el recipiente o parando el flujo de aire
si el cultivo consume oxígeno. La concentración de oxígeno disuelto CAL disminuye
drásticamente durante este período. Posteriormente se bombea aire en el cultivo con un
caudal tiempo. Es importante que la concentración de oxígeno permanezca siempre por
encima de Ccrit para que la velocidad de consumo de oxígeno existente. Suponiendo que
la reoxigenación del caldo es suficientemente rápida para permitir el crecimiento de la
células, el nivel de oxígeno disuelto alcanzará pronto un valor en estado
estacionario CAL promedio que refleja un balance entre el suministro de oxígeno y el
consumo existentes en el sistema. CAL1 y CAL2 son dos concentraciones de oxígeno
medidas durante la reoxigenación a tiempos t1 y t2, respectivamente. De esta manera puede
desarrollarse una ecuación para KLa en función de estos datos experimentales.

Durante la etapa de reoxigenación, el sistema se encuentra en estado no estacionario. La

velocidad con que varía la concentración de oxígeno disuelto durante este período es igual
a la velocidad de transferencia de oxígeno desde el gas hasta el líquido menos la velocidad
de consumo de oxígeno por las células:

Donde:

- qox --> Velocidad de consumo de oxígeno.

De esta manera puede determinarse una expresión para qox considerando el estado final
de concentración de oxígeno disuelto, C*AL. Cuando CAL=C*AL, dCAL/dt= 0 porque no
existe variación en CAL con el tiempo. Por lo tanto, de la ecuación anterior sustituyendo
este resultado en la ecuación y cancelando los términos KLa C*AL se obtiene:

Suponiendo que kLa constante en el tiempo la ecuación puede integrarse entre t1 y t2

utilizando las reglas de integración. La ecuación resultante para kLa es:

Ventajas del método:

- Menor coste del equipo utilizado.

Desventajas del método:

- No tiempos de respuesta rápido de las sonda de oxígeno.

- Tiempo de respuesta de electrodo similar a tiempo necesario para transferencia de
materia.
- Valores de CAL medidos no reflejan conc. Instantánea de oxígeno.
 - Tiempo medio de residencia del gas en el sistema cuando a la desoxigenación le
sigue la aireación (gases residuales).
- Media de CA no refleja la cinética de la transferencia de oxígeno hasta que se
establece de nuevo el contenido total de éste.
- Medición de kLa se encuentra restringido a recipientes con alturas menores a 1m.
- Inapropiados para caldos viscosos por grandes tiempos de residencia de las
burbujas.

3. Oxidación de sulfito

En el metabolismo aeróbico el O2 actúa como último aceptor de electrones, siendo este

proceso clave para la generación de energía (ATP).

Debido a la baja solubilidad del O2 en agua (7 mg/l a 35°C) y a que los microorganismos
son capaces de utilizar solamente el O2 disuelto, es evidente que este deberá́ ser
suministrado continuamente al medio de cultivo. Para lograrlo, es necesario transferir O2
desde la fase gaseosa (normalmente aire) a la fase liquida (medio de cultivo) de modo
permanente.

En el diseño de reactores destinados a cultivos aeróbicos es de fundamental importancia

tener en cuenta el aspecto mencionado anteriormente. En la Figura se puede observarse
un tipo de biorreactor (tanque agitado) empleado para la producción en gran escala. El
chorro de aire ingresa al biorreactor por debajo del agitador y al ser golpeado por las paletas
se transforma en miles de pequeñas burbujas. El primer efecto que se consigue con la
agitación es aumentar enormemente el área interfacial gas-liq ́ uido facilitando la
transferencia de O2 desde la fase gaseosa a la liq ́ uida. La presencia de deflectores impide
la formación de vórtice y hace que el sentido de circulación del liq
́ uido sea el indicado por
las flechas en la figura. De este modo las burbujas no ascienden directamente hacia la
superficie sino que quedan temporalmente retenidas por la circulación del liq ́ uido. El
aumento del tiermpo de retención de las burbujas implica un aumento en la transferencia
de O2.

Macroscópicamente, la transferencia de O2 puede explicarse mediante la ecuación RO2 =

KLa (C*-CL), donde RO2 es la velocidad de transferencia de O2, KLa es el coeficiente
volumétrico de transferencia de O2, C* es la concentración que estariá en equilibrio con la
presión parcial de O2 en el seno de la fase gaseosa. Según la ley de Henry, PO2 = H.C* y
CL es el valor de la concentración de O2 en el seno del liquido. La diferencia de estos dos
últimos términos es la fuerza impulsora de la transferencia. El KLa es una constante de
proporcionalidad que puede tomar diferentes formas dependiendo del modelo que se utilice
para explicarla. Tal como se explica en el trabajo práctico de determinación de KLa por el
método de sulfito (método de Cooper) si se utiliza el modelo del a pelić ula tenemos que:

donde D es la constante de proporcinalidad de la ley de Fick, L es la longitud de la pelicula

estanca que rodea a la burbuja, A es el area total de trasferencia de materia y V es el
volumen del medio.

Tecnologicamente importa determinar el valor de KLa en su conjunto, para tal fin existen
una diversidad de metodos. Entre ellos, el método del sulfito es de uso general, el mismo
se basa en la reaccion entre el sulfito de sodio con el O2 en medio ligeramente alcalino y
en presencia de iones Cu+2 o Co+2. El mismo, tal cual fue desarrollado, posee una
simplicidad que lo hace muy util pero, por otro lado, tienen el inconveniente de que como la
reacción es muy rapida, el gradiente alrededor de la burbuja se ve alterado y los resultados
que se obtienen son sobredimencionados.

Para solucionar ese tema se desarrolló un método alternativo en el cual, en lugar de trabajar
con la solución concentrada de Na2SO3 en el reactor y con una concentración de O2
cercana a 0, se agrega una solución de Na2SO3 a un caudal tal que toda la sal se consume
al momento de ingresar al reactor. Como la velocidad de ingreso de sulfito es menor la
velocidad de trasferencia de O2, la concentración de O2 disuelto es distinta de 0.

La ecuación estequiométrica que representa a la reacción que ocurre entre sulfito y O2 es

la siguiente:

La velocidad de la reacción puede representarse según la ecuación:

Donde:
K: constante de velocidad
m y n: coeficientes que deben determinarse experimentalmente y representan al orden de
la reacción para sulfito y oxígeno respectivamente.

Las ecuaciones que representan al balance de materia para el O2 y el Na2SO3 son las
siguientes:
donde VL es el volumen del reactor, CA y CB son las concentraciones de O2 disuelto y
sulfito en el medio, CAF y CBF son las concentraciones de O2 y sulfito en la alimentación,
Q es el caudal de alimentación,
Cuando se alcanza el estado estacionario el termino de consumo quim ́ ico puede eliminarse
de las ecuaciones anteriores sustrayéndolas y se obtiene la ecuación que permite calcular
el KLa:

En las condiciones de operación, la concentración remanente de sulfito en el medio, la

concentración de O2 en la alimentación y en el reactor son despreciable frente a la
concentración de sulfito en la alimentación con lo que la ecuación puede reducirse a:

Una diferencia operacional importante entre este método y el tradicional de Cooper es que
en el original la concentración elevada de sulfito mantiene relativamente constante el pH.
En el presente protocolo, la aparición de sulfato hace que el pH disminuya rápidamente.
Como el pH es un parámetro crit́ ico en la medida del KLa, se debe controlar el mismo en
forma activa.
A pesar de no permanecer el volumen absolutamente constante, como el volumen de la
planta es grande en relación al caudal de alimentación, se puede considerar que, a tiempos
cortos, se llega al estado estacionario.

4. Técnica de eliminación del gas

Un método que se pueda emplear para medir el valor de KLa consiste en eliminar el oxígeno
disuelto mediante el burbujeo de nitrógeno o bisulfito hasta que se tenga un valor igual a
C=0. Estableciendo las condiciones de operación de aeración y agitación que se desea
emplear, se inicia la aeración hasta que el oxígeno disuelto esté en valores cercanos a la
saturación (C=C*).

Se grafica entonces C en función del tiempo. Si no hay consumo endógeno de oxígeno, la

curva resultante es una exponencial:

C(t) = C* (1 – exp( -kLat))

Para un tiempo suficientemente largo (cuando C llegue casi a la saturación), el área entre
la curva C(t) = C* y el perfil del OD será aproximadamente A = C*/k La
Una manera alternativa de calcular kLa, si bX = 0, es resolviendo directamente la
ecuación:

Si a través del tiempo se miden las distintas concentraciones de oxígeno en el medio (C),
como resultado de la integración de la ecuación anterior se tiene que:

Se observa que es una relación lineal y graficando en función del tiempo, la

pendiente de la recta resultante es kLa.

Ventajas del método:

- Relativamente rápido
- Puede usarse directamente en el medio

Desventajas del método:

- Se requieren grandes volúmenes de nitrógeno, por lo que no es usado a gran escala

- No contempla el hecho de que bX>0, ni una condición inicial de C, ni tampoco el
tiempo de respuesta del sensor de oxígeno